Modeller og metoder for å vurdere transport av Drug Delivery Systems Across Cellular Barrierer

Summary

Mange terapeutiske applikasjoner krever sikker og effektiv transport av legemiddelbærer og den last på tvers av cellebarrierer i kroppen. Denne artikkelen beskriver en tilpasning av etablerte metoder for å vurdere raten og mekanismen for transport av stoffet nanocarriers (NCS) på tvers av cellebarrierer, slik som gastrointestinal (GI) epitel.

Abstract

Sub-mikrometer bærere (nanocarriers; NCS) forbedre effekten av legemidler ved å forbedre oppløselighet, stabilitet, sirkulasjon tid, målretting, og slipp. I tillegg krysser cellulære barrierer i kroppen er av betydning både for oral levering av terapeutiske NCS inn i sirkulasjonen og transport fra blodet inn i vevet, hvor intervensjon er nødvendig. NC transport gjennom cellebarrierer er oppnådd ved: (i) paracellular rute, via forbigående avbrudd i knutepunktene som sammen tilstøtende celler, eller (ii) den transcellular rute, hvor materialene er internalisert ved endocytose, transporteres på tvers av cellelegemet, og skilles ved den motsatte celleoverflaten (transyctosis). Levering over mobilnettet barrierer kan gjøres lettere ved å koble legemiddelselskap eller deres bærere med målretting midler som binder spesifikt til celle-overflate markører som er involvert i transport. Her gir vi fremgangsmåter for å måle graden og mekanismen for NC transport over en modell cellebarriere, noe som tilsvarerch består av et monosjikt av gastrointestinal (GI) epitelceller dyrket på en porøs membran som ligger i et Transwell innsats. Dannelse av en permeabilitet barriere er bekreftet ved å måle transepithelial elektrisk motstand (Teer), transepithelial transport av en kontroll substans, og farging av trange veikryss. Som et eksempel, ~ 200 nm polymer norsk sokkel brukt, som bærer en terapeutisk last og er belagt med et antistoff som er rettet mot et celleoverflate determinant. Antistoffet eller terapeutisk lasten er merket med ^125I for radioisotop sporing og merkede sokkelen tilsatt til det øvre kammer over cellen monolag etter varierende tidsperioder. Norsk sokkel forbundet til cellene og / eller transportert til det underliggende kammer kan detekteres. Måling av frie ^125. I lar subtraksjon av det degraderte fraksjon. Den paracellular ruten blir vurdert ved å bestemme eventuelle endringer forårsaket av NC transport til barriere parametre som er beskrevet ovenfor. Transcellular transport is bestemmes ved å ta virkningen av å modulere endocytose og transcytosis trasé.

Introduction

Cellular barrierer i kroppen fungerer som en gateway mellom det ytre miljøet og interne avdelinger. Dette er tilfellet for den epiteliale foring skille eksternt eksponert overflate av gastrointestinal (GI)-tarmkanalen og i blodet ^{til 1-3.} Cellular barrierer representerer også grenseflaten mellom blodet og parenchyma og cellulære komponenter av vev og organer. Dette er tilfelle for den indre endotelial foring i blodkar, slik som blod-lunge-barrieren, blod-hjerne-barrieren, etc. ^1. Evnen til å passere disse cellulære barrierer i kroppen er avgjørende for effektiv levering av terapeutiske og diagnostiske midler inn i sirkulasjon og vev / organer der intervensjon er nødvendig.

For å forbedre levering av terapeutiske eller diagnostiske midler, kan disse forbindelsene bli lastet inn i sub-mikrometer nanocarriers (NCS). Disse narkotika levering kjøretøy kan formuleres med en rekkekjemi og strukturer for å optimalisere narkotika oppløselighet, beskyttelse, farmakokinetikk, utgivelse, og metabolisme ^4,5. NCs kan også bli functionalized med affinitet eller målretting moieties (f.eks antistoffer, peptider sukker, aptamers, etc.) for å lette vedheft til områder av kroppen der det terapeutiske tiltak kreves ^2,6. Målretting NCS for å uttrykkes på overflaten av cellebarrierer kan videre legge til rette for transport inn i og / eller på tvers av disse pakninger ^2,6.

Rollen til selektivt å transportere stoffer mellom to miljøer krever visse unike egenskaper blant cellelag. En slik funksjon er celle polaritet, hvorved den apikale membran som vender mot hulrommet i hulrom varierer fra basolateral membran orientert mot vevet interstitium, med hensyn til membran morfologi og sammensetning av lipider, transportører, og reseptorer ^2. En annen funksjon innebærer inter Junctions forbinder tilstøtende celler. Regulering av de proteiner som danner trange veikryss, særlig junksjonale adhesjonsmolekyler (syltetøy), occludins og Claudins, modulere barrierefunksjon for selektivt å tillate eller ikke transport av stoffer mellom celler, kjent som paracellular transport, slik at passasje av materialer fra hulrommet til den basolateral plass ^tre. Binding av mange naturlige og syntetiske elementer (leukocytter, molekyler, partikler og medikamentleveringssystemer) til cellebarrierer i kroppen kan indusere celle-koplingsåpning, som kan være forbigående og relativt ufarlige eller mer langvarig og derfor usikre med tilgang av uønskede stoffer over barrieren ^2,5,7-9. Følgelig kan denne veien bedømmes ved å måle transepithelial elektrisk motstand (teer) og passiv paracellular diffusjon av molekyler (heretter kalt paracellular lekkasje), hvorved redusert motstand mot en elektrisk strøm eller økt paracellular lekkasje av en inert sammensatte inn i basolateral plass indikere åpning av celle veikryss, henholdsvis ^5,10,11. For å komplettere disse metodene, kan noen av de trange veikryss proteiner nevnt ovenfor være farget for å vurdere deres integritet, hvor flekker bør vises konsentrert på celle-cellekant hele cellen periferien ^5,10,12.

