Summary
Vele therapeutische toepassingen vereisen een veilig en efficiënt transport van drugs vervoerders en hun lading over cellulaire barrières in het lichaam. Dit artikel beschrijft een aanpassing van bestaande methoden om de snelheid en het mechanisme van het vervoer van drugs nanocarriers (NC's) over cellulaire barrières, zoals de gastro-intestinale (GI) epitheel evalueren.
Abstract
Sub-micrometer dragers (nanocarriers; NC's) te verbeteren werkzaamheid van geneesmiddelen door het verbeteren van de oplosbaarheid, stabiliteit, omlooptijd, targeting en release. Bovendien doorkruisen cellulaire barrières in het lichaam is cruciaal voor zowel de orale toediening van therapeutische NC's in het verkeer en vervoer van het bloed naar de weefsels, waar interventie nodig is. NC transport over cellulaire barrières wordt bereikt door: (i) de paracellulaire route via tijdelijke verstoring van de knooppunten die aangrenzende cellen of (ii) de transcellulaire route, waarbij materialen worden geïnternaliseerd door endocytose, in het cellichaam getransporteerd en uitgescheiden interlock aan de andere celoppervlak (transyctosis). Levering in heel cellulaire barrières kunnen worden vergemakkelijkt door het koppelen van therapeutica of hun dragers met targeting agents die specifiek binden aan het celoppervlak merkers betrokken bij het transport. Hier bieden we methoden om de omvang en het mechanisme van NC transport over een model celbarrière, while metench bestaat uit een monolaag van gastro-intestinale (GI) epitheelcellen gegroeid op een poreus membraan in een Transwell insert. Vorming van een permeabiliteitsbarrière wordt bevestigd door metingen transepithele elektrische weerstand (TEER), transepitheliaal transport van een controle-stof, en immunokleuring van tight junctions. Als voorbeeld, worden ~ 200 nm polymeer NC's gebruikt die een therapeutische lading dragen en zijn bekleed met een antilichaam dat een cel-oppervlak determinant richt. Het antilichaam of therapeutische lading gemerkt met 125I voor radioisotoop gemerkte opsporing en NC's worden toegevoegd aan de bovenste kamer via celmonolaag gedurende variërende tijdsperioden. NC geassocieerd met de cellen en / of naar de onderliggende kamer worden gedetecteerd. Meting van gratis 125 Ik laat aftrekken van de gedegradeerde fractie. De paracellulaire route wordt beoordeeld door het bepalen van mogelijke veranderingen door NC vervoer tot de dam parameters hierboven beschreven. Transcellulaire vervoer iTussen bepaald door het aanpakken van het effect moduleren endocytose en transcytose wegen.
Introduction
Cellulaire barrières in het lichaam fungeren als een gateway tussen de externe omgeving en de interne compartimenten. Dit geldt voor de epitheliale bekleding scheidt het extern blootgestelde oppervlak van de gastro-intestinale (GI) kanaal en de bloedbaan 1-3. Cellulaire belemmeringen vertegenwoordigen ook de interface tussen de bloedbaan en de parenchym en cellulaire componenten van weefsels en organen. Dit geldt voor de binnenste endotheliale bekleding van bloedvaten, zoals de bloed-long barrière, de bloed-hersenbarrière, enz. 1 Het vermogen om deze cellulaire barrières te doorkruisen in het lichaam is cruciaal voor efficiënte levering van therapeutische en diagnostische middelen in de circulatie en weefsels / organen waar interventie nodig is.
Om de levering van therapeutische of diagnostische middelen te verbeteren, kunnen deze verbindingen in sub-micrometer nanocarriers (NC's) worden geladen. Deze drug delivery vehicles kunnen worden geformuleerd met verschillendechemie en structuren om drugs oplosbaarheid, bescherming, farmacokinetiek, de release en de stofwisseling 4,5 optimaliseren. NC kunnen worden gefunctionaliseerd met affiniteit of richtende delen (bijvoorbeeld antilichamen, peptiden suikers, aptameren, enz.) om hechting aan gebieden van het lichaam waar de therapeutische werking vereist 2,6 vergemakkelijken. Targeting van NC's naar determinanten op het oppervlak van cellulaire barrières kunnen het vervoer verder te vergemakkelijken in en / of over deze voeringen 2,6.
De rol van selectief transport van stoffen tussen twee omgevingen vereist een aantal unieke functies onder cellagen. Een dergelijke functie is celpolariteit, waarbij de apicale membraan tegenover het lumen van holten varieert van het basolaterale membraan gericht weefsel interstitium met betrekking tot membraan morfologie en samenstelling van lipiden, transporters en 2 receptoren. Een ander kenmerk betreft intercellulaire junctions verbinden aangrenzende cellen. Regulatie van de eiwitten die krappe kruispunten, met name junctionele adhesiemoleculen (files), occludins en Claudins vormen, moduleren de barrièrefunctie selectief toestaan of niet transport van stoffen tussen cellen, bekend als paracellulaire vervoer, waardoor passage van materialen uit het lumen naar de basolaterale ruimte 3. Binding van vele natuurlijke en synthetische elementen (leukocyten, moleculen, deeltjes en drug delivery systemen) om cellulaire barrières in het lichaam cel-junction opening induceren, die voorbijgaand en relatief onschadelijke of meer langdurig zijn en dus onveilig toegang van ongewenste stoffen over de barrière 2,5,7-9. Bijgevolg kan dit traject worden bepaald door het meten van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en passieve paracellulaire diffusie van moleculen (hierin genoemd paracellulaire lekkage), waarbij verminderde weerstand tegen elektrische stroom of verhoogde paracellulaire lekkage een inert verbinding in de basolaterale ruimte geven opening van de cel contacten, respectievelijk 5,10,11. Ter aanvulling van deze methoden, kan een van de tight junction eiwitten hierboven genoemde worden gekleurd om hun integriteit te beoordelen, waar vlekken moeten verschijnen geconcentreerd bij de cel-cel grenzen rondom de cel periferie 5,10,12.
