Summary
Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.
Abstract
Portadores Sub-micrométricas (nanocarriers; CN) aumentar a eficácia de medicamentos, melhorando a solubilidade, estabilidade, tempo de circulação, segmentação, e solte. Além disso, atravessar barreiras celulares no corpo é crucial tanto para a administração oral de CNs terapêuticos para a circulação e transporte a partir do sangue para os tecidos, onde é necessária a intervenção. NC transporte através de barreiras celulares é conseguido por: (i) a via paracelular, através de disrupção transitória das junções que interligam as células adjacentes, ou (ii) a via intracelular, onde os materiais são internalizados por endocitose, transportado através do corpo da célula e secretados na superfície da célula oposta (transyctosis). Entrega através de barreiras celulares pode ser facilitada pelo acoplamento terapêutica ou dos seus transportadores com agentes de direccionamento que se ligam especificamente a marcadores da superfície celular envolvidas no transporte. Aqui, nós fornecemos métodos para medir a extensão e mecanismo de transporte NC através de uma barreira celular modelo, which consiste em uma monocamada de gastrintestinal (GI), as células epiteliais cultivadas em uma membrana porosa localizada em um transwell insert. Formação de uma barreira de permeabilidade é confirmado pela medição da resistência transepitelial elétrica (TEER), o transporte transepitelial de uma substância de controle e imunomarcação de junções apertadas. Como um exemplo, 200 ~ CNs polímero nm são utilizados, que transportam uma carga terapêutico e são revestidos com um anticorpo que tem como alvo um determinante da superfície celular. O anticorpo ou carga terapêutico é marcado com 125I, para um rastreio de radioisótopos e CNs marcadas são adicionadas à câmara superior sobre a monocamada de células durante períodos de tempo variáveis. CNs associados para as células e / ou transportadas para a câmara subjacente pode ser detectada. Medição de livre 125 I permite a subtração da fração degradada. A via paracelular é avaliada determinando mudanças potenciais causados pelo transporte NC para os parâmetros de barreira descritos acima. Transcelular i transportes determinado, abordando o efeito de modular endocitose e transcitose caminhos.
Introduction
Barreiras celulares no corpo agir como um gateway entre o ambiente externo e compartimentos internos. Este é o caso para o forro epitelial que separa a superfície exterior exposta do tracto gastrointestinal (GI) e pela corrente sanguínea 1-3. Barreiras celulares também representar a interface entre o sangue e o parênquima e os componentes celulares de tecidos e órgãos. Este é o caso para o interior do forro endotelial nos vasos sanguíneos, tais como a barreira sangue-pulmão, a barreira sangue-cérebro, etc 1 A capacidade de ultrapassar estas barreiras celulares no corpo é crucial para a entrega eficaz dos agentes terapêuticos e de diagnóstico para a circulação e tecidos / órgãos onde é necessária intervenção.
Para melhorar a entrega de agentes terapêuticos ou de diagnóstico, estes compostos podem ser carregados em nanocarriers sub-micrométricas (CN). Estes veículos de entrega de droga pode ser formulado com uma variedade dequímicas e estruturas para otimizar a solubilidade de drogas, proteção, farmacocinética, liberação, metabolismo e 4,5. CNs também pode ser funcionalizada com afinidade ou porções de direccionamento (por exemplo, anticorpos, péptidos, aptâmeros, açúcares, etc), para facilitar a aderência às áreas do corpo em que é necessária a acção terapêutica 2,6. Segmentação de CNs para determinantes expressas na superfície de barreiras celulares podem facilitar ainda mais o transporte para dentro e / ou através destes forros 2,6.
O papel do transporte seletivamente substâncias entre dois ambientes exige certas características únicas entre as camadas de células. Uma tal característica é a polaridade da célula, pelo que a membrana apical voltada para o lúmen das cavidades varia de membrana basolateral orientada para o interstício de tecidos, no que diz respeito à morfologia e composição de lípidos, transportadores e receptores de membrana 2. Outra característica envolve junctio intercelularns conectam células adjacentes. Regulamento das proteínas que formam junções apertadas, moléculas de adesão particularmente juncional (compotas), occludins e claudinas, modular a função de barreira para permitir seletivamente ou não transporte de substâncias entre as células, conhecidas como transporte paracelular, permitindo a passagem de materiais do lúmen para o espaço basolateral 3. A ligação de vários elementos naturais e sintéticos (leucócitos, moléculas, partículas e sistemas de entrega de drogas) para barreiras celulares no corpo pode induzir a abertura de alvéolos-junção, que podem ser transiente e relativamente inócuo ou mais prolongada e, portanto, com o acesso de inseguro substâncias indesejáveis através da barreira 2,5,7-9. Por conseguinte, esta via pode ser avaliada pela medição da resistência eléctrica transepitelial (TEER) e difusão paracelular passiva de moléculas (aqui chamado vazamento paracelular), pelo que diminui a resistência à passagem da corrente eléctrica ou aumento de vazamento paracelular de um inert composto no espaço basolateral indicar abertura de junções intercelulares, respectivamente 5,10,11. Para complementar estes métodos, qualquer uma das proteínas de junção apertadas listados acima podem ser coradas para avaliar a sua integridade, em que a coloração deve aparecer concentrada nas fronteiras célula-célula toda à volta da periferia da célula 5,10,12.
Alternativamente, os sistemas de entrega de drogas que têm como alvo os determinantes da superfície celular específicos, tais como aqueles associados a poços revestidos por clatrina ou invaginações da membrana em forma de balão chamados caveolae, pode provocar absorção vesicular nas células por endocitose, proporcionando uma via para a entrega de drogas para compartimentos intracelulares 5, 13. Além disso, a endocitose pode levar ao tráfico de vesículas em todo o corpo da célula para a liberação no lado basolateral, um fenômeno conhecido como transyctosis ou transporte transcelular 14. Portanto, o conhecimento da cinética e mecanismo de endocitose podem ser utilizadas para explorar um intracelularnd entrega da droga para o espaço intracelular, o que oferece um modo relativamente seguro e controlado de entrega em comparação com a via paracelular. (Endocitose como é o caso da molécula de adesão celular (CAM) mediada) O mecanismo de endocitose podem ser avaliadas com moduladores de vias clássica (clathrin e endocitose mediada por caveolina e macropinocitose) ou rotas não-clássicos 5,13,15 .