Alternativt, kan stoffet leveringssystemer som er rettet mot spesifikke celleoverflate determinanter, for eksempel de som er knyttet til clathrin-coated pits eller kolbeformet membran invaginations kalt caveolae, utløse vesicular opptak i cellene ved endocytose, som gir en vei for levering av legemidler til intracellulære rom ^{5, 13.} I tillegg kan endocytose føre til smugling av vesikler over hele cellen kroppen for utgivelse på basolateral side, et fenomen kjent som transyctosis, eller transcellular transport ^14. Derfor kan kjennskap til kinetikk og mekanismen for endocytose brukes til å utnytte en intracellulærnd transcellular levering av legemidler, som tilbyr et relativt trygt og kontrollert modus for levering i forhold til paracellular rute. Mekanismen for endocytose kan evalueres med modulatorer av klassiske baner (clathrin-og caveolin endocytose, og macropinocytosis) eller ikke-klassiske veier (for eksempel tilfellet med celleadhesjonsmolekyl (CAM)-mediert endocytose) ^5,13,15 .

Mens intracellulær trafikkering blir ofte undersøkt i standard brønner eller dekkglass, i fravær av en basolateral kammer utelukker cellepolarisering og evnen til å studere transport over cellelagene. For å overvinne denne hindring, har transport over celle-monolag lenge vært undersøkt ved hjelp av Transwell setter ^10,11,16,17, som består av en øvre (apikal) kammer, en porøs permeabel membran, hvor cellene feste og danner et tett monosjikt, og et nedre (basolateral) kammer (figur 1). I denne konfigurasjonen, transport kan måles iapikal-til-basolateral retning ved administrering av en behandlings inn i det øvre kammer, etter transport gjennom cellemonolaget og den underliggende porøse membranen, og til slutt å samle mediet i det nedre kammeret for kvantifisering av transportert materiale. Transport i basolateral-til-apikal retningen kan også måles ved innledende administrering til det nedre kammer og påfølgende samling fra det øvre kammer ^5,10,12,16. Forskjellige teknikker eksisterer for å bekrefte dannelsen av permeabilitet barriere på transwells, inkludert teer og paracellular transport-analyser, som beskrevet ovenfor. Dessuten kan det permeable filter som cellene dyrkes fjernes for avbildningsanalyse (for eksempel ved fluorescens, konfokal, elektronmikroskopi), som ytterligere kontroll av cellemonolaget modellen, samt mekanismen for transport. Valg av membran-type, som er tilgjengelig i forskjellige pore-størrelser, materialer og overflatearealer, er avhengig av en rekke factors slik som størrelsen av stoffer eller gjenstander som skal transporteres, celletype, og fremgangsmåte for billeddannelse ^16,18-20. Transwell innsatser også lette kontrollert og nøyaktig kvantifisering av transport sammenlignet med komplekse pattedyrsystemer, som volumene av kamrene og celleoverflate er kjente konstanter. Selv om mange faktorer som er involvert i tilførsel in vivo er eliminert, blant annet nærværet av intestinale slim, skjærspenning, fordøyelsesenzymer, immunceller, etc., den lille målestokk in vitro-modell gir nyttig innledende informasjon vedrørende transport.

Som et eksempel for å illustrere tilpasning av disse metodene for å studere NC transport over mobilnettet barrierer ^10,11,16,17, beskriver vi her et tilfelle hvor potensialet for NC transport over GI epitel ble modellert ved å vurdere passering av en modell for levering av legemidler systemet gjennom et monolag av human epitelial kolorektal adenokarsinom (Caco-2) celler. For dette formålet, calen ble dyrket i Transwell innlegg, på en 0,8 um pore polyetylen-tereftalat (PET) filter (6,4 mm diameter), som er gjennomsiktig og kan brukes for mikros avbildning. Statusen til permeabilitet barrieren er validert ved å måle teer, apikal-til-basolateral transport av en styre substans, albumin, og fluorescensmikroskopi visualisering av et element av den trange veikryss, occludin protein. En modell av målrettet polymer NC benyttes, som består av 100 nm, ikke biologisk nedbrytbar polystyren nanopartikler. Norsk sokkel er belagt med overflate adsorpsjon med en målsøkende antistoff alene eller en kombinasjon av en målsøkende antistoff og et terapeutisk last, hvor noen av komponentene kan være merket med ^125I for radioisotop tracing. I det valgte eksempel gjenkjenner antistoffet intercellulære adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1), et protein som uttrykkes på overflaten av GI epithelial (og andre) celler, som er blitt vist for å forenkle intracellulære og transcellular transport o f narkotika bærere og deres last ^21. Lasten er alfa-Galactosidase (α-Gal), et terapeutisk enzym som brukes for behandling av Fabrys sykdom, en genetisk lysosomal lagringsforstyrrelse ^22..

De belagte sokkelen på ca 200 nm i størrelse, tilsettes til den apikale kammeret over cellemonolaget og inkubert ved 37 ° C i varierende tidsperioder, hvoretter ^125. I på norsk sokkel kan detekteres forbundet til cellemonolaget og / eller transporteres til basolateral kammeret under cellene. Ytterligere bestemmelse av fri ^125I tillater subtraksjon av det degraderte fraksjon og estimering av belagt NC transport. Mekanismen for transport er videre undersøkt ved å studere forandringer i permeabiliteten barriere med hensyn til paracellular rute, gjennom parameterne som er beskrevet ovenfor, mens transcellular transport blir bestemt ved å undersøke forandringer i transport når moduler veier av endocytose og transcytosis.

ontent "> Disse metoder gir verdifull informasjon angående cellulær barrieremodeller, grad og hastighet for transport av en medikamentavgivelsessystem, og mekanismen for slik transport, til sammen tillater evaluering av potensialet for levering av legemidler over cellebarrierer.

Protocol

En. Dyrkning en celle med ett lag i Transwell Setter

1. I et sterilt, biosikkerhet nivå to cellekultur hette, legg 0,8 mm pore PET Transwell inserts inn i en 24-brønns plate (4 brønner per tilstand, for statistisk signifikans) med tang. Alle materialer som går panseret bør steriliseres med etanol.

Merk: Porestørrelsen av filteret må velges i samsvar med gjennomsnittsstørrelsen av NC anvendes, for å tillate transport over membranen. Også for statistisk signifikante resultater, krever at hver eksperimentell tilstand minst fire gjentakelser (brønner) i det samme eksperimentet, og et minimum av tre uavhengige eksperimenter.

