Summary
Molte applicazioni terapeutiche richiedono un trasporto sicuro ed efficiente dei vettori della droga e dei loro carichi attraverso le barriere cellulari nel corpo. Questo articolo descrive un adattamento di metodi consolidati per valutare il tasso e il meccanismo di trasporto di nanocarriers droga (NCS) attraverso le barriere cellulari, come il tratto gastrointestinale (GI) epitelio.
Abstract
Vettori sub-micrometriche (nanovettori; NC) migliorare l'efficacia dei farmaci, migliorando la solubilità, stabilità, tempo di circolazione, il targeting e il rilascio. Inoltre, attraversando le barriere cellulari nel corpo è fondamentale sia per la somministrazione orale di NC terapeutici nella circolazione e il trasporto dal sangue nei tessuti, dove è necessario un intervento. NC trasporto attraverso le barriere cellulari si ottiene: (i) il percorso paracellulare, via transitoria interruzione delle giunzioni che si incastrano celle adiacenti, o (ii) il percorso transcellulare, in cui i materiali vengono internalizzati per endocitosi, trasportato attraverso il corpo cellulare, e secreta sulla superficie cellulare opposta (transyctosis). Consegna attraverso le barriere cellulari può essere facilitata con l'accoppiamento di terapie o loro vettori con agenti di targeting che si legano specificamente a marcatori di superficie cellulare coinvolti nel trasporto. Qui, forniamo i metodi per misurare l'entità e il meccanismo di trasporto NC attraverso una barriera cellulare modello, which è costituito da un monostrato di gastrointestinale (GI), le cellule epiteliali coltivate su una membrana porosa situato in un inserto transwell. Formazione di una barriera di permeabilità è confermata dalla misurazione resistenza elettrica transepiteliale (TEER), trasporto transepiteliale di una sostanza di riferimento, e immunocolorazione delle giunzioni strette. Come esempio, si usano ~ 200 nm NC polimeriche, che portano un carico terapeutica e rivestite con un anticorpo che si rivolge a un determinante superficie cellulare. L'anticorpo o un carico terapeutica è etichettato con 125 I per radioisotopo rintracciamento e NC etichettati vengono aggiunti alla camera superiore sopra il monostrato cellulare per diversi periodi di tempo. NC associati alle cellule e / o trasportati alla camera sottostante può essere rilevato. Misurazione della libera 125 I consente la sottrazione della frazione degradato. Il percorso paracellulare è valutata determinando potenziali variazioni causate dal trasporto NC barriera ai parametri sopra descritti. Transcellulare i trasportis determinata affrontando l'effetto di modulare endocitosi e transcitosi percorsi.
Introduction
Barriere cellulari nell'atto corpo come gateway tra l'ambiente esterno e scomparti interni. Questo è il caso per il rivestimento epiteliale separa la superficie esterna esposta del tratto gastrointestinale (GI) e il flusso sanguigno 1-3. Barriere cellulari rappresentano anche l'interfaccia tra il sangue e il parenchima e componenti cellulari di tessuti e organi. Questo è il caso per il rivestimento endoteliale interno in vasi sanguigni, come la barriera emato-polmonare, la barriera emato-encefalica, ecc 1 La capacità di attraversare le barriere cellulari nel corpo è cruciale per la consegna efficiente di agenti terapeutici e diagnostici in circolo e tessuti / organi in cui è necessario l'intervento.
Per migliorare l'erogazione di agenti terapeutici o diagnostici, questi composti possono essere caricati in nanocarriers sub-micrometriche (NC). Questi veicoli di somministrazione di farmaci possono essere formulati con una varietà dichimiche e strutture per ottimizzare la solubilità della droga, la protezione, la farmacocinetica, il rilascio, e il metabolismo 4,5. NC può essere funzionalizzato con affinità o rivolti frazioni (ad esempio anticorpi, peptidi, aptameri zuccheri, ecc) per facilitare l'adesione alle zone del corpo in cui è richiesta l'azione terapeutica 2,6. Targeting di NC determinanti espresse sulla superficie delle barriere cellulari può facilitare il successivo trasporto in e / o di tutti questi rivestimenti 2,6.
Il ruolo di trasportare selettivamente sostanze tra due ambienti richiede alcune caratteristiche uniche tra strati di cellule. Una tale funzionalità è polarità cellulare, per cui la membrana apicale rivolta verso il lume della cavità varia dalla membrana basolaterale orientata verso l'interstizio tessuto, rispetto alla membrana morfologia e composizione dei lipidi, trasportatori e recettori 2. Un'altra caratteristica comporta junctio intercellularens collegamento celle adiacenti. Regolazione delle proteine che formano giunzioni strette, molecole di adesione particolarmente giunzionali (inceppamento), occludins e claudine, modulare la funzione di barriera per permettere selettivamente o non trasporto di sostanze tra cellule, note come trasporto paracellular, permettendo il passaggio di materiali dal lume a lo spazio basolaterale 3. Il legame di molti elementi naturali e sintetiche (leucociti, molecole, particelle e sistemi di drug delivery) alle barriere cellulari nel corpo può indurre apertura cella giunzione, che può essere transitoria e relativamente innocuo o più prolungato e, quindi, non sicuro con accesso di sostanze indesiderate attraverso la barriera 2,5,7-9. Di conseguenza, questa via può essere valutata misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e diffusione paracellular passiva di molecole (qui chiamato dispersione paracellular), per cui diminuita resistenza in corrente elettrica o maggiore dispersione paracellular di un inert composto nello spazio basolaterale indicare l'apertura di giunzioni cellulari, rispettivamente 5,10,11. A complemento di questi metodi, una delle proteine di giunzione stretti sopra elencati possono essere macchiati di valutare la loro integrità, dove la colorazione dovrebbe apparire concentrata ai confini cellula-cellula in tutto il periferia cellulare 5,10,12.