Considerando que o tráfico intracelular é frequentemente estudados em poços de padrão ou lamelas, a ausência de um compartimento basolateral opõe polarização celular e a capacidade para estudar o transporte ao longo das camadas de células. Para superar esse obstáculo, o transporte através monocamadas de células tem sido estudada usando transwell insere 10,11,16,17, que consistem em uma câmara superior (apical), uma membrana permeável poroso onde as células unir e formar uma monocamada apertado, e um menor (basolateral) câmara (Figura 1). Nesta configuração, o transporte pode ser medido noapical-para-basolateral direcção através da administração de um tratamento para a câmara superior, na sequência de transporte, através da monocamada de células e membrana porosa subjacente, e por fim recolhendo o meio na câmara inferior de quantificação de material transportado. De transporte na direcção basolateral-para-apical, também pode ser medido por administração inicial para a câmara inferior e subsequente recolha da câmara superior 5,10,12,16. Existem várias técnicas para verificar a formação da barreira de permeabilidade em transwells, incluindo TEER e ensaios de transporte paracelular, como descrito acima. Além disso, o filtro permeável no qual as células são cultivadas, pode ser removida para análise de imagens (por exemplo, por fluorescência, confocal, microscopia electrónica), como uma validação adicional do modelo de monocamada de células, bem como o mecanismo de transporte. A selecção do tipo de membrana, que está disponível em diferentes tamanhos de poros, os materiais, e áreas de superfície, depende de vários factors como o tamanho de substâncias ou objetos a serem transportados, tipo de célula, e método de imagem 16,18-20. Transwell inserções também facilitar a quantificação controlada e precisa de transporte em comparação com sistemas de mamíferos complexos, como os volumes das câmaras e área de superfície celular são constantes conhecidas. Embora muitos fatores envolvidos na in vivo de entrega são eliminadas, incluindo a presença de muco intestinal, tensão de cisalhamento, enzimas digestivas, células do sistema imunológico, etc, esta pequena escala modelo in vitro fornece informações preliminares úteis sobre transporte.
Como exemplo para ilustrar a adaptação destes métodos para estudar o transporte NC através das barreiras celulares 10,11,16,17, descrevemos aqui um caso em que o potencial de transporte NC através do epitélio GI foi modelada por avaliar passagem de um modelo de entrega de drogas sistema através de uma monocamada de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano (Caco-2), as células. Para este fim, cvaras foram cultivados em inserções Transwell, numa poro de tereftalato 0,8 mM de polietileno (PET) de filtro (6,4 mm de diâmetro), que é transparente e pode ser usado para geração de imagens de microscopia. O estado da barreira de permeabilidade é validada medindo TEER, transporte apical-para-basolateral de uma substância de controlo, albumina, e a visualização de microscopia de fluorescência de um elemento das junções apertadas, ocludina proteína. Um modelo de polímero alvo NF é usado, consistindo de 100 nm, as nanopartículas de poliestireno não-biodegradáveis. CNs são revestidas por adsorção de superfície com um anticorpo alvo sozinho ou uma combinação de um anticorpo e uma carga alvo terapêutico, em que um ou outro componente pode ser marcado com 125I, para um rastreio de radioisótopos. No exemplo escolhido, o anticorpo reconhece molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma proteína expressa sobre a superfície de GI epitelial (e outros), as células, que foram mostrados para facilitar o transporte intracelular e o espaço intracelular transportadores de drogas e suas cargas de f 21. A carga é alfa-galactosidase (α-Gal), uma enzima terapêutica utilizada para o tratamento da doença de Fabry, uma doença de armazenamento lisossómico genético 22.
Os CNs revestidos, de cerca de 200 nm de tamanho, são adicionados à câmara de apical sobre a monocamada celular e incubados a 37 ° C durante diferentes períodos de tempo, depois do que 125 I em CNs podem ser detectados associados à monocamada de células e / ou transportada para a câmara inferior basolateral das células. Determinação adicional de 125 I livre permite a subtração da fração degradada e estimativa de transporte NC revestido. O mecanismo de transporte é avaliada por meio de análise de alterações na permeabilidade da barreira pertencente à via paracelular, através dos parâmetros descritos acima, enquanto que o transporte transcelular é determinada por análise de alterações no transporte quando modulando vias de endocitose e transcitose.
ONTEÚDO "> Esses métodos fornecem informações valiosas sobre os modelos de barreira celular, a extensão ea taxa de transporte de um sistema de entrega de drogas, eo mecanismo desse transporte, permitindo completamente avaliação do potencial de liberação de fármacos através das barreiras celulares.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura de uma monocamada de células em inserções Transwell
- Em uma estéril, o nível de biossegurança 2 célula cultura capuz, coloque 0,8 milímetros de poros PET transwell inserções em uma placa de 24 poços (4 poços por condição, para significância estatística) com uma pinça. Todos os materiais que entram na capa deverá ser esterilizada com etanol.
Nota: O tamanho do poro do filtro deve ser escolhido de acordo com o tamanho médio da NC usado, para permitir o transporte através da membrana. Além disso, para obter resultados estatisticamente significativos, cada condição experimental requer um mínimo de quatro repetições (poços) dentro da mesma experiência, e um mínimo de três experiências independentes.
- Preparar o meio de cultura de células contendo meio DMEM suplementado com 4,5 g / L de glicose, 15% de soro fetal bovino e 1% Pen Strep, e aquecer a 37 ° C em um banho de água.
- Diluir adenocarcinoma colorretal epitelial humano (Caco-2) células em meio celular e lugar200-400 uL da solução das células na (apical) câmara da inserção transwell superior, a uma densidade de 1,5 x 10 5 células / cm 2. Encha a câmara inferior (basolateral) com 700-900 mL de meio de celular.
