Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Summary

Многие терапевтические приложения требуют безопасной и эффективной транспортировки носителей лекарственных средств и их грузов по клеточные барьеры в организме. В этой статье описывается адаптацию установленных методов оценить скорость и механизм транспортировки наноносителей наркотиков (NCS) через клеточные барьеры, такие как желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) эпителия.

Abstract

Суб-микрометр носители (наноносителей; НК) повышения эффективности лекарств путем улучшения растворимости, стабильности, время циркуляции, адресности, и отпустите. Кроме того, пересекая клеточные барьеры в организме имеет решающее значение как для перорального применения терапевтических НК в обращении и транспорта из крови в ткани, где вмешательство не требуется. NC транспорт через клеточные барьеры достигается: (I) парацеллюлярная маршруту, через переходного нарушения стыках, которые сцепляются соседние ячейки, или (II) трансцеллюлярного маршрут, где материалы усвоены эндоцитоза, перемещаемых через тела клетки и секретируется на противоположной поверхности клеток (transyctosis). Доставка по клеточные барьеры можно облегчить путем сочетания терапии или их носителей с таргетинга агентов, которые специфически связываются с клеточной поверхности маркеров, участвующих в транспорте. Здесь мы предоставляем методы для определения степени и механизм НК транспорта через модель клеточный барьер, бееCH состоит из монослоя желудочно-кишечного тракта (GI) эпителиальные клетки, выращенные на пористой мембраной, расположенной в Transwell вставки. Формирование барьера проницаемости подтверждается измерения трансэпителиальный электрическое сопротивление (Тир), трансэпителиальный транспорт контрольного вещества и Иммуноокрашивание плотных контактов. Например, ~ 200 нм полимерные НК используются, которые несут терапевтический груз и покрыты антителом, предназначенного для элемента клеточной поверхности определитель. Антитела или терапевтического грузов помечен ¹²⁵ I для радиоизотопной трассировки и меченые НК добавляются в верхнюю палату по клеточный монослой в течение различных периодов времени. НК, связанные с клетками и / или транспортируемых к основной камере может быть обнаружена. Измерение свободного ¹²⁵ I позволяет вычитание деградированных фракции. Маршрут парацеллюлярная оценивается путем определения потенциальных изменений, вызванных НК транспорта барьерных параметров, описанных выше. Трансцеллюлярного транспорта яы определяется решении эффект модуляции эндоцитоза и трансцитоз пути.

Introduction

Сотовые барьеры в акте тела в качестве шлюза между внешней средой и внутренними отсеками. Это тот случай, для эпителиальной выстилки, отделяющей извне открытую поверхность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и кровоток ^1-3. Сотовые барьеры также представляет собой интерфейс между кровоток и паренхимы и клеточных компонентов тканей и органов. Это тот случай, для внутренней эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов, такие как гематоэнцефалический барьер легких, в гематоэнцефалический барьер и т.д. ¹ способность пересекать эти клеточные барьеры в организме имеет решающее значение для эффективной доставки терапевтических и диагностических средств в обращение и тканей / органов, где вмешательство необходимо.

Чтобы улучшить доставку терапевтических или диагностических агентов, эти соединения могут быть загружены в суб-микронных наноносителей (NCS). Эти транспортные средства доставки лекарственных средств могут быть приготовлены с различнымихимические и структуры для оптимизации растворимость наркотиков, защиту, фармакокинетики, выпуск и обмен веществ ^4,5. НК также можно функционализирован близости или целевые фрагменты (например, антитела, пептиды сахара, аптамеры и т.д.) для облегчения адгезии к областях тела, где терапевтическое действие требуется ^2,6. Ориентация из НК, чтобы детерминант, выраженных на поверхности клеточных барьеров может еще больше облегчить транспорт в и / или через эти накладок ^2,6.

Роль выборочно транспортировки веществ между двумя средами требует определенных уникальных особенностей среди слоев клеток. Одна из таких особенностей является клеточной полярности, причем апикальной мембраны, обращенной в просвет полости варьируется от базолатеральной мембране, ориентированного на ткани интерстиции, по отношению к мембранной морфологии и состава липидов, транспортеры, и рецепторов ^2. Еще одна особенность предполагает межклеточное junctioнс, соединяющие соседние клетки. Регулирование белков, которые формируют плотные соединения, в частности Junctional молекул адгезии (джемы), occludins и клаудины, модулировать барьерную функцию, чтобы выборочно разрешить или не транспорт веществ между клетками, известными как парацеллюлярной транспорта, обеспечивая прохождение материалов из просвета в базолатеральный пространство ^3. Связывание многих природных и синтетических элементов (лейкоцитов, молекул, частиц и систем доставки лекарств) до клеточные барьеры в организме может вызвать открытие клеточного перехода, который может быть временной и относительно безвредны или более продолжительным, а следовательно, небезопасным с доступом нежелательных веществ через барьер ^2,5,7-9. Следовательно, этот путь может быть оценена посредством измерения электрического сопротивления трансэпителиальный (Тир) и пассивный парацеллюлярного диффузию молекул (называемого здесь утечки парацеллюлярная), в результате чего уменьшилось сопротивление электрического тока утечки или повышенного парацеллюлярной из INERT соединение в базолатеральную пространства указывают открытие соединений элементов, соответственно ^5,10,11. В дополнение к этим методам, любой из узких соединительных белков, перечисленных выше, могут быть окрашены, чтобы оценить их целостность, где окрашивание должны отображаться сосредоточена в межклеточных границ все вокруг периферии клетки ^5,10,12.

Кроме того, системы доставки лекарств, которые нацелены на конкретные клеточной поверхности детерминанты, такие как те, что связаны с клатриновых ямы или колбовидные мембранных инвагинаций называемых кавеолы, может вызвать везикулярного поступлению в клетки путем эндоцитоза, обеспечивая путь для доставки лекарств к внутриклеточным ^{5, 13.} Кроме того, эндоцитоз может привести к торговле людьми пузырьков по всему телу клетки для выпуска на базолатеральной стороны, явление, известное как transyctosis или трансцеллюлярного транспорта ^14. Поэтому знание кинетики и механизма эндоцитоза может использоваться, чтобы эксплуатировать внутриклеточный Aй трансцеллюлярного доставки лекарств, которые предлагает относительно безопасный и контролируемый способ доставки по сравнению с парацеллюлярной маршрута. Механизм эндоцитоза может быть оценена с модуляторами классических путей (клатрин и кавеолин-опосредованного эндоцитоза и макропиноцитозом) или неклассических маршрутов (например, в случае молекулы клеточной адгезии (CAM)-опосредованного эндоцитоза) ^5,13,15 .

