Summary
Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.
Abstract
Tek hücre düzeyinde gen ifadesinin miktar nüfus düzeyinde gerçekleştirilen ölçümler gölgede yeni düzenleme mekanizmalarını ortaya çıkarır. İki yöntem mikroskopi dayalı ve akım sitometri gibi veriler elde edilebilir nasıl göstermek için sunulmaktadır. Mayada, ozmotik basıncı yüksek gliserol MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan bir flüoresan raportör ekspresyonu, bir örnek olarak kullanılmıştır. Her bir yöntemin özel avantajları vurgulanır. Sitometrisi hücrelerin geniş bir sayısı (10,000) büyüklüğüne ve floresan proteinin yavaş olgunlaştırma kinetik bağımsız protein ifade dinamikleri doğrudan bir ölçümünü sağlar akış. Mikroskobu ile canlı hücrelerin Imaging az hücrelerinde raportör olgunlaşmış formunun ölçümü ile sınırlı aksine gereğidir. Ancak, bu teknikle üretilen veri setleri birden gazetecilere kombinasyonları ve mekansal ve zamansal bilgiler son derece zengin sayesinde olabilirtek tek hücrelerden elde. Bu iki ölçüm yöntemlerinin kombinasyonu sinyal yolları ile protein ifadesinin düzenlenmesinde yeni anlayışlar sunabilirsiniz.
Introduction
Sinyal transdüksiyon cascades ile genellikle proteinlerin ekspresyonu son bulur. Bu ifade profilinin karakterizasyonu biyolojik yollarının işlevini anlamada önemli bir unsurdur. Up-regüle proteinler ve bunların aktivasyon dinamikleri spektrumunun tanımlanması, bu tür mikro-dizileri, kuzey ya da batı lekeleri blotlar 1-3 gibi çeşitli teknikler ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bu teknikler arasında, hücreler bütün bir nüfusun ortalama tepki. Protein ekspresyonunun ince düzenleme anlamak için, tek hücre düzeyinde ölçümleri toplamak için tercih edilir. İdeal olarak, bu ölçümler de altta yatan yolun matematiksel modeller geliştirmek için uygun nicel veri sağlamalıdır.
Mikroskopi ve akış sitometri ideal gibi nicel tek hücre ölçümlerini sunmak için uygundur iki teknik vardır. Bir floresan protein ile proteinlerin endojen etiketleme be ekspresyon seviyesi 4 ölçmek için kullanılır. Proteinin terminalinde büyük bir floresan yarımının eklenmesi işlevsel olmayan işlemek için Bununla birlikte, bu bir floresan yapısının ekspresyonunu tahrik eden bir promotere göre belirli ifade muhabir oluşturmak için genellikle daha fazla tercih edilir. Bu, raportör protein hücresel sistem için dışsal ve bu nedenle hücre içinde yer alıyor sinyal olaylarını etkilememektedir.
