Summary
יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.
Abstract
ספקי משנה מיקרומטר (nanocarriers; NCS) לשפר את היעילות של תרופות על ידי שיפור מסיסות, יציבות, זמן מחזור, מיקוד, ושחרורו. בנוסף, חוצים מחסומים סלולריים בגוף הוא קריטי עבור שני המשלוח האוראלי של NCS הטיפולי למחזור הדם והתחבורה מהדם לרקמות, שבו יש צורך בהתערבות. תחבורת NC פני מחסומים סלולריים מושגת על ידי: מסלול paracellular (i), באמצעות שיבוש זמני של צמתים שמשתלבים תאים סמוכים, או (ii) את מסלול transcellular, שבו חומרים הם הפנימו על ידי אנדוציטוזה, מועבר על פני גוף התא, ומופרש על פני התא ההפוך (transyctosis). משלוח פני מחסומים סלולריים ניתן להקל על ידי צימוד הרפוי או הספקים שלהם עם סוכני מיקוד שלהיקשר באופן ספציפי לסמנים על פני קרום תא המעורב בהובלה. כאן, אנו מספקים שיטות למדידת WHI המידה ומנגנון של תחבורת NC על פני מחסום תא מודל,פרק מורכב מmonolayer של תאי האפיתל במערכת העיכול (GI) גדל על קרום נקבובי נמצא בכנס transwell. כינונה של מחסום חדירות אושר על ידי מדידת התנגדות חשמלית transepithelial (Teer), תחבורת transepithelial של חומר שליטה, וimmunostaining של צמתים הדוקים. כדוגמא, ~ 200 NCS פולימר ננומטר משמשים, אשר נושא מטען טיפולי והם מצופים בנוגדן שמכוון הקובע על פני קרום תא. הנוגדנים או המטען טיפולי מתויג עם 125 למעקב radioisotope וNCS שכותרתו מתווספים לחדר העליון מעל monolayer התא לתקופות שונות של זמן. NCS הקשורים לתאים ו / או מועברים לתא הבסיסי ניתן לאתרם. מדידה של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר המושפל. מסלול paracellular נבחנים על ידי קביעת שינויים אפשריים הנגרמים על ידי תחבורת NC לפרמטרי המחסום שתוארו לעיל. i תחבורת Transcellulars נקבע על ידי עסק בהשפעה של ויסות מסלולי אנדוציטוזה וtranscytosis.
Introduction
מחסומים נייד במעשה גוף כשער בין הסביבה החיצונית והתאים פנימיים. זהו המקרה לרירית אפיתל להפריד את פני השטח החיצוני החשופים של מערכת העיכול (GI) בדרכי ו1-3 זרם הדם. מחסומים נייד גם לייצג את הממשק שבין זרם הדם וparenchyma ומרכיבים תאיים של רקמות ואיברים. זהו המקרה לרירית האנדותל הפנימית בכלי דם, כגון מחסום דם הריאה, מחסום דם המוח, וכו '1 היכולת לחצות מחסומים סלולריים אלה בגוף היא חיונית לאספקה יעילה של סוכנים טיפוליים ואבחון למחזור הדם ורקמות / איברים שבו יש צורך בהתערבות.
כדי לשפר את המסירה של סוכנים טיפוליים או אבחון, ניתן לטעון תרכובות אלה לnanocarriers תת מיקרומטר (NCS). אפשר לנסח רכב משלוח סמים אלו עם מגוון רחב שלchemistries ומבנים כדי לייעל את מסיסות תרופה, הגנה, הפרמקוקינטיקה, שחרור, וחילוף חומרים של 4,5. NCS יכול להיות גם פונקציונליות עם זיקה או מיקוד moieties (למשל נוגדנים, סוכרים פפטידים, aptamers, וכו ') כדי להקל על הדבקה לאזורים בגוף שבו נדרש הפעולה הטיפולית 2,6. מיקוד של NCS לגורמים הביעו על פני השטח של מחסומים סלולריים יכול עוד יותר להקל על תחבורה אל ו / או על פני רפידות אלה 2,6.
התפקיד של סלקטיבי שינוע חומרים בין שתי סביבות דורש תכונות ייחודיות מסוימות בקרב שכבות תאים. מאפיין אחד כזה הוא קוטביות בתא, שבו קרום הפסגה מול לומן של חללים משתנה מקרום basolateral המכוון כלפי interstitium הרקמות, ביחס למורפולוגיה קרום ורכב שומנים, מובילים, וקולטני 2. תכונה נוספת כרוכה junctio אינטרNS חיבור תאים סמוכים. רגולציה של החלבונים היוצרים צמתים הדוקים, מולקולות במיוחד junctional הידבקות (קונפיטורות), occludins, וclaudins, לווסת את תפקוד המחסום כדי לאפשר באופן סלקטיבי או לא הובלת חומרים בין תאים, המכונים תחבורת paracellular, המאפשר מעבר של חומרים מהלום ל שטח basolateral 3. עקידת אלמנטים רבים טבעיים וסינטטיים (לויקוציטים, מולקולות, חלקיקים, ומערכות אספקת סמים) לחסמים סלולריים בגוף יכולה לגרום לפתיחת תא לצומת, אשר עשוי להיות ארעי ויחסית לא מזיק או ממושך יותר, ולכן, לא בטוח עם גישה של חומרים בלתי רצויים על פני המחסום 2,5,7-9. כתוצאה מכך, מסלול זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית transepithelial (Teer) ודיפוזיה פסיבית paracellular של מולקולות (זליגת paracellular במסמך זה נקרא), לפיה ירידה בהתנגדות לזרם חשמלי או דליפת paracellular המוגברת של ineמתחם rt לחלל basolateral מצביע על פתיחת צמתים תא, בהתאמה 5,10,11. כדי להשלים את השיטות הללו, כל אחד מחלבוני הצומת ההדוקים המפורטים לעיל יכול להיות מוכתם על מנת להעריך את היושרה שלהם, שבו צריכים להופיע כתמים מרוכזים בגבולות תאי תאים בכל רחבי הפריפריה התא 5,10,12.
לחלופין, מערכות אספקת סמים, כי יעד גורמי תא שטח מסוימים, כגון אלה הקשורים לבורות מצופים clathrin או invaginations קרום בצורת בקבוק שנקרא caveolae, עלולות לעורר ספיגת ועי לתוך תאים על ידי אנדוציטוזה, מתן שדרת עבור משלוח סמים לתאים תאיים 5, 13. בנוסף, אנדוציטוזה עלולה להוביל לסחר בשלפוחית על פני גוף התא לשחרור בצד basolateral, תופעה הידועה בtransyctosis, או תחבורת transcellular 14. לכן, ידע של קינטיקה והמנגנון של אנדוציטוזה ניתן להשתמש כדי לנצל תאייםnd משלוח הסמים transcellular, שמציע מצב בטוח יחסית ושליטה מלאה של משלוח בהשוואה לתוואי paracellular. (אנדוציטוזה כמו במקרה של מולקולת הידבקות תא (רמ"א בתיווך)) המנגנון של אנדוציטוזה ניתן להעריך עם מאפננים של מסלולים קלאסיים (clathrin ואנדוציטוזה בתיווך caveolin, וmacropinocytosis) או מסלולים שאינם קלאסיים 5,13,15 .