В то время как внутриклеточный торговля часто учился в стандартных скважин или покровные, отсутствие базолатеральную отсека исключает клеток поляризацию и способность к обучению транспорт через клеточные слои. Чтобы преодолеть это препятствие, транспорт через клеточные монослоев уже давно изучены с помощью Transwell вставляет ^10,11,16,17, которые состоят из верхней (апикальной) камеры, пористой мембраны, где клетки придают и образуют плотный монослой, и ниже (базолатеральная) камера (рис. 1). В этой конфигурации транспортного могут быть измерены вапикальный к базолатеральной направлении путем введения лечение в верхнюю камеру, после транспорта через клеточный монослой и основной пористой мембраны, и, наконец сбора среды в нижней камере для количественного определения транспортируемого материала. Транспорт в базолатеральной к апикальной-направлении также может быть измерена путем первоначального введения в нижнюю камеру и последующего сбора из верхней камеры ^5,10,12,16. Существуют различные способы, чтобы проверить формирование проницаемости барьера на transwells, в том числе и TEER парацеллюлярного транспорта анализов, как описано выше. Кроме того, проницаемый фильтр, на котором клетки культивируют могут быть удалены для анализа изображений (например, путем флуоресценции, конфокальной, электронной микроскопии), а дальнейшей проверки модели монослой клеток, а также механизма транспортировки. Выбор типа мембраны, которая доступна в различных размерах пор, материалов и поверхностных областях, зависит от различных фактоRS, такие как размер веществ или предметов, перевозимых, типа клеток, и метода визуализации ^16,18-20. Transwell вставки также способствовать контролируемое и точный количественный анализ транспорта по сравнению с сложных систем млекопитающих, а объемы камер и площади поверхности клетки, как известно константы. Хотя многие факторы, влияющие на в естественных условиях поставки будут устранены, в том числе наличие кишечной слизи, напряжение сдвига, пищеварительных ферментов, иммунных клеток и т.д. Этот небольшой масштаб в пробирке модель обеспечивает полезную предварительную информацию о транспорте.

В качестве примера, иллюстрирующего адаптации этих методов для изучения NC транспорт через клеточные барьеры ^10,11,16,17, мы описываем здесь случай, когда был смоделирован потенциал для НК транспорта через желудочно эпителия путем оценки прохождение модели доставки лекарств Система через монослой человеческих эпителиальных колоректальной аденокарциномы (Сасо-2) клеток. Для этого, слоктей культивировали в Transwell вставками, на мкм пор полиэтилентерефталата 0,8 (ПЭТ) фильтра (диаметр 6,4 мм), который является прозрачным и может быть использован для визуализации микроскопии. Статус барьер проницаемости проверяется путем измерения TEER, верхушечный к базолатеральная транспорт контрольного вещества, альбумина, и флуоресцентной микроскопии визуализации элемента плотных контактов, occludin белка. Модель целевой полимерной NC используется, состоящий из 100 нм, небиодеградируемых наночастиц полистирола. НК покрыты путем поверхностной адсорбции с использованием только адресным антитела или комбинации антител и ориентации терапевтического грузов, где либо компонент может быть, меченного ¹²⁵ I для радиоизотопного трассировки. В выбранном Например, антитело распознает молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), белок экспрессируется на поверхности из желудочно-кишечного эпителия (и другие) клетки, которые, как было показано способствовать внутриклеточным и трансцеллюлярного транспортного O е носители лекарственных средств и их грузов ^21. Груз альфа-галактозидазы (α-Gal), терапевтический фермент, используемый для лечения болезни Фабри, расстройства ²² генетический хранения лизосомальных.

Покрытые НК, около 200 нм в размере, добавляются в апикальную камеру через клеточный монослой и инкубировали при 37 ° С в течение различных периодов времени, после чего ¹²⁵ I на НК могут быть обнаружены, ассоциированный с монослое клеток и / или транспортируется к базолатеральной камере ниже клеток. Дополнительная определение свободного ¹²⁵ I позволяет вычитание деградированных фракции и оценки покрытием НК транспорта. Механизм транспорта дополнительно оценивали путем анализа изменений в проницаемости барьера, относящейся к парацеллюлярной маршрута, через параметрами, описанными выше, а трансцеллюлярного транспорт определяется путем анализа изменений на транспорте при модуляции путей эндоцитоза и трансцитоза.

ontent "> Эти методы обеспечивают ценную информацию относительно моделей сотовых барьерных, степень и скорость перевозки системы доставки лекарственного, и механизм такого транспорта, в целом позволяет оценить потенциал для доставки лекарств через клеточные барьеры.

Protocol

1. Культивирование монослой клеток в Transwell вставками

1. В стерильной, уровень биологической безопасности 2 клеток капотом культуры, поместите 0,8 мм пор ПЭТ Transwell вставки в 24-луночный планшет (4 скважин в состоянии, на статистическую значимость) щипцами. Все материалы, входящие в капот должны быть стерилизованы с этанолом.

Примечание: размер пор фильтра должен быть выбран в соответствии со средним размером ЧПУ, используемого, чтобы позволить транспортировку через мембрану. Кроме того, для статистически значимых результатов, каждый экспериментальная условие требует как минимум четырех повторов (скважины) в рамках того же эксперимента, и как минимум 3 независимых экспериментов.