- As células de cultura a 37 ° C, 5% de CO 2, e 95% de humidade durante 16-21 dias, substituindo o meio na câmara superior e inferior em cada 3-4 dias, utilizando os volumes indicados no passo 1.3. Substituir meio da seguinte forma a manter a pressão acima (em vez de seguir) a monocamada de células: aspirar o meio a partir da câmara inferior, aspirar o meio a partir da câmara superior, encher a câmara superior com meio fresco, e preencher a câmara inferior com meio fresco.
2. Validação do GI permeabilidade da barreira epitelial Usando resistência elétrica transepitelial (TEER) e imunocoloração de junções apertadas
- Para o armazenamento de curto prazo (menos de 2 semanas), submergir eletrodos STX100 em uma solução eletrolíticação (0,1-0,15 M KCl ou NaCl). Ligue o cabo do eléctrodo para o eléctrodo de porta no medidor EVOM volt-ohm, de modo que o sistema é internamente em curto-circuito e o eléctrodo é mantido simetria. Para o armazenamento a longo prazo, lavar com dH 2 O e armazenar em uma condição seca, escura.
- Para esterilizar os eletrodos, imerso em etanol por 15 minutos e deixar secar ao ar por 15 s. Em alternativa, os eléctrodos podem ser armazenados em uma capa de UV. Lave os eletrodos em uma solução estéril eletrólito (solução salina tampão fosfato, PBS) ou 0,1-0,15 solução M KCl ou NaCl, antes de cada medição de resistência.
- Com o medidor volt-ohm para definir a configuração da resistência, colocar verticalmente eléctrodos num poço contendo o inserto transwell, com o curto eléctrodo na câmara superior e a longo eléctrodo na câmara inferior de tocar no fundo do poço. Uma vez que a leitura EVOM estabiliza, registre o valor da resistência (dada em ohms; Ω) para cada poço.
- Calcule resistividade (resisce normalizada para a área; Ω × cm 2) de amostras subtraindo resistência fundo (TEER de inserções transwell sem células) e multiplicando por área de superfície da membrana. Os valores da resistividade são mais frequentemente descritos na literatura. (Ver discussão)
- Repetir a medição a cada 1-2 dias, até que os valores TEER origem a um patamar máximo e, indicando a formação de uma barreira de permeabilidade, o que normalmente demora de 2-3 semanas a partir do momento do plaqueamento das células. Valores e tempo necessário para atingir a integridade da barreira Planalto Teer pode variar de acordo com o número de passagens celular.
- Para verificar a presença de junções apertadas em monocamadas de células com elevado TEER (igual ou superior ao valor limiar para a formação da barreira), fixar as células por incubação com frio de paraformaldeído a 2% durante 15 min. Em seguida, lavar as células com PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com 1 ug / mL de anti-occludin. Lavar as células novamente com PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com 7,5 ug / ml de fanticorpos secundários luorescently-rotulados. Use poços com baixo TEER como um controlo negativo para a formação da barreira.
Observação: Como um substituto para o anti-ocludina, podem ser utilizados anticorpos para as proteínas de junção alternativos apertados.
- Extirpar cuidadosamente a membrana do filtro em que a monocamada fixo está ligado, e montar em lâminas para imagens utilizando epifluorescência ou microscopia confocal.
3. Avaliando Transepitelial transporte das companhias alvo
- Rotular o anticorpo (anticorpo monoclonal de rato contra ICAM-1, anti-ICAM, neste exemplo) a segmentação com 125 I, tal como descrito anteriormente 7. Use ensaio de Bradford para estimar a concentração de proteína e um contador gama para determinar o teor de 125I no anticorpo, em seguida, calcular a actividade específica, em contagens por minuto (CPM) / mg de anticorpo marcado.
Nota: Para controlar a especificidade, reRepita o processo de etiquetagem por IgG do rato, que será utilizado para preparar CNs revestidos não-alvo. Para estudar o transporte de uma carga terapêutico, repetir o procedimento de etiquetagem de carga, por exemplo, alfa-galactosidase (α-Gal), neste exemplo. As alternativas podem ser utilizados para o agente de direccionamento, o controlo não específico, ou de carga terapêutico. Métodos alternativos podem também ser utilizados para marcar compostos e estimar a concentração dos homólogos marcados.
- Par o direccionamento do anticorpo marcado (anti-ICAM, no nosso exemplo) para a superfície de NCs. Neste exemplo, incubar nanobeads de poliestireno (diâmetro de 100 nm) durante 1 hora à temperatura ambiente com 125I-anti-ICAM para permitir a adsorção de superfície, como descrito 7.
Nota: Para o controlo de não-específica utilizar 125I-IgG. Para rastrear o transporte de uma carga, use uma combinação de segmentação de anticorpos e 125 marcados com carga I (α-Gal no nosso exemplo).
- Centrifugar a 13.000 xg durante 3 min e remover os homólogos não-revestidos no sobrenadante por aspiração. Ressuspender o sedimento contendo CNs revestidos usando 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por pipetagem, e sonicado de baixa potência para perturbar os agregados de partículas potenciais (20-30 breves pulsos).
- Para caracterização, NC, medir o tamanho, polidispersidade e ζ potencial de partículas revestidas, utilizando dispersão de luz dinâmica (seguindo as instruções do fornecedor), e quantificar a quantidade de 125I-marcado alvo (por exemplo, moléculas de anticorpo anti-ICAM) na superfície da partícula usando um contador gama.
Nota: Estes métodos podem ser repetidos para homólogos não-específicos e terapêuticos. O tamanho das partículas revestidas varia em torno de 200 nm.
- Adicionar 125 CNs I-anticorpo, (por exemplo, 125 I-anti-ICAM; NCs 56 nCi / ml) para a câmara superior por cima confluentes monocamadas Caco-2 com TEER &# 8805; 350 Ω × cm 2 (ver discussão) sobre o fundo (16-21 dias pós-semeadura). Incubar a 37 ° C durante uma hora ou mais intervalos desejado. Meça TEER (Seção 2.3), antes e após a incubação para avaliar os efeitos de CNs na barreira de permeabilidade.