בעוד סחר תאיים לעתים קרובות למד בבארות או coverslips סטנדרטיים, היעדר תא basolateral מונע קיטוב תא ואת היכולת ללמוד תחבורה פני שכבות תאים. כדי להתגבר על מכשול זה, תחבורה ברחבי monolayers התא נחקרה ארוכה באמצעות transwell מוסיף 10,11,16,17, שמורכב מחדר עליון (פסגת), קרום חדיר נקבובי שבו תאים לצרף ולהקים monolayer הדוק, ונמוך יותר קאמרי (basolateral) (איור 1). בתצורה זו, תחבורה ניתן למדוד בקודקוד לכיוון basolateral על ידי מתן טיפול לחדר העליון, בעקבות ההובלה דרך monolayer התא והקרום הנקבובי הבסיסי, ולבסוף איסוף הבינוני בתא התחתון לכימות של חומר מועבר. תחבורה בכיוון basolateral לפסגה גם ניתן למדוד על ידי ממשל ראשוני לתא התחתון והאוסף הבא מהעליון קאמרי 5,10,12,16. טכניקות שונות קיימות כדי לאמת את היווצרות מחסום חדירות על transwells, כולל Teer ומבחני תחבורת paracellular, כפי שתוארו לעיל. בנוסף, המסנן החדיר שבו תאים בתרבית ניתן להסיר בניתוח הדמיה (למשל על ידי הקרינה, confocal, מיקרוסקופית אלקטרונים), כהוכחה נוספת של מודל monolayer תא, כמו גם את המנגנון של תחבורה. בחירה של סוג הקרום, שהוא זמין בגדלים שונים נקבוביות, חומרים ופני שטחים, תלויה בפקטו השוניםrs כגון גודל של חומרים או חפצים כדי להיות מועברים, סוג התא, ואת שיטת הדמיה 16,18-20. Transwell מוסיף גם להקל כימות מבוקר ומדויק של תחבורה בהשוואה למערכות של יונקים מורכבים, כאמצעי אחסון של התאים ועל פני השטח של תאים ידועים קבועים. בעוד גורמים רבים המעורבים בin vivo משלוח בוטלו, לרבות הנוכחות של ריר מעיים, מאמץ גזירה, אנזימי עיכול, תאי מערכת החיסון, וכו ', בקנה מידה הקטן הזה במודל מבחנה מספקת מידע ראשוני שימושי לגבי תחבורה.
כדוגמא כדי להמחיש את ההתאמה של שיטות אלה ללמוד תחבורת NC פני מחסומים סלולריים 10,11,16,17, אנו מתארים כאן מקרה שבו הפוטנציאל להובלת NC פני האפיתל במערכת העיכול היה במתכונת על ידי בחינת מעבר משלוח סמים מודל של מערכת באמצעות monolayer של אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל האנושי (קאקו-2) תאים. לצורך, ג זואמות היו בתרבית במוסיפה transwell, על terephthalate 0.8 מיקרומטר הנקבובית פוליאתילן מסנן (PET) (קוטר 6.4 מ"מ), שהוא שקוף וניתן להשתמש בם להדמיה מיקרוסקופית. מעמדו של מחסום החדירות אומת על ידי מדידת Teer, תחבורת הפסגה לbasolateral של חומר שליטה, אלבומין, והדמית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלמנט של צמתים ההדוקים, חלבון occludin. מודל של פולימר הממוקד NC משמש, בהיקף של 100 ננומטר, חלקיקי פוליסטירן, לא מתכלים. NCS הם מצופים על ידי ספיחת משטח עם נוגדן מיקוד לבד או שילוב של נוגדני מיקוד ומטענים טיפוליים, שבו גם מרכיב יכול להיות מתויג עם 125 למעקב radioisotope. בדוגמא שנבחרה, הנוגדנים מזהה הידבקות אינטר מולקולה 1 (ICAM-1), חלבון לידי ביטוי על פני השטח של אפיתל במערכת העיכול (וגם אחרים) תאים, אשר הוכח כדי להקל תאיים וo תחבורת transcellular ספקים ו סמים ומטעניהם 21. המטען הוא אלפא Galactosidase (α-Gal), אנזים טיפולי המשמש לטיפול במחלת פברי, הפרעת אחסון lysosomal גנטי 22.
NCS המצופה, של כ -200 ננומטר בגודלם, מתווספים לתא apical מעל monolayer התא וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופות משתנות של זמן, שלאחריו 125 אני בNCS ניתן לאתרם קשור לmonolayer ו / או התא מועבר לתא basolateral מתחת לתאים. קביעה נוספות של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר והערכה המושפל תחבורת NC המצופה. המנגנון של תחבורה מוערך יותר על ידי בחינת שינויים במחסום החדירות הנוגעים לתוואי paracellular, באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל, תוך הובלת transcellular נקבעת על ידי בחינת שינויים בתחבורה כאשר ויסות מסלולים של אנדוציטוזה וtranscytosis.
ontent "> שיטות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי דגמי מחסום סלולארי, במידה ושיעור ההובלה של מערכת אספקת סמים, ואת המנגנון של תחבורה כזה, לחלוטין ומאפשר הערכה של הפוטנציאל עבור משלוח סמים על פני מחסומים סלולריים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culturing חד שכבתי נייד בהוספת Transwell
- בשכונת סטרילי, רמת בטיחות ביולוגית 2 תא תרבות, מקום 0.8 מ"מ הנקבובית PET transwell מוסיף לתוך צלחת 24 גם (4 בארות לכל מצב, למובהקות סטטיסטיות) עם מלקחיים. כל החומרים שנכנסו למכסת המנוע צריכים להיות מעוקרים עם אתנול.
הערה: הגודל הנקבובית של המסנן צריך להיות שנבחר בהסכם לגודל הממוצע של NC בשימוש, כדי לאפשר תחבורה על פני הממברנה. כמו כן, לתוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, כל תנאי ניסוי דורש מינימום של ארבע חזרות (בארות) בתוך אותו הניסוי, ומינימום של 3 ניסויים בלתי תלויים.
- הכן את המדיום סלולרי תרבות המכיל מדיום DMEM בתוספת גלוקוז 4.5 גר '/ ל', 15% בסרום שור עוברי, ו -1% סטרפטוקוקוס עט, וחום ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- לדלל אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל אנושי (קאקו-2) תאים במדיום סלולרי ומקום200-400 μl של פתרון התא לתוך התא העליון (הפסגה) של להכניס transwell, בצפיפות של 1.5 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר. למלא את התא התחתון (basolateral) עם 700-900 μl של מדיום סלולרי.
