Summary
许多治疗应用需要药物载体及其货物横跨在体内细胞屏障的安全，高效的运输。本文介绍的方法，建立一个适应，以评估药物纳米载体（NCS）跨细胞屏障，如胃肠道（GI）上皮细胞的转运速率和机制。
Abstract
亚微米载体（纳米载体; NCS）通过改善溶解性，稳定性，循环时间，靶向，和释放增强药物疗效。此外，穿越在体内细胞屏障是为口服给药治疗的NC进入流通和运输从血液进入组织，在需要干预至关重要。 （i）该细胞旁路线通过该互锁相邻细胞，或（ii）在跨细胞途径，其中材料是通过细胞内吞作用内在化，在整个细胞体运送，而分泌的结的瞬态干扰，：跨细胞屏障转运的NC被实现在相对的细胞表面（transyctosis）。跨细胞屏障递送可以通过偶联治疗剂或它们的载体与特异性结合到参与运输的细胞表面标志物的靶向剂来促进。这里，我们提供的方法来测量的程度和NC传输的机制跨越模型细胞屏障，WHI通道由胃肠道的单层（GI）的上皮细胞生长在位于一个transwell小室插入一个多孔膜。的渗透性屏障的形成是通过测量跨上皮电阻（TEER），控制物质的跨上皮转运和紧密连接的免疫染色证实。作为一个例子，〜200 nm的聚合物纳米晶的使用，它携带一种治疗货物和涂有靶向的细胞表面决定簇的抗体。所述抗体或治疗性的货物被标记的125 I放射性同位素示踪标记和纳米晶加入到上室在细胞单层的时间期限不同。相关的细胞和/或输送到底层室的NC可以被检测到。免费125我的测量允许的退化分数的减法。该旁路线是通过确定所造成的NC输送到上述的势垒参数的电位变化进行评估。跨细胞运输我s由寻址调节内吞作用和胞转作用途径的作用决定的。
Introduction
细胞屏障在体内充当外部环境和内部隔室之间的网关。这是上皮衬里分离胃肠（GI）道和血液1-3的外部暴露表面上的情况。细胞屏障也代表了血液和软组织及组织和器官的细胞成分之间的界面。这是用于在血管，如血肺屏障，血-脑屏障等在内的内皮衬里的情况下1遍历这些细胞屏障在身体的能力对于有效递送治疗剂和诊断剂的关键为那些需要干预的循环和组织/器官。
以改善递送治疗或诊断剂，这些化合物可以被加载到亚微米的纳米载体（NCS）。这些药物递送载体可以与各种被配制化学和结构优化药物的溶解度，保护，药代动力学，释放和代谢4,5。纳米晶也可官能化亲和或靶向部分（ 如抗体，肽糖，核酸适体等 ），以促进粘附到那里的治疗作用是必需的2,6身体的区域。 NC的靶向表达的细胞屏障的表面上的决定可以进一步便于运输进入和/或在这些衬片2,6。
两个环境之间选择性地运送物质的作用需要细胞间层的某些独特的功能。一个这样的功能是细胞极性，从 而面临着腔的内腔的顶膜从基底外侧膜面向组织间质的变化时，相对于膜的形态和脂质，转运蛋白，受体和2的组合物。另一个特点涉及到细胞间junctioNS连接相邻细胞。形成紧密连接，特别是连接粘附分子（卡纸），occludins和claudins蛋白的调节，调节的屏障功能，以选择性地允许或没有的细胞，称为细胞旁转运之间的物质运输，允许材料从内腔通道到基底外侧空间3。许多天然的和合成的元素（白细胞，分子，粒子和药物递送系统），以在体内细胞屏障的结合可诱导细胞结开口，这可能是短暂的，相对无毒或更长时间的，因此，与不安全的访问跨越障碍2,5,7-9不需要的物质。因此，该途径可通过测量跨上皮电阻（TEER）和分子的被动旁细胞扩散（在本文中称为旁泄漏）进行评估，从而阻力下降到的电流或INE的增加细胞旁漏RT复合成的基底空间指示开幕细胞交界处，分别为5,10,11。为了配合这些方法，任何上面列出的紧密连接蛋白的可染色，以评估其诚信，染色的地方应该会出现集中在细胞与细胞边框四周的细胞外围5,10,12。
可替换地，药物递送系统针对特定的细胞表面决定簇，如那些相关联的网格蛋白小窝或烧瓶形膜内陷称为小窝，可能引发水泡性口摄取到细胞通过内吞作用，提供了一个途径药物递送至细胞内区室5， 13。此外，细胞内吞作用可能导致拐卖整个细胞体囊泡释放的基底侧，这种现象称为transyctosis，或跨细胞运输14。因此，内吞作用的动力学和机制的知识可能被用来利用细胞内的一个ND跨细胞给药，它提供了一个相对安全和控制下交付模式相比，旁路线。内吞作用的机制可能与经典途径（网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用）或者非经典途径的调节剂进行评估（如细胞粘附分子的情况下（CAM） -介导的胞吞作用）5,13,15 。