Nota: Este procedimento pode ser repetido para homólogos não-específicos e terapêuticos.
- Recolha de meio, as câmaras superiores e inferiores e lavá-los uma vez com 0,5 ml de DMEM a 37 ° C (câmara superior) ou 1 ml de dH2O (câmara inferior). Recolher as lavagens para a medição do teor total de radioisótopo utilizando um contador gama.
- Para a medição da fracção de células, excisar o filtro permeável, por exemplo, utilizando uma lâmina de barbear para cortar em torno das arestas, e incubam-se num contador gama com tubo de 1% de Triton X-100 durante 10 min (para libertar o conteúdo das células), antes de medir a célula -associado radioactividade total.
- Para medir 125 I rearrendadas de CNs durante o transporte ou devido a potencial degradação, primeira mistura 300 mL de amostra (das fracções superiores, inferiores, ou celulares), com 700 mL de 3% BSA em PBS e 200 mL de ácido tricloroacético (TCA). Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Entretanto, este tempo, medir a radioactividade total da amostra em um contador gama.
- Centrifugar as amostras TCA a 3000 xg durante 5 minutos para separar a proteína intacta (pelete) a partir da proteína degradada ou 125I fracção (sobrenadante). Quantificar a radioatividade da fração livre de 125 I e subtrair esse valor de radioatividade total medido antes da centrifugação. Isto irá fornecer a quantidade de proteína marcada que não se degrada.
4. Mecanismo de Transepitelial Transporte de nanocarriers alvejados
- Etiqueta albumina com 125 I, como descrito na Seção 3.1 e relatado anteriormente 7.
Nota: A albumina é um 66.5kDa e, por conseguinte, uma parte relativamente grande da substância. Embora um controle válido para o transporte passivo de objetos maiores (por exemplo, 200 CNs nm usado aqui), ele deve ser substituído por moléculas menores traçadores inertes quando se estuda o transporte de portadores de drogas menores (ver Discussão).
- Para avaliar o transporte paracelular usando vazamento paracelular albumina, de cultura de monocamadas Caco-2 em inserções Transwell como descritos acima.
- Para o meio de câmara superior por cima da monocamada de células, adicionar ou 125I-albumina (controlo negativo que mostra o nível basal de vazamento), ou 125 CNs alvo-anticorpo I-albumina e não-marcados (como descrito na Secção 3.5). Incubar a 37 ° C para o intervalo selecionado de tempo (s), que deve coincidir com os examinados ao testar transporte NC. Meça TEER (Seção 2.3), antes, durante e após a incubação, em seguida, recolher todas as frações para total de 125 I e gratuitos 125 medições I, conforme indicado. na Seção 3 Nota: adição concomitante de 125 de controlo I-albumina e não radiomarcado CNs IgG pode ser usado como um controlo.
- Como um controlo positivo para a abertura de junções intercelulares, adicionar meio celular contendo 5 mM de H 2 O 2 para as câmaras superiores e inferiores da inserção transwell, e incubar a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, meça TEER (Seção 2.3) e adicionar 125 I-albumina para a câmara superior para os intervalos de tempo selecionados. Medir TEER em vários pontos de tempo ao longo da incubação para identificar o valor TEER deterioração causada por H 2 O 2-induzida abertura das junções celulares.
- Em experiências paralelas, avaliar o transporte transcelular, também chamado transcitose, de 125 CNs I-alvejados por incubação confluentes monocamadas Caco-2 com 50 uM monodansylcadaverine (MDC; inibidor de endocitose mediada por clatrina), 1 ug / ml Filipin (inibidor de caveolar endocitose mediada), Wortmann 0,5 fiMem (inibidor de fosfatidilinositol 3-quinase [PI3K], envolvido em macropinocitose), ou 20 pM [5 - (N-etil-N-isopropil) amilorida] (EIPA, inibidor da macropinocitose e mediada por CAM endocitose 15).
Nota: 125I-IgG CNs e 125I-albumina podem ser utilizados como controlos negativos para o efeito destes inibidores, e outros métodos (por exemplo, técnicas de siRNA) pode proporcionar a inibição mais selectiva.
- Medir TEER (secção 2.3), antes, durante e após a incubação de células com inibidores e materiais radioativos, como um controlo adicional para o efeito dos inibidores sobre a permeabilidade monocamada.
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Representative Results
Como validação do nosso modelo de célula para estudar o transporte transepitelial de CNs segmentados, a Figura 2 mostra que monocamadas Caco-2 de células plaqueadas a uma densidade de 1,5 x 10 5 células / cm 2 atingiram a confluência ~ Dia 12 e mantida a integridade monocamada até ao Dia 18, indicado por TEER (Figura 2A). Isto foi validado pela presença de junções apertadas occludin-positivo (Figura 2B) em monocamadas com alta TEER (390 Ω × 2 cm, dia 14), em relação à má rotulagem apertado junção em baixo TEER (17 Ω × 2 cm, Dia 5 ).
O rastreio do marcador radioactivo em elementos NC determina a quantidade total desses componentes (NC alvo do anticorpo ou de carga) inicialmente adicionadas à câmara apical, a sua fracção de célula associada, e a sua fracção transportado para o lado basolateral. Estes valores podem ser usados para calcular os vários parâmetros que descrevem o transporte NC numaforma mais relevante, particularmente após a subtração de livre conteúdo 125 I de cada fração, o que representa homólogos degradadas. Por exemplo, o número de moléculas de anticorpos, moléculas de carga, ou que são associados CNs transversal da monocamada de células pode ser calculados para estimar o transporte absoluto. Além disso, a percentagem das ditas moléculas ou CN, que é transportado para o lado basolateral, em relação ao número total de moléculas ou NCs associados à monocamada de células, calcula a eficiência do referido transporte. Finalmente, o coeficiente de permeabilidade aparente (P app), um parâmetro padrão para a taxa de transporte, pode ser estimada. Estes parâmetros são calculados como se segue:
Moléculas transportado ou CNs transportado = × basolateral CPM (Moléculas adicionado ou NC adicionado / CPM adicionado)
moléculas ou CNs% transportado = 100 x [CPM basolateral / (CPM basolateral + CPMfracção de células)]
Aplicativo P (cm / s) = (CPM basolateral × vol.) / (A × t × CPM adicionado)
onde CPM são o 125 I contagens por minuto adicionadas à câmara superior (CPM adicionado), a fracção de monocamada de células (fracção CPMcell), ou a câmara inferior (CPM basolateral), e adicionou-NC ou moléculas são adicionados o número de CNs ou moléculas inicialmente adicionadas à câmara superior, A é a área de superfície da membrana de filtro (cm2), vol. é o volume do meio na câmara superior (ml), e t é o tempo de incubação (s).