- תרבות תאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולחות 95% עבור 16-21 ימים, והחליפו את המדיום בתא העליון ותחתון בכל 3-4 ימים, תוך שימוש באמצעי האחסון שצוין בשלב 1.3. החלף בינוני לפי הסדר הבא כדי לשמור על הלחץ מעל (ולא מתחת) monolayer התא: לשאוב את המדיום מהתא התחתון, לשאוב את המדיום מהחדר העליון, למלא את התא העליון עם מדיום חדש, ולמלא את התא התחתון עם מדיום חדש.
2. אימות של GI אפיתל חדירות המחסום באמצעות Transepithelial חשמל ההתנגדות (Teer) וImmunostaining של צומת הדוקים
- עבור אחסון לטווח קצר (פחות מ -2 שבועות), לצלול אלקטרודות STX100 בsolu אלקטרוליטtion (.1-.15 M KCl או NaCl). חבר את כבל האלקטרודה ליציאת האלקטרודה במד EVOM וולט אוהם, כך שהמערכת היא קצרה חשמלית באופן פנימי, והוא שמר על הסימטריה האלקטרודה. עבור אחסון לטווח ארוך, לשטוף עם DH 2 O ולאחסן אותו במצב יבש, כהה.
- כדי לעקר את האלקטרודות, לטבול באתנול במשך 15 דקות ולאפשר לאוויר יבש ל15 שניות. לחלופין, ניתן לאחסן את האלקטרודות במכסת מנוע UV. יש לשטוף את האלקטרודות בתמיסה סטרילית אלקטרוליט (תמיסת מלח חיץ פוספט, PBS) או .1-0.15 פתרון M KCl או NaCl, לפני כל מדידת התנגדות.
- עם מד וולט אוהם מוגדר להגדרת ההתנגדות, במאונך למקם את האלקטרודות הבמכילה את תוסף transwell היטב, עם האלקטרודה הקצרה בחדר העליון ואלקטרודה הארוכה בתא התחתון נוגע בתחתית הבאר. לאחר קריאת EVOM תתייצב, להקליט את ערך ההתנגדות (שניתן באוהם; Ω) לכל אחד.
- חישוב התנגדות (ההתנגדce מנורמל לאזור; Ω × 2 סנטימטר) של דגימות על ידי הפחתת התנגדות רקע (Teer של מוסיף transwell ללא תאים) והכפלה בשטח הממברנה. ערכי התנגדות לרוב מדווחים בספרות. (ראה דיון)
- חזור על מדידות בכל 1-2 ימים עד Teer ערכי עלייה למקסימום ורמה, המצביעים על היווצרותו של מחסום חדירות, אשר בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות מרגע platting תא. ערכי המישור Teer וזמן דרוש כדי להשיג את שלמות מחסום עשויים להשתנות בהתאם למספר תא מעבר.
- כדי לאמת את נוכחותם של צמתים הדוקים בmonolayers תא עם Teer הגבוה (שווה או מעל ערך הסף להיווצרות מחסום), לתקן את התאים על ידי דגירה עם paraformaldehyde 2% קרים במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף תאים עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי occludin. שטוף תאים שוב עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 7.5 מיקרוגרם / מיליליטר ונוגדנים משני luorescently שכותרת. השתמש בבארות עם Teer נמוך כביקורת שלילית להיווצרות מכשול.
הערה: כתחליף לאנטי occludin, ניתן להשתמש בנוגדנים לחלבוני צומת הדוקים חלופיים.
- הבלו בזהירות את קרום המסנן שבי monolayer הקבוע מצורף, ולעלות על גבי שקופיות להדמיה באמצעות epifluorescence או confocal.
3. הערכת Transepithelial תחבורה של נשאים ממוקדים
- תווית נוגדנים (נוגדנים חד שבטיים כנגד עכבר ICAM-1, אנטי ICAM, בדוגמא זו) מיקוד עם 125 אני, כפי שתואר בעבר 7. השתמש assay ברדפורד להעריך ריכוז חלבון ודלפק גמא לקבוע 125 אני תוכן בנוגדנים, ואז לחשב את הפעילות הספציפית בספירת לדקה (CPM) / מ"ג של נוגדן שכותרתו.
הערה: כדי לשלוט על הספציפיות, מחדשכבול ההליך על ידי IgG עכבר תיוג, אשר ישמש להכנת NCS המצופה שאינו ממוקד. ללמוד הובלה של מטענים טיפוליים, לחזור על תהליך תיוג המטען, למשל, אלפא Galactosidase (α-Gal) בדוגמא זו. חלופות יכולות לשמש לסוכן המיקוד, שליטה שאינה ספציפית, או מטען טיפולי. גם שיטות חלופיות ניתן להשתמש כדי לתייג תרכובות ולהעריך את הריכוז של עמיתיהם שכותרתו.
- זוג שכותרת מיקוד נוגדנים (אנטי ICAM בדוגמא שלנו) על פני השטח של NCS. בדוגמא זו, דגירה nanobeads קלקר (קוטר 100 ננומטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר עם 125 I-אנטי ICAM לאפשר ספיחת פני השטח, כפי שתואר על 7.
הערה: לקבלת השליטה שאינה ספציפית להשתמש 125 I-IgG. כדי לעקוב אחר שינוע מטענים, להשתמש בשילוב של מיקוד נוגדנים ו125 מטען שהכותרת אני (α-גל בדוגמא שלנו).
- צנטריפוגה ב XG 13,000 במשך 3 דקות ולהסיר את עמיתיהם שאינם מצופים בsupernatant על ידי שאיפה. Resuspend את הכדור המכיל NCS המצופה באמצעות 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS על ידי pipetting, וsonicate בהספק נמוך כדי לשבש אגרגטים פוטנציאל חלקיקים (20-30 בפולסים קצרים).
- לאפיון NC, למדוד את הגודל, polydispersity, וζ-פוטנציאלי של חלקיקים מצופים באמצעות פיזור אור דינמי (בעקבות הוראות ספק), ולכמת את מספר 125 כותרת מיקוד מולקולות נוגדן (למשל אנטי ICAM) על פני השטח של החלקיקים באמצעות דלפק גמא.
הערה: שיטות אלה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים. הגודל של חלקיקים מצופים נע סביב 200 ננומטר.
- הוספת 125 NCS אני נוגדנים, (למשל 125 I-אנטי ICAM NCS; 56 NCI / מיליליטר) לתא העליון מעל monolayers המחוברות קאקו-2 עם Teer &# 8805; 350 Ω × 2 סנטימטר (ראה דיון) על רקע (16-21 ימים לאחר זריעה). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחים אחד או יותר זמן רצוי. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני ואחרי הדגירה כדי להעריך את ההשפעות של NCS במחסום החדירות.
הערה: הליך זה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים.
- אסוף בינוני מהתאים העליונים ותחתונים ולשטוף אותם פעם אחת עם 0.5 מיליליטר DMEM על 37 מעלות צלזיוס (בית עליון) או 1 מיליליטר DH 2 O (תא תחתון). לאסוף את שוטף למדידה בסך הכל תוכן radioisotope באמצעות דלפק גמא.