2. Подготовка среды клеточной культуры, содержащей DMEM среду, дополненную 4,5 г / л глюкозы, 15% фетальной бычьей сыворотки и 1% Pen Strep, и тепло до 37 ° С на водяной бане.
3. Развести человека эпителиальных колоректального аденокарциномы (ЦАС-2) клеток в среде клеток и место200-400 мкл клеточной раствора в верхней (апикальной) камеры Transwell вставки, при плотности 1,5 × 10 ⁵ клеток / см ^2. Заполните нижнюю (базолатеральных) камеру с 700 - 900 мкл клеточной среде.
4. Культуры клеток при 37 ° C, 5% СО _2, и 95% влажности в течение 16-21 дней, заменяя среду в верхней и нижней палаты каждые 3-4 дня, используя объемы, указанные в пункте 1.3. Замена среды в следующем порядке, чтобы поддерживать давление выше (а не ниже) клеточный монослой: аспирации среды из нижней камеры, аспирации среды из верхней камеры, заполнить верхнюю камеру свежей средой, и заполнить нижнюю камеру с свежую среду.

2. Подтверждение Г.И. эпителиальной проницаемости барьера Использование трансэпителиального электрического сопротивления (Тир) и Иммуноокрашивание плотных контактов

1. Для кратковременного хранения (менее 2 недель), погрузить STX100 электроды в реше электролитауравнение (0,1-0,15 М KCl или NaCl). Подключение кабеля электрода к электроду порта на метр EVOM вольт-ом так, что система внутренне короткого замыкания и электрод симметрия сохраняется. Для долговременного хранения, промыть дН ₂ O и хранить в сухом, темном состоянии.
2. Для стерилизации электродов, погрузиться в этаноле в течение 15 мин и дайте высохнуть на воздухе в течение 15 сек. Кроме того, электроды могут храниться в УФ капотом. Промыть электроды в виде стерильного раствора электролита (фосфатный буфер солевой раствор, PBS) или 0,1-0,15 М KCl или NaCl раствором, перед каждым измерением сопротивления.
3. С вольтметр Ом установлен с настройкой сопротивления, вертикально разместить электроды в скважине, содержащий вставку Transwell, с коротким электродом в верхней камере и длинной электрода в нижней камере касаясь дна скважины. После того как показания EVOM стабилизируется, записать значение сопротивления (с учетом Ом; Ω) для каждой скважины.
4. Рассчитать сопротивления (стойкиесе, нормированная на площади; Ω × см ²⁾ образцов путем вычитания фона сопротивление (Тир из Transwell вставками без клеток) и умножения на поверхности мембраны. Значения удельного сопротивления наиболее часто сообщалось в литературе. (См. обсуждение)
5. Повторите измерения каждые 1-2 дня, пока TEER не ценит подъем до максимума и плато, указывая формирование барьера проницаемости, который обычно занимает 2-3 недели с момента клеток плетенки. Ценности и время, необходимое для достижения целостности барьера плато Тир может варьироваться в зависимости от числа пассажей клеток.
6. Чтобы проверить наличие плотных контактов в клеточных монослоев с высокой TEER (равной или выше порогового значения для формирования барьера), исправить клетки путем инкубации с холодной 2% параформальдегидом в течение 15 мин. Затем промыть клетки с PBS и инкубировали их в течение 30 мин при комнатной температуре с 1 мкг / мл анти-occludin. Промыть клетки снова с PBS и инкубировали их в течение 30 мин при комнатной температуре с 7,5 мкг / мл Fluorescently меченные вторичные антитела. С помощью скважин с низким TEER в качестве отрицательного контроля для формирования барьера.

Примечание: В качестве замены для анти-occludin, могут быть использованы антитела к альтернативным труднодоступных белков соединительных.

7. Осторожно вырезать мембрану фильтра, на котором фиксируется монослой прилагается, и установка на горками для визуализации с использованием эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.

3. Оценка трансэпителиальной Транспорт целевых перевозчиков

1. Этикетка ориентации антитела (мышиное моноклональное антитело против ICAM-1, анти-ICAM, в этом примере) с ¹²⁵ I, как описано выше ^7. Использование Бредфорда оценить концентрацию белка и гамма-счетчика, чтобы определить, ¹²⁵ I контент на антитела, а затем рассчитать специфическую активность в импульсах в минуту (СРМ) / мг меченого антитела.

Примечание: Для контроля специфичности, повторноторфа процедуру, маркировка мыши IgG, который будет использоваться для подготовки нецелевой НК покрытием. Для изучения транспорт терапевтического груза, повторите процедуру маркировки груза, например, альфа-галактозидазы (α-Гал) в этом примере. Альтернативы могут быть использованы для таргетинга агента, неспецифический управления или терапевтического груза. Альтернативные методы также могут быть использованы для обозначения соединений и оценить концентрацию меченых аналогов.

2. Пара меченый ориентации антитела (анти-ICAM в нашем примере) к поверхности НК. В этом примере, инкубировать полистирола nanobeads (диаметр 100 нм) в течение 1 ч при комнатной температуре с ¹²⁵ I-анти-ICAM чтобы поверхностной адсорбции, как описано ^7.

Примечание: Для неспецифическое управления использовать ¹²⁵ I-IgG. Чтобы проследить транспортировку груза, использовать сочетание ориентации антитела и ¹²⁵ I-меченого груз (α-Гал в нашем примере).

3. Центрифуга при 13000 мкг в течение 3 мин и удалить без покрытия аналогов в супернатант аспирацией. Ресуспендируют осадок, содержащий НК с покрытием с использованием 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS с помощью пипетки, и обрабатывают ультразвуком при низкой мощности, чтобы сорвать потенциальных агрегатов частиц (20-30 коротких импульсов).
4. Для НК характеристики, измерить размер, полидисперсность и ζ-потенциал частиц с покрытием с использованием динамического рассеяния света (в соответствии с инструкциями производителя), и количественно количество ¹²⁵ I-меченого ориентации молекулы антитела (например анти-ICAM) на поверхности частиц с помощью гамма-счетчике.

Примечание: Эти методы можно повторить для неспецифических и терапевтических аналогов. Размер покрытых частиц колеблется в пределах 200 нм.

5. Добавить ¹²⁵ I-антитело НК (например, ¹²⁵ I-анти-ICAM NCS; 56 нКи / мл) в верхнюю палату выше сливающихся Caco-2 монослоев с TEER &# 8805; 350 Ω × см ² (см. Обсуждение) над фоне (16-21 дней после посева). Инкубировать при 37 ° С в течение одного или более временных интервалов желании. Измерьте TEER (раздел 2.3) до и после инкубации с целью оценки последствий НК на барьер проницаемости.