2. Forbered cellekulturmedium inneholdende DMEM-medium supplert med 4,5 g / l glukose, 15% føtalt bovint serum og 1% Pen Strep, og oppvarm til 37 ° C i et vannbad.
3. Fortynne menneskelig epitelial kolorektal adenokarsinom (Caco-2) celler i celle medium og sted200-400 pl av celleløsningen inn i den øvre (apikale) kammer av Transwell innsats, med en tetthet på 1,5 x 10 ⁵ celler / cm ^2. Fyll den nedre (basolateral) kammer med 700-900 pl av cellemediet.
4. Kultur-celler ved 37 ° C, 5% _CO2 og 95% fuktighet i 16 til 21 dager, og erstatte mediet i det øvre og nedre kammer hver 3-4 dager, ved hjelp av de volumer som er angitt i trinn 1.3. Skift medium i følgende rekkefølge for å opprettholde trykket over (i stedet for nedenfor) blir cellemonoskiktet: aspirere mediet fra det nedre kammer, aspirere mediet fra det øvre kammer, fylles det øvre kammer med friskt medium, og fyller det nedre kammer med friskt medium.

2. Validering av GI Epiteliale Permeabilitet Barrier Bruke Transepithelial Elektrisk Resistance (Teer) og Immunostaining av trange veikryss

1. For kort tid (mindre enn 2 uker), senk STX100 elektroder i en elektrolytt løsningsjon (0,1-0,15 M KCl eller NaCl). Koble elektrodeledningen til elektroden porten på EVOM volt-ohm-meter, slik at systemet er internt kortsluttet og elektroden symmetri opprettholdes. For langtidslagring, skyll med dH ₂ O og lagre på et tørt, mørkt tilstand.
2. For å sterilisere elektrodene, nedsenkes i etanol i 15 minutter og tillates å lufttørke i 15 sek. Alternativt kan elektrodene være lagret i en UV-hette. Skyll elektrodene i en steril elektrolytt-løsning (fosfatbuffersaltoppløsning, PBS) eller 0,1 til 0,15 M KCl eller NaCl-løsning, før hver motstandsmåling.
3. Med volt-ohm meter satt til motstanden innstilling, vertikalt plassere elektrodene i en brønn som inneholder Transwell innsats, med den korte elektrode i det øvre kammer og den lange elektrode i det nedre kammer berører bunnen av brønnen. Når EVOM lesing stabiliserer seg, spille inn motstandsverdien (gitt i ohm, Ω) for hver brønn.
4. Beregn resistivitet (resistance normalisert til området; Ω cm x ²⁾ av prøvene ved å subtrahere bakgrunns motstand (teer av Transwell innsatser uten celler) og multiplisere med membranoverflateareal. Resistivitet verdier er oftest rapportert i litteraturen. (Se diskusjon)
5. Gjenta målinger hver 1-2 dager før Teer verdier opphav til et maksimum og platå, indikerer dannelsen av en permeabilitet barriere, noe som vanligvis tar 2-3 uker fra tidspunktet for celle Platting. Plateau teer verdier og tiden som er nødvendig for å oppnå barriereintegritet, kan variere i henhold til celle passasje nummer.
6. For å bekrefte tilstedeværelsen av tett veikryss i cellemonolagene med høy teer (lik eller høyere enn terskelverdien for barrieredannelse), fikse-celler ved inkubasjon med kald 2% paraformaldehyd i 15 min. Deretter vaskes cellene med PBS og inkubere dem i 30 minutter ved romtemperatur med 1 pg / ml anti-occludin. Vask cellene igjen med PBS og inkubere dem i 30 minutter ved romtemperatur med 7,5 ug / ml fluorescently-merket sekundære antistoffer. Bruk brønner med lavt teer som en negativ kontroll for barrieredannelse.

Merk: I stedet for anti-occludin, kan antistoffer mot alternative tight junction proteiner anvendes.

7. Avgiftsdirektoratet nøye filteret membran på som den faste monolayer er festet, og festes oppå lysbilder for bildebehandling bruker epifluorescence eller konfokalmikroskopi.

Tre. Vurderer Transepithelial Transport av Målrettede Carriers

1. Merk den rettet antistoff (mus monoklonalt antistoff mot ICAM-1, anti-ICAM, i dette eksempel) med ¹²⁵ I, som tidligere beskrevet ^7.. Bruk Bradford assay for å beregne proteinkonsentrasjon og en gammateller for å bestemme ¹²⁵ I-innhold på antistoffet, og deretter beregne den spesifikke aktiviteten i tellinger per minutt (CPM) / mg av merket antistoff.

Merk: For å kontrollere for spesifisitet, reGjenta fremgangsmåten med merking mus IgG, noe som vil bli brukt til å tilberede ikke-målrettede belagte sokkelen. Å studere transport av en terapeutisk last, gjenta prosedyren merking av last, for eksempel, alfa-Galactosidase (α-Gal) i dette eksemplet. Alternativer kan benyttes for målretting middel, ikke-spesifikt kontroll eller terapeutisk last. Alternative fremgangsmåter kan også benyttes til å merke forbindelser og beregne konsentrasjonen av de merkede motparter.

2. Par den merkede rettet antistoff (anti-ICAM i vårt eksempel) til overflaten av sokkelen. I dette eksemplet, inkuber polystyren nanobeads (100 nm i diameter) i 1 time ved romtemperatur med ¹²⁵ I-anti-ICAM å tillate overflate adsorpsjon, som beskrevet ^7..

Merk: For ikke-spesifikk kontroll bruke ¹²⁵ I-IgG. Å spore transport av en last, bruker en kombinasjon av målretting antistoff og ¹²⁵ I-merket last (α-Gal i vårt eksempel).

3. Sentrifuger ved 13000 x g i 3 minutter, og fjerne de ikke-belagte motstykker i supernatanten ved aspirasjon. Resuspender pelleten inneholdende belagte norsk sokkel ved hjelp av 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved pipettering, og sonicate ved lav effekt for å forstyrre eventuelle partikkelaggregater (20-30 korte pulser).
4. For karakterisering NC, måle størrelse, polydispersitet og ζ-potensialet av belagte partikler ved hjelp av dynamisk lysspredning (etter leverandørens instruksjoner), og kvantifisere antallet av ¹²⁵ I-merket målretting antistoffmolekyler (for eksempel anti-ICAM) på partikkeloverflaten ved hjelp av en gammateller.

Merk: Disse fremgangsmåter kan gjentas for ikke-spesifikke og terapeutisk motstykker. Størrelsen av belagte partikler varierer rundt 200 nm.

