Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Published: October 17, 2013 doi: 10.3791/50638

Summary

تتطلب العديد من التطبيقات العلاجية النقل الآمن والفعال للناقلات المخدرات وحمولتها عبر الحواجز الخلوية في الجسم. توضح هذه المقالة على تكييف أساليب أنشئت لتقييم معدل وآلية نقل nanocarriers المخدرات (NCS) عبر الحواجز الخلوية، مثل الجهاز الهضمي (GI) ظهارة.

Abstract

ناقلات ميكرومتر الفرعية (nanocarriers؛ نكس) تعزيز فعالية الأدوية من خلال تحسين القابلية للذوبان والاستقرار، زمن الدوران، والاستهداف، والافراج عنهم. بالإضافة إلى ذلك، يجتاز الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم لكلا التسليم عن طريق الفم من البلاغات الوطنية العلاجية إلى الدورة الدموية والنقل من الدم إلى الأنسجة، حيث هناك حاجة إلى التدخل. ويتحقق النقل NC عبر الحواجز الخلوية من (ط) الطريق paracellular، عبر تعطيل عابرة من التقاطعات التي التعشيق الخلايا المجاورة، أو (ب) الطريق العابر للخلايا، حيث يتم المنضوية المواد عن طريق الإلتقام، ونقلها عبر خلايا الجسم، ويفرز في المقابل سطح الخلية (transyctosis). تسليم عبر الحواجز الخلوية يمكن أن تيسره اقتران المداواة أو ناقليها مع استهداف وكلاء التي تربط خصيصا لعلامات سطح الخلية المعنية في مجال النقل. هنا، ونحن نقدم أساليب لقياس مدى وآلية النقل NC عبر حاجز خلية النموذج، مبادرة الخوذ البيضاءيتكون الفصل من أحادي الطبقة من الجهاز الهضمي (GI) الخلايا الظهارية نمت على غشاء مسامي تقع في إدراج transwell. ويؤكد تشكيل حاجز نفاذية عن طريق قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)، والنقل بطريق الظهارة من مادة السيطرة، والمناعية من منعطفات ضيقة. على سبيل المثال، تستخدم ~ 200 نانومتر البوليمر البلاغات الوطنية، التي تحمل بضائع والعلاجية والمغلفة مع الأجسام المضادة التي تستهدف محددا سطح الخلية. هو المسمى الأجسام المضادة أو البضائع العلاجية مع 125 أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين وتضاف نكس المسمى إلى مجلس الشيوخ خلال أحادي الطبقة خلية لفترات متفاوتة من الزمن. ويمكن الكشف عن البلاغات الوطنية المرتبطة الخلايا و / أو نقلها إلى غرفة الأساسي. قياس مجانية 125 I يسمح الطرح الكسر المتدهورة. ويتم تقييم مسار paracellular عن طريق تحديد التغييرات المحتملة الناجمة عن النقل NC لمعلمات حاجز المذكورة أعلاه. ط النقل العابر للخلاياتقدر تحددها معالجة تأثير تحوير الإلتقام وtranscytosis مسارات.

Introduction

الحواجز الخلوية في فعل الجسم كبوابة بين البيئة الخارجية والداخلية المقصورات. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الظهارية التي تفصل بين السطح المعرض من الخارج من الجهاز الهضمي (GI) المسالك ومجرى الدم 1-3. كما تمثل الحواجز الخلوية واجهة بين مجرى الدم وحمة والمكونات الخلوية من الأنسجة والأعضاء. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الداخلية البطانية في الأوعية الدموية، مثل حاجز الدم في الرئة، حاجز الدم في الدماغ، الخ. 1 القدرة على اجتياز هذه الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم للتسليم كفاءة العوامل العلاجية والتشخيصية إلى الدورة الدموية والأنسجة / الأجهزة التي تحتاج إلى التدخل.

لتحسين تقديم وكلاء علاجية أو تشخيصية، هذه المركبات يمكن تحميلها في nanocarriers ميكرومتر الفرعية (NCS). هذه المركبات لتقديم الأدوية يمكن أن تصاغ مع مجموعة متنوعة منكيمياء والهياكل لتحسين القابلية للذوبان في المخدرات، والحماية، والدوائية، وإطلاق سراح، والتمثيل الغذائي 4،5. البلاغات الوطنية يمكن أيضا أن تكون بين functionalized مع تقارب أو استهداف الأنصاف (مثل الأجسام المضادة، الببتيدات السكريات، الأبتامرات، الخ) لتسهيل الانضمام إلى مناطق الجسم التي تتطلب العمل العلاجي 2،6. يمكن استهداف البلاغات الوطنية لمحددات أعرب على سطح الحواجز الخلوية زيادة تسهيل النقل إلى و / أو عبر هذه بطانات 2،6.

دور نقل المواد بشكل انتقائي بين بيئتين يتطلب بعض ميزات فريدة من نوعها بين طبقات الخلية. واحدة من هذه الميزة قطبية الخلية، حيث الغشاء القمي التي تواجه التجويف تجاويف يختلف من غشاء basolateral موجهة نحو الخلالي الأنسجة، وفيما يتعلق التشكل الغشاء وتكوين الدهون، والنقل، ومستقبلات 2. يتضمن ميزة أخرى junctio بين الخلايانانوثانية التي تربط الخلايا المجاورة. تنظيم البروتينات التي تشكل منعطفات ضيقة، جزيئات الالتصاق صلي على وجه الخصوص (المربيات)، occludins، وclaudins، تعدل وظيفة حاجز للسماح بشكل انتقائي أو لا نقل المواد بين الخلايا، والمعروفة باسم النقل paracellular، مما يسمح بمرور المواد من التجويف ل مساحة basolateral 3. يمكن الربط من العديد من العناصر الطبيعية والاصطناعية (الكريات البيض، والجزيئات، والجسيمات، ونظم لتقديم الأدوية) إلى الحواجز الخلوية في الجسم تحفز الخلايا افتتاح تقاطع، والتي قد تكون عابرة وغير مؤذية نسبيا أو أكثر لفترة طويلة، وبالتالي غير آمنة مع وصول المواد غير المرغوب فيها عبر حاجز 2،5،7-9. بالتالي، هذا المسار يمكن تقييمها من خلال قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير) والسلبي نشر paracellular من الجزيئات (وتسمى هنا تسرب paracellular)، حيث انخفضت مقاومة التيار الكهربائي أو زيادة تسرب paracellular من المعهد الوطني للإحصاءمجمع غ في الفضاء basolateral تشير افتتاح تقاطعات الخلية، على التوالي 5،10،11. لتكمل هذه الأساليب، أي من البروتينات مفرق ضيق المذكورة أعلاه يمكن أن تكون ملطخة لتقييم سلامتها، حيث يجب أن يظهر تلطيخ تتركز على الحدود خلية خلية في جميع أنحاء محيط الخلية 5،10،12.

بدلا من ذلك، نظم لتقديم الأدوية التي تستهدف المحددات سطح خلية معينة، مثل تلك المرتبطة حفر المغلفة بالكلاذرين أو invaginations الغشاء على شكل قارورة دعا caveolae، قد يؤدي امتصاص حويصلي في الخلايا عن طريق الإلتقام، وتوفير وسيلة لتوصيل الدواء إلى الخلايا مقصورات 5، 13. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي إلى الاتجار الإلتقام من الحويصلات عبر خلايا الجسم لاطلاق سراح في الجانب basolateral، وهي ظاهرة تعرف باسم transyctosis، أو النقل العابر للخلايا 14. وبالتالي، معرفة حركية وآلية الإلتقام يمكن أن تستخدم لاستغلال الخلايا والثانية تسليم المخدرات العابر للخلايا، والذي يقدم طريقة آمنة نسبيا والتي تسيطر التسليم مقابل الطريق paracellular. (الإلتقام مثل حالة جزيء التصاق الخلية (CAM) بوساطة) آلية الإلتقام يمكن تقييم مع جهري من الممرات الكلاسيكية (بالكلاذرين وبوساطة caveolin الإلتقام، وmacropinocytosis) أو المسارات غير الكلاسيكية 5،13،15 .