Mikroskopi ve akış sitometrisi her ikisi yaygın olarak maya sinyal alanında kullanılmıştır. Örnek olarak, Colman-Lerner ve arkadaşları korelasyon, tek hücreler içinde, maya eşleşme sinyal iletim 5 gürültüyü ölçmek için mikroskopi ile spesifik ve yapısal olarak ifade edilen muhabir çiftleşme ifade Acar ve düzenleyici ağ incelemek için akış sitometrisi el arkadaşları GAL genlerin 6 ekspresyonunu kontrol etmektedir. Önceki bir çalışmada 7'de, bir combinati kullandıkozmotik basıncı yüksek gliserol maya tomurcuklanma olarak (HOG) yolunun gelen ifade çıkışını incelemek için bu iki teknikleri üzerine. Bu, mitojen tarafından aktive edilen protein kinaz (MAPK) yolu hiper-osmotik stres tarafından tetiklenir. Bu, yaklaşık 300 genlerin ekspresyonu ile sonuçlanan bir transkripsiyon programı indükleme hücrenin çekirdeğine doğru Hog1 MAPK aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu işlemi incelemek için, bir dört Venus floresan proteini (p-STL1 QV) ekspresyonunu tahrik STL1 promoteri (Hog1 aktivitesi 8'e yanıt olarak, özellikle kaynaklı bir gen) dayanan bir sentezleme raportör mühendisliği vardı. Ölçümler, flüoresan raportör ifade nüfusun sadece bir kısmı ile orta gerilim seviyesinde (0.1 M NaCl) ile iki hücre popülasyonlarının varlığını ortaya sitometrisi akış. Biz daha bu davranışı araştırmak için mikroskobu kullandılar ve protein ifadesindeki bu gürültü içsel faktörlere 9 tabi olduğunu keşfetti. Biz could ayrıca Hog1 aktivite benzer bir düzeyde olan hücreler çarpıcı farklı ifade sonuçlarını görüntülemek verebilecek görüyoruz. Bu iki tekniğin kombinasyonu bize stres yanıtı genlerinin yavaş yeniden tek hücre düzeyinde 7 de ifade sonucunu nasıl etkilediğini göstermek için izin verdi.
Bu yazıda, mikroskobu ile protein ifade miktarının bir örnek olarak hiper-ozmotik şok tarafından uyarılan p STL1-QV muhabiri ifadesini kullanın ve akım sitometri. 0.2 M NaCl strese maruz aynı gerilme hem tekniklerle incelenmiştir. Bu bize bu iki derece tamamlayıcı teknikler arasındaki bazı temel farklılıkları vurgulamak için izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mikroskopi Ölçümler
- Maya sentetik ortam 5 ml inoküle.
- Gece boyunca 30 ° C'de hücreler büyür.
- Ertesi sabah, gece boyunca kültürün OD 600 ölçün.
- 600 0.05 OD 5 ml sentetik kültür ortamı içinde bir gece boyunca seyreltin.
- En az 4 saat boyunca 30 ° C'de seyreltilmiş kültür büyütün.
- Hazırlama 3 kat sentetik aracı madde içinde (0.6 M) NaCl solüsyonu konsantre edildi.
- PBS, Concanavalin A (ConA) bir 1 mg / ml çözelti hazırlayın.
- Süzüntü ~ iyi slayt içine ConA'nın çözeltisi 200 ul.
- 30 dakika bekletin.
- ConA'nın çözüm çıkarın.
- De 150 ul H 2 O ekleyin.
- H 2 O. kaldır
- Hücre kültürü OD 600 ölçün.
- 1.5 ml = 0.02 mikrotüp içinde OD 600 hücre kültürünün 300 ul hazırlayın.
- 45 saniye için bir su banyosu içinde hücreleri sonikasyon.
- Vortex kısaca microtube.
- 45 saniye için bir su banyosu içinde hücreleri sonikasyon.
- Kısaca Vortex Mikrotüp.
- Oyuğuna hücre kültürünün 200 ul ekleyin.
- Hücreler kuyunun dibine çöker izin 30 dakika bekleyin.
- Mikroskop iyi slayt yerleştirin.
- Kaydedilecek floresan kanal aydınlatma ayarlarını seçin.
- (: Hücrelerinin uygun bir segmentasyon sağlamak için odak düzleminin altında 3 um biraz odak dışında biri) iki parlak bir alan görüntüler için aydınlatma ayarlarını seçin.
- Time-lapse ölçümü için zaman aralıklarını seçin
- Görüntü görüş alanları seçin.
- Bir kaç kare alımı başlatabilirsiniz.
- 0.6 M NaCl ortamında 100 ul eklemek için satın Pause.
- Görüntüleme Devam.
2. Sitometrisi Ölçümler
- Maya sentetik ortam 5 ml inoküle.
- Gece boyunca 30 ° C'de büyür.
- TedbirOD, gece boyunca kültürün 600 ertesi sabah.
- 600 0.1 OD 5 ml sentetik bir ortam içinde bir gece boyunca kültür seyreltin.