5. Legg ¹²⁵ I-antistoff norsk sokkel (f.eks ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS, 56 nCi / ml) til det øvre kammeret ovenfor konfluente Caco-2 monolayers med Teer &# 8805; 350 Ω × cm ² (se diskusjon) over bakgrunnen (16-21 dager etter seeding). Inkuber ved 37 ° C i en eller flere ønskede tidsintervaller. Mål Teer (punkt 2.3) før og etter inkubasjon å vurdere virkningene av norsk sokkel på permeabilitet barriere.

Merk: Denne prosedyren kan gjentas for uspesifikke og terapeutiske kolleger.

6. Samle medium fra de øvre og nedre kammere og vaskes én gang med 0,5 ml DMEM ved 37 ° C (øvre kammer) eller 1 ml dH ₂ O (nedre kammer). Samle vaskinger for måling av den totale radio-isotop-innhold ved bruk av en gammateller.
7. For måling av cellefraksjonen, skjære den gjennomtrengelige filter, f. eks ved hjelp av et barberblad for å skjære rundt kantene, og inkuberes i en gammateller rør med 1% Triton X-100 i 10 minutter (for å frigjøre celleinnhold), før målecellen -forbundet total radioaktivitet.
8. For å måle ¹²⁵ jeg releaset fra norsk sokkel under transport eller på grunn av potensiell degradering, første mix 300 mL av prøven (fra øvre, nedre, eller celle fraksjoner) med 700 mL av 3% BSA i PBS og 200 mL trikloreddiksyre (TCA). Inkuber ved romtemperatur i 15 min. I mellomtiden denne periode måles den totale radioaktiviteten av denne prøven i en gammateller.
9. Sentrifuger TCA prøvene ved 3000 xg i 5 min for å skille intakt protein (pellet) fra det degraderte proteiner eller ^125. I fraksjon (supernatant). Kvantifisere radioaktivitet av gratis ¹²⁵ jeg brøk og trekker denne verdien fra total radioaktivitet målt før sentrifugering. Dette vil gi mengden av merket protein som ikke er forringet.

4. Mechanism of Transepithelial Transport av Målrettede nanocarriers

1. Etikett albumin med ¹²⁵ jeg som beskrevet i kapittel 3.1 og tidligere rapportert ^syv.

Merk: Albumin er et 66,5kDa protein og dermed en forholdsvis stor substans. Selv om en gyldig styre for passiv transport av større gjenstander (f.eks 200 nm norsk sokkel brukes her), bør den være substituert med mindre inerte markørmolekyler ved å studere transport av mindre stoffbærere (se diskusjon).

2. Å vurdere paracellular transport med albumin paracellular lekkasje, kultur Caco-2 monolayers på Transwell inserts som beskrevet ovenfor.
3. Til det øvre kammer medium over cellemonolaget, legge til enten ¹²⁵ I-albumin alene (negativ kontroll som viser at basalnivået for lekkasje), eller ¹²⁵ I-albumin og ikke-radiomerket antistoffrettet norsk sokkel (som beskrevet i avsnitt 3.5). Inkuber ved 37 ° C for den valgte tidsintervall (s), som skal matche de undersøkt ved testing NC transport. Mål teer (avsnitt 2.3) før, under og etter inkubasjon, og samle alle fraksjoner for total ^125I og fri ^125I målinger som indikert. § 3 Merknad: Samtidig tilsetning av ¹²⁵ I-albumin og ikke-radioaktivt merket kontroll IgG-NCS som kan bli brukt som en kontroll.
4. Som en positiv kontroll for åpning av intercellulære veikryss, tilsett cellemedier inneholdende 5 mM H ₂ O ₂ til det øvre og nedre kammer av Transwell innsatsen, og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. Deretter måler Teer (punkt 2.3) og legge ¹²⁵ I-albumin til det øvre kammeret for de valgte tidsintervaller. Mål teer ved forskjellige tidspunkter i løpet av inkuberingen for å identifisere teer verdi forråtnelse forårsaket av H ₂ O _2-indusert åpning av celle veikryss.
5. I parallelle eksperimenter, evaluere transcellular transport, også kalt transcytosis, av ¹²⁵ I-målrettede norsk sokkel ved å ruger konfluente Caco-2 monolayers med enten 50 mikrometer monodansylcadaverine (MDC; hemmer av clathrin endocytose), 1 mg / ml Filipp (hemmer av caveolar endocytose), 0,5 mikrometer Wortmanni (inhibitor av fosfatidylinositol 3-kinase [PI3K], som er involvert i macropinocytosis) eller 20 pM [5 - (N-etyl-N-isopropyl) amilorid] (EIPA, hemmer av macropinocytosis og CAM-mediert endocytose ^15).

Merk: ¹²⁵ I-IgG norsk sokkel og ¹²⁵ I-albumin kan anvendes som negative kontroller for virkningen av disse inhibitorer, og andre metoder (for eksempel siRNA teknikker) kan gi mer selektiv hemming.

6. Mål teer (avsnitt 2.3) før, under og etter inkubering av cellene med inhibitorer og radiomerkede materialer, som en ytterligere kontroll for virkningen av inhibitorer på monolag permeabilitet.

Representative Results

Som validering av vår celle modell for å studere transepithelial transport av målrettede NCs, Figur 2 viser at Caco-2 celle monolayers belagt med en tetthet på 1,5 × 10 ⁵ celler / cm ² nådde samløpet ~ Dag 12 og vedlikeholdt monolayer integritet opp til dag 18, angitt med Teer (Figur 2A). Dette ble bekreftet ved tilstedeværelse av occludin-positive tett veikryss (figur 2B) i monolag med høy teer (390 Ω x cm ^2, dag 14), sammenlignet med dårlig tight junction merking ved lav teer (17 Ω x cm ^2, Dag 5 ).