Alternatief kan geneesmiddelafgiftesystemen die specifieke celoppervlak determinanten zoals die geassocieerd met clathrine beklede putjes of kolf-vormige membraan invaginations genoemd caveolae, gericht vesiculaire opname activeren in cellen door endocytose, die een weg voor geneesmiddelafgifte intracellulaire compartimenten 5, 13. Bovendien kan endocytose leiden tot transport van vesikels in het cellichaam voor vrijgave aan de basolaterale zijde een fenomeen transyctosis of transcellulair transport 14. Daarom kan kennis van de kinetiek en het mechanisme van endocytose worden gebruikt voor een intracellulaire exploiterennd transcellulaire drug delivery, die een relatief veilige en gecontroleerde wijze van levering biedt in vergelijking met de paracellulaire route. Het mechanisme van endocytose worden beoordeeld modulatoren van klassieke routes (clathrine-en-caveolin endocytose en macropinocytose) of niet-klassieke routes (zoals bij celadhesie molecuul (CAM)-gemedieerde endocytose) 5,13,15 .
Dat intracellulair verkeer vaak bestudeerd in standaard putjes of dekglaasjes, het ontbreken van een basolaterale compartiment sluit cel polarisatie en de mogelijkheid om transport te bestuderen in cellagen. Om dit probleem te omzeilen, is transport over cel monolagen werden lang bestudeerd met Transwell inzetstukken 10,11,16,17, die bestaan uit een bovenste (apicaal) kamer, een poreus membraan permeabel waar cellen hechten en een hecht monolaag, en een onderste (basolaterale) kamer (figuur 1). In deze configuratie kan het transport worden gemeten in deapicale naar basolaterale richting door toediening van een behandeling in de bovenste kamer, na het transport door de cel monolaag en de onderliggende poreuze membraan, en uiteindelijk verzamelen van het medium in de onderste kamer voor het kwantificeren van transportgoed. Vervoer in de basolaterale-to-apicale richting kan ook worden gemeten door de eerste toediening aan de Tweede Kamer en de daaropvolgende verzameling van de bovenste kamer 5,10,12,16. Verschillende technieken bestaan om de vorming van barrièrelaag op transwells, waaronder TEER en paracellulaire transport assays controleren, zoals hierboven beschreven. Bovendien kan het permeabele filter waarop cellen gekweekt worden verwijderd beeldverwerkingsanalyses (bijv. fluorescentie, confocale, elektronenmicroscopie) als verdere bevestiging van de cel monolaag model en het mechanisme van transport. Keuze van het membraan, die beschikbaar is in verschillende poriegrootte, materialen en oppervlakken, is afhankelijk van verschillende factors zoals de omvang van stoffen of voorwerpen worden vervoerd, celtype, en imaging methode 16,18-20. Transwell inzetstukken ook gecontroleerd en kwantificatie van vervoer te vergemakkelijken ten opzichte van complexe zoogdiersystemen, als volumes van de kamers en celoppervlak bekend constanten. Hoewel veel factoren betrokken bij in vivo afgifte worden geëlimineerd, waaronder de aanwezigheid van darmslijmvlies, schuifspanning, spijsverteringsenzymen, immuuncellen, enz. Dit kleine schaal in vitro model biedt nuttige voorafgaande informatie over transport.
Als een voorbeeld voor de aanpassing van deze methoden om NC transport te bestuderen over cellulaire barrières 10,11,16,17 illustreren, beschrijven we hier een geval waarin het potentieel voor NC transport over de GI epitheel werd gemodelleerd door het beoordelen van de passage van een model drug delivery systeem via een monolaag van menselijke epitheliale colorectale adenocarcinoma (Caco-2 cellen). Hiertoe cellen werden gekweekt in Transwell inzetstukken, een 0,8 um porie polyethyleentereftalaat (PET) filter (6,4 mm diameter), die transparant is en kan worden gebruikt voor microscopie. De status van de barrièrelaag wordt gevalideerd door TEER, apicale naar basolaterale transport van een controlestof, albumine en fluorescentie microscopie visualisatie van een element van de tight junctions, occludin eiwit. Een model van gerichte polymeer NC wordt gebruikt, bestaande uit 100 nm, niet biologisch afbreekbare polystyreen nanodeeltjes. NC worden bekleed door oppervlakte adsorptie met een targeting antilichaam alleen of een combinatie van een gericht antilichaam en therapeutisch lading, waarbij elke component met 125 I radioisotoop tracering kan worden gemerkt. In het gekozen voorbeeld, het antilichaam intercellulaire adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) herkent een eiwit op het oppervlak van GI epitheel (en andere) cellen, waarvan is aangetoond dat intracellulair transcellulair transport o vergemakkelijken f drug carriers en hun lading 21. De lading alfa-galactosidase (α-Gal) een therapeutisch enzym voor behandeling van de ziekte van Fabry, een erfelijke lysosomale stapelingsziekte 22.
De beklede NC, ongeveer 200 nm groot, toegevoegd aan de apicale kamer via cel monolaag en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende variërende tijdsperioden, waarna 125I op NC kan worden gedetecteerd gekoppeld aan de cel monolaag en / of getransporteerd naar de basolaterale kamer onder de cellen. Aanvullende bepaling van vrije 125 Ik laat aftrekken van de gedegradeerde fractie en de schatting van gecoate NC vervoer. Het mechanisme van transport wordt verder bepaald door onderzoek van veranderingen in de barrièrelaag betrekking tot de paracellulaire route, door de hierboven beschreven parameters, terwijl transcellulair transport wordt bepaald door het onderzoeken van veranderingen in het transport wanneer moduleren wegen van endocytose en transcytose.
NHOUD "> Deze methoden geven waardevolle informatie over cellulaire barrière modellen, de mate en snelheid van transport van een drug delivery systeem, en het mechanisme van dit vervoer, helemaal die interpretatie van de mogelijkheden voor drug delivery over cellulaire barrières.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het kweken van een monolaag van cellen in Transwell Inserts
- In een steriele, bioveiligheidsniveau 2 celkweek kap, plaatst 0,8 mm porie PET Transwell inserts in een 24-well plaat (4 wells per conditie, voor statistische significantie) met een pincet. Alle materialen die gebruikt de kap moet worden gesteriliseerd met ethanol.
Opmerking: De poriegrootte van de filter moet worden geselecteerd in overeenstemming met de gemiddelde grootte van de NC gebruikte transport mogelijk over het membraan. Ook, om statistisch significante resultaten, elke experimentele conditie is minimaal vier herhalingen (wells) binnen hetzelfde experiment, en minimaal 3 onafhankelijke experimenten.
- Bereid celkweekmedium DMEM medium aangevuld met 4,5 g / l glucose, 15% foetaal runderserum en 1% Pen strep en verhit tot 37 ° C in een waterbad.