No nosso exemplo, quando o isótopo radioactivo é etiquetar o anticorpo alvo, esta análise revela o grau e eficiência de transporte em termos de anticorpos ou NCs transportados por células e percentagem de anticorpos ou CNs que foram transportadas associadas a monocamada de células (Figura 3A e 3B ), como nósll como a taxa de transporte em termos de P aplicativo (Figura 3D). Estes parâmetros, calculados no nosso exemplo para 125 CNs I-anti-ICAM, foram também comparados com os de controle 125I-IgG CNs para demonstrar a eficiência do transporte em relação a um homólogo não-alvo (Figura 3C e 3D).
Quando o marcador radioactivo é incorporado na carga NC, os parâmetros descritos reflectir transporte de carga, que no nosso exemplo foi a enzima α-Gal, utilizado para o tratamento de um distúrbio do armazenamento lisossomal genética conhecida como doença de Fabry (Tabela 1). Além de calcular transporte NC traçando disse carga, entrega transepitelial desta enzima terapêutico pode ser estimada, por exemplo, expressando-o como moléculas ou massa de α-Gal transportado por célula.
Finalmente, este método atribui o percurso de transporte para a via paracelular ou orota transcelular. Por exemplo, no nosso exemplo, EIPA reduzida de transporte de 125 CNs I-anti-ICAM através monocamadas Caco-2 de células (Figura 4A), ao passo que MDC, Filipin, e wortmanina não reduziu os níveis de transporte no que diz respeito à condição de controlo (sem inibidor ). Isto sugere que CNs anti-ICAM utilizar endocitose mediada por CAM para o transporte transcelular, mas não clathrin-, caveolar-ou transcitose relacionados com macropinocitose. Além disso, o transporte paracelular foi excluída usando medições de TEER (Figura 4B) e um transporte passivo de albumina (Figura 4C), em que uma diminuição da TEER e um aumento no vazamento paracelular albumina na câmara inferior, durante o transporte de CNs anti-ICAM teria perturbação indicada de junções intercelulares. No entanto, a incubação com anti-ICAM CNs não alterou TEER ou 125 vazamento paracelular I-albumina ao longo de um período de 48 h, semelhante ao controle CNs IgG que não são transportados. Comocontrolo positivo para a abertura das junções de células e transporte paracelular, H 2 O 2 diminuiu TEER aos níveis basais e significativamente melhorada 125 vazamento I-albumina para a câmara basolateral.
Figura 1. Esquema de transporte transepitelial de nanocarriers direcionados através de um modelo epitelial gastrointestinal. (A) como uma plataforma para estudar o transporte transepitelial, Caco-2 monocamadas de células são cultivadas em inserções transwell até uma monocamada apertado é formado (16-21 dias pós-semeadura, TEER ≥ 350 Ω × cm 2 sobre o fundo). Um exemplo de um veículo de entrega de drogas, tal como 125 I-CN anti-ICAM, é adicionado ao (apical) câmara superior por cima da monocamada de células a estudar o transporte através células e através da membrana porosa subjacente.O meio na câmara inferior (basolateral) é então recolhido para quantificação do material transportado. (B) O transporte através da monocamada de células ocorre, quer através de uma rota paracelular ou transcelular / transcitose. Reproduzido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).. Clique aqui para ver maior figura
Figura 2. Monocamadas Caco-2 como modelo para o transporte transepitelial. Células Caco-2 foram cultivadas em inserções Transwell de 1,5 × 10 5 células / cm 2. (A) resistência elétrica transepitelial (TEER) foi medida para avaliar a integridade monocamada. = 3 N, os dados são apresentados como médias ± SEM. (B) A microscopia de fluorescência de junções apertadas immunolabeled com anti-ocludina e anticorpo secundário marcado com vermelho do Texas, nos dias 5 e 14 (baixa em relação aos valores elevados TEER, respectivamente). Reproduzido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).. Clique aqui para ver maior figura
Figura 3. Transporte de nanocarriers anti-ICAM através monocamadas Caco-2 de células. Confluentes monocamadas Caco-2 cultivadas em inserções Transwell foram incubadas com 125 I-CN anti-ICAM ou 125I-IgG CNs adicionada à câmara apical. (AC) 125 conteúdo que eu na câmara basolateral foi medida nos momentos indicados, para calcular a quantidade de CNs transported por célula (ver resultados representativos). (B) por cento de CNs transportados foi calculado como a razão dos transportadores encontrados na fracção basolateral para que nas fracções celulares basolaterais e combinadas. (D) os coeficientes de permeabilidade aparente (app P) foram calculados conforme descrito na resultados representativos, refletindo as taxas de transporte de 125 CNs I-anti-ICAM ou 125 I-IgG CNs. Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 4. Reproduzido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).. Clique aqui para ver maior figura
Figura 4. Mecanismo de transporte de umnanocarriers nti-ICAM através monocamadas Caco-2. (A) o transporte intracelular de 125 CNs I-anti-ICAM através confluentes monocamadas Caco-2 foi avaliada às 24 horas na ausência ou na presença de 20 uM EIPA, 1 ug / ml Filipin, 50 mM MDC, ou 0,5 mM wortmanina. (B) TEER foi medida durante o transporte de 125 CNs I-anti-ICAM através monocamadas Caco-2, para avaliar o transporte paracelular. Os valores TEER na ausência de CNs são mostradas como controlos (o intervalo tracejado assinala SEM do valor médio). A incubação com 5 mM de H 2 O 2 é um controlo positivo para a abertura de junções intercelulares. (C) proteína vazamento paracelular, medida como o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) de 125I-Albumina de atravessar a monocamada de células na ausência ou na presença de 5 mM de H 2 O 2, IgG CNs, ou anti-ICAM CNs, foi medido e calculado como na Figura 3. dados são mostradosn como média ± SEM, n ≥ 4. Reproduzido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).. Clique aqui para ver maior figura