而细胞内运输往往是研究标准井或盖玻片，没有一个基底室的排除细胞极化，研究运输跨越细胞层的能力。为了克服这个障碍，跨细胞单层转运已久使用Transwell小室10,11,16,17，它由一个上（顶）腔室，一多孔可渗透膜，其中细胞附着和形成紧密的单层和下研究（基底）室（ 图1）。在这种结构中，运输可以在被测量心尖至基底外侧通过施用治疗入上腔体，通过细胞单层，并在下面的多孔膜下面的运输，并最终收集培养基中的下腔室用于输送物料的定量方向。运输在基底外侧至顶端的方向也可以通过最初给药测定从上部腔室5,10,12,16的下部腔和随后的集合。各种技术存在以验证渗透性屏障的上转孔，包括TEER和细胞旁转运测定法形成的，如上面所述。此外，可渗透的过滤器上的细胞进行培养可用于成像分析（ 例如，通过荧光，激光共聚焦，电子显微镜）被除去，因为该细胞单层模型的进一步验证，以及传输的机制。选择膜类型，它可在不同的孔尺寸，材料和表面区域的，取决于各种实际RS诸如物质的大小或者被运送的物体，细胞类型和成像方法16,18-20。 Transwell小室也便于控制和准确的运输量化比较复杂的哺乳动物系统中，作为商会和细胞表面积体积是已知常数。而参与体内输送许多因素被消除，包括肠粘液的存在，剪切应力，消化酶，免疫细胞等 ，这种小规模的体外模型提供有关运输有用的初步信息。
作为一个例子来说明这些方法的适应性研究数控运输跨越细胞屏障10,11,16,17，我们在这里描述的地方为整个胃肠道上皮细胞的NC迁移的潜力为蓝本通过评估模型药物输送通道的情况下系统通过人上皮结肠直肠腺癌（Caco-2细胞）的细胞单层。为了这个目的，C细胞l培养于Transwell小室，在0.8微米孔径的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的过滤器（6.4毫米直径），它是透明的，并且可以用于显微镜成像。渗透性屏障的状态，通过测量TEER，控制物质，白蛋白，并且紧密连接，occludin的蛋白中的一个元素的荧光显微镜目测的心尖至基底外侧运输进行了验证。有针对性的聚合物数控的模型时，由100纳米，生物降解聚苯乙烯纳米颗粒。纳米晶是由表面吸附有单独的靶向抗体或靶向抗体的结合和治疗的货物，其中任一组分可以被标记的125 I放射性同位素示踪包衣。在选定实施例中，所述抗体识别细胞间粘附分子-1（ICAM-1），蛋白质胃肠上皮的表面上表达（和其他）细胞，其已经显示出促进细胞内和跨细胞转运ö f药物载体及其货物21。货物是α-半乳糖苷酶（α-半乳糖），用于治疗法布里病，一种遗传性溶酶体贮积症22的治疗酶。
该涂层NC的大小约为200纳米，被添加到心尖部室对细胞单层培养在37℃期限不同的时间，在这之后125我对NC的可检测相关的细胞单层和/或输送到下面的细胞基底外侧腔室。额外的决心免费125我的允许涂层数控运输的退化分数和估计的减法。传输的机制是通过检查变化有关的细胞旁路线的通透性屏障，通过上面描述的参数，而跨细胞运输是通过调节内吞和胞转的通路时，检查改变传输确定进一步评估。
ontent“>这些方法提供关于蜂窝障碍模型的有价值的信息，药物递送系统的运输的程度和速率，并且这样传输的机制，完全允许跨细胞屏障的药物递送的潜力的评价。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。培养在Transwell小插入一个细胞单层
- 在无菌，生物安全2级细胞培养罩，放置0.8毫米毛孔的PET Transwell小室在24孔板（4每口井条件，统计显着性），用血管钳。所有进入罩的材料应与消毒乙醇。
注意：需要的过滤器的孔径，在符合被选择为在NC中使用的平均尺寸，从而使运输穿过细胞膜。另外，对于显著结果，各实验条件需要相同的实验中的最低的4个重复（孔），和至少3个独立实验。
- 制备含有补充用4.5克/升葡萄糖，15％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM培养基的细胞培养液，并加热至37℃的水浴中。
- 稀人上皮大肠腺癌（Caco-2细胞）细胞在细胞培养基和地点200-400微升的细胞溶液进入的transwell插入物的上（顶）室，在1.5×10 5个细胞/ cm 2的密度。 900微升细胞培养基 - 700填补较低（基底）室。