- Verdunnen menselijke epitheliale colorectaal adenocarcinoom (Caco-2-cellen) in cel medium en plaats200-400 ul van de cel oplossing in het bovenste (apicale) kamer van de Transwell insert, bij een dichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / cm 2. Vul het onderste (basolaterale) kamer met 700-900 pi cel medium.
- Cultuur cellen bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 16-21 dagen vervangen medium in de bovenste en onderste kamer om de 3-4 dagen, met de in stap 1.3 volumes. Vervang medium in de onderstaande volgorde de druk boven (in plaats van onder) de celmonolaag doen: Zuig het medium uit de onderste kamer, Zuig het medium van de bovenste kamer, vult de bovenkamer met vers medium en vul de onderste kamer met vers medium.
2. Validatie van de GI Epitheliaale permeabiliteitsbarrière behulp Transepitheliaal Elektrische weerstand (TEER) en Immunokleuring van tight junctions
- Voor opslag op korte termijn (minder dan 2 weken), dompel STX100 elektroden in een elektrolyt oplossingtie (0,1-0,15 M KCl of NaCl). Sluit de elektrode aan op de elektrode in de meter EVOM volt-ohm zodat het systeem intern kortgesloten elektrode en symmetrie wordt gehandhaafd. Voor de lange-termijn opslag, spoelen met dH 2 O en op te slaan in een droge, donkere toestand.
- De elektroden steriliseren, onderdompelen in ethanol gedurende 15 minuten en aan de lucht drogen gedurende 15 sec. Alternatief kunnen de elektroden worden opgeslagen in een UV kap. Spoel de elektroden in een steriele elektrolytoplossing (fosfaatbuffer zoutoplossing, PBS) of 0,1-0,15 M KCl of NaCl-oplossing, voor elke weerstandsmeting.
- Met de meter volt-ohm ingesteld op weerstand instelling verticaal plaatst elektroden in een putje met de Transwell insert met de korte elektrode in de bovenste kamer en de lange elektrode in de onderste kamer raakt de bodem van de put. Zodra de EVOM aflezing stabiliseert, noteer de weerstand waarde (uitgedrukt in ohm; Ω) voor elk putje.
- Bereken weerstand (resistance genormaliseerd tot gebied; Ω × 2 cm) van de monsters door het aftrekken achtergrond weerstand (TEER van transwell inserts zonder cellen) en vermenigvuldigen met membraanoppervlak. Weerstandswaarden zijn meestal in de literatuur. (Zie bespreking)
- Herhaal metingen elke 1-2 dagen tot TEER waarden tot een maximum en plateau aangeeft vorming van een barrièrelaag, die typisch duurt 2-3 weken vanaf het moment van cel platting. Plateau TEER waarden en tijd die nodig is om de barrière integriteit bereiken kan variëren naargelang de cel passage nummer.
- Om de aanwezigheid van krappe kruispunten in celmonolagen met hoge TEER (gelijk aan of boven de drempelwaarde voor barrièrevorming) controleren, repareren cellen door incubatie met koude 2% paraformaldehyde gedurende 15 minuten. Daarna, was cellen met PBS en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 1 ug / ml anti-occludin. Was de cellen opnieuw met PBS en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 7,5 ug / ml fluorescently-gelabelde secundaire antilichamen. Gebruik putten met lage TEER als negatieve controle voor barrière-vorming.
Opmerking: Als alternatief voor anti-occludin kunnen antilichamen alternatieve tight junction eiwitten worden gebruikt.
- Accijnzen voorzichtig het filter membraan waarop de vaste monolaag is bevestigd, en monteren op dia's voor beeldvorming met behulp van epifluorescentie of confocale microscopie.
3. Evalueren transepitheliaal transport van Gerichte Carriers
- Label de targeting antilichaam (monoklonaal antilichaam tegen ICAM-1, anti-ICAM, in dit voorbeeld) met 125I, zoals eerder beschreven 7. Gebruik Bradford assay te schatten eiwitconcentratie en een gamma-teller tot 125 I inhoud op het antilichaam te bepalen, bereken dan de specifieke activiteit in tellingen per minuut (CPM) / mg gelabeld antilichaam.
Opmerking: Om de controle op specificiteit, returf procedure etikettering muis IgG, die zal worden gebruikt om niet-gerichte beklede NC bereiden. Om het vervoer van een therapeutische lading studeren, herhaal dan de procedure labelen van de lading, bijvoorbeeld alfa-galactosidase (α-Gal) in dit voorbeeld. Alternatieven kunnen worden gebruikt voor het doelgericht agens, niet-specifieke controle, of therapeutische lading. Alternatieve werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om verbindingen te labelen en schat de concentratie van de gemerkte tegenhangers.
- Paar het gelabelde gericht antilichaam (anti-ICAM in ons voorbeeld) op het oppervlak van NC. In dit voorbeeld, incubeer polystyreen nanobeads (100 nm diameter) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 125I-anti-ICAM aan de oppervlakte adsorptie toe, zoals beschreven 7.
Opmerking: Voor de niet-specifieke controle gebruiken 125 I-IgG. Om het vervoer van een lading te traceren, gebruiken een combinatie van targeting antilichaam en 125-gemerkte cargo (α-Gal in ons voorbeeld).
- Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 3 minuten en verwijder de niet-gecoate tegenhangers in het supernatant door aspiratie. Resuspendeer de pellet bevattende beklede NC met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS door pipetteren en ultrasone trillingen gering vermogen om mogelijke deeltjes aggregaten (20-30 korte pulsen) verstoren.
- Voor NC karakterisering, meten grootte, polydispersiteit, en ζ-potentieel van gecoate deeltjes met behulp van dynamische lichtverstrooiing (volgens de instructies van de leverancier), en kwantificeren van het aantal 125-gelabeld targeting antilichaam moleculen (bijv. anti-ICAM) op het deeltje oppervlak met behulp van een gamma-teller.
Opmerking: Deze methoden kunnen worden herhaald voor niet-specifieke en therapeutische tegenhangers. De grootte van de beklede deeltjes varieert rond 200 nm.
- Add 125I-antilichaam NC (bijv. 125I-anti-ICAM NC; 56 nCi / ml) aan de bovenste kamer boven confluente Caco-2 monolagen met TEER &# 8805; 350 Ω × cm 2 (zie Overleg) over achtergrond (16-21 dagen na het zaaien). Incubeer bij 37 ° C gedurende een of meer gewenste tijdsintervallen. Meet TEER (paragraaf 2.3) voor en na incubatie de effecten van NC op de barrièrelaag beoordelen.