في حين غالبا ما درس الاتجار داخل الخلايا في الآبار القياسية أو coverslips، وعدم وجود حجرة basolateral يمنع الاستقطاب الخلية والقدرة على دراسة النقل عبر طبقات الخلية. للتغلب على هذه العقبة، والنقل عبر الطبقات الوحيدة الخلية تمت دراسة طويلة باستخدام transwell إدراج 10،11،16،17، والتي تتكون من العلوي (القمي) غرفة، غشاء نفاذية مسامية حيث تعلق الخلايا وتشكيل أحادي الطبقة ضيقة، وأقل (basolateral) غرفة (الشكل 1). في هذا التكوين، يمكن قياس النقل فيقمي، لbasolateral الاتجاه من خلال إدارة العلاج في الغرفة العليا، وبعد النقل من خلال أحادي الطبقة الخلية وغشاء مسامي الكامنة، وجمع أخيرا المتوسطة في مجلس النواب لتقدير حجم المواد المنقولة. ويمكن أيضا نقل في الاتجاه basolateral-لقمية تقاس الإدارة الأولية إلى انخفاض الغرفة وجمع لاحقة من مجلس الشيوخ 5،10،12،16. توجد تقنيات مختلفة للتحقق من تشكيل حاجز نفاذية على transwells، بما في ذلك طير والمقايسات النقل paracellular، كما هو موضح أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة عامل التصفية منفذة على الخلايا التي يتم تربيتها لتحليل التصوير (مثل مضان، مبائر، المجهر الإلكتروني)، وكذلك المصادقة على نموذج أحادي الطبقة المحمولة، فضلا عن آلية النقل. اختيار نوع الغشاء، والذي يتوفر في أحجام مختلفة المسام، والمواد، والمناطق السطحية، ويعتمد على مختلف الواقعالتمرير مثل حجم المواد أو الأشياء المراد نقلها، نوع من الخلايا، وطريقة التصوير 16،18-20. Transwell إدراج أيضا تسهيل التحكم ودقيقة الكمي النقل بالمقارنة مع أنظمة الثدييات المعقدة، كما هي معروفة أحجام الغرف ومساحة سطح الخلية الثوابت. في حين يتم التخلص من العديد من العوامل التي تدخل في الجسم الحي في التسليم، بما في ذلك وجود مخاط الأمعاء، إجهاد القص، والإنزيمات الهضمية، الخلايا المناعية وغيرها، هذا على نطاق صغير في النموذج المختبر يوفر معلومات أولية مفيدة بشأن النقل.

كمثال لتوضيح تكييف هذه الأساليب لدراسة النقل NC عبر الحواجز الخلوية 10،11،16،17، ونحن هنا وصف الحالة التي كان على غرار القدرة على الانتقال NC عبر ظهارة GI عن طريق تقييم مرور تسليم المخدرات نموذج النظام من خلال أحادي الطبقة من الإنسان غدية القولون الظهارية (كاتشو-2) الخلايا. لهذا الغرض، جوكانت أذرع مثقف في إدراج transwell، على 0.8 ميكرومتر المسام البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET) تصفية (6.4 مم)، وهو شفاف، ويمكن استخدامها للتصوير المجهري. يتم التحقق من صحة وضع حاجز نفاذية عن طريق قياس طير والنقل القمي، لbasolateral من مادة السيطرة، والزلال، والتصور مضان المجهري عنصر من منعطفات ضيقة، والبروتين occludin. ويستخدم نموذج من البوليمر استهدفت NC، ويتألف من 100 نانومتر، الجسيمات النانوية البوليسترين nonbiodegradable. والمغلفة البلاغات الوطنية عن طريق الامتزاز السطح مع الأجسام المضادة التي تستهدف وحدها أو مزيج من الأجسام المضادة التي تستهدف والبضائع العلاجية، حيث يمكن أن توصف إما المكون مع 125 أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين. في المثال المحدد، يعترف الضد التصاق بين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1)، أعرب البروتين على سطح GI الظهارية (وغيرها) الخلايا، وهو ما ثبت لتسهيل داخل الخلايا والعابر للخلايا س النقل ناقلات المخدرات و وحمولتها 21. البضائع هو ألفا غالاكتوزيداز (α غال)، انزيم العلاجية المستخدمة لعلاج مرض فابري، وهو اضطراب التخزين الليزوزومية الوراثية 22.

الخدمة المدنية القومية المغلفة، من حوالي 200 نانومتر في الحجم، وتضاف إلى غرفة قمي أكثر من أحادي الطبقة الخلية وحضنت في 37 درجة مئوية لفترات متفاوتة من الزمن، وبعد ذلك يمكن أن يتم الكشف عن 125 وأنا على البلاغات الوطنية المرتبطة أحادي الطبقة الخلية و / أو نقل إلى غرفة basolateral أدناه الخلايا. تقرير إضافية مجانية 125 I يسمح الطرح الكسر المتدهورة وتقدير النقل NC المغلفة. ويتم تقييم آلية النقل من خلال دراسة مزيد من التغييرات في نفاذية حاجز المتعلقة الطريق paracellular، من خلال المعلمات المذكورة أعلاه، في حين يتم تحديد النقل العابر للخلايا من خلال دراسة التغيرات في مجال النقل عند تحوير مسارات الإلتقام وtranscytosis.

ontent "> هذه الأساليب توفير معلومات قيمة حول نماذج حاجز الخلوية، مدى ومعدل نقل نظام تسليم المخدرات، وآلية مثل النقل، والسماح تماما تقييم إمكانات لتسليم المخدرات عبر الحواجز الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة أحادي الطبقة خلية في Transwell إدراجات

  1. في العقيمة، ومستوى السلامة الأحيائية 2 خلية غطاء الثقافة، ضع 0.8 ملم المسام transwell PET إدراج في 24 لوحة جيدا (4 آبار في الشرط، لدلالة إحصائية) بالملقط. ويجب تعقيم جميع المواد التي تدخل هود مع الايثانول.

ملاحظة: حجم المسام من مرشح يجب أن يكون المحدد في اتفاق لحجم متوسط ​​من NC المستخدمة، للسماح النقل عبر الغشاء. أيضا، للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، ويتطلب كل حالة تجريبية لا تقل عن أربعة يكرر (الآبار) في نفس التجربة، والحد الأدنى من 3 تجارب مستقلة.

  1. إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على DMEM المتوسطة تستكمل مع 4.5 غرام / لتر جلوكوز، 15٪ مصل بقري جنيني، و 1٪ القلم بكتيريا، والحرارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. تمييع الإنسان غدية القولون الظهارية (كاتشو-2) الخلايا في خلية متوسطة ومكان200-400 ميكرولتر من الحل خلية في العلوية (القمي) غرفة إدراج transwell، في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 5 خلية / سم 2. ملء الدنيا (basolateral) غرفة مع 700-900 ميكرولتر من المتوسطة الخلية.
  3. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO و 95٪ الرطوبة ل16-21 يوما، لتحل محل المتوسطة في الغرفة العلوية والسفلية كل 3-4 أيام، وذلك باستخدام وحدات التخزين المشار إليها في الخطوة 1.3. استبدال المتوسطة في الترتيب التالي للحفاظ على الضغط فوق (بدلا من أدناه) أحادي الطبقة الخلية: نضح المتوسطة من مجلس النواب، نضح المتوسطة من مجلس الشيوخ، وملء الغرفة العليا مع متوسطة جديدة، وملء مع مجلس النواب متوسطة جديدة.