Примечание: Эта процедура может быть повторена для неспецифических и терапевтических аналогов.

6. Сбор среды из верхней и нижней палат и мыть их раз с 0,5 мл DMEM при 37 ° C (верхняя палата) или 1 мл дН ₂ O (нижняя палата). Сбор моет для измерения общего содержания радиоизотопов с помощью гамма-счетчика.
7. Для измерения клеточной фракции, акцизного проницаемой фильтр, например, с помощью лезвия бритвы вырезать по краям, и инкубировать в гамма-счетной трубки с 1% Triton X-100 в течение 10 мин (чтобы освободить содержимое ячейки), до измерительной ячейки связанных общая радиоактивность.
8. Для измерения ¹²⁵ я повторноарендованные у НК во время транспортировки или из-за потенциальной деградации, первый микс 300 мкл образца (из верхних, нижних, или клеточных фракций) с 700 мкл 3% БСА в PBS и 200 мкл трихлоруксусной кислоты (ТСА). Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Между тем на этот раз, измерения общего радиоактивность этого образца в гамма-счетчике.
9. Центрифуга образцов при TCA 3000 мкг в течение 5 мин, чтобы отделить интактный белок (гранулы) от деградации белка или ¹²⁵ I надосадочной фракции (). Количественная радиоактивности свободной ¹²⁵ I фракции и вычесть это значение из общего объема радиоактивности, измеренный перед центрифугированием. Это обеспечит количества меченого белка, который не разрушается.

4. Механизм трансэпителиальной транспорта целенаправленных наноносителей

1. Этикетка альбумина с ¹²⁵ I, как описано в разделе 3.1 и сообщалось ранее ^7.

Примечание: Альбумин 66,5кДа белок и, следовательно, относительно большое вещество. Хотя действительный контроль для пассивного перевозки крупных объектов (например, 200 нм НК используется здесь), он должен быть замещена мелких инертных молекул-меток при изучении переноса небольших носителей лекарственных средств (см. обсуждение).

2. Для оценки парацеллюлярного транспорта с использованием альбумина утечки парацеллюлярного, культуры Сасо-2 монослоев на Transwell вставками, как описано выше.
3. Для верхней среде камеры выше клеточного монослоя, добавить либо ¹²⁵ наедине I-альбумина (отрицательный контроль показывая базального уровня утечки), или ¹²⁵ I-альбумина и не меченные радиоактивным изотопом НК антител целевых (как описано в разделе 3.5). Инкубировать при 37 ° С в течение выбранного интервала (а) Время, которое должно соответствовать обследованных при тестировании NC транспорт. Измерьте TEER (раздел 2.3) до, во время и после инкубации, затем собрать все фракции для общей ¹²⁵ I и свободного ¹²⁵ I измерений, как указано. в разделе 3 Примечание: Одновременное добавление ¹²⁵ I-альбумина и не радиоактивно контрольных IgG НК могут быть использованы в качестве контроля.
4. В качестве положительного контроля для открытия межклеточные добавить клеток средой, содержащей 5 мМ H ₂ O ₂ в верхней и нижней камерах Transwell вставки, и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Затем измерить TEER (раздел 2.3) и добавьте ¹²⁵ I-альбумина в верхнюю палату для отдельных временных интервалов. Измерьте TEER в различные моменты времени по всей инкубации определить распад значение Тир, вызванной Н ₂ О _{2-индуцированного} открытие соединений элементов.
5. В параллельных экспериментах, оценивать трансцеллюлярного транспорта, также называемый трансцитоза, ¹²⁵ I-целевых НК путем инкубации сливные Сасо-2 монослоев либо 50 мкМ monodansylcadaverine (MDC; ингибитор клатрин-опосредованного эндоцитоза), 1 мкг / мл филипин (ингибитор caveolar эндоцитоза), 0,5 мкМ Wortmannв (ингибитор фосфатидилинозитол 3-киназы [PI3K], участвующих в макропиноцитозом) или 20 мкМ [5 - (N-этил-N-изопропил) амилорид] (EIPA, ингибитор макропиноцитозом и CAM-опосредованного эндоцитоза ^15).

Примечание: ¹²⁵ I-IgG НК и ¹²⁵ I-альбумина могут быть использованы в качестве отрицательных контролей для влияния этих ингибиторов, а также другие методы (например, методы миРНК) может обеспечить более селективное ингибирование.

6. Измерение TEER (раздел 2.3) до, во время и после инкубации клеток с радиоактивно меченных ингибиторов и материалов, в качестве дополнительного контроля для эффекта ингибиторов на монослойной проницаемости.

Representative Results

Как проверки нашей модели клеток для изучения трансэпителиальный транспорт целевых НК, Рисунок 2 показывает, что Сасо-2 монослои клеток высевали при плотности 1,5 × 10 ⁵ клеток / см ^2, достигнутой слияния ~ день 12 и поддерживается целостность монослоя до Дня 18, обозначается TEER (рис. 2А). Это было подтверждено наличием occludin-положительных плотных контактов (рис. 2В) в монослоев с высокой TEER (390 Ω × см ^2, 14-й день), по сравнению с бедной плотного контакта маркировки при низкой TEER (17 Ω × см ^2, 5-й день ).

Отслеживание радиоактивной метки на элементах NC определяет общее количество этих компонентов (NC таргетинга антитела или груз) изначально добавлен в апикальную камеру, их клеток, связанный фракции, и их фракции транспортируется к базолатеральной стороны. Эти значения могут быть использованы для расчета различных параметров, которые описывают NC транспорта вболее актуальными образом, особенно после вычитания свободного содержания ¹²⁵ I каждой фракции, которая представляет деградированных коллег. Например, число молекул антител, молекул груза или связанных с ними НК, которые поперечная клеточный монослой могут быть рассчитаны для оценки абсолютной транспорт. Кроме того, процентное содержание указанного молекул или НК, который транспортируется к базолатеральной стороне по отношению к общему числу молекул или НК, связанных с монослое клеток, оценка эффективности упомянутого транспортного. И, наконец, коэффициент проницаемости очевидно, _(Р арр), стандартный параметр для скорости транспорта, может быть оценена. Эти параметры вычисляются как это следующим образом:

Молекулы транспортировать или НК транспортируется = CPM _{базолатеральных} × (Молекулы _{добавлены} или NC _{добавил} / CPM _{добавил)}
% молекул или НК транспортируется = 100 х [CPM _{базолатеральная} / (CPM _{базолатеральная} + CPMклеток фракция)]
_Рарр (см / с) = (CPM _{базолатеральная} × Vol.) / (× т × CPM _{добавил)}

где CPM являются ¹²⁵ Я рассчитывает поминутной добавлен в верхней палате (CPM _{добавил),} клеточный монослой фракция (CPMcell фракция), или нижняя палата (CPM _{базолатеральная)} и NC _{добавлены} или _{добавлением} молекул являются количество НК или молекулы первоначально добавлены к верхней камере, является площадь поверхности мембраны фильтра (см ^2), Vol. это объем среды в верхней камере (мл) и трет время инкубации (ы).