- OD 0,2-0,4 600 ulaşmak için en az 4 saat boyunca 30 ° C'de büyür.
- H2O içinde sikloheksimid çözelti 1 mg / ml hazırlanması
- Hazırlama 3 kat sentetik aracı madde içinde (0.6 M) NaCl solüsyonu konsantre edildi.
- Ölçülecek her zaman noktası için 0.6 M NaCl ortamın 100 ul bir 1.5 ml mikrotüp hazırlayın.
- 0 zamanında, her bir mikrotüp hücre kültürü 200 ul ekleyin.
- 30 ° C'de çalkalayarak kuluçkalayın
- T süresi de, bir mikrotüpe 30 ul sikloheksimid ekleyin.
- Her istenilen zaman noktaları için adımı 2.11 tekrarlayın.
- En az 45 dakika boyunca tüm mikrotüpler inkübe edin ve çalkalanarak 30 ° C'de 3 saat kadar.
- 400 ul PBS ile FACS tüpleri hazırlayın.
- 1 dakika süre ile bir su banyosunda sonikasyon hücreleri.
- Kısaca Vortex mikrotüpler.
- Oğlum1 dakika boyunca bir su banyosu içinde hücreleri TARĐHĐ BELGE.
- Kısaca Vortex mikrotüpler.
- Her mikrotüpünden olarak karşılık gelen FACS tüpüne 100 ul hücre kültürü ekleyin.
- Tespiti için 488 nm uyarma lazer ve 530/30 nm band geçiren filtre seçin.
- Testi olmayan ifade ve tam onlar dedektör hassasiyet aralığında düşüş olmadığını doğrulamak için örnek ifade.
- Alınan her bir örnek için 10,000 hücre ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopla inceleme
Sentezleme raportör p STL1-QV (ySP9 7) taşıyan maya hücreleri iyi slaydın tabanına bağlanmış ve mikroskop altında yerleştirildi. Hücreler görüntüleme oturumu sırasında doğrudan kuyuya stres ortamının eklenmesi ile uyarıldı. Bu bize yol indüksiyon öncesi hücrelerin birkaç görüntü elde ve stimülasyon sonrasında kendi kaderini takip sağlar. Bu durumda, hücreler, 10 dakika bir zaman aralığı ile ~ 2 saat boyunca takip edildi. Şekil 1A ve Şekil 1B indüksiyon öncesi floresan olmayan hücrelerin bir görüntüsüdür sentezleme raportör sahip 2 saat stresten sonra hücreler aynı görüntüler indüklendiği ve floresan haline gelmiştir.
Bu görüntülerin mevcut sayısal bilgi elde etmek için, karmaşık bir görüntü analiz işlem yapılması gerekir. Bu, i nesneleri tanımlamak için hücrelerin segmentasyon içerirmage, sonraki bir çerçeveden bu nesnelerin izleme ve bu nesneler (şekil ve yoğunluk özellikleri) özelliklerinden ölçümleri. Biz bu analizi gerçekleştirmek için 10 YeastQuant adında kendi platformu geliştirdi. Bir kaç diğer ticari olmayan yazılımları bu görevleri gerçekleştirmek için kullanılabilir:. CellProfiler 11, 12 veya 13 CellX CellID Şekil 1C YeastQuant ile yapılan bir analizin sonuçlarını görüntüler. Her bir kırmızı iz tek bir hücrenin ortalama floresan yoğunluğu zamansal gelişimi temsil etmektedir. Mavi çizgi, aynı kuyudan manzaralı beş farklı alanlardan alınan beş time-lapse film 20 kare boyunca bölümlenmiş ve izlenen 500'den fazla hücre medyan görüntüler. Açık mavi alan belirli bir zaman noktasında ölçülen tüm yoğunluklarının 25. ve 75. yüzdelik temsil eder.