Frembringelse av det radioaktive merke på NC-elementer bestemmer den totale mengden av disse komponentene (NC rettet antistoff eller last) først tilsatt til den apikale kammer, deres celle assosiert fraksjon, og deres fraksjon transporteres til basolateral side. Disse verdiene kan brukes til å beregne ulike parametere som beskriver NC transport i enMer relevant måte, spesielt etter subtraksjon av fri ^125I innholdet i hver fraksjon, som representerer degraderte motstykker. For eksempel er antallet antistoff-molekyler, last-molekyler, eller tilhørende norsk sokkel som er tverrgående cellemonolaget kan beregnes for å estimere absolutte transport. Også den prosentandel av nevnte molekyler eller NCS som transporteres til basolateral side i forhold til det totale antall molekyler eller NCS knyttet til cellemonolaget, beregner effektiviteten av nevnte transport. Endelig er den tilsynelatende permeabilitet koeffisient (P _app), en standard parameter for graden av transport, kan estimeres. Disse parametrene blir beregnet som følger:

Molekyler transporteres eller NCS fraktet = CPM _basolateral × (Molekyler _lagt eller NC _lagt / CPM _lagt)
% molekyler eller NCS fraktet = 100 x [CPM _basolateral / (CPM _basolateral + CPMcellefraksjon)]
P _app (cm / s) = (CPM _basolateral × vol.) / (A × t × CPM _lagt)

hvor CPM er ¹²⁵ I tellinger per minutt innført i det øvre kammeret (CPM _tilsatt), blir cellemonoskiktet fraksjon (CPMcell fraksjon) eller det nedre kammer (CPM _basolateral) og NC _tilsatt eller Molekyler _tilsatt er antallet NCS eller molekyler som opprinnelig tilsatt til det øvre kammer, er en overflatearealet av filtermembranen (cm ^2), vol. er volumet av mediet i det øvre kammeret (ml), og t er tiden for inkubasjon (e).

I vårt eksempel, når den radioaktive isotopen merking targeting antistoff, avslører denne analysen graden og effektivisering av transport i form av antistoffer eller NCS transporteres per celle og prosentandel av cellemonolag-assosierte antistoffer eller NCS som ble transportert (figur 3A og 3B ), som vill som frekvensen av transport i form av _P-app (Figur 3D). Disse parametrene, anslått i eksempelet for ¹²⁵ I-anti-ICAM sokkelen ble også sammenlignet med de av kontroll ^125I-IgG norsk sokkel for å demonstrere transporteffektivitet i forhold til et ikke-målrettet motstykke (figur 3C og 3D).

Når radioaktiv markør er innlemmet på NC last, de beskrevne parametre reflekterer transport av lasten, som i vårt eksempel var α-Gal enzym, anvendes for behandling av en genetisk lysosomal lagringsforstyrrelse kjent som Fabrys sykdom (tabell 1). I tillegg til å beregne NC transport ved å spore sa last, transepithelial levering av denne terapeutiske enzymet kan anslås, for eksempel ved å uttrykke det som molekyler eller masse av α-Gal transporteres per celle.

Endelig attributter denne metoden transportveien til paracellular ruten ellertranscellular rute. For eksempel, i vårt eksempel, reduseres EIPA transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM norsk sokkel på tvers av Caco-2-cellemonolagene (Figur 4a), mens MDC, Filipp og Wortmannin ikke transportnivået reduseres med hensyn til styretilstand (ingen inhibitor ). Dette tyder på at anti-ICAM NCs utnytte CAM-mediert endocytose for transcellular transport, men ikke clathrin-, caveolar-eller macropinocytosis relaterte transcytosis. Videre ble paracellular transport utelukkes ved hjelp av målinger av teer (figur 4B) og et albumin passiv transport (fig. 4C), hvorved en nedgang i teer og en økning i albumin paracellular lekkasje inn i det nedre kammer under transport av anti-ICAM norsk sokkel ville indikert forstyrrelse av inter veikryss. Imidlertid inkubasjon med anti-ICAM norsk sokkel forandret ikke teer or ¹²⁵ I-albumin paracellular lekkasje i løpet av en periode på 48 timer, på samme måte å styre IgG norsk sokkel som ikke transporteres. Somen positiv kontroll for åpning av celle veikryss og paracellular transport, H ₂ O ₂ redusert teer til basalnivåer og vesentlig forbedret ¹²⁵ I-albumin lekkasje til basolateral kammeret.

Figur 1. Skjematisk av transepithelial transport av målrettede nanocarriers over en gastrointestinal epitel modell. (A) Som en plattform for å studere transepithelial transport, Caco-2 celle monolayers dyrkes på Transwell innskuddene til et stramt monolayer er dannet (16-21 dager etter såing, Teer ≥ 350 Ω × cm ² over bakgrunnen). Et eksempel på en medikamentavleverings kjøretøy, slik som ¹²⁵ I-anti-ICAM sokkelen tilsettes til den øvre (apikale) kammer over cellemonolaget for å studere transport over cellene og gjennom det underliggende porøse membranen.Mediet i den nedre (basolateral) kammeret samles så opp for kvantifisering av transportert materiale. (B) Transport gjennom cellemonolag skjer enten via en paracellular eller transcellular / transcytosis rute. Gjengitt fra Ghaffarian et al., J. Kontrollert Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klikk her for å se større figur

Figur 2. Caco-2-monolag som en modell for transepithelial transport. Caco-2-celler ble dyrket i Transwell innsatser på 1,5 x 10 ⁵ celler / cm ^2. (A) Transepithelial elektrisk motstand (teer) ble målt for å vurdere monolag integritet. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM, n = 3. (B) Fluorescensmikroskopi av trange veikryss immunolabeled med anti-occludin og Texas Red-merket sekundært antistoff, på dag 5 eller 14 (lav versus høy Teer verdier, henholdsvis). Gjengitt fra Ghaffarian et al., J. Kontrollert Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klikk her for å se større figur

Figur 3. Transport av anti-ICAM nanocarriers tvers Caco-2 celle monolayers. Confluent Caco-2 monolayers dyrket på Transwell inserts ble inkubert med ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS eller ¹²⁵ I-IgG NCs lagt til den apikale kammeret. (AC) ¹²⁵ Jeg innhold i basolateral kammeret ble målt på de angitte tidspunkter, for å beregne mengden av NCs transported per celle (se Representant Resultater). (B) Prosent av transporterte norsk sokkel ble beregnet som forholdet mellom bærere som finnes i basolateral fraksjon som i de kombinerte basolateral og cellefraksjoner. (D) Tilsynelatende permeabilitet koeffisientene (P _app) ble beregnet som beskrevet i Representant Resultater gjenspeiler utbredelsen av transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS eller ¹²⁵ I-IgG norsk sokkel. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM, n = 4.. Gjengitt fra Ghaffarian et al., J. Kontrollert Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klikk her for å se større figur