| Total de CNs associado / célula | Intracelular CNs / célula | Transportado CNs / célula | Transportado% | Moléculas de α-Gal Transportados / célula × 10 5 | pg transportado / célula × 10 -3 | Papp (x 10 -8 cm / seg) | |
| 3 hr | 663,4 ± 116,0 | 434,0 ± 76,8 | 243.6 ± 15,4 | 44,4 ± 6,7 | 1,8 ± 0,2 | 9,7 ± 1,2 | 8,1 ± 1,1 |
| 24 hr | 2024,8 ± 409,3 | 1218,9 ± 255,6 | 806,9 ± 164,1 | 40,6 ± 2,0 | 3,9 ± 0,5 | 21,3 ± 2,5 | 1,9 ± 0,4 |
| NCs = nanocarriers; α-Gal = α-galactosidase; total CNs associado / célula = + CNs intracelular CNs / celulares transportado / celular;% Transportado = (CNs transportado / Total CNs associada) × 100; P app = coeficiente de permeabilidade aparente (cm / s). Ver métodos para descrição mais detalhada destes parâmetros. Os dados são apresentados como médias ± SEM (n = 8 poços); (-TNF-α células Caco-2). | |||||||
Tabela 1. Transporte transepitelial de α-Gal por nanocarriers anti-ICAM transporte. Transcelular de anti-ICAM / 125 I-α-Gal CNs através confluentes monocamadas Caco-2 foi avaliado em 3 horas e 24 horas. Radioisótopos conteúdo de frações apical, basolateral e celulares foram convertidas em vários valores relevantes para o transporte, conforme descrito em resultados representativos. Reproduzido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012).
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Discussion
Utilizando os métodos discutidos acima, um modelo celular para estudar o transporte de CNs orientadas através das barreiras celulares pode ser estabelecida, tal como o exemplo dado para Caco-2 de células epiteliais, o que é relevante para a avaliação do transporte a partir do lúmen GI para a corrente sanguínea, no caso dos sistemas de distribuição de drogas orais. A cultura de monocamadas de células epiteliais GI em inserções transwell medição de TEER e fluorescência imunocoloração de junções apertadas habilitado para confirmar a formação de uma barreira de permeabilidade celular. Posteriormente, de marcação de alvos e agentes terapêuticos com 125 I, desde a quantificação rápida e sensível de CNs direcionados para dentro e através de GI monocamadas celulares. Finalmente, estudos mecanicistas foram aplicados usando inibidores de endocitose, TEER, e um ensaio de fugas paracelular albumina para avaliar se ocorre o transporte através de uma rota vesicular contra uma via paracelular.
Um parâmetro importante no estabelecimento de modelos similares is a seleção de um tipo de célula, o que deve refletir a natureza fisiológica da barreira celular em estudo. Várias células epiteliais e endoteliais de origem humana ou animal são comercialmente disponíveis 16,18-20. Estes podem ser cultivadas por si só como culturas individuais, como descrito aqui, ou como co-culturas destas células com outros tipos de células 16,18-20 (por exemplo, células imunes, pericitos, etc muco-secretores). Nesta forma de co-cultura, transwell condições de inserção pode ser modulada para ajustar as respectivas taxas e exigências de crescimento para factores de diferenciação nos meios celulares 16,18-20. Por exemplo, um modelo de barreira sangue-cérebro pode envolver co-cultura de células endoteliais microvasculares cerebrais e astrócitos pericitos ou na superfície oposta do filtro poroso, e os respectivos suportes para cada tipo de célula deve ser colocado em cada uma das câmaras 19. Além disso, dependendo da linha celular, componentes da matriz extracelular podem ser required para a fixação de células eficazes para a membrana porosa de 18-20. É importante considerar que a cada modelo particular irá processar diferentes níveis basais em relação aos parâmetros de barreira de permeabilidade e das taxas de transporte e mecanismo, portanto, controlar os valores têm de ser obtidos e esses métodos optimizados para cada situação.
Transwell inserções, tais como as descritas aqui, tem sido amplamente utilizado para estudar o transporte de materiais através de monocamadas de células, do meio apical para um compartimento basolateral ou vice-versa 5,10-12,16,17. Isso não pode ser alcançado através da cultura de células em poços clássicos ou lamelas, pois tais sistemas impede esta forma de transporte como eles não oferecem dois compartimentos independentes e, portanto, não pode dar uma visão realista da separação de células. Por exemplo, materiais naturalmente destinados a libertação a partir da membrana basolateral pode ser desviado para outros compartimentos celulares em um modelo de lamela, o que torna difícil a resolve o mecanismo de transporte transcelular. Além disso, em contraste com lamelas, a configuração transwell dá origem a características fisiologicamente relevantes associadas com a diferenciação celular e de polaridade da membrana 10,11,16-19. Por exemplo, a células Caco-2 cultivadas em transwells exibem as características dos enterócitos maduras, incluindo a presença de microvilosidades e junções estanques, a formação de cúpula, e a produção de enzimas da borda em escova 10,11,17. Outros parâmetros podem induzir um fenótipo mais fisiologicamente relevante, tais como a tensão de corte, no caso de células epiteliais gastrointestinais (por exemplo, movimentos contrácteis de fluxo de muco e) e células endoteliais vasculares (por exemplo, fluxo do sangue), que pode ser aplicado em transwells utilizando agitação ou bombas 10 , 16, e co-culturas para produzir o necessário crescimento e fatores de diferenciação para determinados tipos de células 16,18-20. No entanto, é preciso considerar que as linhas de células, muitas vezes diferem das células nos tecidos do corpo, e. G. Eles podem expressar certas determinantes em diferentes níveis e, portanto, apresentam funções e regulamentos variados. Por exemplo, a células Caco-2 não conter todas as proteínas transportadoras e as enzimas necessárias para a activação e o transporte de terapias orais in vivo, tal como a CYP3A4, uma enzima do metabolismo de drogas 10,17,23. Nestes casos, a linha de células de sub-clones, transfecção, ou adição de agentes de transcrição pode ser usada a linha celular de modular a reflectir melhor condições fisiológicas 17,23,24.