2. المصادقة على GI الظهارية نفاذية حاجز طريق بطريق الظهارة المقاومة الكهربائية (طير) والمناعية من منعطفات ضيقة

  1. للتخزين على المدى القصير (أقل من 2 أسابيع)، يغرق أقطاب STX100 في المحاليل بالكهرباءنشوئها (0.1-0.15 M بوكل أو كلوريد الصوديوم). توصيل كابل كهربائي إلى منفذ كهربائي على EVOM متر فولت أوم بحيث يكون النظام تماس في الداخل ويتم الاحتفاظ القطب التماثل. للتخزين على المدى الطويل، وشطف مع DH 2 O وتخزين في حالة جافة ومظلمة.
  2. لتعقيم الأقطاب، تزج في الإيثانول لمدة 15 دقيقة والسماح للهواء الجاف لمدة 15 ثانية. بدلا من ذلك، الأقطاب يمكن تخزينها في غطاء فوق البنفسجية. شطف الأقطاب في محلول معقم بالكهرباء (العازلة الفوسفات المالحة، PBS) أو 0.1-0.15 M بوكل كلوريد الصوديوم أو الحل، قبل كل قياس المقاومة.
  3. مع متر فولت أوم لتعيين الإعداد المقاومة، ضع عموديا الأقطاب في بئر يحتوي على إدراج transwell، مع القطب قصيرة في مجلس الشيوخ والقطب طويلة في مجلس النواب لمس قاع البئر. ما إن تستقر القراءة EVOM، وتسجيل قيمة المقاومة (أوم الواردة في؛ Ω) لكل بئر.
  4. حساب المقاومة (resistanم تطبيع للمنطقة؛ Ω × سم 2) من عينات عن طريق طرح المقاومة الخلفية (طير من إدراج transwell دون الخلايا) وضرب من قبل مساحة الغشاء. وغالبا ما ذكرت القيم المقاومة في الأدب. (انظر مناقشة)
  5. تكرار القياسات كل 1-2 أيام حتى تقدر طير أدى إلى الحد الأقصى والهضبة، مشيرا إلى تشكيل حاجز النفاذية، والتي تأخذ عادة 2-3 أسابيع من لحظة platting الخلية. قد تتغير قيم هضبة طير والوقت اللازم لتحقيق سلامة الحاجز وفقا لعدد مرور الخلية.
  6. للتحقق من وجود منعطفات ضيقة في الطبقات الوحيدة الخلية مع ارتفاع طير (تساوي أو تزيد على قيمة العتبة لتشكيل حاجز)، وإصلاح الخلايا عن طريق الحضانة مع البرد بارافورمالدهيد 2٪ لمدة 15 دقيقة. ثم، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 1 ميكروغرام / مل مكافحة occludin. غسل خلايا مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 7.5 ميكروغرام / مل والأجسام المضادة الثانوية صفت luorescently. استخدام الآبار مع انخفاض طير كعنصر تحكم السلبية لتشكيل حاجز.

ملاحظة: كبديل لمكافحة occludin، يمكن استخدام الأجسام المضادة للبروتينات تقاطع ضيق البديلة.

  1. استئصال الغشاء بعناية التصفية الذي يتم إرفاق أحادي الطبقة الثابتة، وجبل على الشرائح للتصوير باستخدام epifluorescence أو المجهري متحد البؤر.

3. تقييم بطريق الظهارة نقل الناقلون المستهدفة

  1. تسمية استهداف الأجسام المضادة (الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ضد ICAM-1، ومكافحة ICAM، في هذا المثال) مع 125 الأول، كما هو موضح سابقا 7. استخدام برادفورد مقايسة لتقدير تركيز البروتين وعداد غاما لتحديد 125 I المحتوى على الضد، ثم حساب نشاط محدد في التهم لكل دقيقة (CPM) / ملغ من الأجسام المضادة المسمى.

ملاحظة: للسيطرة على النوعية، إعادةالجفت الإجراء من قبل مفتش وسم الفأر، والتي سيتم استخدامها لإعداد البلاغات الوطنية المغلفة غير المستهدفة. لدراسة نقل البضائع العلاجية، كرر الإجراء وصفها البضائع، على سبيل المثال، ألفا غالاكتوزيداز (α غال) في هذا المثال. يمكن استخدام بدائل للعامل الاستهداف، ومراقبة غير محددة، أو البضائع العلاجية. ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب بديلة لتسمية المركبات وتقدير تركيز نظرائهم المسمى.

  1. الزوجان المسمى استهداف الأجسام المضادة (المضادة للICAM في مثالنا) على سطح البلاغات الوطنية. في هذا المثال، واحتضان nanobeads البوليسترين (قطر 100 نانومتر) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع I-125 المضادة للICAM للسماح امتصاص السطح، كما هو موضح 7.

ملاحظة: للحصول على سيطرة غير محددة استخدام I-125 مفتش. لتتبع نقل البضائع، استخدام مزيج من الأجسام المضادة التي تستهدف و125 البضائع التي تحمل علامات الأول (α غال في مثالنا).

  1. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة نظرائهم غير المغلفة في طاف بواسطة الطموح. resuspend الكرية تحتوي على البلاغات الوطنية المغلفة باستخدام 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني قبل pipetting، ويصوتن في انخفاض القوة لتعطيل المجاميع الجسيمات المحتملة (20-30 نبضات قصيرة).
  2. لNC توصيف وقياس حجمها، والتشتت المتعدد، وζ المحتملة من الجسيمات المغلفة باستخدام تشتت الضوء الحيوي (اتباع الإرشادات بائع)، وتحديد عدد 125 أنا المسمى استهداف جزيئات الأجسام المضادة (مثل مكافحة ICAM) على سطح الجسيمات باستخدام جاما المرتدة.

ملاحظة: يمكن تكرار هذه الأساليب لنظرائهم غير محددة والعلاجية. حجم الجسيمات المغلفة يتراوح حوالي 200 نانومتر.

  1. إضافة 125 نكس-I الأجسام المضادة، (على سبيل المثال I-125 المضادة للICAM البلاغات الوطنية؛ 56 نانوكوري / مل) إلى مجلس الشيوخ أعلاه متموجة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة مع طير و# 8805؛ 350 Ω × 2 سم (انظر مناقشة) على خلفية (16-21 يوما بعد البذر). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة واحدة أو المزيد من الوقت المطلوب فترات. قياس طير (القسم 2.3) قبل وبعد الحضانة لتقييم آثار البلاغات الوطنية على حاجز النفاذية.

ملاحظة: يمكن تكرار هذا الإجراء لنظرائهم غير محددة والعلاجية.

  1. جمع المتوسطة من الغرف العلوية والسفلية وغسلها مرة واحدة مع 0.5 مل DMEM عند 37 درجة مئوية (الغرفة العليا) أو 1 مل درهم 2 O (مجلس النواب). جمع يغسل لقياس مجموع محتوى النظائر المشعة باستخدام عداد غاما.
  2. لقياس جزء الخلية، واستئصال تصفية نفاذية، على سبيل المثال باستخدام شفرة حلاقة لخفض حول حواف، واحتضان في أنبوب عداد غاما مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة (للافراج عن محتويات الخلية)، قبل قياس الخلية المرتبطة مجموع النشاط الإشعاعي.
  3. لقياس 125 أنا أعيدمستأجرة من البلاغات الوطنية أثناء النقل أو بسبب تدهور محتمل، مزيج أول 300 ميكرولتر من العينة (من الكسور العلوي، وانخفاض، أو خلية) مع 700 ميكرولتر من 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني و 200 ميكرولتر حمض الخليك ثلاثي الكلور (TCA). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه هذه المرة، وقياس النشاط الإشعاعي شامل لهذه العينة في عداد غاما.
  4. عينات الطرد المركزي في TCA 3،000 x ج لمدة 5 دقائق لفصل البروتين سليمة (بيليه) من البروتين المتدهورة أو 125 جزء الأول (طاف). قياس النشاط الإشعاعي من 125 حرة أنا جزء وطرح هذه القيمة من مجموع النشاط الإشعاعي تقاس قبل الطرد المركزي. هذا وسوف توفر كمية البروتين المسمى الذي لا يتحلل.