Figur 4. Mekanismen for transport av enNTI-Icam nanocarriers tvers Caco-2 monolayers. (A) transcellular transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM NCs tvers konfluente Caco-2 monolayers ble vurdert til 24 timer i fravær eller tilstedeværelse av 20 mikrometer EIPA, 1 mg / ml Filipp, 50 mikrometer MDC, eller 0,5 mikrometer Wortmannin. (B) Teer ble målt under transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM NCs tvers Caco-2 monolayers, for å vurdere paracellular transport. Teer-verdier i fravær av norsk sokkel er vist som kontroller (den stiplede intervall angir SEM av middelverdien). Inkubering med 5 mM H ₂ O ₂ er en positiv kontroll for åpning av intercellulære veikryss. (C) Paracellular proteinlekkasje, målt som den tilsynelatende permeabilitet koeffisient (Papp) av ¹²⁵ I-albumin krysse cellemonolaget i fravær eller i nærvær av 5 mM H ₂ O _2, IgG norsk sokkel, eller anti-ICAM norsk sokkel, ble målt og beregnet som i figur 3.. Dataene er visn som betyr ± SEM, n ≥ 4. Gjengitt fra Ghaffarian et al., J. Kontrollert Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klikk her for å se større figur

	Total norsk sokkel tilknyttet / celle	Intracellulær NCS / celle	Fraktet NCS / celle	% Fraktet	Fraktet α-Gal molekyler / celle × 10 5	pg transportert / celle × 10 -3	Papp (× 10 -8 cm / sek)
3 hr	663,4 ± 116,0	434,0 ± 76,8	243.6 ± 15,4	44,4 ± 6,7	1,8 ± 0,2	9.7 ± 1.2	8.1 ± 1.1
24 timer	2024,8 ± 409,3	1218,9 ± 255,6	806,9 ± 164,1	40,6 ± 2,0	3,9 ± 0,5	21,3 ± 2,5	1.9 ± 0.4
NCS = nanocarriers; α-Gal = α-galaktosidase, Total NCs assosiert / cellen = Intracellulær NCs / celle + NCs transportert / celle;% Fraktet = (NCS transportert / Total NCs tilhørende) × 100, P-app = tilsynelatende permeabilitet koeffisient (cm / s). Se Metoder for ytterligere beskrivelse av disse parametrene. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 8 brønner), (-TNF-α Caco-2-celler).

Tabell 1. Transepithelial transport av α-Gal av anti-ICAM nanocarriers. Transcellular transport av anti-ICAM / ¹²⁵ I-α-Gal NCs tvers conflytende Caco-2 monolayers ble vurdert til 3 timer og 24 timer. Radioisotop innhold av apikale, basolateral, og celle fraksjonene ble omgjort til ulike verdier som er relevante for transport, som beskrevet i Representant Resultater. Gjengitt fra Ghaffarian et al., J. Kontrollert Rel. 163 (1), 25-33 (2012).

Discussion

Ved hjelp av de metoder som er omtalt ovenfor, kan en cellemodell for å studere transport av målrettede norsk sokkel på tvers av cellebarrierer bli etablert, slik som eksemplet gitt for Caco-2 epitelceller, som er relevante for å evaluere transport fra GI lumen inn i blod i det tilfellet orale medikamentleveringssystemer. Dyrking av GI epitelial cellemonolagene i Transwell inserts aktivert måling av Teer og fluorescens farging av trange veikryss for å bekrefte dannelsen av en celle permeabilitet barriere. Senere, radiomerking av målretting og terapeutiske midler med ¹²⁵ jeg gitt rask og sensitiv kvantifisering av målrettede NCS inn i og på tvers av GI cellemonolagene. Til slutt ble det mekanistiske studier påføres med endocytiske hemmere, Teer, og en albumin paracellular lekkasje analyse for å vurdere om transporten skjer gjennom en vesicular rute versus en paracellular rute.

En viktig parameter i å etablere tilsvarende modeller is valg av en celletype, som skal reflektere den fysiologiske natur av cellebarrieren under studien. Ulike epiteliale og endotelceller fra human eller animalsk opprinnelse er kommersielt tilgjengelig ^16,18-20. Disse kan dyrkes alene som enkelt kulturer som er beskrevet her, eller som co-kulturer av disse cellene med andre celletyper (f.eks slim-sekresjon celler, immunceller, pericytes osv.) ^16,18-20. I et slikt co-kultur skjema, kan Transwell innsatsforhold moduleres for å justere de respektive vekstrater og krav til differensiering faktorer i cellen media ^16,18-20. For eksempel kan en blod-hjerne-barriere-modellen omfatter ko-kultivering av hjerne mikrovaskulære endotelceller og astrocytter eller pericytes på den motsatte overflaten av det porøse filter, og de ​​respektive media for hver celletype skal plasseres i hvert kammer ^19.. I tillegg, avhengig av cellelinjen, ekstracellulære matriks-komponentene kan bli required for effektiv cellebinding til det porøse membran ^18-20. Det er viktig å tenke at hver enkelt modell vil gjengi ulike basale nivåer med hensyn til permeabilitet barriere parametere og transportpriser og mekanismen, dermed kontrollere verdiene må skaffes og disse metodene er optimalisert for hver situasjon.

Transwell inserts for eksempel de som er beskrevet her, har vært mye brukt for å studere transport av materialer på tvers av cellemonolagene, fra den apikale inn en basolateral rommet eller vice versa ^{5,10-12,16,17.} Dette kan ikke oppnås ved å dyrke celler på klassiske brønner eller dekkglass fordi slike systemer utelukke denne formen for transport som de ikke tilbyr to selvstendige avdelinger, og dermed kan ikke gi et realistisk syn på celle sortering. For eksempel kan materialer naturligvis bestemt for frigjøring fra basolateral membranen bli shuntet til andre cellekamre i et dekk modellen, noe som gjør det vanskelig å resolve mekanismen for transcellular transport. Videre, i motsetning til dekkglass, gir Transwell-konfigurasjon fører til fysiologisk relevante funksjoner assosiert med celledifferensiering og membran polaritet ^10,11,16-19. For eksempel, Caco-2 celler dyrket på transwells vise egenskapene til modne enterocytes, inkludert tilstedeværelse av microvilli og trange veikryss, kuppel formasjon, og produksjon av børstesømmen enzymer ^10,11,17. Andre parametere kan indusere en mer fysiologisk relevant fenotype, slik som skjærspenning i tilfelle av GI-epitelceller (f.eks slim flyt-og sammentreknings-bevegelser), og vaskulære endoteliale celler (for eksempel blodstrømmen), som kan anvendes i transwells ved hjelp av omrøring eller pumper ^{10 , 16,} og ko-kulturer for å produsere den nødvendige vekst-og differensieringsfaktorer for visse celletyper ^16,18-20. Likevel må man vurdere at cellelinjer ofte avvike fra cellene i kroppens vev, e. G. De kan uttrykke bestemte determinanter på ulike nivåer, og dermed presentere varierte funksjoner og forskrifter. For eksempel, Caco-2-celler ikke inneholder alle transportørproteiner og enzymer som er nødvendige for aktivering og transport av orale legemiddel in vivo, slik som CYP3A4, et medikament-metaboliserende enzym ^10,17,23. I disse tilfeller kan cellelinje sub-kloner, transfeksjon, eller tilsetning av transkripsjonelle midler anvendes modulere cellelinje som bedre reflekterer fysiologiske betingelser ^17,23,24.