In alternativa, sistemi di somministrazione di farmaci che hanno come target specifici determinanti della superficie cellulare, come quelli associati a fosse rivestite di clatrina o invaginazioni di membrana a fiasco chiamati caveole, possono innescare captazione vescicolare nelle cellule per endocitosi, fornendo una via per la somministrazione di farmaci a compartimenti intracellulari 5, 13. Inoltre, endocitosi può portare al traffico di vescicole in tutto il corpo cellulare per il rilascio sul lato basolaterale, un fenomeno noto come transyctosis, o il trasporto transcellulare 14. Pertanto, la conoscenza della cinetica e meccanismo di endocitosi può essere utilizzata per sfruttare intracellulare unand drug delivery transcellulare, che offre un modo relativamente sicuro e controllato di consegna rispetto alla via paracellular. (Endocitosi come nel caso della molecola di adesione cellulare (CAM)-mediata) Il meccanismo di endocitosi può essere valutata con modulatori dei percorsi classici (clatrina-e endocitosi caveolina-mediata, e macropinocitosi) o rotte non-classici 5,13,15 .
Considerando traffico intracellulare è spesso studiato in pozzetti standard o coprioggetti, l'assenza di un compartimento basolaterale osta polarizzazione cellulare e la capacità di studiare il trasporto attraverso strati di cellule. Per superare questo ostacolo, il trasporto attraverso monostrati cellulari sono stati a lungo studiati utilizzando transwell inserti 10,11,16,17, che consistono in un (apicale) camera superiore, una membrana permeabile poroso in cui le cellule si attaccano e formano un monostrato stretto, ed una inferiore (basolaterale) camera (Figura 1). In questa configurazione, il trasporto può essere misurata nelapicale a basolaterale direzione somministrando un trattamento nella camera superiore, segue un percorso attraverso il monostrato cellulare e la membrana porosa sottostante, e finalmente raccogliendo il mezzo nella camera inferiore per la quantificazione del materiale trasportato. Trasporto in direzione basolaterale-to-apicale può anche essere misurata mediante somministrazione iniziale alla camera inferiore e successiva raccolta dalla camera superiore 5,10,12,16. Esistono varie tecniche per verificare la formazione di permeabilità barriera su transwells, compresi TEER e saggi trasporto paracellular, come descritto sopra. Inoltre, il filtro permeabile in cui le cellule sono coltivate può essere rimosso per l'analisi delle immagini (ad esempio mediante fluorescenza, confocale, microscopia elettronica), come ulteriormente validazione del modello monostrato cellulare così come il meccanismo di trasporto. Selezione del tipo a membrana, che è disponibile in diverse dimensioni dei pori, materiali e superfici, in funzione di varie factors come la dimensione di sostanze o oggetti da trasportare, tipo cellulare, e metodo di imaging 16,18-20. Transwell inserti anche facilitare quantificazione controllato e preciso di trasporto rispetto ai sistemi complessi di mammifero, come volumi delle camere e della superficie cellulare sono costanti note. Mentre molti fattori coinvolti nella consegna in vivo sono eliminati, tra cui la presenza di muco intestinale, shear stress, enzimi digestivi, le cellule immunitarie, ecc, questa piccola scala modello in vitro fornisce informazioni preliminari utili in materia di trasporti.
Come esempio per illustrare l'adattamento di questi metodi per studiare il trasporto NC attraverso le barriere cellulari 10,11,16,17, descriviamo qui un caso in cui il rischio di propagazione NC attraverso l'epitelio GI stato modellato valutando passaggio di un drug delivery modello sistema attraverso un monostrato di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2) cellule. A tal fine, cells stati coltivati in inserti transwell, su un 0,8 micron pori polietilene tereftalato (PET) filtro (diametro 6,4 mm), che è trasparente e può essere utilizzato per l'imaging microscopia. Lo stato della barriera di permeabilità è convalidata misurando TEER, trasporto apicale a basolaterale di una sostanza di riferimento, albumina, e visualizzazione microscopia a fluorescenza di un elemento delle giunzioni strette, proteine occludina. Un modello di polimero mirata NC viene utilizzato, costituito da 100 nm, nanoparticelle polistirene non biodegradabile. NC sono rivestiti mediante adsorbimento superficie con un anticorpo rivolti solo o una combinazione di un anticorpo targeting e un carico terapeutico, in cui o componente può essere marcato con 125 I per radioisotopo tracciamento. Nell'esempio selezionata, l'anticorpo riconosce molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una proteina espressa sulla superficie di GI epiteliale (e altre cellule), che è stato dimostrato per facilitare il trasporto intracellulare e transcellulare o trasportatori di farmaci f e del loro carico 21. Il carico è l'alfa-galattosidasi (α-Gal), un enzima terapeutico usato per il trattamento della malattia di Fabry, una malattia da accumulo lisosomiale genetica 22.
NCS rivestiti, di circa 200 nm dimensioni, vengono aggiunti alla camera apicale sopra il monostrato cellulare e incubate a 37 ° C per vari periodi di tempo, dopo che 125 I sulla NC può essere rilevato associata al monostrato di cellule e / o trasportato alla camera basolaterale sotto le celle. Ulteriori determinazione del libero 125 mi permette di sottrazione della frazione degradato e la stima dei trasporti rivestito NC. Il meccanismo di trasporto è ulteriormente valutata esaminando cambiamenti nella permeabilità della barriera di pertinenza del percorso paracellulare, attraverso i parametri sopra descritti, mentre il trasporto transcellulare è determinata esaminando cambiamenti nel trasporto modulando vie di endocitosi e transcitosi.
ONTENUTO "> Questi metodi forniscono informazioni preziose riguardo modelli barriera cellulare, il grado e la velocità di trasporto di un sistema di somministrazione di farmaci, e il meccanismo di tale trasporto, consentendo complessivamente valutazione del potenziale per la somministrazione di farmaci attraverso le barriere cellulari.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coltivazione di un monostrato di cellule in Transwell Inserti
- In una sterile, livello di biosicurezza 2 cellule cappa cultura, pongono 0,8 millimetri poro PET Transwell inserisce in una piastra a 24 pozzetti (4 pozzi per condizione, per la significatività statistica) con una pinza. Tutti i materiali cofano, devono essere sterilizzati con etanolo.
Nota: La dimensione dei pori del filtro deve essere selezionato in accordo alla dimensione media della NC utilizzato, per consentire il trasporto attraverso la membrana. Inoltre, per ottenere risultati statisticamente significativi, ogni condizione sperimentale richiede un minimo di quattro ripetizioni (pozzi) all'interno dello stesso esperimento, e un minimo di tre esperimenti indipendenti.