Opmerking: Deze procedure kan herhaald worden voor niet-specifieke en therapeutische tegenhangers.
- Verzamel medium uit de bovenste en onderste kamers en was ze een keer met 0,5 ml DMEM bij 37 ° C (bovenste kamer) of 1 ml dH 2 O (Tweede Kamer). Verzamel de wasbeurten voor de meting van de totale radio-isotoop content met behulp van een gamma-teller.
- Voor het meten van de celfractie te snijden de permeabele filter, bijvoorbeeld met een scheermesje uitgesneden rond de randen en incubeer in een gammateller buis met 1% Triton X-100 gedurende 10 min (om de celinhoud vrij) vóór meetcel -geassocieerde totale radioactiviteit.
- Voor het meten van 125 I regehuurd van NC's tijdens het vervoer of als gevolg van mogelijke afbraak, eerste mix-300 ul van het monster (van de boven, onder, of celfracties) met 700 ul van 3% BSA in PBS en 200 ul trichloorazijnzuur (TCA). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Ondertussen deze tijd, het meten van de totale radioactiviteit van dit monster in een gamma-teller.
- Centrifugeer TCA monsters bij 3000 xg gedurende 5 minuten aan intacte eiwit (pellet) scheiden van het gedegradeerde eiwit of 125I fractie (supernatant). Kwantificeren van de radioactiviteit van de gratis 125 I fractie en aftrekken wordt deze waarde van de totale radioactiviteit gemeten voor centrifugeren. Dit zal de hoeveelheid gemerkt eiwit dat niet wordt afgebroken bieden.
4. Mechanisme van transepitheliaal transport van Gerichte nanocarriers
- Etiket albumine met 125 I zoals beschreven in paragraaf 3.1 en eerder gemeld 7.
Opmerking: Albumine is een 66.5kDa eiwit en derhalve een relatief grote inhoud. Hoewel een geldige controle voor passieve transport van grote objecten (bijv. 200 nm NC hier gebruikt) moet worden vervangen door kleinere inerte tracer moleculen bij het bestuderen transport van kleinere geneesmiddeldragers (zie discussie).
- Om paracellulaire transport bepalen middels albumine paracellulaire lekkage cultuur Caco-2 monolagen op Transwell inzetstukken zoals hierboven beschreven.
- De bovenste kamer medium boven de cel monolaag, voeg hetzij 125I-albumine alleen (negatieve controle die het basale niveau van lekkage) of 125I-albumine en niet-radioactief gemerkt antilichaam gericht NC (zoals beschreven in paragraaf 3.5). Incubeer bij 37 ° C gedurende de geselecteerde tijdsinterval (s), die moet overeenkomen met die onderzocht bij het testen NC transport. Meet TEER (paragraaf 2.3) voor, tijdens en na incubatie, verzamel alle fracties van de totale 125I en 125I vrij metingen aangegeven. punt 3 Opmerking: Gelijktijdige toevoeging van 125I-albumine en niet-radioactief gemerkte controle IgG NC kan worden gebruikt als een controle.
- Als een positieve controle voor het openen intercellulaire juncties, voeg celmedium bevattende 5 mM H 2 O 2 om de bovenste en onderste kamers van de Transwell insert en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Meet daarna TEER (paragraaf 2.3) en voeg 125 I-albumine om de bovenste kamer van de geselecteerde tijdsintervallen. Meet TEER op verschillende tijdstippen gedurende de incubatie TEER waarde bederf veroorzaakt door H 2 O 2 geïnduceerde opening van de cel knooppunten identificeren.
- Parallel experimenten evalueren transcellulaire vervoer, ook wel transcytose, van 125 I-gerichte NC's door incubatie samenvloeiing Caco-2 monolagen met ofwel 50 uM monodansylcadaverine (MDC, remmer van clathrin endocytose), 1 ug / ml filipin (remmer van caveolar -gemedieerde endocytose), 0,5 uM Wortmannin (remmer van fosfatidylinositol 3-kinase [PI3K], die deze macropinocytose) of 20 pM [5 - (N-ethyl-N-isopropyl) amiloride] (EIB, remmer van macropinocytose en CAM-gemedieerde endocytose 15).
Opmerking: 125I-IgG NC en 125I-albumine worden gebruikt als negatieve controles voor het effect van deze remmers en andere methoden (bv. siRNA technieken) kunnen hogere selectieve inhibitie.
- Meet TEER (paragraaf 2.3) voor, tijdens en na incubatie van de cellen met remmers en radioactief gemerkt materiaal, als extra controle voor het effect van de remmers op de monolaag permeabiliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als bevestiging van onze cel model transepitheliaal transport gerichte NC bestuderen, Figuur 2 toont dat Caco-2 cel monolagen uitgeplaat bij een dichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / cm 2 confluentie bereikten ~ Dag 12 en onderhouden monolaag integriteit tot dag 18, aangegeven TEER (Figuur 2A). Dit werd bevestigd door de aanwezigheid van occludin-positieve krappe kruispunten (Figuur 2B) in monolagen met hoge TEER (390 Ω × cm 2, Dag 14), in vergelijking met arme tight junction etikettering op lage TEER (17 Ω × cm 2, Dag 5 ).
Tracing van het radioactieve label NC elementen bepaalt de totale hoeveelheid van deze componenten (NC gericht antilichaam of lading) eerst toegevoegd aan de apicale kamer de cel geassocieerde fractie en de fractie getransporteerd naar de basolaterale zijde. Deze waarden kunnen worden gebruikt om verschillende parameters NC transport beschrijven een berekeningrelevantere wijze, vooral na aftrek van vrij 125I gehalte van elke fractie, die afgebroken tegenhangers vertegenwoordigt. Bijvoorbeeld, het aantal antilichaammoleculen, lading moleculen of geassocieerde NC die dwars de cel monolaag kan worden berekend schatten absolute transport. Ook het percentage van genoemde moleculen of NC die wordt getransporteerd naar de basolaterale zijde ten opzichte van het totale aantal moleculen of NC gekoppeld aan de cel monolaag, schat de efficiëntie van de transportmiddelen. Tenslotte, de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (Papp), een standaard parameter voor de transportsnelheid kan worden geschat. Deze parameters worden als volgt berekend:
Moleculen vervoerd of NC's vervoerd = CPM basolaterale × (Molecules toegevoegd of NC toegevoegd / CPM toegevoegd)
% Moleculen of NC's vervoerd = 100 x [CPM basolaterale / (CPM basolaterale + CPMcelfractie)]
P app (cm / s) = (CPM basolaterale × Vol.) / (A × t × CPM toegevoegd)
waar CPM zijn de 125 I tellingen per minuut toegevoegd aan de bovenste kamer (CPM toegevoegd), de cel monolaag fractie (CPMcell fractie), of de onderste kamer (CPM basolaterale) en NC toegevoegd of Moleculen toegevoegd zijn de aantal NC's of moleculen aanvankelijk toegevoegd aan de bovenste kamer, A het oppervlak van het filtermembraan (2 cm), Vol. is volume medium in de bovenste kamer (ml), en t de incubatietijd (s).