- 培养细胞在37℃，5％CO 2和95％湿度下16-21天，更换在上部和下部腔室中的介质，每3-4天，使用在步骤1.3所表示的体积。从下腔室吸出培养基，从上部腔室吸出培养基，注入新鲜的培养基中的上腔室，并填入下部腔室有：在以下，以保持上述（而不是下面）细胞单层中的压力取代介质新鲜培养基。
2。胃肠上皮通透性屏障使用跨上皮电阻（TEER）和免疫染色紧密连接的验证
- 对于短期存储（不超过2个星期），淹没STX100电极在电解质溶液化（0.1-0.15米氯化钾或氯化钠）。电极电缆连接至EVOM电压电阻计电极端口，以便该系统是内部短路和电极对称性保持不变。对于长期储存，冲洗用DH 2 O和存放在干燥，避光条件。
- 消毒电极，浸入在乙醇中15分钟，并允许在空气中干燥15秒。或者，所述电极可以被存储在一个紫外线罩。冲洗电极在无菌电解质溶液（磷酸盐缓冲盐水，PBS）或0.1-0.15摩尔KCl或NaCl溶液中，每个电阻测量之前。
- 用伏特 - 欧姆计设定为电阻设置，垂直放置的电极在井含有的transwell插入物，具有在上部腔室的短电极和在下部腔室触及孔底部的长电极。每口井;一旦EVOM读数稳定后，记录电阻值（Ω（欧姆）给出）。
- 计算电阻率（resistanCE归区域;厘米2）减去背景阻力Transwell小室无细胞（TEER）和膜表面积乘以样本Ω×。电阻率值是最经常在文献中报道。 （见讨论）
- 重复测量，每隔1-2天，直到TEER值上升到最高和高原，表明形成了渗透屏障，它通常需要2-3周的细胞编结的时刻。高原TEER值和必要的时间来实现屏障的完整性可以根据细胞传代次数而变化。
- 以验证紧密连接的细胞单层的存在下具有高的TEER（等于或大于为势垒形成的阈值）时，通过培养用冷的2％多聚甲醛固定15分钟，固定细胞。然后，在室温下用1微克/毫升抗紧密连接蛋白用PBS洗涤细胞，并培育他们30分钟。用PBS再次洗涤细胞，并用7.5微克/毫升f孵蛋30分钟，在室温下luorescently标记的第二抗体。使用井低TEER作为阴性对照屏障的形成。
注意：作为一个替代的抗紧密连接蛋白中，可以使用抗体来替代紧密连接蛋白。
- 仔细切除其上固定单层附着在过滤膜，并安装使用上或落射荧光共聚焦显微镜载玻片成像。
3。评估目标的载体跨上皮转运
- 标记的靶向抗体（小鼠单克隆抗ICAM-1抗体，抗ICAM，在这个例子）与125 I，如前所述7。标记抗体的使用Bradford测定法来估计蛋白质浓度和γ计数来确定该抗体的125 I含量，然后计算出在每分钟（CPM）的计数的比活性/毫克。
注：为了控制特异性，重新通过标记小鼠IgG，这将被用于制备非靶向涂覆纳米晶泥炭的过程。研究的治疗性货物运输，在本例中重复该步骤标记的货物，例如，α-半乳糖苷酶（α-半乳糖）。替代方案可用于靶向剂，非特异性对照，或治疗性的货物。可供选择的方法也可以用于标记的化合物和估计的标记对应的浓度。
- 夫妇标记靶向抗体（抗ICAM在我们的例子），以纳米晶的表面。在这个例子中，孵育聚苯乙烯纳米珠（100纳米直径）为1小时，在室温下，用125 I-抗ICAM允许表面吸附，如所描述7。
注：对于非特定的控制使用125 I-IgG抗体。要跟踪货物的运输，使用靶向抗体和125 I标记的货物（α-半乳糖在我们的例子）的组合。
- 离心机以13,000×g离心3分钟，并通过抽吸除去上清液中的未涂覆的同行。重悬含有用1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS中通过移液，超声在低功率扰乱潜在的颗粒聚集体（20-30简要脉冲）涂覆的纳米晶沉淀。
- 数控表征，测量尺寸，多分散性，和使用动态光散射（以下供应商的说明）涂覆颗 粒的ζ-电势，和量化的数的125 I-标记的在粒子表面上靶向抗体分子（ 如抗ICAM），使用伽玛计数器。
注意：这些方法可以被重复用于非特异性和治疗的同行。大约200纳米涂覆的颗粒的尺寸范围内。
- 加入125 I-NC的抗体，（ 如 125 I-抗ICAM纳米晶; 56 NCI /毫升），以上述融合的Caco-2细胞单层与跨膜电阻及上腔＃8805; 350Ω×2厘米（见讨论）在背景（16-21天后播种）。在37℃下的一个或多个所需的时间间隔。之前和之后孵育测量TEER（第2.3节），以评估NC的对渗透性屏障的作用。
注意：此过程可以重复进行非特异性和治疗的同行。
- 从上，下腔收集培养基，于37℃（上院）或1毫升DH 2 O（下腔）用0.5毫升的DMEM一旦把它们洗干净。用γ计数器收集洗涤液总放射性同位素含量的测定。