- Preparare terreno di coltura contenente DMEM supplementato con 4,5 g / L di glucosio, siero bovino fetale 15% e 1% Pen Strep, e calore a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Diluire adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2), le cellule in terreno cellulare e luogo200-400 microlitri della soluzione nella cella superiore (apicale) camera dell'inserto transwell, ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / cm 2. Riempire il più basso (basolaterale) da camera con 700-900 ml di mezzo cellulare.
- Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO 2, e 95% di umidità per 16-21 giorni, sostituendo il mezzo nella camera superiore e inferiore ogni 3-4 giorni, utilizzando i volumi indicati al punto 1.3. Sostituire medio nel seguente ordine di mantenere la pressione sopra (anziché sotto) il monostrato cellulare: aspirare il terreno dalla camera inferiore, aspirare il terreno dalla camera superiore, riempire la camera superiore con mezzo fresco, e riempire la camera inferiore con terreno fresco.
2. Validazione del GI epiteliale permeabilità della barriera Uso transepiteliale resistenza elettrica (TEER) e Immunostaining di giunzioni strette
- Per la conservazione a breve termine (meno di 2 settimane), immergere gli elettrodi STX100 in una soluzione elettrolitazione (0,1-0,15 M KCl o NaCl). Collegare il cavo dell'elettrodo alla porta elettrodo sul misuratore Evom volt-ohm in modo che il sistema è internamente cortocircuitati e elettrodo simmetria è mantenuta. Per la conservazione a lungo termine, sciacquare con dH 2 O e conservare in un luogo asciutto, condizione di buio.
- Per sterilizzare gli elettrodi, immergere in etanolo per 15 minuti e lasciare asciugare all'aria per 15 sec. In alternativa, gli elettrodi possono essere memorizzati in una cappa UV. Risciacquare gli elettrodi in una soluzione sterile elettrolita (soluzione salina tampone fosfato, PBS) o 0,1-0,15 soluzione M KCl o NaCl, prima di ogni misurazione della resistenza.
- Con il voltmetro ohm impostata alla resistenza, verticalmente posizionare gli elettrodi in un pozzetto contenente l'inserto transwell, con la breve elettrodo nella camera superiore e lungo elettrodo nella camera inferiore toccare il fondo del pozzo. Dopo la lettura Evom stabilizza, registrare il valore di resistenza (dato in ohm, Ω) per ogni bene.
- Calcola resistività (resisce normalizzato a zona; Ω × cm 2) di campioni sottraendo la resistenza di fondo (TEER di inserti transwell senza celle) e moltiplicando per la superficie della membrana. Valori di resistività sono più spesso riportati in letteratura. (Vedi la discussione)
- Ripetere le misurazioni ogni 1-2 giorni fino TEER valori aumentano al massimo e plateau, indicando la formazione di una barriera di permeabilità, che richiede in genere 2-3 settimane dal momento del Platting cella. Valori e il tempo necessario a conseguire integrità della barriera Plateau TEER possono variare in base al numero di cellulare di passaggio.
- Per verificare la presenza di giunzioni strette in monostrati di cellule con alta TEER (uguale o superiore al valore di soglia per la formazione di barriera), fissare le cellule mediante incubazione con freddo 2% paraformaldeide per 15 min. Poi, lavare le cellule con PBS e incubate per 30 minuti a temperatura ambiente con 1 mg / ml di anti-occludina. Lavare le cellule nuovamente con PBS e incubare per 30 min a temperatura ambiente con 7,5 ug / ml fanticorpi secondari luorescently-etichettati. Utilizzare pozzetti con basso TEER come controllo negativo per la formazione barriera.
Nota: Come sostituto per anti-occludina, possono essere utilizzati anticorpi contro proteine alternative giunzione stretti.
- Asportare con cura la membrana filtrante su cui è collegato il monostrato fisso, e montare su vetrini per l'imaging che utilizzano epifluorescenza o microscopia confocale.
3. Valutare transepiteliale trasporto di portatori di mirate
- Etichetta la mira anticorpo (anticorpo monoclonale di topo contro ICAM-1, anti-ICAM, in questo esempio) con 125 I, come descritto in precedenza 7. Utilizzare saggio Bradford per stimare la concentrazione di proteine e un contatore gamma per determinare 125 I contenuti di anticorpi, quindi calcolare l'attività specifica in conteggi per minuto (CPM) / mg di anticorpo marcato.
Nota: Per controllare per la specificità, riRipetere la procedura con IgG etichettatura mouse, che verrà utilizzato per preparare NC rivestiti non mirati. Per studiare il trasporto di un carico terapeutica, ripetere la procedura di etichettatura del carico, per esempio, alfa-galattosidasi (α-Gal) in questo esempio. Alternative possono essere usate per l'agente targeting, il controllo non specifico, o merci terapeutico. Metodi alternativi possono essere utilizzati anche per etichettare i composti e stimare la concentrazione delle controparti etichettati.
- Coppia il marcato di targeting anticorpi (anti-ICAM nel nostro esempio) alla superficie di NC. In questo esempio, incubare nanobeads polistirolo (diametro di 100 nm) per 1 ora a temperatura ambiente con 125 I-anti-ICAM per consentire adsorbimento superficie, come descritto 7.
Nota: Per il controllo non specifico uso 125 I-IgG. Per tracciare il trasporto di un carico, utilizzare una combinazione di anticorpi rivolti e 125 I-marcato carico (α-Gal nel nostro esempio).
- Centrifugare a 13.000 xg per 3 min e rimuovere le controparti non-rivestiti nel surnatante tramite aspirazione. Risospendere il pellet contenente NC rivestiti con 1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS pipettando, e sonicare a bassa potenza per distruggere potenziali aggregati di particelle (20-30 brevi impulsi).
- Per la caratterizzazione NC, misurare le dimensioni, polidispersità, e ζ-potenziale di particelle rivestite utilizzando light scattering dinamico (seguendo le istruzioni del fornitore), e quantificare il numero di 125 I-marcato targeting molecole anticorpali (ad esempio anti-ICAM) sulla superficie delle particelle utilizzando un contatore gamma.
Nota: Questi metodi possono essere ripetute per controparti non specifici e terapeutiche. La dimensione delle particelle rivestite varia circa 200 nm.