- למדידה של שבריר התא, בלו, המסנן החדיר, למשל באמצעות סכין גילוח כדי לחתוך מסביב לקצוות, ודגירה בצינור דלפק גמא עם 1% טריטון X-100 עבור 10 דקות (כדי לשחרר את תוכן תא), לפני מדידת תא הקשורים רדיואקטיביות סך הכל.
- כדי למדוד 125 אני מחדשבחכירה מNCS במהלך הובלה או עקב הידרדרות פוטנציאלית, התמהיל ראשון 300 μl של מדגם (משברים העליונים, תחתון, או תא) עם 700 μl של BSA 3% ב-PBS ו200 μl חומצת Trichloroacetic (TCA). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. בינתיים זה זמן, למדוד את הרדיואקטיביות הכוללת של מדגם זה בדלפק גמא.
- דגימות TCA צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות על מנת להפריד בין חלבון שלם (גלולה) מהחלבון המושפל או 125 אני שבריר (supernatant). לכמת את הרדיואקטיביות שלי שבריר 125 החופשי ולחסר ערך זה מרדיואקטיביות בסך הכל נמדד לפני צנטריפוגה. זה יספק את כמות החלבון שכותרתו כי הוא לא מושפל.
4. מנגנון של Transepithelial תחבורה של Nanocarriers ממוקד
- תווית אלבומין עם 125 כפי שתוארו בסעיף 3.1 והעבר דיווחה 7.
הערה: אלבומין הוא 66.5חלבון kDa, ולכן, חומר גדול יחסית. למרות שליטה בתוקף להובלה פסיבית של אובייקטים גדולים יותר (למשל 200 NCS ננומטר משמש כאן), זה צריכה להיות מוחלף עם מולקולות נותב אינרטי קטנים יותר כאשר לומדים הובלה של נשאי תרופות קטנים יותר (ראה דיון).
- כדי להעריך תחבורת paracellular באמצעות זליגת paracellular אלבומין, קאקו-2 monolayers תרבות על transwell מוסיף כפי שתואר לעיל.
- למדיום החדר העליון מעל monolayer התא, להוסיף או 125 I-אלבומין לבד (ביקורת שלילית המראה את הרמה הבסיסית של דליפה), או 125 NCS-ממוקד נוגדן I-אלבומין ולא רדיואקטיבי (כמתואר בסעיף 3.5). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מרווח הזמן שנבחר (ים), שאמור להתאים לאלו שנבדקו בעת בדיקת תחבורת NC. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ואחרי הדגירה, ואז לאסוף את כל השברים ל125 אני כולל ו125 אני מדידות חופשיות כפי שמצוין. בסעיף 3 הערה: בנוסף בד בבד 125 NCS IgG שליטת I-אלבומין ולא רדיואקטיבי עשוי לשמש כביקורת.
- כביקורת חיובית לפתיחת צמתים אינטר, להוסיף מדיה תא המכילה 5 מ"מ H 2 O 2 לתאי העליונים ותחתונים של להכניס transwell, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ואז, למדוד Teer (סעיף 2.3) ולהוסיף 125 I-אלבומין לחדר העליון למרווחי הזמן שנבחרו. מדוד Teer בנקודות זמן שונים לאורך הדגירה לזהות ריקבון ערך Teer נגרמים על ידי H 2 O פתיחה מושרה 2 של צמתים התא.
- בניסויים מקבילים, להעריך תחבורת transcellular, המכונה גם transcytosis, 125 NCS-ממוקד אני על ידי דוגרים קאקו-2 monolayers מחוברות עם או monodansylcadaverine מיקרומטר 50 (MDC; מעכב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin), 1 מיקרוגרם / מיליליטר filipin (מעכב של caveolar אנדוציטוזה בתיווך), וורטמן 0.5 מיקרומטרב( מעכב של phosphatidylinositol 3 קינאז [PI3K], מעורב בmacropinocytosis), או 20 מיקרומטר [5 - (N-אתיל-N-איזופרופיל) אמילוריד] (EIPA, מעכב של macropinocytosis ואנדוציטוזה בתיווך CAM 15).
הערה: 125 I-IgG NCS ו125 I-אלבומין עשוי לשמש בקרות שליליות להשפעה של מעכבים האלה, ושיטות אחרות (לדוגמא: טכניקות siRNA) עשויות לספק עיכוב בררני יותר.
- מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ולאחר הדגירה של תאים עם מעכבים וחומרי רדיואקטיבי, כבקרה נוספת להשפעה של מעכבים על חדירות השכבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאימות של מודל התא שלנו ללמוד תחבורת transepithelial של NCS הממוקד, איור 2 מראה כי קאקו-2 monolayers תא מצופה בצפיפות של 1.5 × 10 5 תאים / 2 סנטימטר הגיעה מפגש ~ יום 12 ושמר עד יום 18 יושרת monolayer, מסומן על ידי (איור 2 א) Teer. זו קבלה תוקף על ידי הנוכחות של צמתים הדוקים occludin החיובי (איור 2) בmonolayers עם Teer הגבוה (390 Ω סנטימטר × 2, יום 14), בהשוואה לתיוג עניים הדוק צומת בTeer הנמוך (17 Ω סנטימטר × 2, יום 5 ).
איתור של תווית רדיואקטיבית על אלמנטי NC קובע את הסכום הכולל של רכיבים אלה (NC מיקוד נוגדנים או מטענים) בתחילה הוסיף לתא apical, שבריר הסלולרי שלהם קשור, וחלקם הועבר לצד basolateral. ערכים אלו יכולים לשמש לחישוב פרמטרים שונים המתארים תחבורת NC באופן רלוונטי יותר, במיוחד לאחר הפחתת 125 אני תוכן חופשי של כל חלק, המייצג את עמיתיהם מושפלים. לדוגמא, מספר מולקולות נוגדן, מולקולות מטען, או NCS הנלווה הרוחבי monolayer התא ניתן לחשב להעריך תחבורה מוחלטת. כמו כן, אחוז של מולקולות או NCS אמרו שהוא מועבר לצד basolateral ביחס למספר הכולל של מולקולות או NCS הקשורים לmonolayer התא, מעריך את היעילות של התחבורה אמרה. לבסוף, מקדם לכאורה החדירות (האפליקציה P), פרמטר סטנדרטי לשיעור של תחבורה, יכול להיות מוערך. פרמטרים אלה מחושבים כפי שלהלן:
מולקולות מועברים או NCS מועבר = × basolateral CPM (מולקולות נוספות או NC הוסיף / CPM הוסיף)
מולקולות או NCS% מועברים = 100 x [basolateral CPM basolateral / (CPM + CPMחלק תא)]
האפליקציה P (סנטימטר / s) = (CPM basolateral × Vol.) / (t × × CPM הוסיף)
בי CPM הוא הוסיף 125 אני ספירות לדקה לחדר העליון (CPM הוסיף), שבריר monolayer התא (חלק CPMcell), או התא התחתון (basolateral CPM), והוסיפו NC או מולקולות הוסיפו הן מספר NCS או מולקולות בתחילה הוסיפו לחדר העליון, היא את שטח הפנים של קרום המסנן (2 סנטימטר), Vol. הוא נפח בינוני בחדר העליון (מיליליטר), ולא הוא זמן של דגירה (ים).