В нашем примере, когда радиоактивный изотоп маркировки ориентации антитела, этот анализ показывает степень и эффективность транспорта в плане антител или НК, перевозимых на клетку и процент клеточный монослой связанных антител или НК, которые были транспортируемых (рис. 3A и 3B ), как мыLL как скорость транспорта с точки зрения P _{приложение} (рис. 3D). Эти параметры, оцениваемые в нашем примере на ¹²⁵ I-анти-ICAM НК, были также по сравнению с теми контроля ¹²⁵ I-IgG NCS, чтобы продемонстрировать эффективность транспорта по отношению к не-целевого коллегой (рис. 3C и 3D).

Когда радиоактивная метка включена на груза НК, описанные параметры отражают перевозку груза, который в нашем примере был α-Гал фермент, используемый для лечения генетического заболевания хранения лизосомные известный как болезни Фабри (табл. 1). В дополнение к расчету NC транспорт, прослеживая сказал грузов, трансэпителиальная доставка данного терапевтического фермента можно оценить, например, выразив его в виде молекул или массы α-Gal перевозимого на клетку.

Наконец, этот метод атрибуты транспортного пути на маршрут парацеллюлярной илитрансцеллюлярного маршрут. Например, в нашем примере, EIPA уменьшается перенос ¹²⁵ I-анти-ICAM НК всей Caco-2 клеток монослоя (рис. 4А), в то время как MDC, филипин и вортманнин не не снизить уровень транспортных относительно состояния управления (без ингибитора ). Это говорит о том, что анти-ICAM НК использовать CAM-опосредованного эндоцитоза для трансцеллюлярного транспорта, но не клатрин-, caveolar-или макропиноцитозом связанных трансцитоз. Кроме того, парацеллюлярная транспорта была исключена с помощью измерения TEER (Рисунок 4B) и альбумина пассивный транспорт (Рисунок 4C), в результате чего снижение TEER и увеличение альбумина утечки парацеллюлярной в нижнюю камеру во время транспортировки анти-ICAM НК будет иметь указано нарушение межклеточных соединений. Однако инкубации с анти-ICAM НК не изменяет TEER или ¹²⁵ I-альбумина утечки парацеллюлярная в течение 48 ч, аналогично контролировать IgG НК, которые не перемещались. Какположительный контроль для открытия соединений элементов и парацеллюлярной транспорта, Н ₂ О ₂ снизился TEER в базальных уровнях и заметно усиливаются ¹²⁵ I-альбумина попадание в базолатеральную камеры.

Рисунок 1. Схема трансэпителиальной транспорта целевых наноносителей через желудочно-кишечного эпителия модели. (А) В качестве платформы для изучения трансэпителиальный транспорт, Сасо-2 монослои клеток культивируют на Transwell вставками до плотный монослой не образуется (16-21 дней после посева, TEER ≥ 350 Ω × см ² в течение фоне). Пример доставки лекарственного средства, например, ¹²⁵ I-анти-ICAM НК, добавляют к верхней (апикальной) камеры выше клеточный монослой для изучения транспорт через клеток и через основной пористой мембраны.Среда, в нижней (базолатеральной) камеры, затем собирают для количественного определения транспортируемого материала. (В) Транспорт через клеточный монослой происходит либо через парацеллюлярная или трансцеллюлярного / трансцитоза маршрута. Воспроизводится по Ghaffarian соавт., J. Controlled отн. 163 (1), 25-33 (2012). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок

Рисунок 2. Сасо-2 монослоя как модель для трансэпителиальной транспорта. Сасо-2 клетки были выращены на Transwell вставками 1,5 х 10 ⁵ клеток / см ^2. (A) трансэпителиальная электрическое сопротивление (TEER) измеряли для оценки целостности монослоя. Данные представлены как среднее ± SEM; п = 3. (В) Флуоресцентная микроскопия плотных контактов immunolabeled с анти-occludin и Texas Red-меченого вторичного антитела, на (низких по сравнению с высокими значениями Тир, соответственно) дней 5 или 14. Воспроизводится по Ghaffarian соавт., J. Controlled отн. 163 (1), 25-33 (2012). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок

Рисунок 3. Транспорт анти-ICAM наноносителей через Caco-2 монослоев клеток. Конфлюэнтные Сасо-2 монослоя, выращенные на Transwell вставками инкубировали с ¹²⁵ I-анти-ICAM НК или ¹²⁵ I-IgG НК добавлен в апикальную камеру. (AC) ¹²⁵ Содержание Я в базолатеральную камеры измеряли в указанные моменты времени, чтобы вычислить количество NCS транспorted на ячейку (см. репрезентативные результаты). (B) Процент транспортируемых НК рассчитывали как отношение носителей, обнаруженных в базолатеральной фракции в том, что в сочетании базолатеральных и клеточных фракций. были рассчитаны (D) коэффициенты Кажущиеся проницаемости (P _{приложение),} как описано в репрезентативные результаты, отражающие темпы транспорта ¹²⁵ I-анти-ICAM НК или ¹²⁵ I-IgG НК. Данные представлены как среднее ± SEM; п = 4. Воспроизводится по Ghaffarian соавт., J. Controlled отн. 163 (1), 25-33 (2012). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок

Рисунок 4. Механизм переносаNTI-ICAM наноносителей через Caco-2 монослоев. (А) трансцеллюлярного транспортировка ¹²⁵ I-анти-ICAM НК через вырожденных Сасо-2 монослоев оценивали на 24 ч в отсутствие или в присутствии 20 мкМ EIPA, 1 мкг / мл филипин, 50 мкм MDC, или 0,5 мкМ вортманнин. (В) TEER измеряли при транспортировке ¹²⁵ I-анти-ICAM НК всей Caco-2 монослоев, оценить парацеллюлярного транспорта. Тир значения в отсутствие НК приведены в качестве контроля (пунктирная интервал отмечает СЭМ среднего значения). Инкубационный 5 мМ H ₂ O ₂ является положительным управления для открытия межклеточных соединений. (C) белок утечки парацеллюлярной, измеренная как видимого коэффициента проницаемости (Papp) ¹²⁵ I-альбумина, пересекающей клеточный монослой в отсутствие или в присутствии 5 мМ H ₂ O _2, IgG НК, или анти-ICAM НК, была измерена и рассчитывается как на рисунке 3. Данные шоун а значит ± SEM, п ≥ 4. Воспроизводится по Ghaffarian соавт., J. Controlled отн. 163 (1), 25-33 (2012). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок

	Всего НК связано / клетка	Внутриклеточного НК / элемент	Перевезено НК / элемент	% Перевезено	Перевезено молекулы α-Гал / клеток × 10 5	пг транспортируется / клеток × 10 -3	Папп (× 10 -8 см / сек)
3 часа	663,4 ± 116,0	434,0 ± 76,8	243.6 ± 15,4	44.4 ± 6.7	1,8 ± 0,2	9,7 ± 1,2	8,1 ± 1,1
24 часа в сутки	2024,8 ± 409,3	1218,9 ± 255,6	806,9 ± 164,1	40,6 ± 2,0	3,9 ± 0,5	21,3 ± 2,5	1,9 ± 0,4
NCs = наноносителей; α-Гал = α-галактозидазы; Всего НК связано / элемент = внутриклеточного НК / сотовые + НК транспортируется / элемент;% Перевезено = (НК транспортируется / Всего NCS попутный) × 100; Рарр = коэффициент очевидно проницаемость (см / с). См. методы для дальнейшего описания этих параметров. Данные представлены в виде средних значений ± SEM (N = 8 скважин); (-ФНО-α клетки Сасо-2).

Таблица 1. Трансэпителиальной транспорт α-Gal анти-ICAM наноносителей. Трансцеллюлярного транспорт анти-ICAM / ¹²⁵ I-α-гал НК по конбеглые Сасо-2 монослоя был оценен в 3 часа и 24 часов. Содержание радиоизотопов из верхушечных, базолатеральных и клеточных фракций были преобразованы в различных значениях в области транспорта, как описано в репрезентативные результаты. Воспроизводится по Ghaffarian соавт., J. Controlled отн. 163 (1), 25-33 (2012).

Discussion

Используя методы, описанные выше, модель сотового для изучения транспорт целевых НК всей клеточные барьеры могут быть установлены, например, примера, приведенного в Caco-2 эпителиальных клеток, которая имеет отношение к оценке транспорт из GI просвета в кровь в случае оральных систем доставки лекарств. Культивирование Г.И. эпителиальных клеток монослоев в Transwell вставками включен измерение TEER и флуоресценции Иммуноокрашивание плотных контактов, чтобы подтвердить образование барьера клеточной проницаемости. Впоследствии радиоактивной метки таргетинга и терапевтических агентов с ¹²⁵ I при условии, быстрый и чувствительный количественный анализ целевых НК в и через GI монослоев клеток. Наконец, механистические исследования были применены с помощью эндоцитотических ингибиторы, TEER, а также альбумина анализа утечки парацеллюлярная оценить, происходит ли транспорт через везикулярного маршруту сравнении с парацеллюлярной маршрута.

Важным параметром при установлении аналогичные модели яс Выбор типа клеток, которые должны отражать физиологическую природу клеточном барьер в исследовании. Различные эпителиальные и эндотелиальные клетки человека или животного происхождения являются коммерчески доступными ^16,18-20. Они могут быть выращены в одиночку, как отдельных культур, как описано здесь, или в качестве со-культуры этих клеток с другими типами клеток (например, слизь секретирующих клеток, иммунных клеток, перициты и т.д.) ^16,18-20. В такой форме сокультуры, Transwell условия вставки можно модулировать регулировать соответствующие темпы роста и требования к дифференциации факторов в клеточных СМИ ^16,18-20. Например, барьер модель гематоэнцефалический может включать совместное культивирование мозг микрососудистых эндотелиальных клеток и астроцитов или перицитов на противоположной поверхности пористой фильтра, а соответствующие носители для каждого типа клеток должны быть размещены в каждой камере ^19. Кроме того, в зависимости от клеточной линии, компоненты внеклеточного матрикса могут быть REQuired для эффективного прикрепления клеток на пористой мембране ^18-20. Важно учесть, что каждый конкретный модель будет оказывать различные уровни базальной в отношении параметров проницаемость барьерных и транспортных ставок и механизма, следовательно, контролировать значения должны быть получены и эти методы оптимизированы для каждой конкретной ситуации.

Transwell вставки, такие как те, что описаны здесь, были широко используются для изучения транспортировку материалов через монослоев клеток, из вершинной в базолатеральную отсеке или наоборот ^{5,10-12,16,17.} Это не может быть достигнуто путем культивирования клеток на классических скважин или покровные потому такие системы исключает этот вид транспорта, как они не предлагают два независимых отделения и, следовательно, не может дать реалистичный взгляд на сортировки клеток. Например, материалы, естественно, предназначенные для освобождения от базолатеральной мембране может быть шунтируется другим отсеков клеток в модели покровное, что затрудняет резонансномуLve механизм трансцеллюлярного транспорта. Кроме того, в отличие от покровных, конфигурация Transwell приводит к физиологически соответствующих особенностей, связанных с дифференциацией клеток и мембран полярности ^10,11,16-19. Например, Сасо-2 клетки, выращенные на transwells проявляют характеристики зрелых энтероцитов, в том числе при наличии микроворсинок и плотных контактов, формирования купола, и производства щеточных пограничных ферментов ^10,11,17. Другие параметры могут индуцировать более физиологически соответствующего фенотипа, например, напряжения сдвига в случае GI эпителиальных клеток (например, потока слизи и движений сократительные) и эндотелиальных клеток сосудов (например, поток крови), которые могут быть применены в transwells использованием перемешивание или насосы ^{10 , 16,} и со-культур для производства необходимого роста и факторы дифференциации для определенных типов клеток ^16,18-20. Тем не менее, следует учитывать, что клеточные линии, часто отличаются от клеток в тканях организма, э. Г. Они могут выразить определенные детерминанты на разных уровнях и, следовательно, представляют разнообразные функции и правила. Например, клетки Сасо-2 не содержит всех транспортных белков и ферментов, необходимых для активации и транспортировки устных терапии в естественных условиях, например, CYP3A4, от наркотиков метаболизм фермента ^10,17,23. В этих случаях клеточная линия суб-клоны, трансфекции, или добавление транскрипции агентов могут быть использованы модулировать клеточную линию, чтобы лучше отражать физиологические условия ^17,23,24.