- Aggiungere 125 NC I-anticorpo, (ad esempio 125 I-anti-ICAM NCs; 56 nCi / ml) alla camera superiore sopra confluenti Caco-2 monostrati con TEER &# 8805; 350 Ω × cm 2 (vedi discussione) su sfondo (16-21 giorni dopo la semina). Incubare a 37 ° C per una o più di tempo desiderato intervalli. Misurare TEER (Sezione 2.3) prima e dopo incubazione per valutare gli effetti della NC sulla barriera di permeabilità.
Nota: Questa procedura può essere ripetuta per controparti non specifici e terapeutiche.
- Raccogliere medio dalle camere superiori e inferiori e lavare una volta con 0,5 ml di DMEM a 37 ° C (camera superiore) o 1 ml dH 2 O (camera inferiore). Raccogliere i lavaggi per la misurazione del contenuto totale radioisotopo in un contatore gamma.
- Per la misura della frazione di cellule, asportare il filtro permeabile, per esempio usando una lama di rasoio per tagliare lungo i bordi, e incubare in un tubo contatore gamma con 1% Triton X-100 per 10 minuti (per rilasciare il contenuto delle celle), prima cella di misura associata radioattività totale.
- Per misurare 125 ho riaffittati da NC durante il trasporto oa causa di potenziale degrado, primo mix 300 ml di campione (provenienti dalle frazioni superiori, inferiori o cellulari) con 700 ml di 3% BSA in PBS e 200 ml di acido tricloroacetico (TCA). Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Nel frattempo questa volta, misurare la radioattività totale di questo campione in un contatore gamma.
- Centrifugare i campioni TCA a 3.000 xg per 5 minuti per separare proteina intatta (pellet) dalla proteina degradata o 125 I frazione (surnatante). Quantificare la radioattività della libera 125 frazione I e sottrarre questo valore dal radioattività totale misurato prima della centrifugazione. Ciò fornirà la quantità della proteina marcata che non viene degradato.
4. Meccanismo di trasporto transepiteliale di nanovettori mirate
- Etichetta albumina con 125 I, come descritto nella Sezione 3.1 e riportato in precedenza 7.
Nota: L'albumina è un 66.5kDa e, quindi, una relativamente grande sostanza. Anche se un controllo valido per il trasporto passivo di oggetti di grandi dimensioni (ad esempio, 200 CN nm utilizzati qui), dovrebbe essere sostituito con molecole traccianti inerti più piccoli quando si studia il trasporto di portatori di farmaci più piccoli (vedi discussione).
- Per valutare trasporto paracellulare utilizzando albumina perdite paracellulare, cultura Caco-2 monolayers su transwell inserti come descritto sopra.
- Per il mezzo camera superiore sopra il monostrato cellulare, aggiungere o 125 solo I-albumina (controllo negativo che mostra il livello basale di perdite), o 125 NC anticorpi mirati I-albumina e non radioattivi (come descritto nella Sezione 3.5). Incubare a 37 ° C per l'intervallo di tempo selezionato (s), che dovrebbe corrispondere a quelli esaminati durante le prove del trasporto NC. Misurare TEER (Sezione 2.3) prima, durante e dopo l'incubazione, quindi raccogliere tutte le frazioni per un totale di 125 mi e libero 125 I misure come indicato. nella sezione 3 Nota: concomitante aggiunta di 125 controllo I-albumina e non radiomarcato NC IgG può essere utilizzato come controllo.
- Come controllo positivo per l'apertura di giunzioni intercellulari, aggiungere media cella contenente 5 mM H 2 O 2 alle camere superiore ed inferiore dell'inserto transwell, e incubare a 37 ° C per 30 min. Quindi, misurare TEER (Sezione 2.3) e aggiungere 125 I-albumina alla camera superiore per gli intervalli di tempo selezionati. Misurare TEER in vari momenti durante l'incubazione per identificare TEER decadimento valore causata da H 2 O 2 indotta apertura delle giunzioni cellulari.
- In esperimenti paralleli, valutare i trasporti transcellulare, chiamato anche transcitosi, di 125 NC I-mirati da parte di incubazione confluenti Caco-2 monostrati sia con 50 pm monodansylcadaverine (MDC; inibitore di endocitosi clatrina-mediata), 1 mg / ml filipin (inibitore della caveolari endocitosi mediata), 0,5 micron Wortmannin (inibitore della fosfatidilinositolo 3 chinasi [PI3K], coinvolto in macropinocitosi), o 20 micron [5 - (N-etil-N-isopropile) amiloride] (EIPA, inibitore della macropinocitosi e CAM-mediata endocitosi 15).
Nota: 125 I-IgG NC e 125 I-albumina possono essere utilizzati come controlli negativi per l'effetto di questi inibitori, e altri metodi (ad esempio tecniche di siRNA) possono fornire inibizione più selettiva.
- Misurare TEER (Sezione 2.3) prima, durante, e dopo incubazione delle cellule con inibitori e materiali radiomarcati, quale ulteriore controllo per l'effetto degli inibitori sulla permeabilità monostrato.
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Representative Results
Come validazione del nostro modello cellulare per lo studio trasporto transepiteliale di CN mirati, la figura 2 mostra che Caco-2 monostrati di cellule piastrate ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / cm 2 raggiunto confluenza ~ 12 ° giorno e mantenuti integrità monostrato fino al giorno 18, indicato con TEER (Figura 2A). Questo è stato convalidato dalla presenza di giunzioni strette occludina-positivi (Figura 2B) in monostrati con elevata TEER (390 Ω × cm 2, 14 ª giornata), rispetto ai poveri etichettatura stretta derivazione a bassa TEER (17 Ω × cm 2, 5 ª giornata ).