- 对于细胞级分进行测定，用剃刀刀片切割的边缘，并孵育在γ计数管，用1％的Triton X-100的10分钟（以释放细胞内容物），测定细胞前切除的透气性过滤器， 例如相关的总放射性。
- 为了测量125我重新在运输过程中的NC或租赁由于潜在的降解，第一混合300微升的样品（从上，下，或细胞级分）与700微升PBS中的3％BSA和200微升三氯乙酸（TCA）。在室温下孵育15分钟。另外此时，测量该样品的在γ计数器中的总放射性。
- 离心机TCA样品在3000×g离心5分钟，以从蛋白质降解或125 I部分（上清液）分离完整蛋白质（粒料）。量化免费125我分数的放射性和减去总放射性这个值离心前测量。这将提供标记的蛋白质的未降解的量。
4。靶向纳米载体的跨上皮转运机制
- 标签在3.1节中描述并预先用125 I白蛋白报7。
注：白蛋白是66.5kDa的蛋白质，因此，相对大的物质。虽然较大的对象（例如200 nm的纳米晶用在这里）的被动转运有效的控制，应该学习较小的药物载体转运时被较小的惰性示踪剂分子（见讨论）。
- 使用白蛋白旁漏，培养的Caco-2细胞单层上，如上所述的transwell插入物评估细胞旁转运。
- 到上面的细胞单层上腔介质，添加或125单独的I-白蛋白（阴性对照，显示泄漏的基础水平），或125 I-白蛋白和非放射性标记的抗体靶向纳米晶（如在第3.5节中所述）。在37°C为选定的时间间隔（S），这应与测试数控交通工具时检查。前测量TEER（2.3节），在此期间，和孵化后，然后收集所有组分总125我和免费125 I测量所示，第3节中说明：伴随另外的125 I-白蛋白和非放射性标记的对照IgG纳米晶可以被用作对照。
- 作为阳性对照用于打开间连接中，添加含细胞介质5mM的H 2 O 2到Transwell小插入物的上部和下部腔室，并在37℃下进行30分钟。然后，测量TEER（2.3节），并加入125 I-白蛋白选定的时间间隔上院。测量TEER在整个孵化不同的时间点，以确定引起H 2 O 2诱导的开幕细胞连接的TEER值衰减。
- 在平行实验，评估跨细胞运输，也被称为胞转，125 I-NC的针对性孵化融合的Caco-2细胞单层带为50微米monodansylcadaverine（MDC;抑制网格蛋白介导的内吞作用），1微克/毫升律平（抑制剂胞膜窖介导的内吞作用），0.5μM沃特曼在（抑制剂的磷脂酰肌醇3激酶PI3K]，参与巨胞饮作用），或20μM的[5 - （N-乙基-N-异丙基）阿米洛利]（EIPA，抑制剂巨胞饮作用和CAM介导的内吞作用15）。
注意：125 I-IgG的纳米晶和125 I-白蛋白可作为对这些抑制剂的作用阴性对照，以及其他方法（例如siRNA的技术），可以提供更多的选择性抑制。
- 测量TEER之前（第2.3节），在此期间，与细胞抑制剂和放射性材料的温育后，作为一个额外的控制的抑制剂在单层通透性的影响。
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Representative Results
作为我们的细胞模型，研究对象NC的跨上皮转运的验证， 图2示出的Caco-2细胞单层镀以1.5×10 5个细胞/ cm 2的密度达到汇合〜第12天，并保持单层完整性达18天，通过跨膜电阻（ 图2A）表示。这是由occludin的阳性紧密连接的细胞单层用高TEER（390Ω×cm 2时，第14天）的存在（ 图2B）进行验证，相比于低TEER差的紧密连接标记（17Ω×cm 2时，第5天）。
数控元素的放射性标记的示踪确定这些组件输送到基底侧的总量（NC靶向抗体或货物）最初添加到心尖室中，其单元格相关联组分，它们的级分。这些值可以被用来计算描述NC传输的各种参数更多相关的方式，特别是每个分数，它代表退化同行免费125我的内容相减后。例如，抗体分子，货物分子，或者是横向的细胞单层，可以计算估计的绝对传输关联的NC的数目。此外，所述分子或NC的被输送到基底外侧边相对于相关联的细胞单层分子或纳米晶的总数量的百分比，估计的效率，所述传输。最后，表观渗透系数（P 应用程序 ），用于传输的速率的标准参数，可以进行估计。这些参数的计算，因为它如下所示：
分子运输或运输的NC = CPM 基底 ×（分子添加或NC 添加 / CPM 添加 ）
％分子或NCS运= 100×[CPM 基底 /（CPM 基底 + CPM细胞分数）]