Akış sitometrisi
Akış sitometrisi için measuremveliler, hücre kültürü stres ortamı içeren mikrotüplerde döküldü. P STL1-QV ifade zamansal evrimini incelemek için, translasyon sikloheksimid, farklı zaman noktalarında (5-10 dakika aralıklarla) (Şekil 2) engellenmiştir. Bu ilaç blok yeni protein sentezi, ancak daha önce ifade edilen floresan proteinin olgunlaşma tedirgin değildir. Bu nedenle, inkübasyon bir saat 45 dakika sonra, hücreler, sikloheksimid ilave zamanda üretilen protein miktarı sayılmasına olanak tanıyan akış sitometresi ölçülebilir. Bu strateji, floresan protein olgunlaşma problemi aşılmaktadır ve dolayısıyla floresan protein sentezinin gerçek dinamiklerini miktarını belirler.
İki teknik karşılaştırılması
Şekil 3A, sentezleme muhabir dinamiklerini mikroskopi ile ölçülen ve akış sitometrisi karşılaştırır. Flüoresan sinyal 30-40 yükselmeye başlar ikenmin mikroskobu ile gerilmesinden sonra akış sitometrisi ölçümleri açıkça proteinleri daha önce uyarıcı sonra 10-15 dakika arasında üretilmektedir kanıtlamak. Bu yarım saatlik gecikme floresan proteinleri 14 yavaş olgunlaşması nedeniyle. Her iki yöntem hücrelerin floresan yoğunluğunu ölçmek rağmen, bir bu çalışmada, aynı biyolojik sürecini ölçmek olmadığını akılda tutulması vardır. Birlikte, mikroskopi floresan sinyalinin takip hayalet, akış sitometrisi, aslında protein sentezini ifade etmektedir. Bu canlı hücre görüntüleme yaparken dikkate bu olgunlaşma adımı almak esastır. Onun etiketinin floresan tespit edilebilir önce endojen protein bir floresan protein ile etiketlenmiş bir durumda, endojen protein olarak ifade ve aktif olacaktır.
Yukarıda belirtildiği gibi, her iki teknik tamamlayıcı bilgiler sağlar. (Çok hızlı bir şekilde hücre, bir çok sayıda ölçebilen akış sitometri10000 ya da daha fazla). Bu nedenle üst üste binen iki popülasyonu tespit edilebilir ya da birkaç nadir olaylar görülebilir istatistiksel zengin veri setleri sunabilirsiniz. Mikroskop (100 sırasına) hücre sınırlı sayısı hakkında bilgi sağlar. Bu veri seti zamansal ve mekansal bilgileri içeren ve aynı hücrede birden ölçümlerin korelasyon sağlar, çünkü Ancak, incelenen biyolojik sürecine çok değerli bakış açısı sunabilir.
Şekil 1. Mikroskobu ile raportör ifade ölçümü. 0.2 M NaCl (B). C ile uyarıldıktan sonra (A) ve 2 saat önce, flüoresan raportör sentezleme p STL1-QV taşıyan hücrelerin A ve B. Görüntüler. Grip zamanı ders orescence hayalet. Kırmızı eğrileri birkaç temsilci, tek hücreli izlerinin ortalama hücresel floresan yoğunluğunu temsil etmektedir. Mavi eğri 550 tek hücre izleri medyan floresan temsil eder. Açık mavi alanı her zaman noktasında hücre popülasyonunun floresan ifade 25. ve 75. yüzdelik temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Akış sitometresi ile raportör ifade ölçülmesi. Farklı zaman noktalarında 0.2 M NaCI ve sikloheksimid ile inhibe ile muamele flüoresan raportör sentezleme p STL1-QV taşıyan hücrelerin hücresel floresans Histogramlar.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Mikroskopi ile ölçülen ve akış sitometresi ekspresyon dinamikleri karşılaştırılması. Floresan yoğunluğu A. ortalama üç biyolojik kopyalar için zamanın bir fonksiyonu olarak akış sitometrisi (düz çizgi) ve mikroskobu (kesikli çizgi) ile ölçülür. Hata çubukları mikroskopi için stres (B) ile üç kez tekrarlanmış için akış sitometrisi (C) için bir stres sonrası 60 dakika sonra ortalama. Yatak ve 120 dk 'da normalize floresan yoğunluğunun C. Histogramlar, standart hatayı temsil eder. için tıklayınDaha büyük resmi görmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopla inceleme