Tracciamento del marcatore radioattivo su elementi NC determina la quantità totale di questi componenti (NC rivolti anticorpo o cargo) inizialmente aggiunta alla camera apicale, la frazione associata cella, e la frazione trasportato al lato basolaterale. Questi valori possono essere utilizzati per calcolare i vari parametri che descrivono il trasporto NC in unmaniera più rilevante, in particolare dopo la sottrazione di contenuti gratuiti 125 I di ogni frazione, che rappresenta controparti degradate. Per esempio, il numero di molecole di anticorpi, molecole cargo, o NCS associati che sono trasversali il monostrato cellulare può essere calcolato per stimare trasporto assoluto. Inoltre, la percentuale di dette molecole o NCS che viene trasportato al lato basolaterale rispetto al numero totale di molecole o NCS associate monostrato cellulare, stima dell'efficienza di detto trasporto. Infine, il coefficiente di permeabilità apparente (P app), un parametro standard per il tasso di trasporto, può essere stimata. Tali parametri sono calcolati come segue:
Le molecole trasportate o NCS trasportati = CPM × basolaterale (Molecole aggiunto o NC aggiunto / CPM aggiunto)
% molecole o NC trasportati = 100 x [CPM basolateral / (CPM basolaterale + CPMfrazione di cellule)]
P app (cm / s) = (CPM basolateral × vol.) / (A × t × CPM aggiunto)
dove CPM sono il 125 I conteggi al minuto aggiunto alla camera superiore (CPM aggiunto), la frazione monostrato cellulare (frazione CPMcell), o la camera inferiore (CPM basolaterale), e NC aggiunte o molecole aggiunte sono il numero di CN o molecole inizialmente aggiunti alla camera superiore, A è l'area della superficie della membrana filtrante (cm 2), vol. è il volume del mezzo nella camera superiore (ml), e t è il tempo di incubazione (s).
Nel nostro esempio, quando l'isotopo radioattivo viene etichettare l'anticorpo mira, questa analisi rivela il grado e l'efficienza del trasporto in termini di anticorpi o NCS trasportate per cellula e la percentuale di cellule anticorpi o NCS che sono stati trasportati monostrato-associato (Figura 3A e 3B ), come abbiamoll come il tasso di trasporto in termini di P app (Figura 3D). Questi parametri, stimati nel nostro esempio per 125 NC I-anti-ICAM, sono stati confrontati con quelli di controllo 125 I-IgG NC per dimostrare l'efficienza del trasporto rispetto ad una controparte non mirato (Figura 3C e 3D).
Quando il marcatore radioattivo è incorporato sul carico NC, i parametri descritti riflettono trasporto del carico, che nel nostro esempio era α-Gal enzima, utilizzato per il trattamento di una malattia lisosomiale genetica nota come malattia di Fabry (Tabella 1). Oltre a calcolare trasporto NC tracciando detto carico, consegna transepiteliale di questo enzima terapeutico può essere stimato, per esempio esprimendolo come molecole o massa di α-Gal trasportati per cella.
Infine, questo metodo attribuisce il percorso di trasporto per il percorso paracellulare o l'percorso transcellulare. Per esempio, nel nostro esempio, EIPA ha ridotto trasporto di 125 NC I-anti-ICAM tutto Caco-2 monostrati cellulari (Figura 4A), che MDC, filipin, e wortmannina non ha ridotto i livelli di trasporto rispetto alla condizione di controllo (senza inibitore ). Ciò suggerisce che NC anti-ICAM utilizzano CAM endocitosi mediata per il trasporto transcellulare, ma non clatrina-, caveolari-o transcitosi macropinocitosi-correlati. Inoltre, il trasporto paracellular stata esclusa sulla base delle misure di TEER (Figura 4B) e un trasporto passivo albumina (Figura 4C), per cui una diminuzione TEER e un aumento di albumina perdite paracellular nella camera inferiore durante il trasporto di NC anti-ICAM avrebbero indicato interruzione delle giunzioni intercellulari. Tuttavia, l'incubazione con anti-ICAM NC non ha alterato TEER o 125 I-albumina perdite paracellular su un periodo di 48 ore, simile a NCS IgG che non vengono trasportati. Comeun controllo positivo per l'apertura delle giunzioni cellulari e trasporto paracellular, H 2 O 2 è diminuito TEER a livelli basali e marcatamente migliorata dispersione 125 I-albumina alla camera basolaterale.
Figura 1. Schema del trasporto transepiteliale di nanovettori mirati attraverso un modello epiteliale gastrointestinale. (A) come una piattaforma per studiare il trasporto transepiteliale, Caco-2 monostrati di cellule sono coltivate su inserti transwell fino ad un monostrato stretto si forma (16-21 giorni dopo la semina, TEER ≥ 350 Ω × cm 2 su sfondo). Un esempio di un vettore della droga, come NC 125 I-anti-ICAM, viene aggiunto al (apicale) camera superiore sopra il monostrato cellulare per studiare il trasporto attraverso le cellule e attraverso la membrana porosa sottostante.Il mezzo in basso (basolaterale) camera viene poi raccolto per la quantificazione del materiale trasportato. (B) Trasporti attraverso il monostrato cellulare avviene sia tramite un paracellulare o rotta transcellulare / transcitosi. Tratto da Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Clicca qui per ingrandire la figura
Figura 2. Caco-2 monostrati come modello per il trasporto transepiteliale. Cellule Caco-2 sono state coltivate su inserti transwell a 1,5 × 10 5 cellule / cm 2. (A) transepiteliale resistenza elettrica (TEER) è stato misurato per valutare l'integrità monostrato. = 3 n; dati sono mostrati come media ± SEM. (B) Microscopia a fluorescenza di giunzioni strette immunolabeled con anti-occludina e anticorpo secondario marcato con Texas Red, nei giorni 5 o 14 (basso contro valori elevati TEER, rispettivamente). Tratto da Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Clicca qui per ingrandire la figura
Figura 3. Trasporto di nanocarriers anti-ICAM tutta Caco-2 monostrati cellulari. Confluenti Caco-2 coltivati su monostrati transwell inserti sono stati incubati con 125 CN I-anti-ICAM o 125 I-IgG NC aggiunto alla camera apicale. (AC) 125 contenuti che nella camera basolaterale è stata misurata nei punti temporali indicati, per calcolare la quantità di NC trasported per cella (vedi Rappresentante dei risultati). (B) Percentuale di NC trasportati è stato calcolato come rapporto tra vettori presenti nella frazione di basolaterale che nelle frazioni cellulari basolaterale e combinati. (D) coefficienti di permeabilità apparente (P app) sono stati calcolati come descritto Rappresentante dei risultati, che riflette i tassi di trasporto di 125 NC I-anti-ICAM o 125 I-IgG NC. = 4 n; dati sono mostrati come media ± SEM. Tratto da Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Clicca qui per ingrandire la figura