Ved valg av en optimal Transwell-modell, må de ulike funksjonene i permeable filteret tas i betraktning. Utette filtre er tilgjengelig i forskjellige pore størrelser, alt 0,4 til 8 mikrometer, og må romme størrelsen på transportert gods. For eksempel, er mindre porestørrelser (0,4 til 3 mikrometer) som typisk benyttes for studier av transport av små kjemiske forbindelser, mens porene 3 mikrometer eller større anvendes for celle invasjon, chemotaxis, og motilitet studier der mikrobiell, er immun, og migrerende celler transporteres. Pore ​​størrelse og tetthet påvirker også celletetthet og differensiering, som noen celler kan migrere gjennom porene på seeding, utelukker monolayer formasjon. I tillegg er materialet i den gjennomtrengelige støtte påvirker bildeklarhet, for vurdering av cellenes levedyktighet og monolayer formasjon, og celleadhesjon. Polyetylen-tereftalat (PET) filtre er gjennomsiktig, slik at sikten i henhold til fasekontrastmikroskopi, i motsetning til gjennomsiktig polykarbonatfiltere. For forbedret cellefesting, permeable bærere belegges på forhånd med kollagen eller fibronectin er kommersielt tilgjengelige. Videre kan filter diameter, som er justert for ulike brønners plater, påvirke permeabilitet, hvorved større diameter (for eksempel i 6-brønners plater) har en tendens til å øke paracellular leakiness av cellemonolaget.

Når en Transwell-modellen er etablert, inkludert det hensiktste utvalg av celletype og-sammensetning, og gjennomtrengelige filter, kan statusen til cellemonolaget bli vurdert i løpet av dyrkingen og eksperimentelle trinn som benytter teer. Men Teer verdier varierer med 1) medfødte biologiske faktorer assosiert med celletype, kilde, og passasje nummer, 2) dyrkningsforhold, som for eksempel de nevnte Transwell egenskaper, seeding tetthet, dager i kultur, media sammensetning og pH, 3) fysiske faktorer , slik som temperatur, mediavolum, prøvetagningsplan, og graden av agitering / vasking, og 4) patologiske og / eller kjemiske faktorer som modulerer cellekoplings integritet (f.eks cytokiner, immunceller, oksidativt stress, farmakologiske additiver, etc.) ^{10, 16,17.} På grunn av de ulike biologiske og miljømessige faktorer som påvirker Teer, minimum grunnverdi som indikerer barriere dannelse må etableres for hvert system med regelmessig overvåking Teer under kultur periode og etter eksperimentelle manipulasjoner. VaLues som anses tilstrekkelig for barrieredannelse, som kan variere mellom 150-1,600 Ω x cm ^{2 16,} også være avhengig av størrelsen av stoffet som skal transporteres slik at passive paracellular diffusjon av stoffet er begrenset, mens teer ≥ 350 Ω x cm ² ser ut til å utelukke passiv diffusjon av relativt store NCs som de som vises her (200 nm), kan dette ikke være tilfelle for mindre narkotikaleveringssystemer, der strammere monolayers (f.eks ≥ 700 Ω × cm ²⁾ må fylles ut. Denne grunnverdi kan også bli vurdert ved hjelp av kontroller for å forstyrre permeabilitet barriere, inkludert H ₂ O _2, gjennomtrengende peptider, kalsium kelater (f.eks EDTA), protein kinaser og fosfataser, og diverse andre regulatoriske molekyler ^25-27.

Komplementær til Teer, mange permeabilitet analyser eksisterer for å verifisere monolayer integritet og vurdere paracellular transport. Som albumin, andre membran-ugjennomtrengelig tracer molekyler av forskjellige størrelser, som for eksempel mannitol, lucifer gule, inulin og dextraner, som kan være kombinert med en UV, fluorescerende eller radioaktiv markør for å måle og sammenligne gjennomtrengningshastigheter (P _app) å kjent Verdiene for disse solutes. Ved vurdering paracellular transport, er det viktig å bruke en tracer-molekyl som er mindre enn den transporterte forbindelse som studeres. For eksempel vil paracellular transport av 200 nm-partikler åpne intercellulære veikryss nok til å forårsake paracellular lekkasje av mindre, men likevel forholdsvis store molekyler, slik som albumin brukt i eksemplet. I kontrast, bør paracellular transport av mindre narkotika levering kjøretøy som dendrimers (~ 5 nm) skal evalueres ved hjelp av molekyler <5 nm, som mannitol. Paracellular lekkasje studier indikerer derfor størrelsen på cellen krysset åpning, men på grunn av lang inkubasjonstid de ikke kan identifisere forbigående forstyrrelser av celle juncsjoner.

En annen modus for å vurdere barriereintegritet er å image de trange veikryss som kobler tilstøtende celler. I denne studien immunostained vi occludin for fluorescens mikroskopi, men forskjellige andre proteiner som er tilstede i tight junction kan anvendes for denne analysen, blant annet transmembrane proteiner av koblings adhesjonsmolekyl (JAM), claudin og occludin familier. Her, beiset vi den ekstracellulære domenet til å omgå en permeabilization skritt, men intracellulære domener kan også være farget. Påbygging til dette er bruken av kontroller for ikke-spesifikk farging, ved hjelp av fluorescerende sekundære antistoffer bare, fravær av trange veikryss (her brukte vi celler med en monolayer som viser lav Teer), eller avbrudd av trange veikryss ved hjelp av koblings-modulerende midler oppført ovenfor.