ConA ile kuyunun tedavisi, hücrelerin uygun bir görüntüleme sağlamak için önemli bir adımdır. ConA PBS (5 mg / mi) içinde düşük bir çözünürlüğe sahip olduğundan, filtreleme işlemi sağlar: filtre çözelti içinde mevcut olan ve görüntüleme müdahale büyük agregaların çıkarılması. Hücreler, işlemden geçirilen yüzeye bağlı olarak güçlü bir şekilde tutunur ve uyaran çözeltisinin eklenmesinin uyaran önce ve sonra, bir sürekli izleme sağlayan, hücrelerin lokalizasyonu rahatsız edilmemelidir. Hücreler, sabit bir akış 7,15 maruz olan bu tedavi aynı zamanda kanal veya mikroakışkan cihazları akış için uygulanabilir. De düzgün bir şekilde tedavi sonrasında su ile durulanır değilse çözelti içinde ConA hücrelere doğrudan bağlanan ve cam yüzeyinde güçlü bir bağ oluşturmak için engeller, çünkü muhtemelen, hücreler, cama doğru bağlı değildir. Yıkama aşamasından sonra, kuyu 3 için kuru kalabilir -Belirgin cama hücrelerin bağlayıcı etkilemeden hücrelerin eklenmesinden önce 4 saat.
Floresan kanal için kalma süresinin seçimi deney başarısı için kritik bir ayardır. Hücrenin floresan geçen zaman boyunca artacak bu yana, satın alma sırasında görsellerin doymasını önlemek için kullanılabilir maksimum maruz kalma süresi ne kadar büyük bir neden numune ile önceden test edilmesi önemlidir. Pozlama süresini seçerken dikkate alınması gereken bir diğer parametre floresan sinyalinin ağartma olduğunu. Her bir örnek için, bir zaman içerisinde, bağlı ağartma sinyalin görüntü ve parlaklık bozulma arasında bir ödünleşim bulmak zorundadır. Her edinimi arasındaki zaman aralığı da güçlü floroforun ağartma etkiler. Protein ifadesi nispeten yavaş bir süreç olduğu için, biz genellikle 10-15 dk kullanın. aralıkları. Diğer hızlı süreçler f gerekiyorsaprotein ifadesi paralel ollowed, o bütün zaman-lapse film (daha sonra satın almalar için başında ve 5-15 dakika 1-2 dak) üzerindeki farklı zaman adımları kullanmak için tavsiye olabilir.
Hücre yoğunluğunun kontrol dikkate almak için çok önemli bir parametredir. Yoğunluğu çok düşük ise, çok az sayıda hücre veri kümesi için zayıf istatistiği ile sonuçlanan görüş her alanda mevcut olacaktır. Yoğunluğunun çok yüksek olduğu, ancak, bu zor görüntülerden istenen bilgileri elde etmek için yapma, bölümleme, izleme ve hücrelerin miktarının engelleyebilir. Tohumlama yoğunluğunu belirlemek için, dikkate almak için ek bir parametre deney süresidir. Bir deneme birden fazla bölme döngü boyunca sürerse, yavaş yavaş nedeniyle hücrelerin bölünme ve çözelti içinde hücre yerleşmesinin için görüntüleme zamanı süresince dolduracaktır görünüşünün seyrek alan ile başlamak için tavsiye edilir. Protokol, biz kullanmanızı öneririzBiz daha uzun olanlar için 0.005 kısa zaman atlamalı filmleri için 0.05 ile OD 600 kullanmak yerine deney türüne bağlı olarak, 0.02 'lik bir OD 600,.