Figura 4. Meccanismo di trasporto di unnanocarriers nti-ICAM tutto Caco-2 monostrati. (A) il trasporto transcellulare di 125 NC I-anti-ICAM tutto confluenti Caco-2 monostrati è stata valutata a 24 ore in assenza o in presenza di 20 mM EIPA, 1 mg / ml filipin, 50 micron MDC, o 0,5 micron wortmannina. (B) TEER è stata misurata durante il trasporto di 125 NC I-anti-ICAM tutto Caco-2 monostrati, per valutare il trasporto paracellulare. Valori TEER in assenza di NC sono indicati come controlli (l'intervallo tratteggiata segna SEM del valore medio). Incubazione con 5 mM H 2 O 2 è un controllo positivo per l'apertura delle giunzioni intercellulari. (C) paracellular perdita proteica, misurata come coefficiente di permeabilità apparente (Papp) di 125 I-albumina attraversando il monostrato di cellule in assenza o in presenza di 5 mM H 2 O 2, IgG CN, o anti-ICAM NC, è stata misurata e calcolato come in Figura 3. dati sono mostran come media ± SEM, n ≥ 4. Tratto da Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Clicca qui per ingrandire la figura
| Totale NC associato / cella | Intracellulare NC / cella | Trasportato NC / cella | Trasportato% | Trasportati molecole di α-Gal / cella 10 × 5 | pg trasportati / cella × 10 -3 | Papp (× 10 -8 cm / sec) | |
| 3 ore | 663,4 ± 116,0 | 434.0 ± 76.8 | 243.6 ± 15.4 | 44.4 ± 6.7 | 1.8 ± 0.2 | 9.7 ± 1.2 | 8.1 ± 1.1 |
| 24 ore | 2024,8 ± 409,3 | 1218,9 ± 255,6 | 806,9 ± 164,1 | 40.6 ± 2.0 | 3.9 ± 0.5 | 21.3 ± 2.5 | 1.9 ± 0.4 |
| NCs = nanocarriers; α-Gal = α-galattosidasi; Totale NC associato / cella = intracellulare NC / cellulari + NC trasportati / cella;% Trasportato = (NC trasportato / Totale NC associata) × 100, P app = coefficiente di permeabilità apparente (cm / s). Vedere Metodi per una descrizione più dettagliata di questi parametri. I dati sono riportati come media ± SEM (n = 8 pozzetti); (-TNF-α cellule Caco-2). | |||||||
Tabella 1. Il trasporto transepiteliale di α-Gal by nanocarriers anti-ICAM. Trasporto transcellulare di anti-ICAM / 125 I-α-Gal NC di tutti confluenti Caco-2 monostrati è stata valutata in 3 ore e 24 hr. Radioisotopo contenuto di frazioni apicali, basolaterali e cellulari sono stati convertiti in vari valori relativi al trasporto, come descritto nella Rappresentante dei risultati. Tratto da Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012).
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Discussion
Usando i metodi discussi sopra, un modello cellulare per studiare il trasporto di NC mirati attraverso le barriere cellulari può essere stabilita, come l'esempio fornito per Caco-2 cellule epiteliali, che è rilevante per valutare trasporto dal lume GI nel sangue nel caso dei sistemi di drug delivery per via orale. Coltura di monostrati di cellule epiteliali GI in inserti transwell ha permesso la misurazione di TEER e fluorescenza immunoistochimica di giunzioni strette per confermare la formazione di una barriera di permeabilità cellulare. Successivamente, radiomarcatura di targeting e agenti terapeutici con 125 mi ha fornito un rapido e sensibile quantificazione delle NC mirati all'interno e attraverso GI monostrati cellulari. Infine, studi meccanicistici stati applicati usando inibitori endocitosi, TEER, e un saggio perdite paracellular albumina per valutare se il trasporto avviene attraverso un percorso vescicolare contro un percorso paracellulare.
Un parametro importante per stabilire modelli simili is la selezione di un tipo di cellula, che dovrebbe riflettere la natura fisiologica della barriera cellulare in studio. Varie cellule epiteliali e endoteliali di origine umana o animale sono disponibili in commercio 16,18-20. Questi possono essere coltivate solo come singole culture come qui descritto, o come co-colture di queste cellule con altri tipi cellulari 16,18-20 (cellule, cellule immunitarie, periciti, ecc es muco-secernenti). In tale forma di co-coltura, transwell condizioni di inserimento possono essere modulate per regolare i rispettivi tassi di crescita ei requisiti per i fattori di differenziazione nei media celle 16,18-20. Per esempio, un modello barriera emato-encefalica può comportare co-coltura di cellule endoteliali microvascolari cerebrali e astrociti o periciti sulla superficie opposta del filtro poroso, ei rispettivi supporti per ogni tipo cellulare deve essere collocato in ogni camera 19. Inoltre, a seconda della linea cellulare, componenti della matrice extracellulare possono essere required per l'adesione delle cellule efficace alla membrana porosa 18-20. E 'importante considerare che ogni modello particolare renderà diversi livelli basali per quanto riguarda i parametri di permeabilità della barriera e dei prezzi di trasporto e il meccanismo, quindi, il controllo dei valori devono essere ottenute e questi metodi ottimizzati per ogni situazione.
Transwell inserti come quelli qui descritti, sono stati ampiamente utilizzati per studiare il trasporto di materiali attraverso monostrati cellulari, dalla apicale in un compartimento basolaterale o viceversa 5,10-12,16,17. Questo non può essere raggiunto coltivando cellule sui pozzi classici o lamelle, perché tali sistemi ostano a questa forma di trasporto in quanto non offrono due scomparti indipendenti e quindi non possono dare una visione realistica di ordinamento delle cellule. Ad esempio, materiali naturalmente destinati per il rilascio dalla membrana basolaterale possono essere manovrati da altri compartimenti cellulari in un modello vetrino, rendendo difficile ResoLVE il meccanismo di trasporto transcellulare. Inoltre, a differenza coprioggetti, la configurazione transwell dà origine a caratteristiche fisiologicamente rilevanti connessi con differenziamento cellulare e membrana polarità 10,11,16-19. Per esempio, cellule Caco-2 coltivate su transwells presentano le caratteristiche di enterociti maturi, compresa la presenza di microvilli e giunzioni strette, formazione di cupola, e la produzione di spazzole enzimi frontiera 10,11,17. Altri parametri possono indurre un fenotipo più fisiologicamente rilevanti, come shear stress nel caso di GI cellule epiteliali (ad esempio flusso muco e movimenti contrattili) e cellule endoteliali vascolari (ad esempio il flusso di sangue), che può essere applicato in transwells mediante agitazione o pompe 10 , 16, e co-colture per produrre la necessaria crescita e fattori di differenziazione per certi tipi di cellule 16,18-20. Tuttavia, si deve considerare che le linee cellulari spesso differiscono dalle cellule nei tessuti del corpo, e. G. Essi possono esprimere certe determinanti a diversi livelli e, quindi, presenti funzioni e regolamenti vari. Per esempio, cellule Caco-2 non contengono tutte le proteine di trasporto ed enzimi necessari per l'attivazione e trasporto di terapie orali in vivo, come CYP3A4, un enzima che metabolizzano farmaco 10,17,23. In questi casi, sub-cloni di linee cellulari, trasfezione, o aggiunta di agenti trascrizionali possono essere usate modulare la linea cellulare da riflettere meglio le condizioni fisiologiche 17,23,24.