4. آلية بطريق الظهارة نقل Nanocarriers المستهدفة

  1. التسمية الألبومين مع 125 I كما هو موضح في القسم 3.1 والتي أبلغت 7.

ملاحظة: الزلال هو 66.5البروتين كيلو دالتون، وبالتالي، وهي مادة كبيرة نسبيا. على الرغم من أن السيطرة صالحة للنقل السلبي من الأجسام الكبيرة (على سبيل المثال 200 نانومتر المستخدمة هنا البلاغات الوطنية)، وينبغي أن تكون بديلا مع أصغر الجزيئات الخاملة التتبع عند دراسة نقل ناقلات المخدرات أصغر (انظر مناقشة).

  1. لتقييم النقل paracellular باستخدام تسرب الزلال paracellular والثقافة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة على transwell إدراج كما هو موضح أعلاه.
  2. إلى متوسطة الغرفة العليا فوق الخلية أحادي الطبقة، إضافة إما 125 I-الزلال وحده (السيطرة السلبية تظهر على المستوى القاعدي من التسرب)، أو 125 البلاغات الوطنية التي تستهدف الأضداد I-الزلال وغير رديولبلد (كما هو موضح في القسم 3.5). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة الفاصل الزمني المحدد الوقت (ق)، والتي ينبغي أن تتطابق مع تلك درست عند اختبار النقل NC. قياس طير (القسم 2.3) قبل وأثناء وبعد الحضانة، ثم جمع كل الكسور لمجموع 125 أنا وأنا حرة 125 القياسات كما هو مبين. في القسم 3 ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك يصاحب ذلك من السيطرة I-125 الزلال وغير رديولبلد البلاغات الوطنية مفتش يمكن استخدامها كمجموعة تحكم.
  3. كعنصر تحكم إيجابية لفتح تقاطعات بين الخلايا، إضافة وسائل الإعلام خلية تحتوي على 5 ملي H 2 O 2 إلى الغرف العلوية والسفلية من إدراج transwell، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، وقياس طير (القسم 2.3) وإضافة 125 I-الألبومين إلى الغرفة العليا للفترات الزمنية المحددة. قياس طير في نقاط مختلفة في جميع أنحاء الحضانة الوقت لتحديد قيمة الاضمحلال طير الناجمة عن H 2 O 2 الافتتاحية التي يسببها للتقاطعات الخلية.
  4. في التجارب المتوازية، وتقييم النقل العابر للخلايا، وتسمى أيضا transcytosis، من 125 نكس أنا المستهدفة التي يحتضنها متموجة كاتشو-2 مع الطبقات الوحيدة إما 50 ميكرومتر monodansylcadaverine (حركة التغيير الديمقراطي؛ المانع من بوساطة بالكلاذرين الإلتقام)، 1 ميكروغرام / مل فيليبين (المانع من caveolar الإلتقام بوساطة)، و 0.5 ميكرومتر فورتمانفي (المانع من فوسفتيدلينوستول 3 كيناز [PI3K]، والمشاركة في macropinocytosis)، أو 20 ميكرومتر [5 - (N-إيثيل-N-الآيزوبروبيل) الأميلوريد] (EIPA، المانع من macropinocytosis وبوساطة CAM الإلتقام 15).

ملاحظة: I-125 مفتش البلاغات الوطنية و125 I-الزلال يمكن استخدام ضوابط السلبية لتأثير هذه المثبطات، وغيرها من الأساليب (مثل تقنيات سيرنا) قد توفر تثبيط أكثر انتقائية.

  1. قياس طير (القسم 2.3) قبل وأثناء وبعد حضانة الخلايا مع مثبطات والمواد رديولبلد، كعنصر تحكم إضافية للتأثير مثبطات على نفاذية أحادي الطبقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحقق من صحة نموذج خلية لدينا لدراسة النقل بطريق الظهارة من البلاغات الوطنية المستهدفة، ويبين الشكل 2 أن كاتشو-2 الطبقات الوحيدة الخلية مطلي في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 5 خلية / سم 2 وصلت التقاء ~ 12 يوم وحافظ سلامة أحادي الطبقة تصل إلى 18 يوم، يتبين من طير (الشكل 2A). تم التحقق من صحة ذلك من خلال وجود-occludin إيجابية منعطفات ضيقة (الشكل 2B) في الطبقات الوحيدة مع ارتفاع طير (390 Ω × سم يوم 14)، بالمقارنة مع الفقراء وضع العلامات ضيق تقاطع في انخفاض طير (17 Ω × 2 سم، 5 يوم ).

تتبع التسمية المشعة على عناصر NC يحدد المبلغ الإجمالي من هذه المكونات (NC استهداف الأجسام المضادة أو البضائع) وأضاف في البداية إلى غرفة قمي، خلية جزء المرتبطة بها، وجزء على نقلها إلى الجانب basolateral. ويمكن استخدام هذه القيم لحساب المعلمات المختلفة التي تصف النقل NC فيبطريقة أكثر ذات الصلة، ولا سيما بعد الطرح الحر المحتوى 125 الأول من كل جزء، وهو ما يمثل نظرائهم المتدهورة. على سبيل المثال، فإن عدد جزيئات الأجسام المضادة، والجزيئات البضائع، أو البلاغات الوطنية المرتبطة التي يتم عرضية أحادي الطبقة الخلية يمكن أن تحسب لتقدير النقل المطلقة. أيضا، فإن النسبة المئوية للجزيئات قال البلاغات الوطنية أو التي يتم نقلها إلى الجانب basolateral فيما يتعلق إجمالي عدد الجزيئات أو البلاغات الوطنية المرتبطة أحادي الطبقة الخلية، وتقدر كفاءة قال النقل. أخيرا، ومعامل نفاذية واضحة (P التطبيق)، معلمة القياسية لمعدل النقل، ويمكن تقدير. وتحسب هذه المعايير كما يلي:

الجزيئات نقلها أو نقلها نكس = CPM × basolateral (المضافة الجزيئات أو إضافة NC أضاف / CPM)
جزيئات٪ أو نكس نقل = 100 × [CPM basolateral / (CPM basolateral + CPMجزء الخلية)]
P التطبيق (سم / ث) = (CPM basolateral × المجلد) / (A × × ر CPM المضافة)

حيث CPM هي أضاف 125 I التهم لكل دقيقة إلى الغرفة العليا (المضافة CPM)، جزء أحادي الطبقة الخلية (CPMcell جزء)، أو مجلس النواب (CPM basolateral)، وأضاف NC أو الجزيئات المضافة هي عدد من البلاغات الوطنية أو الجزيئات وأضاف في البداية إلى الغرفة العليا، A هو المساحة السطحية للغشاء فلتر (سم 2)، المجلد. هو حجم المتوسطة في الغرفة العليا (مل)، و t هو الوقت من الحضانة (ق).

في مثالنا، عندما النظائر المشعة ووصفها الأجسام المضادة التي تستهدف، هذا التحليل يكشف عن درجة وكفاءة النقل من حيث الأجسام المضادة أو نقلها البلاغات الوطنية لكل خلية والنسبة المئوية للخلايا الأجسام المضادة المرتبطة أحادي الطبقة أو البلاغات الوطنية التي تم نقلها (3A الشكل و3B )، ونحنليرة لبنانية، حيث وصل سعر النقل من حيث التطبيق P (الشكل 3D). هذه المعايير والتي تقدر في مثالنا لنكس I-125 المضادة للICAM، كما تم مقارنة تلك السيطرة I-125 مفتش البلاغات الوطنية للتدليل على كفاءة النقل بالنسبة إلى نظيره غير المستهدفة (الشكل 3C و 3D).