Analiz hücre sayısı açık bir şekilde deney geçerliliği için önemli bir parametredir. Bazen kadar az 20-30 kadar hücre, bir veri seti oluşturmak için bir araya getirilmektedir. Ancak, istatistiksel olarak anlamlı veri setleri, yüz hücreleri veya daha fazla sahip başlamak için muhtemelen gereklidir. Objektif büyütme görüntülenen alanda boyutunu ve görüntülü hücre böylece sayısını belirler. Amacı, hücrenin ortalama floresan ölçmektir protein sentezleme ölçümleri için, yüksek bir sayısal açıklık 40X daldırma objektif gürültü oranı iyi sinyal ve geniş bir görüş alanı sağlamak hem de en iyi çözümdür. Alt hücresel yapılar analiz edilmesi varsa, daha yüksek büyütme (60X veya 100X hedefler) Daha az hücrelerin ölçümü sonucunda, sıklıkla gerekmektedir. SCMO gelişiGeleneksel CCD olandan neredeyse dört kat daha büyük bir dedektör boyutu ile S kamera görüş alanının başına daha fazla hücre elde etmek için açıkça bir avantajdır.
Bir motorlu XY-aşama ile, nihai veri kümesi içinde hücrelerin sayısını arttırmak için bakış paralel birden fazla görüntü alanlarında mümkündür. Bununla birlikte, ziyaret edilen XY pozisyonların sayısı ve görüntü edinim hızı arasında bir değiş tokuş vardır. Sahnenin hızı ve kaydedilen aydınlatmaları sayısına bağlı olarak, görüntü bir dakikadan daha kısa bir sürede on pozisyonları tipik olarak mümkündür. Hızlı sinyal olaylarını ölçmek için, bu sınırlayıcı bir faktör haline gelebilir. Floresan değişiklikler daha yavaş bir zaman ölçeğinde meydana protein ifadesi ölçümleri için, genellikle bir sınırlama değildir. Bu sentezleme deneyleri, bir kaç saat için son çünkü gerekli olan yavaş zamansal çözünürlüğü için, alternatif olarak, bu paralel olarak birden fazla görüntü örnekleri avantajlı olur. Birden komşu kuyular can, yabani tip ve mutant hücreleri ile ekilebilir, farklı uyarıcı her oyuğuna uygulanabilir veya biyolojik replika paralel olarak ölçülebilir. Bir 96-yuvalı plaka her kuyudan rutin tarama mikroskobu ekranlar 16 hava amacı ile elde edilir. Nedeniyle Mayada endojen proteinlerin düşük bolluğu nedeniyle, bunların yüksek miktar sayısal açıklığı olan bir yağ objektif gerektirir. Bu ciddi amacı ile seyahat edilebilir aralığını sınırlar. Yine de biz yakın ortak köşesine kalarak rutin görüntü dört komşu kuyular. Bununla birlikte gözenekli bir daha fazla sayıda görüntü daha da zordur. Otomatik dağıtıcılar ile su hedefleri parlaklık küçük kaybı pahasına bu sorunu aşmak olabilir.
Flow sitometri
Hücrelerinin yeterli sayıda toplama hiç akış sitometre ile bir sorundur. Tipik 10.000-100.000 hücreler bir dakika içinde elde edilebilir. Ancak, t görüntü yokHücre kazanılır o, doğru analiz edilmesi için hücre popülasyonu seçmek önemlidir. Ölçülmüş ileri ve yan scatter göre hücrelerin Yolluk tek tek hücrelerinin yerine, hücre kümeleri seçmek ve analiz hücre artıklarının alınması için izin verebilir. Şekil 2'de, her bir histogram ölçülen 10.000 olaylardan kendi saçılma özelliklerine göre seçilen yaklaşık 5000 hücrelerinin bir popülasyonu temsil etmektedir.