P 应用程序 （厘米/秒）=（CPM 基底 ×卷）/（A×T×CPM 添加 ）
其中CPM是125 I计数每分钟加入到上室（CPM 加 ），单层细胞分数（CPMcell分数），或下腔室（CPM 基底外侧 ），与NC 添加或附加的分子是NC的数目或开始时加入到上室分子中，A是在过滤膜的表面面积（cm 2），卷。是培养基中的上腔室（毫升）量，t是培养时间（s）。
在我们的例子中，当放射性同位素标记的靶向抗体，这种分析揭示的程度和运输的效率在抗体或NCS每个细胞和细胞单层相关抗体或共运送该NC的百分比运输方面（ 图3A和图3B ），因为我们LL运输中的对应用程序 （ 图3D）条款的速率。这些参数，估计在我们的例子中为125 I-抗ICAM NCS，也与那些比较器125的I-IgG的纳米晶表现出相对传输效率，以一个非目标的对应（ 图3C和3D）的。
当放射性标记掺入在NC货物时，所述参数反映了货物，这在我们的例子是α-半乳糖的酶，用于治疗遗传溶酶体贮积症称为法布里病（ 表1）中的传输。除了 计算NC传输通过跟踪所述货物，跨上皮这种治疗酶的递送可以被估计， 例如 ，通过表达它作为分子的α-半乳糖每个细胞输送或质量。
最后，这种方法属性的运输途径的旁路线或跨细胞途径。例如，在我们的例子中，EIPA减少125在Caco-2细胞单层的I-抗ICAM NCS（ 图4A）运输，而MDC，非律和渥曼青霉素并没有减少运输水平相对于对照条件（无抑制剂）。这表明，抗ICAM奈米利用CAM-介导的胞吞作用进行跨细胞运输，但不是网格蛋白，胞膜窖-或巨胞饮作用相关的胞转。此外，细胞旁转运使用TEER（ 图4B）的测量和白蛋白被动运输（ 图4C）被排除，从而在TEER的降低，并增加了白蛋白旁漏入下腔室的抗ICAM NC的运输期间将有间连接的指示中断。然而，孵化与抗ICAM的NC没有改变TEER或125 I-白蛋白旁漏了一段48小时，类似的，以控制不运的IgG NC的。如的阳性对照孔的细胞连接和细胞旁转运，H 2 O 2减少TEER的基础水平以及显着增强的125 I-白蛋白渗漏到基底外侧腔室。
图1。示意图跨越胃肠道上皮细胞模型有针对性的纳米载体的跨膜运输（A）作为研究跨上皮转运的平台，Caco-2细胞单层上Transwell小室培养，直到紧张的单层形成（16-21天后播种，TEER ≥350Ω×2厘米以上的背景）。药物递送载体，如125 I-抗ICAM NC的一个例子，将被添加到上部（顶）腔室上方的细胞单层以研究运输跨细胞和通过底下的多孔膜。在下部（基底）腔室中的介质，然后收集用于输送物料的定量。通过细胞单层（B）运输通过一根旁或跨细胞/ transcytosis的路线发生。从Ghaffarian等转载，J.控制相对。163（1），25-33（2012）。 点击这里查看大图
图2。 Caco-2细胞单层的典范跨上皮转运。Caco-2细胞上生长的transwell插入物在1.5×10 5个细胞/ cm 2。 （A） 的跨上皮电阻（TEER）进行测量，以评估单层的完整性。数据显示为平均值±SEM，N = 3。 （二）荧光紧密连接的显微镜免疫标记与抗occludin和德克萨斯红标记的二抗，上5天或14（低与高TEER值，分别）。从Ghaffarian等转载，J.控制相对。163（1），25-33（2012）。 点击这里查看大图
图3。在Caco-2细胞单层的抗ICAM纳米载体传输。汇合Caco-2细胞上生长的transwell插入物的单层培养与125 I-抗ICAM奈米或125 I-IgG的纳米晶加入到心尖室。在基底外侧腔室（AC） 的125 I含量测量在指定的时间点，来计算NC的运输量每个细胞orted（见代表性成果）。输送NC的（B）的百分比计算为发现在基底外侧部分，以在该基底结合和细胞组分的载体的比率。 （ 四）表观渗透系数（P 应用程序 ）的计算方法为以代表结果描述，反映了125 I-抗ICAM奈米或125 I-IgG抗体的NC运输费率。数据显示为平均值±SEM，N = 4。从Ghaffarian等转载，J.控制相对。163（1），25-33（2012）。 点击这里查看大图