При выборе оптимальной модели Transwell, различные особенности проницаемой фильтра должны быть приняты во внимание. Проницаемые фильтры доступны в различных размеров пор, начиная от 0.4-8 мкм, и должны учитывать размер перевозимого груза. Например, меньшие размеры пор (0.4-3 мкм) обычно используются для исследования транспорта малых химических соединений, а поры 3 мкм или больше используются для инвазии клеток, чеmotaxis и моторики исследования, в которых микробов, иммунные и мигрирующие клетки транспортируются. Размер пор и плотность также влияет на плотность клеток и дифференциацию, так как некоторые клетки могут мигрировать через поры на посева, исключающих образование монослоя. Кроме того, материал, из которого поддерживают влияет на четкость изображения, проницаемой для оценки жизнеспособности клеток и формирование монослоя и прикрепление клеток. Полиэтилентерефталат (ПЭТ) фильтры являются прозрачными, что позволяет видимость под фазово-контрастной микроскопии, в отличие от прозрачного поликарбоната фильтры. Для повышения прикрепления клеток, проницаемых опоры предварительно покрытые коллагеном или фибронектином являются коммерчески доступными. Кроме того, диаметр фильтра, который корректируется с учетом различных пластин а, может влиять на проницаемость, в результате чего большие диаметры (например, в 6-луночных планшетах) имеют тенденцию к увеличению парацеллюлярного неплотности в клеточный монослой.

Как только модель Transwell устанавливается, в том числе ассигнований наТе выбор типа клеток, состава материала, а также проницаемый фильтр, статус клеточный монослой могут быть оценены в ходе культивирования и экспериментальных стадий с использованием TEER. Однако значения Тир изменяться в зависимости от 1) врожденных биологических факторов, связанных с типом клеток, источнику и числом пассажей, 2) условий культивирования, например, указанных выше характеристик Transwell, плотность посева, дней в культуре, состав медиа и рН, 3) физических факторов , таких как температура, объем информации, график отбора проб, и степень перемешивания / мытья и 4) патологические и / или химические факторы, которые модулируют клеточную целостность перехода (например, цитокинов, иммунных клеток, окислительный стресс, фармакологические добавки и т.д.) ^{10, 16,17.} Из-за различных биологических и экологических факторов, влияющих TEER, минимальное значение базовой показывающее формирование барьер должен быть установлен для каждой системы, регулярно мониторинга TEER в период культуры и после экспериментальных манипуляций. Васифилис, которые считаются достаточными для формирования барьера, который может составлять от 150-1,600 Ω × см ^{2 16,} также зависят от размера перевозимого вещества, такие, что пассивное парацеллюлярная диффузии этого вещества ограничен, в то время TEER ≥ 350 Ω × см ^2, кажется, исключает пассивной диффузии относительно крупных НК, таких как тех, что показаны здесь (200 нм), это не может быть так, для небольших систем доставки лекарственных средств, в которых требуются более жесткие монослоя (например ≥ 700 Ω × см ^2). Это базовое значение также может быть оценена с помощью элементов управления за срыв барьер проницаемости, в том числе H ₂ O _2, проникающего пептиды, энтеросорбенты кальция (например, ЭДТА), протеинкиназы и фосфатазы, а также различные другие регуляторных молекул ^25-27.

В дополнение к TEER, многие анализы проницаемости существуют для проверки целостности монослоя и оценить парацеллюлярного TRANSPORT. Как альбумина, другие мембранные непроницаемый молекул-меток различных размеров, такие как маннит, Lucifer желтый, инулина и декстраны, который может быть в сочетании с УФ, флуоресцентного или радиоактивной метки измерить и сравнить цены проницаемости (P _APP) с известными Значения этих растворов. При оценке парацеллюлярного транспорта, важно использовать молекулу копира, который меньше транспортируемого исследуемого соединения. Например, парацеллюлярная транспортировка 200 нм частиц откроет межклеточные достаточно, чтобы вызвать утечку парацеллюлярного небольших, но все еще относительно больших молекул, таких как альбумин, используемого в нашем примере. В противоположность этому, парацеллюлярная транспорт из небольших транспортных средств доставки лекарственных средств, таких как дендримеров (~ 5 нм), должны быть оценены с использованием молекул <5 нм, такие как маннит. Парацеллюлярная исследования утечки поэтому указать размер отверстия ячейки перехода, но в связи с большим временем инкубации они не могут определить переходные нарушения клеточного переходамиTIONS.

Другой способ оценки целостности барьера является изображение плотных контактов, которые соединяют соседние ячейки. В этом исследовании мы иммуноокрашиванию occludin для флуоресцентной микроскопии, но различные другие белки, присутствующие в плотного контакта можно использовать для этого анализа, в том числе трансмембранных белков молекулы перехода сцепления (JAM), Claudin и occludin семей. Здесь мы окрашивали внеклеточный домен обойти шаг пермеабилизации, еще внутриклеточные домены также могут быть окрашены. Дополнительный к этому является использование элементов управления для не-специфического окрашивания, используя флуоресцентные вторичные антитела только, отсутствие плотных контактов (здесь мы использовали клетки с монослоя, показывая низкую TEER), или нарушение плотных контактов с помощью соединительных-модуляции агентов, перечисленных выше.