I vårt eksempel på transepithelial transport bruker vi ICAM-1-målrettet norsk sokkel, men Transwell systemet rommer også transport av annen medikamentell kjøretøy formulerings, terapeutiske og diagnostiske sammensetninger, medfødte forbindelser som finnes i legemet, eller en kombinasjon av de ovennevnte, med verdifulle konsekvenser for kliniske studier eller forståelsen av de grunnleggende veier. Metodene vi beskriver å kvantifisere transport over cellemonolagene innebærer radioisotop merking av målretting middel eller terapeutisk lasten i NC pels, men denne strategien kan også brukes til å spore norsk sokkel med forskjellige kjemikalier og strukturer, blant lineære eller forgrenede polymerer, dendrimers, partiklene , miceller, liposomer, etc. ^4,5,28,29. Forskjellige isotoper (for eksempel ¹²⁵ I, ³ H, ³² P, etc.) er tilgjengelige for å kvantifisere transport av et bredt spekter av både små og store molekyler: ikke bare legemiddelbærer, men også kjemiske og biologiske behandlingsformer, uten å påvirke den funksjonelle eller strukturelle integriteten det sammensatte, i motsetning til store fluorescerende etiketter. Radiomerking gir større kvantitativ følsomhet og hastighet i forholdmed andre strategier som måler transport, for eksempel gel-elektroforese, PCR, massespektrometri, HPLC, og fluorescens-spektrometri. Denne etiketten kan også brukes til å bestemme graden av nedbrytning (f.eks protein målretting middel og last i vårt eksempel) ved å vurdere fritt jod-innhold, som er rask og nøyaktig i forhold til alternative protein aktivitetsmålinger, inkludert UV-spektrofotometri og Western blot. Ettersom fritt jod ikke helt gjenspeiler endringer i protein konformasjon eller aktivitet som kan forekomme i fravær av nedbryting, de ovennevnte alternative metoder kan benyttes for ytterligere å evaluere integriteten av transportert materiale. Også, ved administrering av forbindelsene med frie radioisotoper til den apikale kammeret, er det uklart hvorvidt etiketten finnes i cellemonolaget og transportert fraksjoner resultat av virkelige proteinnedbrytning, eller diffusjon av fritt jod fra apikal verdensrommet. For å omgå denne begrensningen, den apikale NC konsentrasjon kananvendes for et kort tidsintervall for å tillate tilknytning til cellemonolaget, etterfulgt av fjerning av den apikale medium i bytte for friskt medium, og en chase periode for å vurdere transport. Selv om en mengde gratis radioisotoper fra den opprinnelige bassenget kan i utgangspunktet lekke inn i de andre fraksjonene, kan denne verdien bestemmes ut fra prøvene uten jage periode og trekkes fra tilstander som involverer en jakt periode.

I forhold til vurderingen av mekanismen for transport, de samme metodene som er beskrevet for å validere monolayer integritet (Teer, lekkasje analyser, og tight junction flekker) kan brukes til å evaluere paracellular rute. For transcellular transport, farmakologiske hemmere av determinanter involvert i intracellulær trafficking (f.eks transferrin knyttet til clathrin trasé, kolera toksin B knyttet til caveolar veier, etc.) kan brukes, hvor effektive konsentrasjoner å spesifikt hemmer disse determinants trenger to bli belyst for hvert system. Alternativer til de hemmere som brukes i vår studie omfatter klorpromazin og kalium utarming, spesifikk for clathrin-avhengig endocytose, og genistein og metyl-β-syklodekstrin (MβCD), spesifikt for caveolae-mediert opptak ^30. Andre strategier som kan unngå potensielle ikke-spesifikke virkninger av farmakologiske inhibitorer omfatter ko-lokalisering av transportert gods med disse determinanter ved bruk av fluorescens-eller radioisotop merking, anvendelse av spesifikke ligander som kontroller (f.eks transferrin eller koleratoksin B, som angitt ovenfor), og siRNA til knockdown uttrykk for regulatoriske elementer av disse banene.

I denne studien, demonstrerer vi ligninger for å konvertere radioaktivitet data til ulike parametere som gir nøkkelen foreløpig informasjon om transepithelial transport. For eksempel er graden av transepithelial transport representert ved NCS eller molekyler som transporteres pr celle, effektiviteten i transport av innholdet som binder eller inngår celler er representert ved prosentandel av celleassosierte NCS eller molekyler som transporteres, og hastigheten av transport, noe som gir mulighet for sammenligning av permeabilitet mellom forskjellige oppløste stoffer, er representert ved P _ca. For å forstå den potensielle av målrettede sokkelen i stor skala levering av terapeutiske midler (f.eks dosen som er nødvendig for in vivo-administrering), kan disse ligninger modifiseres for å estimere transport verdier på en makroskopisk skala. For eksempel kan mengden av en terapeutisk last transporteres per enhet overflateareal av tarmvevet (mg / cm ^2), så vel som potensialet for arrangementet på tvers av mage-tarmkanalen til en pasient som beregnes fra følgende ligninger,
Mass last transportert / cm ² vev = (CPM _basolateral / Specific Activity) / A
Mass last transporteres over tynntarm = [(CPM _basolateral / Specific Activity) × TA] / A

ve_content "> hvor den spesifikke aktiviteten representerer den målte CPM / masseenhet av lasten (se protokoll, trinn 3.1), og TA representerer det totale absorberende overflaten av tynntarmen (2000000 cm ^2). Derfor er data som resulterer fra våre fremgangsmåter får stige til et bredt spekter av mulige kvantitative analyser som beskriver transport i relevante betingelser.

Fremme av Transwell innsatser, modeller som bedre reflekterer den fysiologiske kompleksiteten av transport omfatter "Ussing" kamre og microfluidic enheter, som gir dynamisk fluidstrømning, og en inneholdt kammer som minimaliserer kontakt med luft, slik som i blodkar. Disse modellene også tillate vev eksplantater å dyrkes for ex vivo studier, før validering in vivo ^17,18.

I konklusjonen, har de metoder som brukes i denne studien gitt verdifull foreløpig informasjon om transport av en modell for levering av legemidler, i form av efficieNCY, over cellemonolagene. Ved hjelp av denne cellekulturmodell vi vist potensialet av ICAM-1-målrettet nanocarrier-plattformen i forbindelse med muntlig stoff levering, banet vei for senere in vivo studier, men kan tilpasses andre systemer som krever transport over mobilnettet barrierer som finnes i legeme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90