In ons voorbeeld, wanneer de radioactieve isotoop merken van het antilichaam gericht, deze analyse onthult de mate en de efficiëntie van het vervoer in termen van antilichamen of NC vervoerd per cel en het percentage van cel-monolaag geassocieerde antilichamen of NC die getransporteerd (figuur 3A en 3B ), well als de snelheid van het vervoer in termen van P app (Figuur 3D). Deze parameters geschat ons voorbeeld van 125I-anti-ICAM NC, werden vergeleken met die van controle 125I-IgG NC de efficiëntie transport opzichte tonen een niet-gerichte tegenhanger (Fig. 3C en 3D).
Wanneer het radioactieve label is opgericht op de NC lading, beschreven parameters tijdens transport van de lading, die in ons voorbeeld was α-Gal enzym, voor de behandeling van een erfelijke lysosomale stapelingsziekte bekend als de ziekte van Fabry (tabel 1). Naast berekenen NC vervoer traceren genoemde lading, transepitheliale levering van dit therapeutische enzym kan worden geschat, bijvoorbeeld door expressie als moleculen of massa α-Gal vervoerd per cel.
Tenslotte schrijft deze methode de transportroute naar de paracellulaire route oftranscellulaire route. Bijvoorbeeld, in ons voorbeeld, EIPA verminderd transport van 125I-anti-ICAM NC's over Caco-2 celmonolagen (Figuur 4A), terwijl MDC, filipine en wortmannine geen vervoer niveau heeft verlaagd, met betrekking tot de controle conditie (geen remmer ). Dit suggereert dat anti-ICAM NC's maken gebruik van CAM-endocytose voor transcellulaire vervoer, maar niet clathrine-, caveolar-of-macropinocytose gerelateerde transcytose. Bovendien werd paracellulaire transport uitgesloten middels metingen van TEER (figuur 4B) en een albumine passief transport (fig. 4C), waarbij een afname in TEER en een toename van albumine paracellulaire lekkage in de onderste kamer tijdens het transport van anti-ICAM NC zou aangegeven verstoring van intercellulaire juncties. Echter, incubatie met anti-ICAM NC veranderde niet TEER of 125I-albumine paracellulaire lekkage gedurende 48 uur, vergelijkbaar met IgG NC's die niet zijn vervoerd controle. Alseen positieve controle voor het openen van de cel kruispunten en paracellulaire vervoer, H 2 O 2, verlaagd TEER om basale niveaus en duidelijk versterkte 125I-albumine lekkage naar de basolaterale kamer.
Figuur 1. Schematische voorstelling van transepitheliaal transport gerichte nanocarriers over een gastro-intestinale epitheliale model. (A) als een platform om transepitheliaal transport te bestuderen, Caco-2 celmonolagen zijn gekweekt op transwell inserts tot een strakke monolaag gevormd (16-21 dagen na het zaaien, TEER ≥ 350 Ω × cm 2 op de achtergrond). Een voorbeeld van een drug delivery vehicle, zoals 125I-anti-ICAM NC, wordt toegevoegd aan de bovenste (apicale) kamer boven de cel monolaag om transport te bestuderen in cellen en door het onderliggende poreuze membraan.Het medium in de onderste (basolaterale) kamer wordt vervolgens verzameld voor het kwantificeren van transportgoed. (B) het vervoer door de cel monolaag gebeurt via ofwel een paracellulaire of transcellulaire / transcytose route. Overgenomen uit Ghaffarian et al.., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken
Figuur 2. Caco-2 monolagen als model voor transepitheliaal transport. Caco-2 cellen werden gekweekt op Transwell-inserts van 1,5 x 10 5 cellen / cm 2. (A) Transepitheliaal elektrische weerstand (TEER) werd gemeten aan monolaag integriteit te beoordelen. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelden ± SEM, n = 3. (B) Fluorescentie microscopie van tight junctions immunologisch met anti-occludin en Texas rood gemerkte tweede antilichaam op dag 5 of 14 (lage versus hoge TEER waarden, respectievelijk). Overgenomen uit Ghaffarian et al.., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken
Figuur 3. Vervoer van anti-ICAM nanocarriers in Caco-2 cel monolagen. Confluente Caco-2 monolagen gekweekt op Transwell inzetstukken werden geïncubeerd met 125I-anti-ICAM NC of 125I-IgG NC aan de apicale kamer toegevoegd. (AC) 125I-gehalte in de basolaterale kamer werd gemeten op de aangegeven tijdstippen, de hoeveelheid van NC transp berekenenorted per cel (zie Representatieve resultaten). (B) Percentage van getransporteerde NC werd berekend als de verhouding van de dragers in de basolaterale fractie dat de gecombineerde basolaterale en celfracties. (D) Schijnbare permeabiliteitscoëfficiënten (P app) werden berekend zoals beschreven in Representatieve resultaten, als gevolg van de tarieven van het vervoer van 125 I-anti-ICAM NC's of 125 I-IgG NC's. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelden ± SEM, n = 4. Overgenomen uit Ghaffarian et al.., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken
Figuur 4. Mechanisme van het vervoer van eennti-ICAM nanocarriers in Caco-2 monolagen. (A) transcellulair transport van 125I-anti-ICAM NC in confluente Caco-2 monolagen werd op 24 uur in de afwezigheid of aanwezigheid van 20 uM EIB, 1 ug / ml filipin, 50 uM MDC, of 0,5 pM wortmannine. (B) TEER werd gemeten tijdens het transport van 125I-anti-ICAM NC's in Caco-2 monolagen te paracellulaire transport beoordelen. TEER waarden in afwezigheid van NC worden weergegeven als controles (de gestippelde interval markeert SEM van de gemiddelde waarde). Incubatie met 5 mM H 2 O 2 is een positieve controle voor het openen van intercellulaire juncties. (C) Paracellulaire eiwitlekkage, gemeten als de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (Papp) van 125I-albumine die de cel monolaag in afwezigheid of aanwezigheid van 5 mM H 2 O 2, IgG NC's, of anti-ICAM NC, werd gemeten en berekend zoals in figuur 3. Gegevens zijn toonn als gemiddelden ± SEM; n ≥ 4. Overgenomen uit Ghaffarian et al.., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken
| Totaal NCs bijbehorende / cel | Intracellulaire NCs / cel | Vervoerd NCs / cel | % Vervoerd | Vervoerd α-Gal moleculen / cel × 10 5 | pg vervoerd / cel × 10 -3 | Papp (× 10 -8 cm / sec) | |
| 3 hr | 663,4 ± 116,0 | 434,0 ± 76,8 | 243.6 ± 15.4 | 44,4 ± 6,7 | 1.8 ± 0.2 | 9.7 ± 1.2 | 8.1 ± 1.1 |
| 24 uur | 2024,8 ± 409,3 | 1218,9 ± 255.6 | 806,9 ± 164.1 | 40,6 ± 2,0 | 3.9 ± 0.5 | 21,3 ± 2,5 | 1.9 ± 0.4 |
| NC = nanocarriers; α-Gal = α-galactosidase; Totaal NC's geassocieerd / cel = Intracellular NC / cel + NC's vervoerd / cel;% Vervoerd = (NC's vervoerd / Totaal NC bijbehorende) × 100; P app = schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (cm / s). Zie Methoden voor verdere beschrijving van deze parameters. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelden ± SEM (n = 8 putjes), (TNF-α Caco-2 cellen). | |||||||
Tabel 1. Transepitheliale transport van α-Gal door anti-ICAM nanocarriers. Transcellulair transport van anti-ICAM / 125 I-α-Gal NC in convloeiend Caco-2 monolagen werd op 3 uur en 24 uur. Radio-isotoop inhoud van apicale, basolaterale en celfracties omgezet in verschillende waarden transport relevant, zoals beschreven in Representatieve resultaten. Overgenomen uit Ghaffarian et al.., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven besproken werkwijzen kan een cel model voor het bestuderen transport gerichte NC in cellulaire barrières worden vastgesteld, zoals het voorbeeld van Caco-2 epitheelcellen, waarvan evalueren vervoer van het GI lumen in het bloed bij betrokken is van orale drug delivery systemen. Kweken van GI epitheliale celmonolagen in transwell inserts ingeschakeld meting van TEER en fluorescentie immunostaining van krappe kruispunten om de vorming van een cel permeabiliteitsbarrière bevestigen. Vervolgens radiolabeling van targeting en therapeutische middelen met 125 I verstrekt snelle en gevoelige kwantificering van gerichte NC's in en over GI celmonolagen. Tenslotte werden mechanistische studies toegepast met behulp van endocytische remmers, TEER, en een albumine paracellulaire lekkage test om te beoordelen of het vervoer plaatsvindt via een vesiculaire route versus een paracellulair route.
Een belangrijke parameter bij het vaststellen van soortgelijke modellen is de selectie van een celtype, waarvan de fysiologische aard van de cellulaire barrière bestudeerde weerspiegelen. Diverse epitheliale en endotheliale cellen van humane of dierlijke oorsprong zijn in de handel verkrijgbaar 16,18-20. Deze kunnen alleen als een cultuur worden gekweekt zoals beschreven, of als co-kweken van deze cellen met andere celtypen (bijv. mucus uitscheidende cellen, immuuncellen, pericyten, enz.) 16,18-20. In een dergelijke co-cultuur vorm kunnen transwell insert voorwaarden worden gemoduleerd aan de respectieve groeicijfers en eisen voor differentiatie factoren in de cel media 16,18-20 passen. Bijvoorbeeld kan een bloed-hersenbarrière model co-cultivatie van de hersenen microvasculaire endotheliale cellen en astrocyten of pericyten op het tegenoverliggende oppervlak van het poreuze filter omvatten, en de respectieve media voor elk celtype moet in iedere ruimte 19 geplaatst. Bovendien, afhankelijk van de cellijn, extracellulaire matrixcomponenten kunnen required voor effectieve cel gehechtheid aan het poreuze membraan 18-20. Het is belangrijk om te overwegen dat elke specifieke model verschillende basale niveaus zal maken met betrekking tot barrièrepermeabiliteitsfunctie parameters en transportsnelheden en het mechanisme, waardoor controle waarden moeten worden verkregen en deze werkwijzen geoptimaliseerd voor elke situatie.
Transwell inzetstukken zoals die hier beschreven zijn op grote schaal gebruikt voor het vervoer van materiaal in celmonolagen bestuderen van de apicale naar basolaterale compartiment een of vice versa 5,10-12,16,17. Dit kan niet worden bereikt door het kweken van cellen op klassieke putjes of dekglaasjes omdat dergelijke systemen sluit deze vorm van vervoer en niet twee onafhankelijke compartimenten bieden en dus kan een realistische weergave van celsortering niet geven. Bijvoorbeeld, kunnen materialen van nature voor vrijlating uit de basolaterale membraan bestemd worden gerangeerd naar andere cel compartimenten in een dekglaasje model, waardoor het moeilijk is om resonantie telve het mechanisme van transcellulair transport. Bovendien, in tegenstelling tot dekglaasjes de transwell configuratie leidt tot fysiologisch relevante kenmerken geassocieerd met celdifferentiatie en membraan polariteit 10,11,16-19. Bijvoorbeeld, Caco-2 cellen gegroeid op transwells de kenmerken van volwassen enterocyten, waaronder de aanwezigheid van microvilli en tight junctions, vorming koepel en productie van brush border enzymen 10,11,17. Andere parameters kunnen een fysiologisch relevant fenotype, zoals schuifspanning bij GI epitheelcellen (bijvoorbeeld slijm stroom en contractiele bewegingen) en vasculaire endotheliale cellen (bijvoorbeeld bloedstroom), die kan worden toegepast transwells met agitatie of pompen 10 induceren , 16, en co-culturen de noodzakelijke groei en differentiatiefactoren voor bepaalde celtypen 16,18-20 produceren. Toch moet men rekening houden dat cellijnen verschillen vaak van cellen in de lichaamsweefsels, e. G. Zij bepaalde factoren op verschillende niveaus uitdrukken en is dus aanwezig uiteenlopende functies en regelgeving. Zo kan Caco-2 cellen niet alle transporter eiwitten en enzymen vereist voor de activering en transport van orale therapeutische in vivo, zoals CYP3A4, een-geneesmiddelmetaboliserende enzymen 10,17,23 bevatten. In deze gevallen kan cellijn sub-klonen, transfectie, of toevoeging van transcriptie middelen worden gebruikt moduleren de cellijn als een betere afspiegeling van fysiologische omstandigheden 17,23,24.