Ao selecionar um modelo transwell ideal, deve ser levado em conta as diversas características do filtro permeável. Permeáveis filtros estão disponíveis em diferentes tamanhos de poros, que vão 0,4-8 mM, e deve acomodar o tamanho da carga transportada. Por exemplo, os tamanhos de poro mais pequenos (0,4-3 uM) são tipicamente usados para os estudos de transporte de compostos químicos pequenos, ao passo que poros de 3 um ou maiores são usadas para a invasão celular, chemotaxis e estudos de motilidade em que microbiana, células do sistema imunológico, e que migram são transportados. O tamanho dos poros e densidade também afeta a densidade ea diferenciação celular, como algumas células podem migrar através de poros após a semeadura, impedindo a formação de monocamada. Além disso, o material de suporte a influências clareza permeável de imagem, para a avaliação da viabilidade das células e formação de monocamada, e a fixação das células. O tereftalato de polietileno (PET) filtros são transparentes, permitindo a visibilidade sob microscopia de contraste de fase, em contraste com filtros de policarbonato translúcido. Para a fixação de células aumentada, suportes permeáveis previamente revestidas com colagénio ou fibronectina estão disponíveis comercialmente. Além disso, o diâmetro do filtro, a qual é ajustada para diferentes placas assim, podem influenciar a permeabilidade, através do qual os diâmetros maiores (por exemplo, em placas de 6 poços) tendem a aumentar leakiness paracelular da monocamada de células.
Uma vez que um modelo transwell é estabelecida, incluindo o dotaseleção te do tipo de célula, composição de mídia, e filtro permeável, o status da monocamada de células podem ser avaliadas durante o cultivo e estágios experimentais usando TEER. Entretanto, os valores variam de acordo com Teer 1) fatores inatos biológicos associados com o tipo de célula, a fonte eo número de passagens, 2) condições de cultura, tais como as características acima mencionadas transwell, densidade de semeadura, dias em cultura, composição de mídia e pH, 3) fatores físicos , tais como a temperatura, volume do meio, esquema de amostragem, e grau de agitação / lavagem, e 4) patológicos e / ou químicos que modulam a integridade celular (por exemplo, citocinas junção, as células imunitárias, o stress oxidativo, aditivos farmacológicos, etc) 10, 16,17. Devido aos vários fatores biológicos e ambientais que afetam TEER, um valor mínimo de referência indicando deve ser estabelecida a formação de barreira para cada sistema, monitorando regularmente TEER durante o período de cultura e depois de manipulações experimentais. Valores que sejam consideradas adequadas para a formação da barreira, que pode variar entre 150-1,600 Ω × 16 cm 2, dependem também do tamanho da substância a ser transportada de modo que a difusão paracelular passiva de substâncias que é restrito, enquanto que TEER ≥ 350 Ω × cm 2 parece impedir a difusão passiva de relativamente grandes CNs, como os mostrados aqui (200 nm), isso pode não ser o caso dos sistemas de distribuição de drogas menores, em que são necessários monocamadas mais apertadas (por exemplo, ≥ 700 Ω × cm 2). Este valor de referência também pode ser avaliada utilizando os controlos para perturbar a barreira de permeabilidade, incluindo H 2 O 2, penetrando péptidos quelantes de cálcio (por exemplo, EDTA), as proteínas cinases e fosfatases, e várias outras moléculas reguladoras 25-27.
Complementar a TEER, existem muitos ensaios de permeabilidade para verificar a integridade de monocamada e avaliar transpo paracelularrt. Tal como albumina, outras moléculas marcadoras de membrana impermeável de vários tamanhos, tais como manitol, Amarelo Lúcifer, inulina, e dextranos, o qual pode ser acoplado com um UV, fluorescente, ou radioactivo para medir e comparar as taxas de permeabilidade (P app) para conhecida Os valores para estes solutos. Ao avaliar o transporte paracelular, é importante o uso de uma molécula de marcador que é menor do que o composto transportado sob estudo. Por exemplo, o transporte paracelular de 200 nm partículas abriria junções intercelulares suficientes para causar vazamento de paracelular, ainda moléculas ainda menores relativamente grandes, tais como albumina usado em nosso exemplo. Em contraste, o transporte paracelular de veículos menores de distribuição de drogas, tais como dendrímeros (~ 5 nm) deve ser avaliada usando moléculas <5 nm, como o manitol. Estudos de fuga paracelular, portanto, indicar o tamanho da abertura de junção celular, mas devido a longos períodos de incubação que não podem identificar as interrupções transitórias de junção celularções.
Outro modo de avaliar a integridade da barreira é a imagem das junções apertadas que conectam células adjacentes. Neste estudo, foram imunocoradas occludin para a microscopia de fluorescência, no entanto, várias outras proteínas presentes na junção apertado pode ser utilizado para esta análise, incluindo as proteínas de transmembrana da molécula de adesão de junção (JAM), claudina, e as famílias occludin. Aqui, nós manchado o domínio extracelular para ignorar um passo permeabilização, mas domínios intracelulares também pode ser manchada. Complementar a isso é o uso de controles para a coloração não específica, utilizando anticorpos secundários fluorescentes só, ausência de junções apertadas (aqui, usamos células com uma monocamada mostrando baixo TEER) ou ruptura de junções apertadas usando os agentes de modulação junção listados acima.