عندما يتم إدراج التسمية المشعة على البضائع NC، المعلمات وصفها تعكس نقل البضائع، الذي كان في مثالنا α غال الانزيم، وتستخدم للعلاج من اضطراب وراثي التخزين الليزوزومية المعروف باسم مرض فابري (الجدول 1). بالإضافة إلى حساب النقل NC عن طريق تتبع قال يمكن تقدير البضائع، والتسليم بطريق الظهارة هذا الانزيم العلاجية، مثلا عن طريق التعبير عن ذلك كما الجزيئات أو كتلة α غال نقلها لكل خلية.

أخيرا، سمات هذا الأسلوب مسار النقل إلى الطريق paracellular أوالطريق العابر للخلايا. على سبيل المثال، في مثالنا، وانخفاض EIPA نقل 125 نكس I-مكافحة ICAM عبر كاتشو-2 الطبقات الوحيدة الخلية (الشكل 4A)، في حين أن حركة التغيير الديمقراطي، فيليبين، وwortmannin لم يقلل مستويات النقل فيما يتعلق بحالة التحكم (لا المانع ). هذا يشير إلى أن البلاغات الوطنية لمكافحة ICAM الاستفادة بوساطة CAM الإلتقام للنقل العابر للخلايا، ولكن ليس بالكلاذرين، caveolar، أو transcytosis المتعلقة macropinocytosis. وعلاوة على ذلك، كان يحكم النقل paracellular خارج باستخدام قياسات طير (الشكل 4B) والنقل السلبي الألبومين (الشكل 4C)، حيث انخفاض في طير وزيادة في تسرب الزلال paracellular في مجلس النواب أثناء النقل من البلاغات الوطنية لمكافحة ICAM سيتعين تعطل أشارت تقاطعات بين الخلايا. ومع ذلك، لم الحضانة مع مكافحة ICAM البلاغات الوطنية لا يغير طير أو تسرب 125 paracellular I-الزلال على مدى 48 ساعة، على غرار سيطرة البلاغات الوطنية مفتش التي لم يتم نقلها. كماتحكم إيجابية لافتتاح تقاطعات الخلية والنقل paracellular، H 2 O 2 طير انخفضت إلى مستويات القاعدية وبشكل ملحوظ تعزيز تسرب 125 I-الألبومين إلى غرفة basolateral.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي النقل بطريق الظهارة من nanocarriers المستهدفة عبر نموذج الظهارية المعوية. (A) ومنصة لدراسة النقل بطريق الظهارة، كاتشو-2 الطبقات الوحيدة الخلية يتم تربيتها على إدراج transwell حين تشكيل أحادي الطبقة ضيق (16-21 يوما بعد البذر، طير ≥ 350 Ω × 2 سم على الخلفية). مثال على السيارة تسليم المخدرات، مثل البلاغات الوطنية I-125 المضادة للICAM، يضاف إلى الجزء العلوي (القمي) غرفة فوق أحادي الطبقة خلية لدراسة النقل عبر الخلايا وعبر الغشاء المسامي الأساسية.ثم يتم جمع المتوسطة في الطبقة السفلى (basolateral) غرفة للالكمي للمادة المنقولة. (ب) النقل من خلال أحادي الطبقة الخلية يحدث إما عن طريق paracellular أو الطريق العابر للخلايا / transcytosis. مستنسخة من Ghaffarian آخرون، J. الشواهد الرطوبة. 163 (1)، 25-33 (2012). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية

الرقم 2
الشكل 2. كاتشو-2 الطبقات الوحيدة كنموذج للنقل بطريق الظهارة. كانت تزرع كاتشو-2 الخلايا على إدراج transwell في 1.5 × 10 5 خلية / سم 2. (A) وقد تم قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير) لتقييم سلامة أحادي الطبقة. وتظهر البيانات كما يعني ± SEM، ن = 3. (B) الإسفار المجهر من منعطفات ضيقة immunolabeled مع المضادة للoccludin وتكساس الأحمر المسمى الأجسام المضادة الثانوية، على يوم 5 أو 14 (مقابل انخفاض القيم طير عالية، على التوالي). مستنسخة من Ghaffarian آخرون، J. الشواهد الرطوبة. 163 (1)، 25-33 (2012). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية

الرقم 3
الرقم 3. نقل nanocarriers مكافحة ICAM عبر كاتشو-2 الطبقات الوحيدة الخلية. حضنت متموجة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة نمت على إدراج transwell مع البلاغات الوطنية I-125 المضادة للICAM أو إضافة 125 I-مفتش البلاغات الوطنية إلى غرفة قمي. وقد تم قياس (AC) 125 أنا المحتويات في غرفة basolateral عند نقاط الوقت المشار إليه، لحساب كمية البلاغات الوطنية TRANSPorted لكل خلية (انظر نتائج الممثل). تم حساب (B) النسبة المئوية لنكس نقل كنسبة من الناقلين وجدت في جزء basolateral لأنه في الجمع بين الكسور وbasolateral الخلية. وحسبت (D) معاملات النفاذية الظاهرية (P التطبيق) كما هو موضح في ممثل النتائج، والتي تعكس معدلات نقل 125 نكس I-مكافحة ICAM أو I-125 مفتش البلاغات الوطنية. وتظهر البيانات كما يعني ± SEM، ن = 4. مستنسخة من Ghaffarian آخرون، J. الشواهد الرطوبة. 163 (1)، 25-33 (2012). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية

الرقم 4
الشكل 4. آلية النقل منnanocarriers NTI-ICAM عبر كاتشو-2 الطبقات الوحيدة. (A) تم تقييم النقل العابر للخلايا من 125 نكس I-مكافحة ICAM عبر متموجة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة في 24 ساعة في غياب أو وجود 20 ميكرومتر EIPA، 1 ميكروغرام / مل فيليبين، 50 ميكرومتر حركة التغيير الديمقراطي، أو 0.5 ميكرومتر wortmannin. وقد تم قياس (B) طير أثناء النقل من 125 نكس I-مكافحة ICAM عبر كاتشو-2 الطبقات الوحيدة، لتقييم النقل paracellular. يتم عرض القيم طير في غياب البلاغات الوطنية والضوابط (يصادف الفاصل متقطع SEM من القيمة المتوسطة). الحضانة مع 5 ملم H 2 O 2 هو السيطرة الإيجابية لافتتاح تقاطعات بين الخلايا. (C) تسرب البروتين Paracellular يقاس معامل نفاذية واضح (برنامج مساعدة الشعب الفلسطيني) من 125 I-الزلال عبور أحادي الطبقة خلية في غياب أو وجود 5 ملي H 2 O مفتش البلاغات الوطنية، أو مكافحة ICAM البلاغات الوطنية، وقد تم قياس و يحسب كما في الشكل 3. البيانات هي عرضن كما يعني ± SEM، ن ≥ 4. مستنسخة من Ghaffarian آخرون، J. الشواهد الرطوبة. 163 (1)، 25-33 (2012). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية

مجموع البلاغات الوطنية / يرتبط
الخلية
الخلايا نكس / خلية نقل البلاغات الوطنية / خلية ٪ المنقولة نقل جزيئات α غال /
خلية × 10 5
خريج نقل /
خلية × 10 -3
برنامج مساعدة الشعب الفلسطيني (× 10 -8 سم / ثانية)
3 ساعة 663.4 ± 116.0 434.0 ± 76.8 243.6 ± 15.4 44.4 ± 6.7 1.8 ± 0.2 9.7 ± 1.2 8.1 ± 1.1
24 ساعة 2024.8 ± 409.3 1218.9 ± 255.6 806.9 ± 164.1 40.6 ± 2.0 3.9 ± 0.5 21.3 ± 2.5 1.9 ± 0.4
نكس = nanocarriers؛ α غال = α غالاكتوزيداز؛ إجمالي البلاغات الوطنية المرتبطة / خلية = تنقل بين الخلايا نكس / خلية + نكس / خلية؛٪ المنقولة = (NCS نقل / إجمالي البلاغات الوطنية المرتبطة بها) × 100؛ P = معامل نفاذية التطبيق واضح (سم / ث). راجع أساليب لوصف المزيد من هذه المعلمات. وتظهر البيانات كما يعني ± SEM (ن = 8 آبار)، (TNF-α كاتشو-2 خلايا).