Tek tek hücrelere hücre kümeleri kırarak, hücre kültürünün sonication edinilen verilerin kalitesini artırmak için ek bir yoldur. Bu, hücre kümeleri, uygun şekilde kesimine çok zor olabilir mikroskopi için de geçerlidir. Bu aşamanın süresi, deneysel olarak test edilmesi gerekir. Genellikle hücre süspansiyonu vorteks ardından bir dakika için 30 sn 'lik bir su banyosu içinde sonikasyon iki tur yapar. Uzun süreli sonikasyon birkaç hücre lizizine neden olabilir. Ancak, o vermediBu deneysel adım bağlı stres duyarlı genlerin bir up-regülasyonu bserve. Örneğin W303 hücreleri, S288C hücrelere göre toplamak için güçlü bir eğilimi göstermek için hücrelerin agregasyonu, bir arka plan bağlı fenotip olduğuna dikkat edin.
Tek hücre ölçümlerde değişkenlik
Şekil 3A içinde, akış sitometrisi ve mikroskopi ile yapılan, üç bağımsız deneyin için ortalama ve standart hata çizilir. Üç eğrileri arasındaki küçük farklılıklar deneysel hatalar bu basit ölçümler için nispeten küçük ve çok sayıda hücreleri (mikroskopi için 370-550 arasında, akış sitometrisi için 5.000 'den fazla) ölçülür olduğu gerçeğinden ortaya çıkar. Mikroskopi eğrilerinin zamansal evrimi akım sitometri veri bir daha düzgündür. Bu davranış için bir muhtemel nedeni numune hazırlama sürecidir. Mikroskopisi, bir deney içinde tüm zaman noktaları iken, aynı gerilme olayı sonucuFACS, her bir zaman noktası için bir numunenin ayrı ayrı vurgulanmaktadır. Stres ve Kültür çözümler hacminde küçük varyasyonlar gen sentezleme çıktı küçük bir fark neden olabilir. Bir alternatif strateji, hücre 5 ml kültür stres ve sikloheksimid ile inhibe etmek için arzu edilen zamanlarda numuneler kaldırmak olacaktır. Her iki yöntem de daha fazla esneklik sağlar ve aynı zamanda birden fazla NaCl konsantrasyonları, paralel olarak ölçülmüş olmak zorunda doz-yanıt eğrilerinin ölçümleri için çok uygundur çünkü mikrotüp Hazırlama yöntemi kullanarak, iyi çalışır.
Bu ortalama virajlarda düşük gürültü, ancak tek hücre düzeyinde değişkenlik mevcut olan dizi yansıtmaz. Şekil 3B ve 3C, mikroskopi ile ölçülür ve tek bir zaman noktasında akış sitometresi ekspresyonunun histogramlar çizilir. Bu iki panel espec, iyi çoğaltır arasındaki teknik varyasyonlar nispeten küçük olduğu gerçeğini açıklamaktadırially tek tek hücrelerin ifadesinde gözlenen büyük değişkenlik ile karşılaştırıldığında. Ölçümler sitometrisi mikroskopi ve akış arasındaki dağılım şekiller fark mikroskop görüntüleri ortalama hücre yoğunluğu hesaplanmıştır ise, toplam hücre yoğunluğu akış sitometrisi ile ölçülür gerçeğinden ortaya çıkar. Dolayısıyla bu ikinci ölçüm hücresi boyutlarındaki değişiklikler dışarı ortalamalar ve dar dağılımları sonuçlanır.
Burada sunulan iki teknik kantitatif tek hücre davranışlarını incelemek için izin verir. Bu özellik genellikle nüfus düzeyinde gerçekleştirilen geleneksel biyolojik ölçümler gizlidir. Bireysel hücrelerin yanıt değişkenliği ortaya nasıl anlayış biyolojik süreçlerin karmaşık düzenleme haline önemli bilgiler sunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Matthias Peter ve bu yöntemler geliştirilmiştir Zürich ETH Biyokimya Enstitüsü'nde yaptığı grup ederim. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