No nosso exemplo de transporte transepitelial usamos CNs 1-alvo-ICAM, mas o sistema transwell também acomoda transporte de outra formulação veículo de drogass, os compostos terapêuticos e de diagnóstico, compostos inatas encontradas no corpo, ou uma combinação dos anteriores, com implicações importantes para estudos clínicos ou compreensão das vias fundamentais. Os métodos aqui descritos para quantificar o transporte através de monocamadas de células envolvem rotulagem radioisótopo do agente de direccionamento ou carga terapêutico no revestimento NC, no entanto, esta estratégia também pode ser utilizada para rastrear CNs com diversos produtos químicos e de estruturas, incluindo polímeros lineares ou ramificados, dendrímeros, partículas , micelas, lipossomas, etc 4,5,28,29. Isótopos diferentes (por exemplo, 125 I, 3 H, 32 P, etc) estão disponíveis para quantificar o transporte de uma ampla gama de pequenas e grandes moléculas: transportadores de drogas não só, mas também terapêutica químicas e biológicas, sem afetar a integridade funcional ou estrutural de o composto, ao contrário das etiquetas fluorescentes volumosos. Radiomarcação proporciona maior sensibilidade e velocidade em comparação quantitativapara outras estratégias que medem o transporte, tais como a electroforese em gel, a PCR, a espectrometria de massa, HPLC e espectrometria de fluorescência. Esta etiqueta pode também ser usada para determinar o grau de degradação (por exemplo, agente de direccionamento de proteínas e de carga, no nosso exemplo), avaliando o conteúdo de iodo livre, que é rápida e precisa em relação a ensaios de actividade de proteínas alternativos, incluindo espectrometria de UV e Western blot. No entanto, uma vez que o iodo livre não reflectirem alterações na conformação ou actividade que possa ocorrer na ausência de degradação da proteína, os métodos alternativos listados acima podem ser utilizados para avaliar a integridade dos materiais transportados. Além disso, quando se administram os compostos com radioisótopos livres para dentro da câmara apical, não é claro se o rótulo encontrado na monocamada de células e fracções transportados resultam da degradação de proteína real ou difusão do iodo livre a partir do espaço apical. Para contornar essa limitação, a concentração NC apical podeser aplicada durante um curto intervalo de tempo para permitir a associação para a monocamada de células, seguido de remoção do meio apical em troca de meio fresco, e um período de corrida para avaliar o transporte. Apesar de uma quantidade de radioisótopos livres da piscina original pode inicialmente vazar para as outras frações, este valor pode ser determinado a partir de amostras sem período de perseguição e subtraído de condições que envolvem um período de perseguição.
Em termos de avaliação do dispositivo de transporte, os mesmos métodos descritos para validar a integridade monocamada (TEER, ensaios de fuga, e coloração tight junction) pode ser usado para avaliar a via paracelular. Para o transporte transcelular, inibidores farmacológicos dos determinantes envolvidos no tráfico intracelular (por exemplo, a transferrina associada aos caminhos clatrina, a toxina da cólera B associada a vias caveolar, etc) pode ser usado, em que concentrações eficazes para inibir especificamente aquelas determinantes precisa to ser elucidados para cada sistema. Alternativas para os inibidores utilizados no nosso estudo incluem a clorpromazina e depleção de potássio, específicos para a endocitose dependente de clatrina-, e genisteína e metil-β-ciclodextrina (MβCD), específico para a absorção mediada por caveolas 30. Outras estratégias que podem evitar os possíveis efeitos não-específicos de inibidores farmacológicos envolvem co-localização de carga transportada com estes determinantes utilizando fluorescência ou marcação por radioisótopos, a utilização de ligantes específicos como controlos (por exemplo transferrina ou B da toxina da cólera, como indicado acima), e siRNA para knockdown da expressão de elementos reguladores de tais vias.
Neste estudo, demonstramos equações para a conversão de dados de radioatividade de vários parâmetros que fornecem informações preliminares chave sobre transporte transepitelial. Por exemplo, o grau do transporte transepitelial é representado por CN ou moléculas transportadas por célula, a eficiência de transporte dos conteúdos que se liga ou entra nas células é representada em percentagem de CNs associados a células ou moléculas transportadas, e a taxa de transporte, o que permite uma comparação da permeabilidade entre diferentes solutos, é representado por P app. A fim de compreender o potencial de CNs orientadas para entrega em larga escala de agentes terapêuticos (por exemplo, a dose necessária para administração in vivo), estas equações podem ser modificadas para estimar os valores de transporte numa escala macroscópica. Por exemplo, a quantidade de uma carga terapêutico transportado por unidade de área superficial de tecido intestinal (mg / cm 2), bem como o fornecimento de potencial ao longo do tracto GI de um paciente pode ser calculada a partir das seguintes equações,
Massa carga transportada / cm 2 de tecido = (CPM basolateral / Atividade Específica) / A
Massa carga transportada através intestino delgado = [(CPM basolateral / Atividade Específica) × TA] / A
Avançando a partir de inserções transwell, os modelos que melhor reflitam a complexidade fisiológica de transporte incluem câmaras "Ussing" e dispositivos microfluídicos, que fornecem o fluxo de fluido dinâmico e uma câmara contido que minimiza o contato com o ar, como nos vasos sanguíneos. Estes modelos também permitem que explantes de tecido para ser cultivados para estudos ex vivo, antes da validação in vivo 17,18.
Em conclusão, os métodos utilizados neste estudo forneceram informações preliminares valiosas sobre o transporte de um sistema de entrega de drogas modelo, em termos de efficieNCY, através de monocamadas de células. Usando este modelo de cultura de células que demonstraram o potencial da plataforma nanocarrier alvo ICAM-1 no contexto de entrega de droga por via oral, abrindo o caminho para estudos in vivo subsequentes, ainda que possa ser modificado para outros sistemas que requerem o transporte através de barreiras celulares encontrados no corpo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto Médico Howard Hughes e da National Science Foundation para RG, e os fundos atribuídos a SM pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant R01-HL98416) e da American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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