الجدول 1. النقل بطريق الظهارة من α غال بواسطة nanocarriers مكافحة ICAM. النقل العابر للخلايا المضادة للICAM / 125 I-α غال البلاغات الوطنية عبر يخدعتم تقييم بطلاقة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة في 3 ساعة و 24 ساعة. تم تحويل محتوى النظائر المشعة الكسور القمي، basolateral، والخلية إلى القيم المختلفة ذات الصلة بالنقل، كما هو موضح في نتائج الممثل. مستنسخة من Ghaffarian آخرون، J. الشواهد الرطوبة. 163 (1)، 25-33 (2012).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استخدام الأساليب التي تمت مناقشتها أعلاه، يمكن تأسيس نموذج خلية لدراسة نقل البلاغات الوطنية المستهدفة عبر الحواجز الخلوية، مثل المثال المنصوص عليها كاتشو-2 الخلايا الظهارية، والتي هي ذات الصلة لتقييم النقل من التجويف GI في الدم في حالة نظم لتقديم الأدوية عن طريق الفم. زراعة الخلايا الظهارية من الطبقات الوحيدة GI في إدراج transwell تمكين قياس طير والمناعية مضان من منعطفات ضيقة لتأكيد تشكيل حاجز نفاذية الخلية. في وقت لاحق، radiolabeling من استهداف وكلاء العلاجية مع 125 أنا قدمت الكمي السريع وحساسة من البلاغات الوطنية المستهدفة في وعبر GI الطبقات الوحيدة الخلية. أخيرا، تم تطبيق الدراسات الآلية باستخدام مثبطات التقامي، طير، وتسرب الزلال paracellular فحص لتقييم ما إذا كان النقل يتم عبر طريق حويصلي مقابل طريقا paracellular.

معلمة هامة في إنشاء نماذج مماثلة طو اختيار نوع من الخلايا، والتي يجب أن تعكس طبيعة الفسيولوجية من الجدار الخلوي تحت الدراسة. تتوفر تجاريا 16،18-20 مختلف الخلايا الظهارية والبطانية من أصل إنساني أو حيواني. هذه يمكن زراعتها وحدها، لأن الحضارات واحد كما هو موضح هنا، أو كما شارك في ثقافات هذه الخلايا مع أنواع الخلايا الأخرى 16،18-20 (مثل الخلايا، والخلايا المناعية، pericytes، الخ المخاط إفراز). في مثل نموذج الاشتراك في الثقافة وtranswell شروط إدراج يمكن التضمين لضبط معدلات النمو منها ومتطلبات عوامل التمايز في وسائل الإعلام خلية 16،18-20. على سبيل المثال، نموذجا حاجز الدم في الدماغ قد تنطوي شارك في زراعة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ والخلايا النجمية أو pericytes على السطح الآخر من مرشح يسهل اختراقها، وينبغي أن توضع وسائل الإعلام منها لكل نوع من الخلايا في كل غرفة 19. بالإضافة إلى ذلك، اعتمادا على خط الخلية، يمكن ةداملا مسا مكونات المصفوفة خارج الخليةuired لمرفق الخلية فعالة لغشاء مسامي 18-20. من المهم أن نعتبر أن كل نموذج معين سوف تجعل المستويات القاعدية المختلفة فيما يتعلق المعلمات حاجز النفاذية وأسعار النقل وآلية، والسيطرة بالتالي تحتاج القيم التي يمكن الحصول عليها وهذه الأساليب الأمثل لكل حالة.

Transwell إدراج مثل تلك المذكورة هنا، وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة نقل المواد عبر الطبقات الوحيدة الخلية، من قمية في حجرة basolateral أو العكس بالعكس 5،10-12،16،17. لا يمكن أن يتحقق ذلك عن طريق زراعة الخلايا على الآبار الكلاسيكية أو coverslips لأن مثل هذه الأنظمة تمنع هذا النوع من النقل كما أنها لا تقدم اثنين من مقصورات مستقلة، وبالتالي قد لا تعطي صورة واقعية من الفرز الخلية. على سبيل المثال، والمواد الموجهة بطبيعة الحال للإفراج عن غشاء basolateral قد القوا إلى المقصورات الخلايا الأخرى في نموذج ساترة، مما يجعل من الصعب ريسوLVE آلية النقل العابر للخلايا. علاوة على ذلك، وعلى النقيض من coverslips، والتكوين transwell يثير ميزات من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة المرتبطة تمايز الخلايا والأغشية قطبية 10،11،16-19. على سبيل المثال، كاتشو-2 الخلايا المزروعة على transwells يحمل خصائص المعوية ناضجة، بما في ذلك وجود الزغيبات الصغيرة ومنعطفات ضيقة، وتشكيل قبة، وإنتاج الانزيمات فرشاة الحدود 10،11،17. يمكن المعلمات الأخرى لحث على النمط الظاهري أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية، مثل إجهاد القص في حالة الخلايا الظهارية GI (على سبيل المثال تدفق المخاط والحركات مقلص) وخلايا بطانة الأوعية الدموية (مثل تدفق الدم)، والتي يمكن تطبيقها في transwells باستخدام التحريض أو مضخات 10 ، 16 عاما، وشارك في الثقافات لإنتاج النمو اللازم وعوامل التمايز لبعض أنواع الخلايا 16،18-20. ومع ذلك، يجب على المرء أن ينظر في خطوط الخلايا غالبا ما تختلف عن الخلايا في أنسجة الجسم، والبريدز. أنها قد تعبر عن بعض المحددات على مستويات مختلفة، وبالتالي، وظائف متنوعة واللوائح الحالية. على سبيل المثال، كاتشو-2 خلايا لا تحتوي على جميع البروتينات والإنزيمات نقل اللازمة لتفعيل وسائل النقل من العلاجات عن طريق الفم في الجسم الحي، مثل CYP3A4، وهو الإنزيم استقلاب المخدرات 10،17،23. في هذه الحالات، استنساخ شبه خط الخلية، ترنسفكأيشن، أو إضافة وكلاء النسخي يمكن استخدامها تعدل خط الخلية لتعكس على نحو أفضل الظروف الفسيولوجية 17،23،24.

في اختيار نموذج transwell الأمثل، يجب أن تؤخذ في ملامح مختلفة من مرشح نفاذية بعين الاعتبار. مرشحات قابلة للاختراق متوفرة في أحجام المسام مختلفة، تتراوح 0،4-8 ميكرون، ويجب استيعاب حجم البضائع المنقولة. على سبيل المثال، تستخدم عادة أحجام المسام أصغر (0،4-3 ميكرومتر) لدراسات النقل من المركبات الكيميائية الصغيرة، بينما تستخدم المسام 3 ميكرون أو أكبر لغزو الخلايا، تشيالتي الميكروبية، يتم نقل الخلايا المناعية، والهجرة motaxis، ودراسات الحركة. حجم المسام والكثافة يؤثر أيضا على كثافة الخلايا والتمايز، حيث أن بعض الخلايا قد تهاجر من خلال المسام على البذر، مما يحول دون تشكيل أحادي الطبقة. بالإضافة إلى ذلك، المواد من وضوح قابلة للاختراق الدعم التأثيرات التصوير، لتقييم بقاء الخلية وتشكيل أحادي الطبقة، ومرفق الخلية. البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET) فلاتر شفافة، مما يتيح الرؤية تحت النقيض من المرحلة المجهري، على النقيض من المرشحات شفافة البولي. لتعزيز مرفق الخلية، تتوفر تجاريا يدعم نفاذية precoated مع الكولاجين أو فبرونيكتين. وعلاوة على ذلك، فإن قطره التصفية، والتي يتم ضبط لوحات جيدا مختلفة، قد تؤثر نفاذية، حيث بأقطار أكبر (على سبيل المثال في 6 لوحات جيدة) تميل إلى زيادة التسرب من paracellular أحادي الطبقة الخلية.