Bij het selecteren van een optimale Transwell model moeten de verschillende kenmerken van de permeabele filter rekening gehouden. Doorlatende filters zijn verkrijgbaar in verschillende poriegrootte, variërend 0,4-8 micrometer, en moet ruimte bieden aan de grootte van de vervoerde lading. Zo worden kleinere poriegrootten (0,4-3 pm) doorgaans gebruikt voor onderzoek naar transport van kleine chemische verbindingen, terwijl poriën 3 urn of groter worden gebruikt voor invasie, chemotaxis en motiliteit studies waarin microbiële, immuun en migrerende cellen worden getransporteerd. Poriegrootte en dichtheid heeft ook invloed op celdichtheid en differentiatie, zoals sommige cellen kunnen migreren door poriën op zaaien, zich verzet tegen een monolaag formatie. Bovendien is het materiaal van de permeabele steun invloeden beeldvorming duidelijkheid voor de beoordeling van cellevensvatbaarheid en monolaag vorming en celhechting. Polyethyleentereftalaat (PET) filters zijn transparant, zodat de zichtbaarheid onder fasecontrast microscopie, anders dan polycarbonaat filters doorschijnend. Voor een verbeterde celhechting, permeabele steunen vooraf bekleed met collageen en fibronectine zijn commercieel verkrijgbaar. Bovendien kan het filter diameter, die is aangepast voor verschillende putjes, permeabiliteit beïnvloeden, waarbij grotere diameters (bijv. in 6-well platen) vaak paracellulaire lekkage van de cel monolaag verhogen.
Zodra een transwell model wordt vastgesteld, met inbegrip van de kredietente selecteren van het type cel, media samenstelling en doorlatend filter, kan de status van de cel monolaag worden beoordeeld tijdens het kweken en experimentele fase met behulp van TEER. Echter, TEER waarden afwijken met 1) aangeboren biologische factoren geassocieerd met celtype, bron en passage nummer, 2) kweekomstandigheden, zoals de eerder genoemde transwell eigenschappen zaaidichtheid, dagen in kweek media samenstelling en pH, 3) fysische factoren , zoals temperatuur, media volume beenmergafname en graad van agitatie / wassen, en 4) pathologische en / of chemische factoren die cel knooppunt integriteit (bijvoorbeeld cytokines, immuuncellen, oxidatieve stress, farmacologische additieven enz.) 10 moduleren, 16,17. Als gevolg van de verschillende biologische en omgevingsfactoren die van invloed TEER, een minimale uitgangswaarde aangeeft barrière vorming moet voor elk systeem worden vastgesteld door regelmatige controle TEER tijdens de kweekperiode en na experimentele manipulaties. Values die geschikt zijn voor barrièrevorming geacht, die kan variëren tussen 150-1,600 Ω · cm 2 16, ook afhankelijk van de grootte van de stof te transporteren zodat paracellulaire passieve diffusie van de stof is beperkt, terwijl TEER ≥ 350 Ω × cm 2 lijkt passieve diffusie relatief grote NC zoals die hier (200 nm) weergegeven uitsluit, kan dit op voor kleine geneesmiddelafgiftesystemen, waarbij strakker monolagen (bijv. ≥ 700 Ω · cm 2) nodig zijn. Deze basiswaarde kan getest worden met bedieningsorganen voor het verstoren van de barrièrelaag, zoals H 2 O 2, penetrerende peptiden, calcium chelerende middelen (bijvoorbeeld EDTA), proteïne kinasen en fosfatasen, en verschillende andere moleculen 25-27.
Complementair aan TEER, veel permeabiliteit testen bestaan om monolaag integriteit te controleren en te beoordelen paracellulaire transport. Zoals albumine, andere membraan-impermeabel tracer moleculen van verschillende grootte, zoals mannitol, lucifer geel, inuline en dextranen, die kan worden gekoppeld met UV, fluorescent of radioactief label te meten en permeabiliteit tarieven (Papp) te vergelijken bekende waarden voor deze opgeloste stoffen. Bij de beoordeling paracellulaire transport, is het belangrijk om een tracer molecule die kleiner is dan de getransporteerde onderzoeken verbinding gebruiken. Bijvoorbeeld, paracellulaire transport van 200 nm deeltjes intercellulaire juncties hebben een paracellulaire lekkage kleinere, maar nog steeds relatief grote moleculen, zoals albumine dat in dit voorbeeld teweegbrengen. Daarentegen dient paracellulaire transport van kleinere drug delivery vehicles zoals dendrimeren (~ 5 nm) worden geëvalueerd met moleculen <5 nm, zoals mannitol. Paracellulaire lekkage studies geven dus de grootte van cel knooppunt opening, maar vanwege de lange incubatietijd ze niet van tijdelijke verstoringen van de cel junc kunnen identificerengen.
Een andere wijze van evalueren barrière integriteit is het imago van de krappe kruispunten dat aangrenzende cellen verbinden. In deze studie hebben we immunostained occludin fluorescentiemicroscopie, maar diverse andere eiwitten die in de tight junction kan worden gebruikt voor deze analyse, zoals transmembraan eiwitten van de verbinding adhesiemolecuul (JAM), claudin en occludin families. Hier hebben we gekleurd het extracellulaire domein van een permeabilisatie stap overslaan, maar intracellulaire domeinen kan ook worden gekleurd. Aanvullend hierop is het gebruik van controles voor niet-specifieke kleuring met fluorescerende secundaire antilichamen alleen, zonder tight junctions (hier, gebruikten we cellen met een monolaag toont laag TEER) of verstoring van tight junctions met de kruising modulerende middelen opgenomen hierboven.