图4。的传输机制的在Caco-2细胞单层NTI-ICAM纳米载体（A）的125跨融合的Caco-2细胞单层I-抗ICAM NC的跨细胞转运于24小时在20μm进出口许可证法存在与否进行评估，1微克/毫升律平， 50微米MDC，或0.5微米渥曼青霉素。 （B）被TEER 125在Caco-2细胞单层的I-抗ICAM NC的运输过程中的测量，以评估细胞旁转运。在没有NC的TEER值显示为对照（虚线间隔马克的平均值SEM）。孵化与5 mM的H 2 O 2为阳性对照，用于打开细胞间连接的。 （C）细胞旁蛋白渗漏，测得的125 I-白蛋白的表观渗透系数（Papp的）穿过单层细胞在5mM H 2 O 2，IgG的纳米晶，或抗ICAM纳米晶的存在或不存在，进行测定，并计算为在图3中，数据是节目n作为平均值±标准误差，N≥4。从Ghaffarian等转载，J.控制相对。163（1），25-33（2012）。 点击这里查看大图
| 总的NC关联/ 细胞 | 细胞内的NC /电池 | 运输的NC /电池 | 载运％ | 运输时，α-半乳糖分子/ 电池×10 5 | 皮克运输/ 电池×10 -3 | PAPP（×10-8厘米/秒）的 | |
| 3小时 | 663.4±116.0 | 434.0±76.8 | 243。6±15.4 | 44.4±6.7 | 1.8±0.2 | 9.7±1.2 | 8.1±1.1 |
| 24小时 | 2024.8±409.3 | 1218.9±255.6 | 806.9±164.1 | 40.6±2.0 | 3.9±0.5 | 21.3±2.5 | 1.9±0.4 |
| NCS =纳米载体，α-半乳糖=α-半乳糖苷酶，总的NC关联/电池=细胞内的NC /电池+ NCS运输/格;％载运=（NCS运输/总奈米相关）×100，P = 应用程序的表观渗透系数（厘米/秒）。见方法对这些参数的进一步描述。数据显示为平均值±SEM（每组8个孔）;（TNF-α的Caco-2细胞）。 | |||||||
表1中。 α-半乳糖的跨膜运输通过抗ICAM纳米载体抗ICAM / 125 I-α-半乳糖NC的跨越CON。跨细胞运输流利的Caco-2细胞单层于3小时和24小时评估。心尖，基底和细胞组分的放射性同位素含量转换为相关运输各种数值，如代表性的成果介绍。从Ghaffarian等转载，J.控制相对。163（1），25-33（2012）。
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Discussion
使用上面讨论的方法中，细胞模型用于研究跨细胞屏障靶向NC的传输可以被建立，例如提供的Caco-2上皮细胞，这是有关从GI管腔评价运输到血液中的情况下的示例的口服药物传递系统。胃肠道上皮细胞单层在Transwell小室培养启用TEER的测量和紧密连接的荧光免疫染色，以确认形成的细胞渗透屏障。随后，定位和治疗药物的125単我提供了有针对性的纳米晶的快速，灵敏的定量成和整个胃肠道细胞单层。最后，机理研究，利用内吞抑制剂，TEER和白蛋白旁漏检测，以评估交通是否是通过一个水泡路线与一个旁的路由应用。
在建立类似模型的重要参数i细胞类型s的选择，这应该反映所研究的细胞屏障的生理性质。市售16,18-20从人类或动物来源的各种上皮细胞和内皮细胞。这些溶剂可以单独作为单一培养物生长，如下所述，或与其它类型的细胞作为共培养这些细胞（ 例如粘液分泌细胞，免疫细胞，周细胞等 ）16,18-20。在这种共同的文化形式，Transwell小插入条件可调制来调整各自的增长率和要求分化因子在细胞培养基16,18-20。例如，血脑屏障模型可以涉及共培养的脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞或周细胞在多孔过滤器的相反表面上，并且对于每种细胞类型的各媒体应放置在每个腔室19中。此外，根据不同的细胞系，细胞外基质组分可以REQuired进行有效的细胞附着到所述多孔膜18-20。要考虑到每一个特定的模式将呈现不同的基础水平方面的渗透屏障的参数和传输速率和机制，因此控制值需要获得这些方法的每一种情况的优化是很重要的。