בדוגמא שלנו, כאשר איזוטופ רדיואקטיבי הוא תיוג נוגדן המיקוד, ניתוח זה חושף את התואר ויעילות של תחבורה במונחים של נוגדנים או NCS מועבר לכל תא ואחוז של נוגדנים הקשורים monolayer תא או NCS שהועברו (איור 3 א ו 3 ב ), כפי שאנוll כמו השיעור של תחבורה במונחים של האפליקציה P (איור 3D). פרמטרים אלה, נאמדו בדוגמא שלנו ל125 NCS I-אנטי ICAM, גם בהשוואה לאלו של שליטה 125 I-IgG NCS כדי להדגים את יעילות תחבורה ביחס למקבילו הלא ממוקד (איור 3 ג ו3D).
כאשר התווית רדיואקטיבי המאוגדת במטען NC, הפרמטרים שתוארו משקפים הובלה של המטענים, שבדוגמא שלנו היה אנזים α-גל, המשמשים לטיפול בהפרעת אחסון lysosomal גנטית המכונה מחלת פברי (טבלת 1). בנוסף לחישוב תחבורת NC על ידי התחקות אמר מטען, משלוח transepithelial של אנזים טיפולי זו ניתן להעריך, למשל על ידי מבטא אותו כמולקולות או מסה של α-גל מועבר לכל תא.
לבסוף, שיטה זו מייחסת את מסלול התחבורה למסלול או paracellularמסלול transcellular. למשל, בדוגמא שלנו, EIPA מופחת הובלה של 125 NCS I-אנטי ICAM פני קאקו-2 monolayers תא (איור 4 א), ואילו תנועה לשינוי דמוקרטי, filipin, וwortmannin לא להפחית את רמות התחבורה ביחס למצב הביקורת (ללא מעכב ). הדבר מצביע על כך NCS אנטי ICAM לנצל אנדוציטוזה בתיווך CAM לתחבורת transcellular, אבל לא clathrin, caveolar, או transcytosis הקשורות macropinocytosis. יתר על כן, תחבורת paracellular הייתה לשלול באמצעות מדידות של Teer (איור 4) ותחבורה פסיבית אלבומין (איור 4C), לפיה ירידה בTeer ועלייה בזליגת paracellular אלבומין לתא התחתון במהלך ההובלה של NCS אנטי ICAM הייתה שיבוש מצויינים של צמתים בין תאית. עם זאת, דגירה עם אנטי ICAM NCS לא שינתה Teer או 125 זליגת paracellular I-אלבומין על פני תקופה של 48 שעות, בדומה לשליטה NCS IgG שאינם מועברים. כמוביקורת חיובית לפתיחת צמתים התא והתחבורה paracellular, H 2 O 2 ירד Teer לרמות בסיס, במידה ניכרת משופר 125 זליגה I-אלבומין לתא basolateral.
איור 1. סכמטי של תחבורת transepithelial של nanocarriers ממוקדת על פני מודל אפיתל במערכת העיכול. () כפלטפורמה ללימודי תחבורת transepithelial, קאקו-2 monolayers תא בתרבית על מוסיף transwell עד monolayer הדוק נוצר (16-21 ימים לאחר זריעה, Teer ≥ 350 Ω × 2 סנטימטר מעל רקע). דוגמא לרכב משלוח סמים, כגון 125 NCS I-אנטי ICAM, מתווספת לחדר העליון (apical) מעל monolayer התא ללמוד תחבורה על פני תאים ודרך הממברנה נקבובית הבסיסית.הבינוני בתא התחתון (basolateral) לאחר מכן נאסף לכימות של חומר מועבר. תחבורה (ב ') באמצעות monolayer התא מתרחשת באמצעות שני paracellular או מסלול transcellular / transcytosis. לשכפל מGhaffarian et al., J. מבוקר Rel. 163 (1), 25-33 (2012). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה
איור 2. קאקו-2 monolayers כמודל לתחבורת transepithelial. קאקו-2 תאים גדלו על מוסיף transwell ב1.5 × 10 5 תאים / 2 סנטימטר. (א) התנגדות חשמלית Transepithelial (Teer) נמדדה כדי להעריך את שלמות שכבה. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM, n = 3. (Bמיקרוסקופ פלואורסצנטי) של צמתים הדוקים immunolabeled עם אנטי occludin ונוגדנים משני שכותרתו האדומה טקסס, בימי 5 או 14 (נמוכים לעומת ערכי Teer גבוהים, בהתאמה). לשכפל מGhaffarian et al., J. מבוקר Rel. 163 (1), 25-33 (2012). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה
איור 3. הובלה של nanocarriers אנטי ICAM פני קאקו-2 monolayers תא. קאקו-2 monolayers מחוברות גדל על transwell מוסיף הודגרו עם 125 NCS I-אנטי ICAM או 125 I-IgG NCS הוסיף לתא apical. (AC) 125 אני תוכן בתא basolateral נמדד בנקודות זמן המצוינות, כדי לחשב את כמות TRANSP NCSorted לכל תא (ראה נציג תוצאות). אחוזים (B) של NCS מועבר היו מחושב כיחס של נשאים שנמצאו בחלק basolateral לזה שבברים basolateral והסלולריים גם יחד. מקדמים (ד ') גלוי חדירות (אפליקציה P) חושבו כאמור בנציג תוצאות, המשקפים את שיעורי ההובלה של 125 NCS I-אנטי ICAM או 125 I-IgG NCS. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM, n = 4. לשכפל מGhaffarian et al., J. מבוקר Rel. 163 (1), 25-33 (2012). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה
איור 4. מנגנון של הובלהnanocarriers NTI-ICAM פני קאקו-2 monolayers. () תחבורת Transcellular של 125 NCS I-אנטי ICAM פני קאקו-2 monolayers מחוברות הוערכה ב24 שעות בהעדר או הנוכחות של 20 מיקרומטר EIPA, 1 מיקרוגרם / מיליליטר filipin, 50 מיקרומטר MDC, או 0.5 wortmannin מיקרומטר. (ב) Teer נמדד במהלך ההובלה של 125 NCS I-אנטי ICAM פני קאקו-2 monolayers, להעריך תחבורת paracellular. ערכי Teer בהעדר NCS מוצגים כשולט (המרווח המקווקו מסמן SEM של הערך הממוצע). דגירה עם 5 מ"מ H 2 O 2 היא ביקורת חיובית לפתיחה של צמתים בין תאית. (C) דליפת חלבון Paracellular, הנמדדת כמקדם לכאורה החדירות (פאפ) של 125 I-אלבומין חוצה את monolayer התא בהעדר או הנוכחות של 5 מ"מ H 2 O 2, IgG NCS, או אנטי ICAM NCS, נמדדה ו מחושב כמו באיור 3. נתונים הם מופעn כאמצעי ± SEM, n ≥ 4. לשכפל מGhaffarian et al., J. מבוקר Rel. 163 (1), 25-33 (2012). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה
| / קשור סה"כ NCS תא | NCS / תא תאיים | NCS / תא מועבר | % מוסעים | מולקולות α-גל מועברים / תא × 10 5 | pg מועבר / תא × 10 -3 | פאפ (× 10 -8 סנטימטר / שנייה) | |
| 3 שעות | 663.4 ± 116.0 | 434.0 ± 76.8 | 243.6 ± 15.4 | 44.4 ± 6.7 | 1.8 ± 0.2 | 9.7 ± 1.2 | 8.1 ± 1.1 |
| 24 שעות | 2024.8 ± 409.3 | 1218.9 ± 255.6 | 806.9 ± 164.1 | 40.6 ± 2.0 | 3.9 ± 0.5 | 21.3 ± 2.5 | 1.9 ± 0.4 |
| NCS = nanocarriers; α-גל = α-galactosidase; סה"כ NCS קשור / תא = תאיים NCS / תא + NCS מועבר / תא;% מוסעים = (NCS מועבר / סה"כ NCS הנלווה) × 100; אפליקציה P = מקדם חדירות לכאורה (סנטימטר / S). ראה שיטות לתיאור נוסף של פרמטרים אלה. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM (n = 8 בארות); (TNF-α קאקו-2 תאים). | |||||||
טבלת 1. תחבורת Transepithelial של α-Gal ידי nanocarriers אנטי ICAM. תחבורת Transcellular של אנטי ICAM / 125 I-α-גל NCS פני קוןקאקו-2 monolayers הרהוט הוערך בשעה 3 ו24 שעות. תוכן radioisotope של שברים הפסגה, basolateral, ותא הוסבו לערכים שונים רלוונטיים להובלה, כפי שמתואר בנציג תוצאות. לשכפל מGhaffarian et al., J. מבוקר Rel. 163 (1), 25-33 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימוש בשיטות שנדונו לעיל, ניתן לקבוע מודל תא לחקר תחבורה של NCS הממוקד על פני מחסומים סלולריים, כמו בדוגמא הניתנת לקאקו-2 תאי אפיתל, שהוא רלוונטי להערכת תחבורה מלומן במערכת העיכול אל הדם במקרה של מערכות להולכת תרופות דרך הפה. Culturing של monolayers תאי אפיתל במערכת העיכול במוסיף transwell אפשר מדידה של Teer וimmunostaining הקרינה של צמתים הדוקים כדי לאשר הקמתה של גדר חדירות תא. בהמשך לכך, radiolabeling של מיקוד וסוכנים טיפוליים עם 125 אני מסופק כימות מהיר ורגיש של NCS הממוקד ולרוחב במערכת העיכול monolayers תא. לבסוף, מחקרים מכניסטית יושמו באמצעות מעכבי endocytic, Teer, וassay זליגת paracellular אלבומין להעריך האם תחבורה מתרחשת באמצעות מסלול ועי לעומת מסלול paracellular.
פרמטר חשוב בהקמת מודלים דומים iשל הבחירה של סוג תא, אשר אמור לשקף את האופי הפיזיולוגי של המחסום הסלולרי תחת מחקר. תאי אפיתל ואנדותל שונים מהמקור אנושי או חיה זמינים 16,18-20 מסחרי. אלה יכולים להיות מבוגרים לבד כמו תרבויות בודדות כפי שתוארו כאן, או כשיתוף תרבויות של תאים אלה עם סוגי תאים אחרים (למשל ליחה-מפריש תאים, תאי מערכת החיסון, pericytes, וכו ') 16,18-20. בצורת שיתוף תרבות כזו, יכול להיות מווסת transwell תנאים להוסיף כדי להתאים את שיעורי צמיחה בהתאמה ודרישות לגורמי בידול בתקשורת הסלולרי 16,18-20. לדוגמא, מודל מחסום דם מוח עשוי להיות כרוך בשיתוף טיפוח של תאי אנדותל כלי הדם במוח והאסטרוציטים או pericytes על המשטח הנגדי של המסנן הנקבובי, ובאמצעי התקשורת המתאים לכל סוג תא צריכה להיות ממוקם בכל תא 19. בנוסף, בהתאם לקו התא, עשויים להיות req רכיבי מטריצה תאייםuired מצורף תא יעיל הקרום הנקבובי 18-20. חשוב לקחת בחשבון שכל דגם מסוים יהפוך את רמות בסיס שונות בכל קשורים לפרמטרי מחסום חדירות ושיעורי תחבורה ומנגנון, ומכאן לשלוט בערכים צריכים לקבל ושיטות אלה מותאמים לכל מצב.
Transwell מוסיף כגון אלה שתוארו כאן, היו בשימוש נרחב ללמוד הובלת חומרים על פני monolayers תא, מהפסגה לתא basolateral או להיפך 5,10-12,16,17. זה לא יכול להיות מושגת על ידי תאי culturing על בארות או coverslips קלאסיים משום שמערכות כאלה ימנעו צורה זו של תחבורה כפי שהם לא מציעים שני תאים עצמאיים, ולכן לא יכולים לתת הערכה ריאליסטית של מיון תא. כך, למשל, חומרים המיועדים באופן טבעי לשחרור מן הקרום basolateral ניתן נדחקו לתאי תאים אחרים במודל coverslip, מה שהופך את זה קשה resolve המנגנון של תחבורת transcellular. יתר על כן, בניגוד לcoverslips, תצורת transwell מולידה תכונות פיזיולוגיות רלוונטיות הקשורים להתמיינות תאים וקוטביות קרום 10,11,16-19. לדוגמא, קאקו-2 תאים גדלו על transwells להציג את המאפיינים של enterocytes הבוגר, לרבות הנוכחות של microvilli וצמתים הדוקים, יצירת כיפה, והייצור של אנזימי גבול מברשת 10,11,17. פרמטרים אחרים יכולים לגרום לפנוטיפ יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כגון מאמץ גזירה במקרה של תאי האפיתל במערכת העיכול (כגון: זרימת ריר ותנועות התכווצות) ותאי האנדותל של כלי דם (למשל, זרימת דם), אשר יכול להיות מיושמת בtranswells באמצעות תסיסה או משאבות 10 , 16, ושיתוף תרבויות לייצר צמיחה הדרושה וגורמי בידול לסוגי תאים מסוימים 16,18-20. עם זאת, יש לקחת בחשבון שלעתים קרובות שורות תאים שונות מהתאים ברקמות גוף, דואר. גרם. הם עשויים לבטא גורמים מסוימים ברמות שונות, ולכן, פונקציות מגוונות בהווה ובתקנות. לדוגמא, קאקו-2 תאים אינם מכילים את כל חלבוני טרנספורטר ואנזימים דרושים להפעלה והובלה של תרופות אוראליות in vivo, כמו CYP3A4, אנזים חילוף חומרים של סמים 10,17,23. במקרים אלה, משנה שיבוטים שורת תאים, transfection, או תוספת של סוכני תעתיק יכולים לשמש לווסת את שורת התאים שישקפו טוב יותר מצבים פיסיולוגיים 17,23,24.