مرة واحدة يتم تأسيس نموذج transwell، بما في ذلك appropriaالشركة المصرية للاتصالات اختيار نوع من الخلايا، وتكوين وسائل الإعلام، وتصفية نفاذية، ووضع أحادي الطبقة الخلية يمكن تقييمها خلال زراعة ومراحل تجريبية باستخدام طير. ومع ذلك، تختلف مع القيم طير 1) العوامل البيولوجية الفطرية المرتبطة نوع من الخلايا، والمصدر، وعدد مرور؛ 2) ظروف زراعة، مثل الخصائص المذكورة آنفا transwell، كثافة البذر، أيام في الثقافة والتكوين وسائل الإعلام ودرجة الحموضة، 3) العوامل المادية ، مثل درجة الحرارة، وحجم وسائل الإعلام، والجدول الزمني أخذ العينات، ودرجة الهياج / الغسيل؛ و 4) العوامل المرضية و / أو الكيميائية التي تعدل خلية تقاطع النزاهة (مثل السيتوكينات، وخلايا المناعة، والإجهاد التأكسدي و الإضافات الدوائية، الخ) 10، 16،17. نظرا لمختلف العوامل البيولوجية والبيئية التي تؤثر على طير، قيمة خط الأساس الحد الأدنى تشير يجب وضع تشكيل حاجز لكل نظام من خلال رصد منتظم طير خلال الفترة الثقافة وبعد التلاعب التجريبية. فازهري التي تعتبر كافية لتشكيل حاجز، والتي يمكن أن تتراوح بين 150-1،600 Ω × 16 سم وتعتمد أيضا على حجم المادة المراد نقلها بحيث paracellular السلبي نشر هذه المادة يقتصر، في حين طير ≥ 350 Ω × سم 2 ويبدو أن يحول دون نشر السلبي من البلاغات الوطنية الكبيرة نسبيا مثل تلك التي تظهر هنا (200 نانومتر)، وهذا قد لا يكون الأمر كذلك لنظم لتقديم الأدوية أصغر، والذي يطلب من الطبقات الوحيدة تشديد (على سبيل المثال ≥ 700 Ω × سم 2). ويمكن أيضا أن يتم تقييم هذه القيمة الأساسية باستخدام ضوابط لتعطيل حاجز النفاذية، بما في ذلك H 2 O اختراق الببتيدات، chelators الكالسيوم (مثل EDTA)، تحركات البروتينات وphosphatases، ومختلف الجزيئات التنظيمية الأخرى 25-27.

مكملة للطير، وجود العديد من فحوصات النفاذية للتحقق من سلامة أحادي الطبقة وتقييم TRANSPO paracellularغ. مثل الزلال، وغيرها من الجزيئات التتبع غشاء كتيمة من مختلف الأحجام، مثل مانيتول والأصفر إبليس، حبوب، وdextrans، والتي يمكن أن يقترن مع الأشعة فوق البنفسجية، فلوري، أو تسمية المشعة لقياس ومقارنة معدلات النفاذية (P التطبيق) إلى معروف قيم هذه المواد المذابة. عند تقييم النقل paracellular، فمن المهم استخدام جزيء التتبع التي هي أصغر من مركب نقل قيد الدراسة. على سبيل المثال، فإن النقل paracellular من 200 نانومتر الجزيئات فتح تقاطعات بين الخلايا كافية للتسبب في تسرب paracellular من أصغر، ومع ذلك لا تزال جزيئات كبيرة نسبيا، مثل الزلال المستخدمة في مثالنا. في المقابل، ينبغي تقييم النقل paracellular من أصغر السيارات تسليم المخدرات مثل dendrimers (~ 5 نانومتر) باستخدام جزيئات <5 نانومتر، مثل مانيتول. لذا تشير الدراسات تسرب Paracellular حجم افتتاح تقاطع الخلية، ولكن نظرا لمرات حضانة طويلة أنهم لا يستطيعون تحديد اضطرابات عابرة من junc الخليةستعقد.

طريقة أخرى لتقييم سلامة الحاجز هو صورة منعطفات ضيقة التي تربط الخلايا المجاورة. في هذه الدراسة، ونحن immunostained occludin لمضان المجهري، ولكن العديد من البروتينات الأخرى الموجودة في مفرق ضيق يمكن استخدامها لهذا التحليل، بما في ذلك البروتينات عبر الغشاء من جزيء التصاق تقاطع (JAM)، claudin، والأسر occludin. هنا، ونحن ملطخة المجال خارج الخلية لتجاوز خطوة permeabilization، ولكن يمكن أيضا أن تكون ملطخة المجالات داخل الخلايا. تكميلية لهذا هو استخدام ضوابط لتلطيخ غير محددة، وذلك باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية فقط، وغياب منعطفات ضيقة (هنا، استخدمنا خلايا مع أحادي الطبقة تظهر انخفاض طير)، أو اختلال منعطفات ضيقة باستخدام عوامل تحوير تقاطع المدرجة أعلاه.

في مثالنا النقل بطريق الظهارة نستخدم نكس-1-ICAM المستهدفة، ولكن النظام transwell أيضا يستوعب النقل الأخرى صياغة مركبة المخدراتق، والمركبات العلاجية والتشخيصية، ومركبات فطرية وجدت في الجسم، أو مزيج مما سبق، مع آثار قيمة لدراسات سريرية أو فهم مسارات الأساسية. الطرق وصفنا لقياس النقل عبر الطبقات الوحيدة الخلية تنطوي وضع العلامات النظائر المشعة وكيل استهداف أو البضائع العلاجية في معطف NC، ولكن يمكن أيضا أن هذه الاستراتيجية أن تستخدم لتتبع البلاغات الوطنية مع كيمياء متنوعة والهياكل، بما في ذلك البوليمرات الخطية أو تشعبت، dendrimers، والجسيمات ، المذيلات، الجسيمات الشحمية، الخ 4،5،28،29. هي نظائر مختلفة (على سبيل المثال 125 I، H 3، 32 ف، الخ) المتاحة لقياس نقل مجموعة واسعة من الجزيئات الصغيرة والكبيرة: ناقلات المخدرات فحسب، بل أيضا العلاجات الكيميائية والبيولوجية، دون أن يؤثر ذلك على سلامة وظيفية أو الهيكلية لل المجمع، على عكس التسميات الفلورسنت ضخمة. يوفر Radiolabeling حساسية أكبر كمية وسرعة مقارنةإلى غيرها من الاستراتيجيات التي تقيس النقل، مثل هلام الكهربائي، PCR، مطياف الكتلة، HPLC، ومضان الطيف. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التسمية لتحديد درجة التدهور (مثل البروتين استهداف وكيل والبضائع في مثالنا) من خلال تقييم محتوى اليود الحرة، والتي هي سريعة ودقيقة مقارنة المقايسات نشاط البروتين البديلة، بما في ذلك القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية وصمة عار الغربية. ومع ذلك، منذ اليود الحر لا تعكس تماما التغييرات في البروتين التشكل أو النشاط الذي قد يحدث في غياب تدهور، ويمكن استخدام الطرق البديلة أعلاه لمزيد من تقييم سلامة المواد المنقولة. أيضا، عند إدارة المركبات مع النظائر المشعة حرة في غرفة القمي، أنه من غير الواضح ما إذا كانت التسمية موجودة في أحادي الطبقة الخلية وكسور نقل تنجم عن تدهور البروتين الحقيقي أو نشر اليود خالية من مساحة قمية. للتحايل على هذا القيد، يجوز للتركيز NC قميةأن تطبق لفترة زمنية وجيزة للسماح لجمعية أحادي الطبقة الخلية، تليها إزالة المتوسطة قمي في مقابل متوسطة جديدة، وفترة مطاردة لتقييم النقل. على الرغم من أن كمية النظائر المشعة خالية من التجمع الأصلي قد تسرب في البداية إلى كسور أخرى، يمكن تحديد هذه القيمة من العينات مع عدم وجود فترة مطاردة وتطرح من الظروف التي تنطوي على فترة المطاردة.