Transwell小室，如在这里所描述的，已被广泛用于研究跨细胞单层转运的材料，从心尖到基底外侧隔室或反之亦然 5,10-12,16,17。这不可能通过培养细胞古典井或盖玻片实现，因为这样的系统排除这种形式的运输，因为他们不提供两个独立的隔间，因此可能不会给细胞分选的一个现实的看法。例如，材料自然发往从基底外侧膜释放可能被分流到在盖玻片模型其他细胞区室，使其难以雷索LVE跨细胞转运的机制。此外，与此相反的盖玻片，在transwell小的配置产生了与细胞分化和膜极性10,11,16-19相关的生理学上相关的功能。例如，Caco-2细胞上生长的转孔表现出成熟肠细胞的特征，包括微绒毛的存在和紧密连接，形成圆顶，以及制作刷状缘酶10,11,17。其他参数可以诱导多种生理上相关的表型，如在胃肠道的上皮细胞（ 例如粘液流和收缩运动）和血管内皮细胞（ 例如血流量），可以在转孔用搅动施加或泵10的情况下的剪切应力，16，并共培养以产生必要的生长和分化因子的某些细胞类型16,18-20。然而，必须考虑到的细胞系通常由不同的细胞在机体组织，电子。克，他们可以表达一定的决定因素在不同层面，因此，目前各种不同的职能和法规。例如，Caco-2细胞不包含激活所需的口服治疗剂在体内 ，如CYP3A4，药物代谢酶10,17,23和运输都转运蛋白和酶。在这些情况下，细胞系的亚克隆，转染，或另外的转录试剂可用于调节细胞系，以更好地反映生理条件17,23,24。
中选择最佳的transwell模型，可渗透过滤器的各种特性，必须加以考虑。可渗透的过滤器，可在不同的孔尺寸，范围从0.4-8微米，且必须容纳运送货物的大小。例如，更小的孔径大小（0.4-3微米），通常用于小的化学化合物的运输研究，而孔隙为3μm或更大的用于细胞侵入，车motaxis和能动性的研究，其中的微生物，免疫和细胞迁移被运送。孔径大小和密度也影响细胞密度和分化，一些细胞可能通过毛孔后播种迁移，排除单层形成。另外，透气性支承影响成像清晰度，对细胞活力和单分子层形成的评估，以及细胞附着的材料。聚对苯二甲酸乙酯（PET）的过滤器是透明的，允许相差显微镜下可见，而相比之下，半透明的聚碳酸酯过滤器。用于增强细胞的附着，是市售的预先涂有胶原蛋白或纤连蛋白的可渗透支撑。此外，该过滤器的直径，这被调整为不同的孔板，可能会影响渗透性，从 而更大的直径（ 例如，在6孔板）趋向于增加细胞单层的细胞旁泄漏。
一旦Transwell小模型被建立，包括appropria特选的细胞类型，介质组合物，以及透气性过滤器，所述细胞单层的状态可以使用TEER的培养和试验阶段期间进行评估。然而，TEER值的变化与细胞类型，源和通道数有关的1）先天生物因素; 2）培养条件下，如上述的transwell小的特点，接种密度，培养，培养基组成和pH天; 3）物理因素诸如温度，介质体积，取样时间表，并搅拌/洗涤的程度;和4），其调节细胞连接的完整性（ 例如，细胞因子，免疫细胞，氧化应激，药物添加剂等 ）10的病理和/或化学因素的影响， 16,17。由于影响TEER，最低的基线值，指示屏障的形成必须通过在培养周期和实验操作后定期监测TEER的建立为每个系统中的各种生物和环境因素。 VA被认为足够的屏障形成梅毒，这之间150-1,600Ω×2厘米16范围，也取决于物质的待运的大小，以使该物质的被动旁的扩散受到限制，而跨膜电阻≥350Ω×厘米2似乎排除了相对大的NC如这里（200纳米）所示的那些被动扩散，这未必是对于较小的药物递送系统，其中紧密单层（ 例如，≥700Ω×厘米2）所需要的情况。该基准值也可以使用控件扰乱渗透屏障进行评估，包括H 2 O 2，穿透肽，钙螯合剂（ 如 EDTA），蛋白激酶和磷酸酶，和各种其它调节分子25-27。
补充TEER，许多渗透性试验存在来验证单层的完整性和评估旁TRANSPORT。如白蛋白，各种尺寸的其他不可透过膜的示踪分子，如甘露糖醇，荧光黄，菊粉，和葡聚糖，可以加上一个紫外线，荧光或放射性标记来测量并比较渗透性率（P 应用程序 ），以公知的值，这些溶质。当评估细胞旁转运，使用示踪分子比所研究的化合物输送小是很重要的。例如，200纳米的颗粒细胞旁转运将开放胞间足以导致细胞旁泄漏较小，但仍然相对较大的分子，例如在我们的例子中使用的白蛋白结。相反，较小的药物递送载体，例如树枝状聚合物（〜5nm）的细胞旁转运应使用分子<5纳米，如甘露醇进行评价。因此，细胞旁漏的研究表明细胞连接开口的尺寸，但由于长的温育时间，他们不能识别细胞JUNC的瞬态干扰系统蒸发散。
评估屏障完整性的另一种模式是对图像中的紧密连接是连接相邻的细胞。在这个研究中，我们进行免疫染色occludin的荧光显微镜，还存在于紧密连接各种其它蛋白质可用于这种分析中，包括交界粘附分子（JAM），紧密连接蛋白，和occludin的家庭跨膜蛋白。在这里，我们将染色胞外结构域绕过一个通透的步骤，但胞内结构域也可以染色。补充到这是利用控制对非特异性染色，用荧光第二抗体只使用列出的交界调节剂不存在紧密连接（在这里，我们使用了细胞的单层，显示低TEER），或紧密连接的破坏以上。