In ons voorbeeld van transepitheliaal vervoer gebruiken we-ICAM 1-gerichte NC's, maar het transwell systeem is ook geschikt voor vervoer van andere geneesmiddelformulering voertuigs, therapeutische en diagnostische samenstellingen, aangeboren verbindingen die in het lichaam, of een combinatie van bovenstaande, waardevolle implicaties voor klinische studies of begrip van fundamentele wegen. De methoden beschrijven we transport kwantificeren in cel monolagen omvatten radioisotoop etikettering van het richtende middel of therapeutische lading in de NC laag, maar deze strategie kan ook worden gebruikt om NC volgen met verschillende chemische en structuren, waaronder lineaire of vertakte polymeren, dendrimeren, deeltjes , micellen, liposomen, etc. 4,5,28,29. Verschillende isotopen (bijv. 125I, 3H, 32P, enz.) beschikbaar voor transport van een groot aantal kleine en grote moleculen te kwantificeren: niet alleen geneesmiddeldragers ook chemische en biologische therapeutica, zonder de functionele of structurele integriteit de verbinding, in tegenstelling tot omvangrijke fluorescente labels. Radiomerking biedt meer kwantitatieve gevoeligheid en snelheid vergelekenandere strategieën die transport meten, zoals gelelektroforese, PCR, massaspectrometrie, HPLC, en fluorescentie spectrometrie. Dit label kan ook worden gebruikt om de mate van afbraak (bv. eiwit richtend middel en vracht in ons voorbeeld) te bepalen door het bepalen van vrij jodium, die snel en nauwkeurig vergeleken met andere eiwit activiteit assays, zoals UV spectrofotometrie en Western blot. Aangezien vrij jodium niet geheel overeen veranderingen in eiwit conformatie of activiteit die kan optreden in de afwezigheid van afbraak, de bovengenoemde alternatieve methoden worden toegepast om de integriteit van getransporteerde materiaal verder te evalueren. Ook, bij het toedienen van verbindingen met vrije radio-isotopen in de apicale kamer, is het onduidelijk of de label in de cel monolaag en vervoerd fracties gevolg van echte eiwitafbraak of diffusie vrij jood van de apicale ruimte. Om deze beperking te omzeilen, kan de apicale NC concentratieworden toegepast korte tijdsinterval associatie toelaten de cel monolaag, gevolgd door verwijdering van het apicale medium in ruil voor vers medium, en een uitwasperiode te gaan transport. Hoewel een hoeveelheid vrije radio-isotopen van het originele zwembad kan aanvankelijk lekken in de andere fracties, kan deze waarde worden bepaald op basis van monsters zonder chase periode en afgetrokken van voorwaarden met betrekking tot een achtervolging periode.
Wat de beoordeling van het mechanisme van vervoer, dezelfde werkwijzen beschreven voor het valideren monolaag integriteit (TEER, lekkage testen en tight junction kleuring) kunnen worden gebruikt om de paracellulaire route te evalueren. Voor transcellulair transport farmacologische remmers van factoren betrokken bij het intracellulair verkeer (bijvoorbeeld transferrine geassocieerd met clathrine wegen, choleratoxine B geassocieerde caveolar wegen, enz.) worden gebruikt, waarbij effectieve concentraties name die determinanten remmen nodig to toegelicht voor elk systeem. Alternatieven voor de remmers in onze studie omvatten chloorpromazine en kalium uitputting, specifiek voor clathrine afhankelijke endocytose en genisteïne en methyl-β-cyclodextrine (MβCD), specifiek voor caveolae-gemedieerde opname 30. Andere strategieën die mogelijke niet-specifieke effecten van farmacologische remmers kan voorkomen omvatten co-lokalisatie van vervoerde lading met deze determinanten via fluorescentie of radioisotoop etikettering, gebruik van specifieke liganden als controles (bijvoorbeeld transferrine of choleratoxine B, zoals hierboven aangegeven) en siRNA de expressie van regulerende elementen van deze routes knockdown.
In deze studie demonstreren we vergelijkingen voor het omzetten radioactiviteit gegevens verschillende parameters die belangrijke voorafgaande informatie over transepitheliaal vervoer. Zo wordt de mate van transepitheliale transport vertegenwoordigers NC of moleculen per cel getransporteerd, de efficiëntie van het vervoer van inhoud die bindt of binnenkomt cellen wordt vertegenwoordigd door het percentage van cel-geassocieerde NC's of moleculen vervoerd, en de snelheid van het vervoer, die het mogelijk maakt voor de vergelijking van de doorstroming tussen de verschillende opgeloste stoffen, wordt aangeduid met P app. Om het potentieel van gerichte NC voor grootschalige levering van geneesmiddelen (bv. de dosis die nodig is voor in vivo toediening) begrijpen, kunnen deze vergelijkingen worden gemodificeerd schatten transportwaarden op microscopische schaal. Bijvoorbeeld kan de hoeveelheid van een therapeutisch vracht die per oppervlakte-eenheid van darmweefsel (mg / cm 2) en de mogelijke levering in het maagdarmkanaal van een patiënt worden bepaald met de volgende vergelijkingen,
Massa vracht vervoerd / cm 2 weefsel = (CPM basolaterale / specifieke activiteit) / A
Massa lading over dunne darm = [(CPM basolaterale / specifieke activiteit) × TA] / A vervoerd
Oprukkende uit transwell inserts, modellen die beter aansluiten bij de fysiologische complexiteit van vervoer zijn "Ussing" kamers en microfluïdische apparaten, die dynamische vloeistofstroom en een bevatte kamer die contact met de lucht minimaliseert, zoals in de bloedvaten te bieden. Met deze modellen kunnen ook weefselexplantaten te worden gekweekt voor de ex vivo studies, voorafgaand aan de validatie in vivo 17,18.
Tot slot hebben de in dit onderzoek gebruikte methoden waardevolle voorlopige informatie met betrekking tot het vervoer van een model drug delivery systeem voorzien, in termen van efficiency, over celmonolagen. Met behulp van deze celcultuurmodel we aangetoond dat het potentieel van de ICAM-1-gerichte nanocarrier platform in het kader van orale toediening van medicijnen, de weg vrijmaakt voor verdere in-vivo studies, nog kan worden aangepast voor andere systemen die transport over cellulaire barrières in de lichaam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een beurs van het Howard Hughes Medical Institute en de National Science Foundation om RG, en fondsen te SM uitgereikt door de National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) en de American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