בבחירת מודל transwell אופטימלי, התכונות השונות של המסנן החדיר חייבים להילקח בחשבון. מסננים חדירים זמינים בגדלים נקבוביות שונים, הנעים 0.4-8 מיקרומטר, וחייבים להתאים את גודלו של מטען מועבר. לדוגמא, בגדלים קטנים יותר נקבוביות (.4-3 מיקרומטר) משמשים בדרך כלל עבור לימודים של תחבורה של תרכובות כימיות קטנות, בעוד נקבוביות 3 מיקרומטר או גדול יותר משמשים לפלישת תא, chemotaxis, ומחקרי תנועתיות שבחיידקים, תאי מערכת החיסון, ונודדים מועברים. גודל נקבובית וצפיפות משפיעים גם על צפיפות תאים והתמיינות, כפי שכמה תאים עשויים לנדוד דרך נקבוביות על זריעה, לא ניתן היווצרות שכבה. בנוסף, החומר של הבהירות חדירה השפעות תמיכת הדמיה, להערכת כדאיות תא והיווצרות monolayer, וקובץ מצורף תא. מסנני terephthalate פוליאתילן (PET) הם שקופים, המאפשרים את הנראות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב, בניגוד לשקופות מסנני פוליקרבונט. עבור התקשרות סלולרי משופרת, תומך חדיר precoated עם קולגן או פיברונקטין זמין מסחרי. יתר על כן, בקוטר המסנן, אשר מותאם לצלחות גם שונות, עשוי להשפיע על חדירות, לפיה בקטרים גדולים יותר (למשל ב6 צלחות היטב) נוטים להגדיל leakiness paracellular של monolayer התא.
ברגע שמודל transwell היא הוקמה, ובכלל זה appropriaבחירת te של סוג תא, הרכב תקשורת, ומסנן חדיר, מעמדו של monolayer התא ניתן להעריך במהלך culturing ושלבי ניסוי באמצעות Teer. עם זאת, ערכי Teer להשתנות עם 1 גורמים) מולדים ביולוגיים הקשורים לסוג התא, מקור, ומספר קטע; 2) תנאי תרבית, כגון מאפיינים כאמורים transwell, צפיפות זריעה, ימים בתרבות, תקשורת ורכב PH, 3) גורמים פיזיים , כגון טמפרטורה, תקשורת נפח, לוח זמנים דגימה, ומידה מסוימת של התרגשות / כביסה, ו 4) גורמים פתולוגיים ו / או כימיים המווסתים יושרת צומת תא (למשל ציטוקינים, תאי מערכת החיסון, סטרס חמצוני, תוספים תרופתיים, וכו ') 10, 16,17. בשל הגורמים ביולוגיים וסביבתיים השונים המשפיעים Teer, ערך בסיסי מינימאלי המצביע על היווצרות מחסום חייבת להיות הוקמה עבור כל מערכת על ידי ניטור באופן קבוע Teer בתקופת התרבות ולאחר מניפולציות ניסיוני. Values שנראים מתאים להיווצרות מכשול, אשר יכול לנוע בין 150-1,600 Ω × 2 סנטימטר 16, גם תלוי בגודל של החומר להיות מועבר באופן שדיפוזיה paracellular הפסיבי של חומר שמוגבל; תוך Teer ≥ 350 Ω × נראה 2 סנטימטר כדי למנוע דיפוזיה פסיבית של NCS הגדול יחסית כמו אלה שמוצגים כאן (200 ננומטר), זה לא יכול להיות במקרה של משלוח הסמים מערכות קטנות יותר, שבו monolayers הדוק יותר (למשל ≥ 700 Ω × 2 סנטימטר) נדרשים. ערך בסיס זה גם ניתן להעריך באמצעות פקדים לשיבוש מחסום החדירות, כולל H 2 O 2, חודר פפטידים, chelators סידן (למשל EDTA), קינאז החלבון וphosphatases, ומולקולות רגולטוריות שונות אחרות 25-27.
משלים לTeer, מבחני חדירות רבים קיימים כדי לוודא תקינות monolayer ולהעריך transpo paracellularrt. כמו אלבומין, מולקולות אחרות קרום בלתי חדיר נותב בגדלים שונים, כגון מניטול,, אינולין, וdextrans וציפר צהובים, אשר יכול להיות בשילוב עם UV, פלורסנט, או תווית רדיואקטיבי כדי למדוד ולהשוות את שיעורי חדירות (אפליקציה P) לידועים ערכים למומסים אלה. בעת הערכת תחבורת paracellular, חשוב להשתמש במולקולה נותב, כי הוא קטן יותר מהמתחם מועבר תחת מחקר. לדוגמא, תחבורת paracellular של 200 חלקיקים ננומטר תפתח צמתים אינטר מספיק כדי לגרום דליפה של paracellular, אך מולקולות עדיין גדולות יחסית קטנות יותר, כגון אלבומין השתמש בדוגמא שלנו. בניגוד לכך, תחבורת paracellular של כלי רכב משלוח סמים קטנים יותר כגון dendrimers (~ 5 ננומטר) יש להעריך באמצעות מולקולות <5 ננומטר, כגון מניטול. מחקרי זליגת Paracellular לכן מציינים את הגודל של פתיחת צומת תא, אך בשל זמני דגירה ארוכים הם לא יכולים לזהות שיבושים זמניים של Junc התאtions.
מצב נוסף של הערכת יושרת מכשול הוא תמונת צמתים ההדוקים המתחברים לתאים סמוכים. במחקר זה, אנו immunostained occludin למיקרוסקופ פלואורסצנטי, אך חלבונים אחרים שונים הנמצאים בצומת ההדוקה יכולים לשמש לניתוח זה, כולל חלבונים הטרנסממברני של מולקולת הידבקות צומת (JAM), claudin, ומשפחות occludin. כאן, אנו מוכתמים תחום תאי לעקוף צעד permeabilization, אך יכולים גם להיות מוכתמים תחומים תאיים. משלים לזה הוא השימוש בפקדים עבור מכתים שאינו ספציפי, תוך שימוש בנוגדנים משני ניאון בלבד, היעדר צמתים הדוקים (כאן, אנחנו השתמשנו בתאים עם monolayer מראה Teer הנמוך), או שיבוש של צמתים הדוקים באמצעות סוכני ויסות הצומת רשומים לעיל.
בדוגמא של תחבורת transepithelial שלנו אנו משתמשים NCS-1-ICAM ממוקד, אבל מערכת transwell גם להכיל הובלה של גיבוש רכב תרופות אחרים, תרכובות טיפוליות ואבחון, מולדת תרכובות שנמצאו בגוף, או שילוב של הנ"ל, עם השלכות חשובות ללימודים או הבנה של מסלולים בסיסיים קליניים. השיטות שאנו מתארים לכמת תחבורה ברחבי monolayers תא כרוך בתיוג radioisotope של סוכן המיקוד או מטען טיפולי במעיל NC, אך גם אסטרטגיה זו יכולה לשמש גם כדי לעקוב אחר NCS עם chemistries מגוון ומבנים, ובם פולימרים ליניארי או מסועפים, dendrimers, חלקיקים , מיצלות, ליפוזומים, וכו '4,5,28,29. איזוטופים שונים (למשל 125, 3 ח', 32 P, וכו ') זמינים לכמת תחבורה של מגוון רחב של מולקולות קטנות וגדולות: נשאי תרופות לא רק, אלא גם תרופות כימיות וביולוגיות, מבלי לפגוע בשלמות הפונקציונלית או מבנית של המתחם, בניגוד לתוויות ניאון מגושמים. Radiolabeling מספק יותר רגישות ומהירות הכמותי לעומתאסטרטגיות אחרות המודדות תחבורה, כגון ג'ל אלקטרופורזה, PCR, ספקטרומטריית מסה, HPLC, וספקטרומטריית הקרינה. גם תווית זו יכולה לשמש כדי לקבוע את מידת ההשפלה (לדוגמא סוכן חלבון מיקוד ומטענים בדוגמא שלנו) על ידי הערכת יוד תוכן חופשי, שהוא מהיר ומדויק בהשוואה למבחני פעילות החלבון חלופיים, כולל spectrophotometry UV וכתם מערבי. עם זאת, מאז יוד החופשית לא לגמרי משקפת את השינויים בקונפורמציה בחלבון או פעילות שעלולה להתרחש בהיעדר השפלה, השיטות חלופיות לעיל עשויות לשמש כדי להעריך את היושרה של חומרים מועברים הלאה. כמו כן, בעת ניהול תרכובות עם רדיואיזוטופים חופשיים לתוך תא הפסגה, לא ברור אם התווית נמצאה בשכבת התאים ושברים מועברים כתוצאה מפירוק חלבונים אמיתי או דיפוזיה של יוד החופשית מהחלל הפסגה. כדי לעקוף מגבלה זו, ייתכן שריכוז NC הפסגהלהיות מיושם על מרווח זמן קצר כדי לאפשר לעמותת monolayer התא, ואחרי ההסרה של מדיום הפסגה בתמורה למדיום חדש, ותקופה מרדף להערכת תחבורה. למרות כמות רדיואיזוטופים חופשיים מהברכה המקורית עשויה בתחילה לדלוף לתוך שברים אחרים, ערך זה ניתן לקבוע מן הדגימות ללא תקופת מרדף ומופחתי המצבים מעורבים תקופת מרדף.
במונחים של הערכת המנגנון של תחבורה, באותן השיטות שתוארו לאימות תקינות monolayer (Teer, מבחני זליגה, ומכתימים צומת הדוקה) ניתן להשתמש כדי להעריך את מסלול paracellular. עבור הובלת transcellular, מעכבים תרופתיים של גורמים מעורבים בסחר תאיים (למשל transferrin קשור למסלולי clathrin, רעלן B הכולרה הקשורים למסלולי caveolar, וכו ') יכול לשמש, לפיה ריכוזים יעילים כדי לעכב באופן ספציפי גורמים אלה צריכים לאo להיות הובהר לכל מערכת. תחליפים למעכבים ששמשו במחקר שלנו כוללים chlorpromazine ודלדול אשלגן, ספציפי לאנדוציטוזה clathrin תלוי, וגניסטאין ומהתיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD), ספציפי לספיגה בתיווך caveolae 30. אסטרטגיות אחרות שיכול למנוע תופעות לא ספציפיות פוטנציאל של מעכבים תרופתיים כרוכות בשיתוף לוקליזציה של מטענים מועברים עם גורמים אלה באמצעות הקרינה או תיוג radioisotope, ניצול של ליגנד הספציפי שולטת (למשל transferrin או רעלן הכולרה ב ', כפי שצוין לעיל), וsiRNA למציאת הביטוי של אלמנטי רגולציה של מסלולים אלה.
במחקר זה, אנו מדגימים משוואות להמרת נתונים רדיואקטיביות לפרמטרים שונים המספקים מידע ראשוני מפתח בנוגע להובלת transepithelial. לדוגמא, מידת תחבורת transepithelial מיוצגת על ידי NCS או מולקולות מועברים לכל תא, את היעילות של העברת תוכן שנקשר או נכנס לתאים מיוצגת על ידי אחוז של NCS-קשורים תא או מולקולות מועברים, והשיעור של תחבורה, המאפשר השוואה של חדירות בין מומסים שונים, מסומן על ידי האפליקציה P. על מנת להבין את הפוטנציאל של NCS הממוקד למסירה בקנה מידה גדולה של תרופות (למשל המינון הדרוש לin vivo מנהלה), משוואות אלה עשויות להיות שונה כדי לאמוד ערכי תחבורה בקנה מידה מקרוסקופית. לדוגמא, כמות מטען טיפולי מועבר ליחידת שטח פני השטח של רקמת מעי (מ"ג / 2 סנטימטר), כמו גם האספקה הפוטנציאלית ברחבי מערכת העיכול של חולה עשויה להיות מוערכת מהמשוואות הבאות,
2 רקמות = (basolateral CPM / פעילות ספציפית) מטען המוני מועבר / סנטימטר /
מטען המוני מועבר על פני מעי דק = [(basolateral CPM / פעילות ספציפית) × ת"א] /
קידום ממוסיף transwell, מודלים שייטיבו לשקף את המורכבות הפיזיולוגיות של תחבורה כוללים תאים "Ussing" ומכשירי microfluidic, המספקים זרימת נוזל דינמית וחדר כלול שממזער את המגע עם אוויר, כמו בכלי דם. דגמים אלה גם מאפשרים explants הרקמה להיות מתורבת למחקרי vivo לשעבר, לפני אימות in vivo 17,18.
לסיכום, השיטות ששמשו במחקר זה סיפקו מידע ראשוני חשוב לגבי ההובלה של מערכת אספקת הסמים מודל, במונחים של efficiency, על פני monolayers תא. שימוש במודל תרבית תאים זה אנחנו הוכיחו את הפוטנציאל של פלטפורמת nanocarrier ממוקדת ICAM-1-בהקשר של משלוח תרופות דרך הפה, וסלל את הדרך למחקרי vivo שלאחר מכן, עדיין עשוי להיות שונה עבור מערכות אחרות הדורשות הובלה על פני מחסומים סלולריים שנמצאו ב גוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הרפואי הווארד יוז והקרן הלאומי למדע לRG, וקרנות הוענקו לSM על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (גרנט R01-HL98416) ואיגוד הלב האמריקאי (גרנט 09BGIA2450014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