Nella scelta di un modello ottimale transwell, le varie caratteristiche del filtro permeabile devono essere prese in considerazione. I filtri permeabili sono disponibili in diverse dimensioni dei pori, che vanno 0,4-8 micron, e devono adattarsi alle dimensioni del carico trasportato. Per esempio, dimensioni dei pori più piccoli (0,4-3 micron) sono tipicamente utilizzati per studi di trasporto di piccoli composti chimici, mentre pori 3 um o più grandi vengono utilizzate per l'invasione delle cellule, il Chemotaxis, e studi di motilità in cui microbica, le cellule immunitarie, e la migrazione sono trasportati. Dimensione dei pori e la densità colpisce anche la densità e la differenziazione cellulare, come alcune cellule possono migrare attraverso i pori sulla semina, precludendo la formazione monostrato. Inoltre, il materiale del supporto permeabile influenze di imaging chiarezza, per la valutazione della vitalità cellulare e formazione monostrato, e l'attaccamento cellulare. Polietilene tereftalato (PET) filtri sono trasparenti, permettendo visibilità al microscopio a contrasto di fase, in contrasto con filtri di policarbonato traslucido. Per una maggiore adesione cellulare, supporti permeabili rivestiti con collagene o fibronectina sono disponibili in commercio. Inoltre, il diametro del filtro, che viene regolata per pozzetti differenti, può influenzare permeabilità, per cui diametri grandi (ad esempio in piastre da 6 pozzetti) tendono ad aumentare leakiness paracellular del monostrato cellulare.
Una volta stabilito un modello transwell, compreso il stanziamentiTE selezione di tipo cellulare, composizione media, e filtro permeabile, lo stato del monostrato cellulare può essere valutata durante la coltura e fasi sperimentali utilizzando TEER. Tuttavia, i valori Teer variano di 1) fattori innati biologici associati con il tipo di cellule, di origine, e il numero di passaggio, 2) le condizioni di coltura, quali le caratteristiche di cui sopra transwell, densità di semina, giorni in coltura, la composizione media e pH; 3) fattori fisici , come la temperatura, volume dei supporti, programma di campionamento, e il grado di agitazione / lavaggio e 4) fattori patologici e / o chimici che modulano cella giunzione integrità (es. citochine, cellule immunitarie, stress ossidativo, additivi farmacologici, ecc) 10, 16,17. A causa di vari fattori biologici e ambientali che influenzano TEER, un valore minimo di riferimento che indica la formazione di barriera deve essere stabilita per ciascun sistema, monitorando regolarmente TEER durante il periodo di coltura e dopo manipolazioni sperimentali. Value ritenuti sufficienti per la formazione di barriera, che può variare tra 150-1,600 Ω × 16 cm 2, dipendono anche dalla dimensione della sostanza da trasportare tale che paracellular passiva diffusione di tale sostanza è limitata, mentre TEER ≥ 350 Ω × cm 2 sembra precludere la diffusione passiva di relativamente grandi NC come quelli mostrati qui (200 nm), questo non può essere il caso per i sistemi di drug delivery più piccoli, in cui sono richieste monolayers più stretti (ad esempio ≥ 700 Ω × cm 2). Questo valore di base può anche essere valutata utilizzando i comandi per interrompere la barriera di permeabilità, tra cui H 2 O 2, penetrante peptidi, chelanti del calcio (es. EDTA), protein chinasi e fosfatasi, e varie altre molecole regolatrici 25-27.
Complementare a TEER, molti saggi permeabilità esistono per verificare l'integrità del monostrato e valutare trasposizione paracellularert. Come albumina, altre molecole traccianti membrana impermeabile di varie dimensioni, come il mannitolo, Lucifero giallo, inulina, e destrani, che può essere accoppiato con un UV, fluorescenza, o l'etichetta radioattiva per misurare e confrontare i tassi di permeabilità (P app) per nota valori per questi soluti. Nel valutare trasporto paracellular, è importante utilizzare una molecola tracciante che è più piccolo rispetto al composto trasportati sotto studio. Ad esempio, il trasporto paracellulare di 200 particelle nm avrebbe aperto giunzioni intercellulari sufficiente a causare perdite paracellulare di piccole, ma ancora relativamente grandi molecole, come l'albumina utilizzato nel nostro esempio. Al contrario, il trasporto paracellulare di veicoli di consegna della droga più piccoli come dendrimeri (~ 5 nm) deve essere valutata utilizzando molecole <5 nm, come il mannitolo. Gli studi di dispersione paracellulare indicano quindi la dimensione dell'apertura di giunzione cellulare, ma a causa di tempi di incubazione lunghi non possono identificare le interruzioni transitorie di giunzione cellularezioni.
Un'altra modalità di valutazione dell'integrità barriera è all'immagine giunzioni strette che collegano le celle adiacenti. In questo studio, abbiamo immunostained occludina per la microscopia a fluorescenza, ma varie altre proteine presenti nella giunzione stretta può essere utilizzato per questa analisi, comprese le proteine transmembrana della molecola svincolo di adesione (JAM), claudin, e le famiglie occludina. Qui, abbiamo macchiato il dominio extracellulare di evitare una fase di permeabilizzazione, ma i domini intracellulari può anche essere colorato. In aggiunta a questo è l'uso di controlli per la colorazione non specifica, utilizzando anticorpi secondari fluorescenti solo, assenza di giunzioni strette (qui, abbiamo usato le cellule con un monostrato che mostra TEER basso), o rottura di giunzioni strette con gli agenti di giunzione modulante quotate sopra.