在我们的跨膜运输的例子中，我们使用的ICAM-1靶向纳米晶，但Transwell小系统也能兼容其他药物配方车辆运输秒，治疗和诊断的化合物，在体内，或上述的组合，以用于临床研究或根本途径的理解有价值的影响发现先天化合物。我们描述了量化运输跨细胞单层的方法涉及靶向剂或治疗的货物在NC涂层的放射性同位素标记，但这种策略也可用于与不同的化学组成和结构，包括直链或支链的聚合物，树枝状聚合物，粒子跟踪纳米晶，胶束，脂质体等 ，4,5,28,29。不同的同位素（ 如 125 I，3 H，32 P 等 ）可量化的广泛小分子和大分子的运输：不仅药物载体也可化学和生物治疗剂，而不会影响的功能或结构完整性的化合物，不同于笨重的荧光标记物。放射性标记相比提供了更大的定量灵敏度和速度以衡量运输其他策略，如凝胶电泳，PCR技术，质谱，高效液相色谱法和荧光光谱法。该标签也可用于通过评估游离碘的含量，相对于另一种蛋白的活性测定法，包括紫外分光光度法和Western印迹是快速和准确的判断劣化程度（ 例如蛋白靶向剂和货物在我们的例子）。然而，由于游离碘并不完全反映蛋白质构象，或可能发生在不存在退化该活动的改变，上述可供选择的方法可用于进一步评估输送材料的完整性。此外，施用了免费放射性同位素化合物转化为心尖室时，还不清楚在单层细胞并输送馏分中发现的标签是否从实际的蛋白质降解或从心尖空间游离碘的扩散造成的。为了克服这个限制，心尖数控浓度被申请了短暂的时间间隔，使联想到细胞单层，随后以换取新鲜培养基去除根尖介质，和追逐周期评估运输。虽然从原来的泳池免费放射性同位素的量最初可能泄漏到其他部分，这个值可以从样品来判定，没有追逐期间，而且涉及追逐期限中减去。
在评估传输的机制而言，相同的方法中描述的用于验证单层完整性（TEER，泄漏检测，并且紧密连接染色），可用于评价细胞旁路线。对于跨细胞运输，参与细胞内运输的决定因素的药理学抑制剂（ 例如转铁蛋白相关的网格蛋白通路，关联到胞膜窖途径等霍乱毒素B），可以使用，由此有效浓度，以专门抑制这些因素需要吨Ø阐明每个系统。替代在我们的研究中使用的抑制剂包括氯丙嗪和钾耗竭，具体为网格蛋白依赖的内吞作用和染料木素和甲基-β-环糊精（MβCD），具体为胞膜窖介导的摄取30。其他策略可避免药理学抑制剂的潜在的非特异性效应涉及的共定位运送货物的这些决定使用荧光或放射性同位素标记，利用特定的配位体作为对照（ 例如转铁蛋白或霍乱毒素B，如上文所述），和siRNA拦截这些途径的调控元件的表达。
在这项研究中，我们证明方程放射性数据转换到提供有关跨膜传输密钥初步的各种参数信息。例如，跨上皮转运的程度是由纳米晶或分子每单元传送来表示，输送结合或进入细胞含量的效率是由输送细胞相关的NC或分子的百分比来表示，并且传输的速率，这允许不同的溶质渗透率之间的比较，由P 应用程序的表示。为了理解目标的NC用于大规模输送治疗剂（ 例如，需要在体内给药的剂量）的电势，这些方程可被修改以估计在宏观尺度上传输的值。举例来说，一个治疗货物每肠组织的单位表面积（毫克/厘米2），以及横跨在患者的胃肠道中的电位输送输送量可以从下面的公式估算
大规模的货物运输/厘米2组织=（CPM 基底 /比活度）/ A
货物质量跨越小肠= [（CPM 基底 /比活度）×TA] / A运
从Transwell小室行进，模型能更好地反映运输的生理复杂性包括“尤斯灌流”腔和微流体装置，其中提供动态流体流动和密封的容器，最大限度地减少与空气的接触，如在血管。这些模型也允许为培养离体研究之前，验证在体内 17,18组织块。
总之，本研究中使用的方法已经提供了关于模型药物输送系统的输送有价值的初步信息，在efficie方面NCY，跨细胞单层。使用这种细胞培养模型中，我们展示了ICAM-1的靶向纳米载体平台在口服给药的情况下的电势，为后续的体内研究铺平了道路，还可以被修改为需要运输跨细胞屏障的其它系统中所发现的体。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由霍华德休斯医学研究所和美国国家科学基金会的RG，并颁发给SM卫生（批准R01-HL98416）全国学院和美国心脏协会（批准09BGIA2450014）基金的奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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