В нашем примере трансэпителиальной транспорта мы используем ICAM-1, ориентированных на НК, однако система Transwell также размещает транспортировку другой лекарственной автомобилясек, терапевтические и диагностические соединения, врожденные соединений, которые содержатся в организме, или комбинации выше, с ценными последствия для клинических исследований или понимании фундаментальных путей. Методы, описывающие количественно транспорт через клеточные монослои включать радиоизотопный маркировки таргетинга агента или терапевтического груза в пальто НК, но эта стратегия может также использоваться для отслеживания НК с различными химии и структур, в том числе линейных или разветвленных полимеров, дендримеров, частиц , мицеллы, липосомы и т.д. ^4,5,28,29. Различные изотопы (например, ¹²⁵ я, ³ Н, ³² Р и т.д.) доступны для количественного транспортировку широкого круга малых и больших молекул: не только носителей лекарственных средств, но и химические и биологические терапии, не влияя на функциональное или структурную целостность соединение, в отличие от громоздких флуоресцентных меток. Радиоактивной обеспечивает большую количественную чувствительность и скорость сравнениюс другими стратегиями, которые измеряют транспорт, таких как гель-электрофореза, ПЦР, масс-спектрометрии, ВЭЖХ и флуоресцентной спектрометрии. Эта метка может также использоваться, чтобы определить степень деградации (например, белок агента и ориентации грузового в нашем примере) путем оценки содержания свободного йода, который является быстрым и точным по сравнению с альтернативными анализах активности белка, в том числе УФ-спектрофотометрии и вестерн-блоттинга. Однако, поскольку свободный йод не полностью отражать изменения в конформации белка или активности, которые могут возникнуть в отсутствие деградации, указанные выше альтернативные методы могут быть использованы для дальнейшей оценки целостности транспортируемых материалов. Кроме того, при введении соединений с бесплатными радиоизотопов в апикальную камеру, неясно, является ли метка обнаружена в монослое клеток и транспортировать фракций результатом реального деградации белка или диффузии свободного йода из апикальной пространстве. Чтобы обойти это ограничение, верхушечный концентрация НК можетприменяться в течение короткого временного интервала, чтобы позволить объединение в монослое клеток, с последующим удалением апикальной среды в обмен на свежей среде и в течение погоне за оценку транспорт. Хотя количество свободных радиоизотопов из первоначального пула может первоначально просочиться в других фракций, это значение может быть определено из образцов без периода делу и вычитают из состояний, включающих период Chase.

С точки зрения оценки механизм транспортировки, те же способы, описанные для проверки целостности монослоя (TEER, анализы утечки, и плотно окрашивание узел) может быть использован для оценки парацеллюлярного маршрут. Для трансцеллюлярного транспорта, фармакологические ингибиторы детерминант, участвующих в внутриклеточного транспорта (например, трансферрин, связанный с клатрином путей, холерного токсина, связанный с caveolar путей и т.д.), могут быть использованы, в результате чего эффективные концентрации в специфически ингибируют эти детерминанты нужно то разъяснена для каждой системы. Альтернативы ингибиторов, используемых в нашем исследовании, включают аминазин и истощение калия, специфические для клатрин зависит от эндоцитоза и генистеин и метил-β-циклодекстрина (MβCD), определенный для кавеол опосредованного поглощения ^30. Другие стратегии, которые могут избежать потенциальных неспецифические эффекты фармакологических ингибиторов включают совместной локализации перевозимого груза с этих детерминант с использованием флуоресценции или радиоизотопный маркировка, использование специфических лигандов в качестве контроля (например трансферрина или холерного токсина B, как указано выше), и миРНК в нокдаун экспрессии регуляторных элементов этих путей.

В этом исследовании мы демонстрируем уравнения для преобразования данных радиоактивности с различными параметрами, которые обеспечивают ключевую предварительную информацию о трансэпителиальной транспорта. Например, степень трансэпителиального транспорта представлена ​​НК или молекул, перевозимых на клетку, эффективность транспортировки содержимого, которое связывается или проникает в клетку представлена ​​процентах от клеточно-ассоциированного НК или молекул, перевозимых, а скорость транспорта, который позволяет для сравнения проницаемости между различными растворенных веществ, обозначено P _{приложение.} Для того чтобы понять потенциал целевых НК для крупномасштабной доставки терапевтических (например дозы, необходимой для в естественных условиях введения), эти уравнения могут быть изменены, чтобы оценить транспортные значения в макроскопических масштабах. Например, количество терапевтического грузов, перевозимых на единицу площади поверхности кишечной ткани (мг / см ^2), а также потенциального доставки через желудочно-кишечный тракт пациента может быть оценена с помощью следующих уравнений,
Масса грузов, перевозимых / см ² ткани = (CPM _{базолатеральная} / удельная активность) /
Масса грузов, перевозимых через тонкий кишечник = [(CPM _{базолатеральная} / удельная активность) × TA] / A

ve_content "> где удельная активность представляет собой измеренную CPM / единицу массы груза (см. протокол, шаг 3,1) и TA представляет собой общую поглощающую поверхность тонкой кишки (2000000 см ^2). Таким образом, данные, полученные в наших методов дает подняться на широкий спектр возможных количественного анализа, которые описывают транспорт в соответствующих условиях.

Продвижение от Transwell вставками, модели, которые лучше отражают физиологическую сложность транспорта включают "Ussing" камеры и микрожидкостных устройств, которые обеспечивают динамический поток жидкости и содержащийся камеру, которая минимизирует контакт с воздухом, а в кровеносных сосудах. Эти модели также позволяют ткани эксплантов, чтобы культивировать для бывших естественных условиях исследования, до проверки в естественных условиях ^17,18.

В заключение, методы, используемые в этом исследовании, оказывают ценную предварительную информацию о перевозке модельного системы доставки лекарственного средства, с точки зрения efficieNCY, через клеточные монослоев. Используя эту модель клеточной культуры мы продемонстрировали потенциал ICAM-1, ориентированных на nanocarrier платформы в контексте устной доставки лекарств, прокладывая путь для последующих естественных условиях исследования в, но могут быть изменены для других систем, требующих транспорт через клеточные барьеры, найденных в тело.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90