Nel nostro esempio di trasporto transepiteliale usiamo NC ICAM-1-targeting, ma il sistema transwell ospita anche trasporto di altre formulazioni veicolo farmacos, composti terapeutici e diagnostici, composti innate presenti nel corpo, o una combinazione di quanto sopra, con implicazioni importanti per gli studi clinici o comprensione delle vie fondamentali. I metodi che descriviamo di quantificare il trasporto attraverso monostrati cellulari comportano l'etichettatura radioisotopo l'agente di targeting o del carico terapeutica nel cappotto NC, ma questa strategia può essere utilizzato anche per monitorare NC con diverse chimiche e strutture, compresi i polimeri lineari o ramificati, dendrimeri, particelle , micelle, liposomi, ecc 4,5,28,29. Isotopi diversi (ad esempio, 125 I, 3 H, 32 P, ecc) sono disponibili per quantificare il trasporto di una vasta gamma di piccole e grandi molecole: non solo i trasportatori di farmaci, ma anche terapeutici chimici e biologici, senza compromettere l'integrità funzionale o strutturale di il composto, a differenza etichette fluorescenti ingombranti. Radiomarcatura fornisce maggiore sensibilità quantitativa e velocità rispettoad altre strategie che misurano trasporto, quali gel elettroforesi, PCR, spettrometria di massa, HPLC, spettrometria e fluorescenza. Questa etichetta può anche essere utilizzato per determinare il grado di degradazione (ad esempio proteine agente mirato e merci nel nostro esempio) valutando contenuto di iodio libero, che è veloce e preciso rispetto ai saggi di attività proteine alternativi, compresi spettrofotometria UV e Western blot. Tuttavia, poiché iodio libero non riflette interamente alterazioni nella conformazione proteica o attività che possono verificarsi in assenza di degradazione, metodi alternativi di cui sopra possono essere utilizzati per valutare ulteriormente l'integrità dei materiali trasportati. Inoltre, quando si somministra composti con radioisotopi gratuitamente nella camera apicale, non è chiaro se l'etichetta trovato monostrato cellulare e frazioni trasportati risultano da degradazione proteica reale o diffusione di iodio libero dallo spazio apicale. Per aggirare questa limitazione, la concentrazione apicale NC puòessere applicato per un breve intervallo di tempo per consentire associazione al monostrato di cellule, seguita dalla rimozione del mezzo apicale in cambio di mezzo fresco, e un periodo di inseguimento per valutare trasporto. Anche se una quantità di radioisotopi liberi dalla piscina originale inizialmente può fuoriuscire nelle altre frazioni, questo valore può essere determinato da campioni senza periodo di caccia e sottratto da condizioni che comportano un periodo di caccia.
In termini di valutazione del meccanismo di trasporto, gli stessi metodi descritti per convalidare l'integrità monostrato (TEER, saggi di dispersione, e stretto svincolo colorazione) possono essere utilizzati per valutare il percorso paracellulare. Per il trasporto transcellulare, inibitori farmacologici di determinanti coinvolti nel traffico intracellulare (ad es transferrina associate percorsi clatrina, B della tossina colerica associato alle vie caveolari, ecc) può essere utilizzato, per cui le concentrazioni efficaci per inibire specificamente quelle determinanti bisogno di to da chiarire per ogni sistema. Alternative agli inibitori utilizzati nel nostro studio includono clorpromazina e del potassio, specifico per endocitosi clatrina-dipendente, e genisteina e metil-β-ciclodestrina (MβCD), specifico per caveole-mediata assorbimento 30. Altre strategie che possono evitare possibili effetti non specifici di inibitori farmacologici comportano co-localizzazione di merci trasportate con questi determinanti utilizzando fluorescenza o etichettatura radioisotopo, utilizzo di ligandi specifici come controlli (es transferrina o B della tossina colerica, come indicato in precedenza), e siRNA al knockdown l'espressione di elementi regolatori di queste vie.
In questo studio, abbiamo dimostrato equazioni per la conversione dei dati di radioattività a vari parametri che forniscono informazioni chiave preliminari per quanto riguarda il trasporto transepiteliale. Per esempio, il grado di trasporto transepiteliale è rappresentato dal CN o molecole trasportate per cella, l'efficienza del trasporto del contenuto che si lega o entra nelle cellule è rappresentato dalla percentuale di NC cellule associate o molecole trasportate, e il tasso di trasporto, che permette la comparazione di permeabilità tra i diversi soluti, è significata da P app. Per comprendere il potenziale di NC mirati per la consegna su larga scala di terapeutica (ad esempio la dose necessaria per somministrazione in vivo), queste equazioni possono essere modificati per stimare i valori di trasporto su scala macroscopica. Per esempio, la quantità di un carico trasportato terapeutico per unità di superficie del tessuto intestinale (mg / cm 2) e la consegna potenziale attraverso il tratto gastrointestinale di un paziente può essere stimata dalle seguenti equazioni,
Carico Mass trasportato / cm 2 tessuto = (CPM basolateral / attività specifica) / A
Merci di massa trasportato attraverso tenue = [(CPM basolateral / attività specifica) × TA] / A
Avanzando da inserti transwell, modelli che riflettono meglio la complessità fisiologica di trasporto includono camere "ussing" e dispositivi microfluidici, che forniscono il flusso di fluido dinamico e una camera di contenuto che riduce al minimo il contatto con l'aria, come nei vasi sanguigni. Questi modelli consentono inoltre espianti di tessuto per essere coltivati per studi ex vivo, prima di validazione in vivo 17,18.
In conclusione, i metodi utilizzati in questo studio hanno fornito preziose informazioni preliminari in relazione al trasporto di un sistema di somministrazione di farmaci modello, in termini di efficieNCY, attraverso monostrati cellulari. Utilizzando questo modello di coltura cellulare abbiamo dimostrato il potenziale della piattaforma nanocarrier ICAM-1-targeting nel contesto della somministrazione orale dei farmaci, aprendo la strada per i successivi studi in vivo, ma possono essere modificati per altri sistemi che richiedono il trasporto attraverso le barriere cellulari presenti nel corpo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Howard Hughes Medical Institute e la National Science Foundation per RG, e fondi erogati a SM dal National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) e l'American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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