من حيث تقييم آلية النقل، وصفت نفس الأساليب للتحقق من صحة سلامة أحادي الطبقة (طير، المقايسات التسرب، وضيق تقاطع تلطيخ) يمكن استخدامها لتقييم مسار paracellular. للنقل العابر للخلايا، مثبطات الدوائية المحددات المتورطين في الاتجار داخل الخلايا (على سبيل المثال ترانسفيرين المرتبطة مسارات بالكلاذرين والكوليرا السم B المرتبطة مسارات caveolar، الخ) يمكن استخدامها، حيث تركيزات فعالة لمنع وتحديدا تلك المحددات في حاجة رس يتم توضيح لكل نظام. وتشمل بدائل لمثبطات المستخدمة في دراستنا الكلوربرومازين ونضوب البوتاسيوم ومحددة لتعتمد على بالكلاذرين الإلتقام، والجينيستين وميثيل β-cyclodextrin (MβCD)، محددة لامتصاص بوساطة caveolae 30. الاستراتيجيات الأخرى التي قد تجنب الآثار المحتملة غير محددة من مثبطات الدوائية تنطوي شارك التعريب من البضائع المنقولة مع هذه المحددات باستخدام مضان أو وضع العلامات النظائر المشعة، والاستفادة من بروابط معينة وضوابط (على سبيل المثال ترانسفيرين أو بكتيريا الكوليرا B، كما هو مبين أعلاه)، وسيرنا لضربة قاضية للتعبير عن العناصر التنظيمية من هذه المسارات.

في هذه الدراسة، ونحن لشرح المعادلات لتحويل بيانات النشاط الإشعاعي لمختلف المعالم التي توفر المعلومات الأولية الأساسية المتعلقة النقل بطريق الظهارة. على سبيل المثال، يتم تمثيل درجة النقل بطريق الظهارة بواسطة نكس أو الجزيئات المنقولة في كل خلية، ويمثل كفاءة نقل المحتوى الذي يربط أو يدخل الخلايا عن طريق نسبة البلاغات الوطنية المرتبطة الخلية أو الجزيئات نقلها، ومعدل النقل، والذي يسمح للمقارنة بين المواد المذابة من نفاذية مختلفة، وتدل عليه P التطبيق. من أجل فهم إمكانات البلاغات الوطنية المستهدفة للتسليم على نطاق واسع من العلاجات (مثل الجرعة اللازمة لفي الجسم الحي الإدارة)، يجوز تعديل هذه المعادلات لتقدير القيم النقل على نطاق والعيانية. على سبيل المثال، كمية من البضائع المنقولة العلاجية في وحدة المساحة من الأنسجة المعوية (ملغم / سم 2) وكذلك تنفيذ محتملة عبر الجهاز الهضمي للمريض ويمكن تقدير من المعادلات التالية،
البضائع المنقولة الشامل / سم 2 الأنسجة = (CPM basolateral / النشاط النوعي) / A
البضائع الشامل نقلها عبر الأمعاء الدقيقة = [(CPM basolateral / النشاط النوعي) × TA] / A

ve_content "> حيث يمثل النشاط النوعي قياس وحدة CPM / كتلة البضائع (انظر البروتوكول، خطوة 3.1)، وTA يمثل مجموع سطح الاستيعابية من الأمعاء الدقيقة (2،000،000 سم 2). ولذلك، فإن البيانات الناتجة من طرقنا يعطي ترتفع إلى مجموعة واسعة من التحليلات الكمية الممكن أن تصف وسائل النقل في المصطلحات ذات الصلة.

تتقدم من إدراج transwell، النماذج التي تعكس على نحو أفضل التعقيد الفسيولوجية النقل تشمل "Ussing" الغرف والأجهزة ميكروفلويديك، والتي توفر تدفق السوائل الحيوية وغرفة الوارد أن يقلل من ملامسة الهواء، كما هو الحال في الأوعية الدموية. تسمح هذه النماذج أيضا إإكسبلنتس الأنسجة ليكون مثقف لالسابقين الدراسات المجراة، قبل التحقق من صحة في الجسم الحي 17،18.

في الختام، قدمت الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة معلومات أولية قيمة فيما يتعلق بنقل نظام تسليم المخدرات النموذج، من حيث efficieNCY، وعبر الطبقات الوحيدة الخلية. باستخدام هذا النموذج خلية ثقافة أثبتنا إمكانات منصة nanocarrier استهدفت ICAM-1-في سياق تقديم الأدوية عن طريق الفم، مما يمهد الطريق لاحقة في الدراسات المجراة، ومع ذلك يجوز تعديلها للأنظمة الأخرى التي تتطلب النقل عبر الحواجز الخلوية وجدت في الجسم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الزمالة من معهد هوارد هيوز الطبي والمؤسسة الوطنية للعلوم إلى RG، والأموال التي منحت لSM من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنحة R01-HL98416) وجمعية القلب الأمريكية (المنحة 09BGIA2450014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transwell inserts BD Falcon 353095  
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x Cellgro 10-013-CM  
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-015-CV  
Pen Strep Gibco 15140  
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells ATCC HTB-37TM  
125Iodine Perkin Elmer NEZ033H002MC Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco 14190-235  
Bovine Serum Albumin (BSA) Equitech Bio BAH-66  
Paraformaldehyde (16%) Fisher Scientific 15710  
Mouse Immunoglobulin G (IgG) Jackson ImmunoResearch 015-000-003  
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) Marlin 1987  
α-Galactosidase, from green coffee beans Sigma G8507-25UN  
FITC latex beads, 100 nm Polysciences, Inc. 17150  
Triton X-100 Sigma 234729-500ML  
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific SA433-500  
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human Santa Cruz Biotechnology Sc-27151  
Monodansylcadaverine (MDC) Sigma D4008  
Filipin Sigma F9765  
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) Sigma A3085  
Wortmannin Sigma W1628  
Gamma counter Perkin Elmer Wizard2  
Volt-ohm meter World Precision Instruments EVOM2  
TEER electrodes World Precision Instruments STX100 Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS) Malvern Nano-ZS90  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
  2. Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
  3. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
  4. Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
  5. Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
  6. Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
  7. Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
  8. Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
  9. Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
  10. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
  11. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  12. Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
  13. Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
  14. Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
  15. Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
  16. Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
  17. Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
  18. Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
  19. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
  20. Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
  21. Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
  22. Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
  23. Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
  24. Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
  25. Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
  26. Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
  27. Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
  28. Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
  29. Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
  30. Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 80، المستضدات، الإنزيمات والبيولوجية العلاج، الهندسة الحيوية (عامة)، المستحضرات الصيدلانية، المواد ضخم الجزيئات، التداوي، والجهاز الهضمي والفم الفسيولوجية الظواهر والبيولوجية الظواهر، خلية الفسيولوجية الظواهر، ونظم تسليم المخدرات، nanocarriers المستهدفة، والنقل العابر للخلايا، الظهارية الخلايا، ومنعطفات ضيقة، المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة، الإلتقام، transcytosis، تتبع النظائر المشعة، المناعية
نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaffarian, R., Muro, S. Models andMore

Ghaffarian, R., Muro, S. Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers. J. Vis. Exp. (80), e50638, doi:10.3791/50638 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter