Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Summary

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Abstract

Alt-mikrometre taşıyıcılar (nanocarriers; NC'ler) çözünürlük, istikrar, dolaşım süresi, hedefleme ve salınımını artırarak ilaçların etkinliğini arttırmak. Buna ek olarak, vücuttaki hücre engelleri geçme müdahale gereklidir dokular içine kan dolaşımı ve taşıma içine terapötik NC'ler hem ağız yoluyla verilmesi için çok önemlidir. Komşu hücreler ya da (ii) hücre üzerinden hücre gövdesi üzerinde taşınan malzeme endositoz tarafından içselleştirilir yol, ve salgılanan içiçe birleşme geçici bozulma ile, (i) paraselüler rotası: hücresel engelleri arasında NC taşıma ile elde edilmektedir ters hücre yüzeyinde (transyctosis) at. Hücresel engelleri arasında Gönderme taşıma katılan hücre yüzeyi işaretleri için spesifik olarak bağlanan hedefleyen maddeler ile terapötik ya da taşıyıcıların birleştirilmesi suretiyle kolaylaştırılabilir. Burada, WHI bir model hücre bariyerinden ölçüde ve NC taşıma mekanizması, ölçmek için bir yöntem sağlarch bir Transwell uç bulunan bir gözenekli zar üzerinde yetiştirilen gastrointestinal bir tek tabaka (GI) epitel hücreleri oluşur. Bir geçirgenlik bariyeri oluşumu transepitelyal elektriksel direnci (TEER), bir kontrol maddenin transepitelyal taşıma ve sıkı birleşme bölgesinin immün ölçümü ile teyit edilir. Bir örnek olarak, ~ 200 nm polimer NC'ler terapötik bir yük taşıyan ve bir hücre yüzeyi hedef belirleyici bir antikor ile kaplanmış olan, kullanılmıştır. Antikor ya da terapötik yük radyoizotop izleme için ¹²⁵ I ile etiketlenir ve etiketlenmiş NC'ler değişen zaman dönemleri için hücre tek tabaka üzerinde, üst bölmeye eklenir. Temel bölmeye taşınan hücreler ve / veya ilişkili NC'ler tespit edilebilir. Ücretsiz ¹²⁵ I ölçümü bozulmuş fraksiyonu çıkarma sağlar. Paraselüler yol, yukarıda tarif edilen bariyer parametrelere NC taşıma ile neden olduğu potansiyel değişiklikleri saptanmasıyla değerlendirilir. Transsellüler taşıma iendositoz ve yolunu modüle transsitoz etkisini ele belirlenir s.

Introduction

Dış çevre ve iç bölmeleri arasında bir ağ geçidi olarak vücut eyleminde hücresel engelleri. Bu durum, gastrointestinal (GI) sistemi ve kan ^1-3 maruz kalan harici bir yüzey ayırma epitel astar için de geçerlidir. Hücresel bariyerleri de kan ve parankimi ve doku ve organların hücresel bileşenleri arasındaki arayüz temsil eder. Vücutta bu hücresel engelleri hareket yeteneği terapötik ve teşhis maddeleri etkili biçimde aktarılması için çok önemlidir ¹ Bu, vb kan-akciğer engeli, kan-beyin engeli, kan damarları, endotel iç astar için geçerlidir müdahale gerekli dolaşımı ve dokuların / organların içine.

Tedavi edici veya teşhis edici maddelerin geliştirilmesi için, bu bileşikler, alt mikrometre nanocarriers (NCS) yüklenebilir. Bu ilaç dağıtım araçları, çeşitli ile formüle edilebilirkimyaları ve ilacın çözünürlüğünü koruma, farmakokinetik, serbest ve metabolizma ^4,5 optimize yapıları. NC'ler, terapötik etki için gerekli ^{olan, 2,6} vücut bölgelerine yapışmasını kolaylaştırmak için afinite ya da (örn. antikorlar, peptidler, şekerler, aptamerler) hedefleme parçaları ile fonksiyonalize edilebilir. Hücresel engellerin yüzeyinde ifade belirleyicilere NC'ler hedeflenmesi daha fazla ^2,6 içine ve / veya bu astarları arasında taşınmasını kolaylaştırır.

Seçici iki ortam arasında madde taşınması rolü hücre katmanları arasında bazı benzersiz özellikleri gerektirir. Boşlukların lümeni bakan apikal zar zar morfoloji ve lipid, taşıyıcılar ve reseptörler ² bileşimi ile ilgili olarak, doku interstisyumunda yönelik bazolateral zardan değişir ve böylece Böyle bir özellik, hücre kutupludur. Diğer bir özelliği içerir arası junctiokomşu hücreyi birleştiren ns. Sıkı birleşim, özellikle kavşak yapışma molekülleri (Sıkışması), occludins ve klaudin oluşturan proteinlerin düzenlenmesi konusunda bu lumeninden maddelerin geçişine izin veren, seçici paraselüler taşıma olarak bilinen hücrelerin arasında maddelerin taşınmasına olanak veya olmasın bariyer fonksiyonunu modüle basolateral alan ^3. Vücutta hücresel bariyerleri için birçok doğal ve sentetik elemanları (lökositler, moleküller, parçacıklar ve ilaç verme sistemleri gibi) bağlanma, bu nedenle, bir erişim güvenli olmayan geçici ve nispeten zararsız ya da daha uzun olabilir ve bu, hücre-bağlantı açıklığı uyarabilir ^2,5,7-9 bariyer üzerinde arzu edilmeyen maddeler. Sonuç olarak, bu geçiş yolu, transepitelyal elektrik direnci (TEER) ve moleküllerin pasif difüzyon paraselüler (burada adı paraselüler kaçak) ölçülmesiyle değerlendirilebilir, bu sayede, bir elektrik akımı ya da bir ine artan paraselüler sızıntıya direnci azalmışbazolateral boşluğa rt bileşiği, hücre birleşme açılmasını gösterir sırasıyla ^5,10,11. Boyama tüm hücre kenarına ^5,10,12 çevresinde hücre-hücre sınırlarının altında konsantre gözükmelidir.Onu burada bu yöntemler tamamlamak üzere, yukarıda listelenen sıkı birleşme proteinlerinin herhangi bütünlüklerini değerlendirmek için boyanmış olabilir.

Alternatif olarak, klatrin kaplı çekirdeklerin veya caveolae olarak adlandırılan bir şişe-şekilli zar invajinasyonları, ilişkili olanlar gibi, spesifik hücre yüzeyi belirleyici, hedef ilaç dağıtım ^sistemleri, hücre içi bölmelerin ^5'e ilaç verilmesi için bir yol sağlayarak, endositoz ile hücre içine alınmasını veziküler tetikleyebilir ^13. Buna ek olarak, endositoz bazolateral tarafında serbest, transyctosis olarak bilinen bir olgu ya da hücre üzerinden taşıma için ¹⁴ hücre gövdesi boyunca veziküllerin ticareti yol açabilir. Bu nedenle, endositoz kinetiği ve mekanizmasının bilgisi hücre içi a yararlanmak için kullanılabilmektedirnd paraselüler rotaya göre teslimat nispeten güvenli ve kontrollü bir mod sunuyor transsellüler ilaç dağıtım,. Endositoz mekanizması, klasik yolları (klatrin ve caveolin aracılı endositoz ve makropinositoz) ya da klasik olmayan yollarının modülatörleri ile değerlendirilebilmektedir (örneğin, hücre yapışma molekülü durumunda olduğu gibi (CAM) aracılı endositoz) ^5,13,15 .

Hücre içi ticaretinin genellikle standart kuyulara veya lamelleri okudu Oysa, bir Bazolateral bölmesinin olmaması hücre kutuplaşmayı ve hücre katmanları arasında ulaşım çalışma yeteneğini engellemektedir. Bu engeli aşmak için, hücre tekli katmanları üzerinde taşıma uzun transwell bir üst (apikal) odası, hücreler takmak ve sıkı bir tek tabaka oluşturan bir gözenekli geçirgen zar oluşur ki, ^10,11,16,17 ekler, ve bir alt kullanılarak incelenmiştir (Bazolateral) odası (Şekil 1). Bu yapılandırmada, taşıma ölçülebilirapikal-to-bazolateral, üst bölmesine bir tedavi uygulanmasını hücre mono tabakasında ve altta yatan gözenekli zar içinden taşınmasını takiben, ve son olarak taşınan malzeme miktarının belirlenmesi için, alt bölmede ise orta toplayarak yönü. Bazolateral-apikal yönünde Transport aynı zamanda, üst bölme ^5,10,12,16 ikinci alt bölme ve daha sonra toplama ilk uygulanması ile ölçülebilir. Çeşitli teknikler yukarıda tarif edildiği gibi, TEER ve paraselüler taşıma deneyleri de dahil olmak üzere transwells ilgili geçirgenlik bariyeri oluşumunu doğrulamak için vardır. Buna ek olarak, hücreler kültürlenir üzerinde geçirgen filtre (floresan konfokal, elektron mikroskopi ile) görüntüleme analizi için kaldırılabilir ayrıca, hücre tek tabaka modeli doğrulama hem de taşıma mekanizması olarak. Farklı gözenek boyut, malzeme ve yüzey alanları mevcuttur membran türü, seçimi, çeşitli fiili bağlıdırBu tür maddelerin bir boyut veya taşınan nesneler, hücre tipi ve görüntüleme yöntemi ^16,18-20 olarak rs. Transwell uçlar da bölmeler ve hücre yüzey alanı hacim sabitleri bilinmektedir kompleks bir memeli sistemleri ile karşılaştırıldığında taşıma kontrollü ve hassas ölçümü kolaylaştırır. In vivo verilmesi dahil birçok faktör gibi bağırsak mukus varlığı, kesme stresi, sindirim enzimleri, bağışıklık hücreleri, aşağıdakileri içeren, elimine edilir olsa da, in vitro modelinde bu küçük çaplı taşıma ilgili yararlı ön bilgiler sağlar.

Hücresel engelleri ^10,11,16,17 genelinde NC taşıma çalışma bu yöntemlerin adaptasyonunu göstermek için bir örnek olarak, biz burada GI epitel üzerinden NC taşınması için potansiyel bir model ilaç dağıtım geçişini değerlendirerek modellenmiş bir olgu sunulmuştur insan epitel kolorektal adenokarsinom (Caco-2) hücreleri, bir tek tabaka ile sistemi. Bu amaçla, carşın saydamdır ve mikroskopi görüntüleme için kullanılabilecek bir 0.8 um gözenek polietilen tereftalat (PET) filtre (6.4 mm çap) üzerinde, transwell uçlar kültürlenmiştir. Geçirgenlik bariyeri durumu Teer, bir kontrol madde, albumin ve sıkı birleşme, occludin proteinin bir elemanın floresan mikroskobu görselleştirme apikal-to-bazolateral taşıma ölçülmesiyle doğrulanır. Polimer hedef NC bir model 100 nm, doğada çözülmeyen polistiren nano partiküller oluşan kullanılır. NC'ler yüzey tek bir hedef antikor ile adsorpsiyon ya da bir hedef antikorun bir kombinasyonu ve bileşen ya da radyoizotop izleme boyunca ¹²⁵ I ile etiketlenebilir terapötik bir kargo ile kaplanmıştır. Seçilen örnek, antikor, hücreler arası yapışma molekülü-1 (ICAM-1) gösterilmiştir, bir protein GI epitel yüzeyinde eksprese (ve diğer) hücre içi ve hücre üzerinden taşıma o kolaylaştırmak gösterilmiştir hücreleri, f ilaç taşıyıcıları ve bunların kargolar ^21. Yük alfa-galaktosidaz (α-Gal), Fabry hastalığı, genetik bir lizozomal depo ²² bozukluk tedavisi için kullanılan tedavi edici bir enzimdir.

Boyutu yaklaşık 200 nm kaplanmış NC'ler, değişen zaman dönemleri için hücre mono tabakasında üzerinde apikal bölmeye ilave edilmiş ve 37 ° C'de inkübe edilir ve bundan sonra ¹²⁵ NCS I hücre mono tabakasında ve / veya ilişkili tespit edilebilir Hücrelerin aşağıdaki bazolateral bölmeye taşınır. Ücretsiz ¹²⁵ I Ek belirlenmesi kaplanmış NC ulaşım bozulmuş fraksiyonu ve tahmini çıkarma sağlar. Taşıma mekanizması ayrıca hücre üzerinden taşıma endositoz ve transsitoz arasında yolunu modüle zaman taşıma değişiklikler incelenerek belirlenir ise, yukarıda tarif edilen parametreler aracılığıyla, paraselüler yönlendirmek için ilişkin geçirgenlik bariyeri değişiklikler incelenerek değerlendirilir.

"ontent> Bu yöntemler, tamamen hücresel engelleri arasında ilaç verilmesi için potansiyel olarak değerlendirilmesine imkan veren, değerli hücre bariyer modelleri ile ilgili bilgiler, bir ilaç verme sisteminin taşıma oranı ve derecesini, ve bu taşıma mekanizmasını sağlar.

Protocol

1.. Transwell Ek'ler hücre tek tabaka Kültürleme

1. Steril, biyogüvenlik düzeyi 2 hücre kültürü kaputu, 0.8 mm PET forseps ile (istatistiksel anlamlılık için, durum başına 4 kuyu) 24 plaka içine ekler Transwell gözenek yerleştirin. Kapağı giren bütün malzemeler, etanol ile sterilize edilmelidir.

Not: filtrenin gözenek boyutu NC kullanılan ortalama boyutuna uygun olarak seçilmesi gerekir, zar boyunca taşıma izin vermek. Ayrıca, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için, her deney durumu aynı deney içinde dört tekrarlar (oyuk) bir minimum ve 3 bağımsız deney en az gerektirir.

2. Bir su banyosu içinde 37 ° C hücre kültürü 4.5 g / L glukoz,% 15 fetal bovin serum ve% 1 Pen Strep ile takviye edilmiş DMEM ortamı ihtiva eden bir ortam, ve ısı hazırlayın.
3. Hücre ortamı ve yerinde (Caco-2) hücreleri insan epitel kolorektal adenokarsinom seyreltin/ Cm ² 1.5 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda transwell ucun üst (apikal) bölme içine, hücre çözeltisinin 200-400 ul. Hücre ortamında 900 ul - 700 ile alt (bazolateral) bölmesini doldurun.
4. Adım 1.3 'de gösterilen birimleri kullanılarak, her 3-4 günde, üst ve alt odası içindeki bir ortam değiştirme 37 ° C,% 5 _CO2 ve 16-21 gün için% 95 nem oranında kültür hücreleri. , Alt bölmeden orta aspire üst bölmeden orta aspire, taze ortam ile üst bölmeyi doldurmak ve alt bölmeyi doldurmak: Hücre mono tabakasının (yerine göre aşağıda) üzerindeki basıncın muhafaza edilmesi için aşağıdaki sırayla orta değiştirin taze ortam.

2. Sıkı EklemlerininTünelleme GI epitel geçirgenliği Transepitelyal Elektrik Direnci kullanma Bariyer (TEER) ve immünboyanmadan Doğrulama

1. Kısa süreli saklama (2 haftadan daha az) için, bir elektrolit sorunun çözümünden de STX100 elektrotlar batığıntion (0.1-0.15 M KCl veya NaCl). Sistem dahili kısa devre ve elektrot simetri korunur, böylece EVOM volt-ohm metre üzerinde elektrot noktasına elektrot kablosunu bağlayın. Uzun süreli depolama için, dH ₂ O ile yıkayın ve kuru, karanlık koşullarda saklayın.
2. , Elektrotlar sterilize 15 dakika boyunca etanol içinde batırmak ve 15 saniye boyunca havada kurumaya izin vermek için. Alternatif olarak, elektrotlar bir UV başlığı içinde saklanabilir. Her bir ölçümden önce direnç, steril bir elektrolit çözeltisi (fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) veya 0.1-0.15 M KCl veya NaCl çözeltisi içinde elektrotlar durulayın.
3. Volt-ohm metre direnç ayara sahip, dikey olarak üst odasında kısa elektrot ve kuyunun alt temas alt bölme içinde uzun elektrot ile, iyi transwell inserti ihtiva eden elektrotlar yerleştirin. Her bir kuyu için; EVOM okuma stabilize sonra, (Ω ohm verilen) direnç değerini kaydedin.
4. Özdirenç (DAYANIKLI hesaplayınce alana normalize; Ω × cm ²⁾ arka plan direncini hücreleri olmadan transwell uçlar (TEER) çıkarılarak ve membran yüzey alanı ile çarpılarak numunelerin. Direnç değerleri en sık literatürde bildirilmiştir. (Tartışma bak)
5. TEER tipik olarak hücre platting andan itibaren 2-3 hafta alır geçirgenlik bariyer oluşumunu gösteren bir maksimum ve plato sebebiyet değeri kadar her 1-2 gün ölçümleri tekrarlayın. Plato TEER değerleri ve bariyer bütünlüğünü sağlamak için gerekli zamanı hücre kanalı sayısına bağlı olarak değişebilir.
6. Yüksek TEER (engelleyici formasyonu için eşik değerine eşit veya üzerinde) ile hücre mono tabakaları sıkı birleşme varlığını doğrulamak için, 15 dakika boyunca soğuk% 2 paraformaldehid ile inkübasyon yoluyla Hücreleri sabitlemek. Daha sonra, 1 ug / ml anti-occludin ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS ile bunları hücreleri yıkayın ve inkübe edilir. PBS ile tekrar hücreleri yıkayın ve 7.5 ug / ml F, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübeluorescently-etiketli sekonder antikorları içerir. Bariyer oluşumu için bir negatif kontrol olarak, düşük TEER ile kuyu kullanın.

Not: Anti-occludin için bir ikame olarak, alternatif bir sıkı bağlantı proteinlerine antikorlar kullanılabilmektedir.

7. Dikkatlice sabit tek tabaka bağlı olduğu filtre zarı tüketim ve Epifloresans veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntüleme için slaytlar üzerine monte edilir.

3. Hedeflenen Taşıyıcılar Transepitelyal Transport Değerlendirilmesi

1. ^7, daha önce tarif edildiği gibi, ¹²⁵ I ile hedefleme antikoru (bu örnekte, ICAM-1'e karşı fare monoklonal antikoru, anti-ICAM) etiketleyin. Etiketli antikorun antikor üzerindeki ^125I içeriğini belirlemek için, protein konsantrasyonu ve bir gama sayacı tahmin etmek Bradford tahlili kullanarak, ardından dakika (CPM) sayım olarak spesifik aktivitesinin hesaplanması / mg.

Not: özgünlük için kontrol etmek için, yenidenUygun olmayan bir kaplanmış, NCS hazırlamak için kullanılacak etiketleme fare IgG ile prosedür turba. Terapötik bir kargo taşıma incelemek için, bu örnekte, yük etiketleme prosedürü, örneğin, alfa-galaktosidaz (α-Gal) tekrarlayın. Alternatifler hedefleme ajanı, spesifik olmayan bir kontrol ya da tedavi edici yükler için de kullanılabilir. Alternatif yöntemleri de bileşikler etiket ve etiketlenmiş meslektaşları konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilmektedir.

2. Çift NCS yüzeyine antikoru (örnekte anti-ICAM) hedefleme etiketli. Bu örnekte, ^7, tarif edildiği gibi, yüzey soğrulmasına olanak vermek için ¹²⁵ I-anti-ICAM ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca polistiren nanobeads (100-nm çapında) inkübe edilir.

Not: spesifik olmayan kontrol ^125I-IgG kullanın. Bir kargo taşıma izlemek için, antikor ve ^125-etiketli kargo (bizim örneğimizde α-Gal) hedefleyen bir arada kullanın.

3. 3 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüj ve aspirasyon ile üstte yüzen madde içindeki kaplı olmayan muadilleri çıkarın. Parçacıkların kümelenmesi potansiyel (20-30 kısa darbeler) bozmak için düşük güçte% 1 sığır serum pipetleme PBS albümini (BSA) ve sonikasyon kullanılarak kaplanmış NCS içeren pelet yeniden süspanse edin.
4. NC karakterizasyonu için, boyut, bir çoklu-dağınıklığa ve dinamik ışık saçılması (satıcı talimatlarına uygun) kullanılarak kaplanmış parçacıkların ζ-potansiyelini ölçmek ve sayısını ölçmek ¹²⁵ kullanarak bir parçacık yüzeyi üzerinde antikor moleküllerinin (örneğin, anti-ICAM) hedef-işaretli gama sayacı.

Not: Bu yöntem, spesifik olmayan ve terapötik karşıtları için tekrarlanabilir. Kaplanmış taneciklerin büyüklüğü 200 nm civarında değişmektedir.

5. TEER ile birleşen ve Caco-2 tek katmanlarının üzerindeki üst bölmeye, ¹²⁵ I-antikor NCS, (56 nCi / ml, örneğin ^{125I-anti-ICAM} NCS) ekleyin# 8805; arka plan üzerinde 350 Ω × cm ² (Tartışma) (16-21 gün sonrası-ekim). Bir veya daha fazla arzu edilen zaman aralıkları boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Geçirgenlik bariyer üzerinde NC'ler etkilerini değerlendirmek için inkübasyon öncesi ve sonrası Teer (Bölüm 2.3) ölçün.

Not: Bu işlem, özel olmayan ve terapötik karşıtları için tekrarlanabilir.

6. Üst ve alt odadan orta toplamak ve 37 ° C (oda üst) veya 1 ml dH ₂ O (alt odası) 0.5 ml DMEM ile bir kere yıkayın. Bir gama sayacı kullanılarak toplam radyoizotop içeriğinin ölçülmesi için yıkama toplayın.
7. Hücre fraksiyonu ölçümü için, kenarlarda kesme ve ölçme hücresi önce 10 dakika boyunca (hücre içeriği serbest bırakmak için),% 1 Triton X-100 ile bir gamma sayıcı tüp içinde inkübasyona bir ustura kullanılarak, örneğin, geçirgen filtre tüketim toplam radyoaktivite ilişkili.
8. Ben tekrar ¹²⁵ ölçmek için, olası bozulma, ilk karışımı, PBS içinde% 3 BSA içinde 700 ul ve 200 ul trikloroasetik asit (TCA) ile (üst, alt veya hücre fraksiyonlarından) numune 300 ul için nakil sırasında NC'ler veya kiralanan. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bununla birlikte, bu kez, bir gamma sayacında Bu örnek, toplam radyoaktivite ölçülür.
9. Bozulmuş protein veya ¹²⁵ I fraksiyon (yüzer) için sağlam protein (pelet) ayırmak üzere 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüjleyin TCA örnekleri. Serbest ^125I fraksiyonun radyoaktivitesi sayısal olarak ve daha önce santrifüj ölçülen toplam radyoaktivitenin bu değeri çıkarın. Bu bozulmuş değildir etiketli protein miktarını sağlayacaktır.

4. Hedeflenen Nanocarriers of Transepitelyal Ulaştırma Mekanizması

1. Etiket da Bölüm 3.1 'de tarif edildiği gibi ¹²⁵ ile bir albümin ⁷ bildirilmiştir.

Not: Albumin a 66.5 olduğunudolayısıyla kDa protein ve, nispeten büyük bir madde. Küçük ilaç taşıyıcılarının taşıma okuyan zaman büyük nesneler (örneğin 200 nm NC'ler Burada kullanılan) pasif taşıma için geçerli bir denetim, bu (Tartışma) küçük asal izleyici moleküller ile ikame edilmelidir rağmen.

2. Albumin paraselüler sızıntı, yukarıda tarif edildiği gibi Transwell kültür ekleri üzerine Caco-2 tek tabakaları kullanılarak paraselüler taşıma değerlendirmek.
3. Hücre mono tabakasının üzerindeki üst odası ortamı için, (Bölüm 3.5 'de tarif edildiği gibi) ¹²⁵ I-albümin, tek başına (sızıntısının bazal seviyesini gösteren negatif kontrol) ya da ¹²⁵ I-albümin ve non-radyo-etiketli antikor ya da hedefli bir NCS ekleyin. NC taşıma test ederken muayene uymalıdır seçilen zaman aralığı (s), 37 ° C'de inkübe edin. Öncesinde, sırasında Teer (Bölüm 2.3) ölçün ve belirtildiği gibi inkübasyondan sonra, bundan sonra, toplam ¹²⁵ I ve serbest ^125I ölçümleri seyahati fraksiyonlarım toplamak. Bölüm 3 Not: ^{125I-albümin} ve radyo-etiketlenmemiş kontrol IgG NC'ler eş zamanlı ek bir kontrol olarak kullanılabilir.
4. Arası bağlantı yerlerine açılması için bir pozitif kontrol olarak, hücre ortamı transwell ucun üst ve alt bölmelere 5 mM H ₂ O ₂ içeren ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, Teer (Bölüm 2.3) ölçmek ve seçilen zaman aralıkları için üst bölmeye ¹²⁵ I-albümin ekleyin. H ₂ hücre birleşme kısımlarının O ₂ kaynaklı açma neden olduğu çürüme TEER değeri tespit etmek kuluçkalama boyunca çeşitli zaman noktalarında Teer ölçün.
5. Paralel deneylerde, 50 uM ya da monodansylcadaverine ile birleşen Caco-2 tek-tabakalar inkübe edilerek ¹²⁵ I-hedefli NCS, aynı zamanda transsitoz adlandırılan hücre üzerinden taşıma değerlendirmek (MDC, klatrin dolayımlı endositoz inhibitörü), 1 ug / ml filipin (caveolar inhibitörü aracılı endositoz), 0.5 uM Wortmannin ya da 20 uM [5 - (N-etil-N-izopropil) amilorit] (fosfatidilinositol 3 makropinositoz dahil kinaz [PI3K] inhibitörü) (makropinositoz ve CAM dolayımlı endositoz ¹⁵ inhibitörü EIPA).

Not: ^125I-IgG NC'ler ve ¹²⁵ I-albumin, bu inhibitörlerin etkisi için negatif kontrol olarak kullanılabilir, ve diğer yöntemler (örneğin, siRNA teknikleri) daha seçici inhibisyonu sağlayabilir.

6. Tek tabaka geçirgenliği üzerindeki inhibitörlerinin etkisi için ilave bir kontrol olarak, Teer sırasında önce (Bölüm 2.3) ve inhibitörleri ve radyo-etiketli malzeme ile hücrelerin inkübasyonu sonrasında ölçün.

Representative Results

Hedeflenen NCS transepitelyal taşıma çalışma için hücre modelinin doğrulama olarak, Şekil 2, Caco-2 hücre mono tabakaları izdiham ~ 12 gün ulaşmıştır 1.5 x 10 ⁵ hücre / cm ² arasında bir yoğunlukta kaplanmıştır ve 18 gün kadar tek tabaka bütünlüğünü muhafaza olduğunu göstermektedir TEER (Şekil 2A) ile. Bu düşük TEER kötü sıkı kavşak etiketleme (17 Ω × cm ^2, 5 günde kıyasla, yüksek TEER (390 Ω × cm ^2, Gün 14) ile mono tabakaları occludin-pozitif sıkı kavşaklar varlığı (Şekil 2B) tarafından doğrulandı .)

NC elemanları üzerindeki radyoaktif etiketin Takip bazolateral yanına taşınan başlangıçta apikal bölmeye eklenen bu bileşenlerin toplam miktarı (NC antikor veya yük hedef), hücre bağlantılı fraksiyonu, ve bunların bir bölümünü belirler. Bu değerler bir NC taşıma tanımlamak için çeşitli parametreleri hesaplamak için kullanılabilirdaha uygun bir şekilde, özellikle bozulmuş meslektaşları temsil her fraksiyonun, ücretsiz ¹²⁵ Ben içeriği çıkarıldıktan sonra. Örneğin, antikor moleküllerinin, kargo moleküller, ya da enine hücre tek tabaka mutlak taşıma tahmin etmek için hesaplanabilir vardır ilişkili NC'ler sayısıdır. Aynı zamanda, hücre tek tabaka ile ilişkili moleküller veya NC'ler toplam sayısı ile ilgili olarak bazolateral tarafa taşınır, bahsedilen moleküllerin veya NC'ler yüzdesi verimini tahmin taşıma söyledi. Son olarak, belirgin geçirgenlik katsayısı (P _app), nakil oranı için standart bir parametre, tahmin edilebilir. Aşağıda belirtildiği gibi bu parametreler hesaplanmıştır:

Moleküller taşınan veya NC'ler = CPM _Bazolateral × taşınan (Moleküller _eklenen veya NC / CPM _{eklendi eklendi)}
% Moleküller veya NC'ler = 100 x [CPM (/ _Bazolateral CPM _Bazolateral + CPM taşınırHücre fraksiyonu)]
P _app (cm / s) = (CPM _Bazolateral × Vol.) / (A × t × CPM _eklendi)

CPM ^125I sayısı dakika başına (CPM) _eklendi, üst bölmeye eklendi yerde, hücre tek fraksiyon (fraksiyon CPMcell) ya da alt bölme (CPM _bazolateral) ve NC _eklenen veya _ilave moleküller NC'ler sayısıdır veya başlangıçta, üst bölmeye eklendi moleküller, bir filtre membran yüzey alanı ^(cm2), Cilt olduğunu. Üst bölme (ml) içinde ortam hacmidir ve t inkübasyon süresi (s) 'dir.

Radyoaktif izotop, hedefleyici antikor etiketleme bizim örneğimizde, bu analiz, antikorlar ya da hücre ve hücre tek-bağlantılı antikorlar veya taşınan NC'ler yüzdesi başına taşınan NC'ler açısından derecesi ve taşıma etkinliğini (Şekil 3A ve 3B ortaya koymaktadır ), bizP _uygulaması (Şekil 3D) cinsinden ulaşım oranı olarak ll. ^{125I-anti-ICAM} NC'ler için örneğimizde yaklaşık Bu parametreler, aynı zamanda bir hedef olmayan muadili (Şekil 3C ve 3D) için nakil verimi göreli göstermek için kontrol ^125I-IgG NCS ile karşılaştırıldı.

Radyoaktif etiket, NC yük üzerine dahil edildiğinde, tarif edilen parametreler Fabry hastalığı (Tablo 1) olarak bilinen bir genetik lizozomal depo bozukluğu tedavisi için kullanılan örneğimizde α-Gal enzim olan yükün, taşınmasını göstermektedir. Izleme NC taşıma hesaplanmasında ek olarak bu tedavi enzimin kargo, transepitelyal teslimat hücre başına taşınan α-Gal moleküller veya kitle olarak ifade ederek, örneğin tahmin edilebileceğini söyledi.

Son olarak, bu yöntem, paraselüler yol ya da taşıma yolu öznitelikleritranssellüler rota. MDC, filipin ve wortmannin (kontrol koşulu ile ilgili hiçbir inhibitörü taşıma seviyelerini azaltmak vermedi oysa Örneğin, bizim örneğimizde, EIPA, Caco-2 hücre mono tabakaları genelinde ¹²⁵ I-anti-ICAM NC'ler (Şekil 4A) taşınmasını azaltılmış .) Bu anti-ICAM NC'ler hücre üzerinden taşınması için CAM aracılı endositoz kullanmak olduğunu göstermektedir, ancak klatrin-,-caveolar veya makropinositoz ilgili transsitoz. Ayrıca, paraselüler taşıma TEER azalma ve anti-ICAM NC'ler taşınması sırasında alt odasına albümin paraselüler kaçak bir artış olurdu sayede, TEER (Şekil 4B) ölçümleri ve albümin pasif taşıma (Şekil 4C) kullanılarak ekarte edildi hücrelerarası kavşak belirtilen bozulması. Ancak, anti-ICAM NCS ile inkübasyon Teer değiştirmez veya taşınmayan IgG NCS kontrol Benzer 48 saat arasında bir süre boyunca ¹²⁵ I-albumin paraselüler kaçak değildi. OlarakHücre birleşme açılması ve paraselüler taşıma için bir pozitif kontrol, ₂ H O ₂ bazal seviyelere düşmüş ve Teer belirgin bazolateral bölmeye ¹²⁵ I-albumin sızıntısını geliştirilmiştir.

Şekil 1. Sıkı bir tek tabakalı (16-21 gün sonrası tohumlama, Teer oluşuncaya kadar gastrointestinal epitel modelin genelinde hedeflenen nanocarriers arasında transepitelyal taşıma şematik. (A) transepitelyal taşıma incelemek için bir platform olarak, Caco-2 hücre mono tabakaları transwell ekler üzerinde kültüre ≥ 350 arka plan üzerinde Ω × cm ^2). Örneğin ^{125I-anti-ICAM} NC'ler gibi bir ilaç verme vasıtası, bir örneği, hücreler boyunca ve altta yatan gözenekli zar içinden taşıma incelemek için, hücre tek tabaka üzerinde, üst (apikal) bölmeye eklenir.Düşük (bazolateral) odasındaki ortamı, daha sonra taşınan malzeme miktarının belirlenmesi için toplanır. Hücre tek tabaka ile (B) Transport paraselüler veya transsellüler / transsitoz rota ya aracılığıyla gerçekleşir. Ghaffarian ark çoğaltılamaz., J. İ Kontrollü. 163 (1), 25-33 (2012). büyük rakam görmek için buraya tıklayın

Şekil 2. Transepitelyal taşınması için bir model olarak Caco-2 mono tabakalar. Caco-2 hücreleri, 1.5 x 10 ⁵ hücre / cm ² 'de transwell uçlar üzerinde büyütülmüştür. (A) Transepitelyal elektrik direnci (TEER) tek tabaka devamlılığını değerlendirmek için ölçülmüştür. Veriler ± SEM olarak gösterilmiştir, n = 3. (BSıkı kavşaklar) Floresan mikroskopi) (yüksek TEER değerlerine karşı düşük, sırasıyla gün 5 ya da 14, anti-occludin ve Texas Red etiketli sekonder antikor ile immunolabeled. Ghaffarian ark çoğaltılamaz., J. İ Kontrollü. 163 (1), 25-33 (2012). büyük rakam görmek için buraya tıklayın

Şekil 3,. Caco-2 hücre mono tabakaları üzerinde anti-ICAM nanocarriers nakliyesi. Transwell uçlar üzerinde büyümüş karışmış mono tabakalar Caco-2 ¹²⁵ I-anti-ICAM NC'ler veya ^125I-IgG NC'ler apikal bölmeye ilave ile inkübe edildi. Bazolateral odasındaki (AC) ¹²⁵ I içerik NC'ler Şeffaf miktarını hesaplamak için, belirtilen zaman noktalarında ölçülmüştürhücre başına orted (Temsilcisi Sonuçlar bakınız). Taşınan NCS (B) yüzde birleştirilen ve bazolateral hücre fraksiyonlarında edilene bazolateral fraksiyonunda bulunan taşıyıcıların oranı olarak hesaplanmıştır. Örnek Sonuçlar tarif edildiği gibi (D) Görünür permeabilite katsayıları _(Papp) ^{125I-anti-ICAM} NC'ler veya ^125I-IgG NCS taşıma oranları yansıtan hesaplandı. Veri ± SEM olarak gösterilmiştir; n = 4. Ghaffarian ark çoğaltılamaz., J. İ Kontrollü. 163 (1), 25-33 (2012). büyük rakam görmek için buraya tıklayın

Şekil 4. Bir taşıma mekanizmasıCaco-2 tekli katmanları üzerinde nti-ICAM nanocarriers. (A) konfluent Caco-2 tek tabakaları üzerinde ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS hücre üzerinden nakil 20 uM EIPA yokluğunda veya varlığında, 24 saat sonra değerlendirildi, 1 ug / ml filipin, 50 uM MDC veya 0.5 uM wortmannin. (B) TEER paraselüler taşıma değerlendirmek için, Caco-2 tek tabakaları üzerinde ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS taşıma sırasında ölçülmüştür. NC'ler yokluğunda TEER değerleri, kontrol grubuna göre (kesikli aralık ortalama değerin işaret SEM) olarak gösterilmektedir. 5 mM _H2O ile inkübasyon _2-arası birleşme açılması için bir pozitif kontrol. (C) 5 mM, _{H2O 2,} IgG NC'ler veya anti-ICAM NC'ler yokluğunda veya varlığında, hücre tek tabaka geçen ^125I-Albumin belirgin geçirgenlik katsayısı (Papp) olarak ölçülmüştür paraselüler kaçak protein, ölçülmüş ve Şekil 3 olarak hesaplandı. Datashow vardırn ± SEM olarak; n ≥ 4. Ghaffarian ark çoğaltılamaz., J. İ Kontrollü. 163 (1), 25-33 (2012). büyük rakam görmek için buraya tıklayın

	Toplam NC'ler ilişkili / hücre	Hücre içi NC'ler / hücre	Taşınan NC'ler / hücre	% Taşınan	Taşınan α-Gal moleküller / Hücre × 10 5	pg / taşınan Hücre × 10 -3	Papp (× 10 -8 cm / sn)
3 saat	663.4 ± 116.0	434.0 ± 76.8	243.6 ± 15.4	44.4 ± 6.7	1.8 ± 0.2	9.7 ± 1.2	8.1 ± 1.1
24 saat	2024,8 ± 409,3	1218.9 ± 255.6	806,9 ± 164,1	40.6 ± 2.0	3.9 ± 0.5	21.3 ± 2.5	1.9 ± 0.4
NC'ler = nanocarriers, α-Gal = α-galactosidase; Toplam NC'ler ilişkili / hücre = Intraselüler NC'ler / hücre + NC'ler / hücreyi taşınan;% Taşınan = × 100 (NC'ler / Toplam NC'ler Associated'a taşınan), P app = belirgin geçirgenlik katsayısı (cm / s). Bu parametreler daha fazla açıklama için metodlar bakınız. (TNF-α-Caco-2 hücreleri), Veri ± SEM (n = 8 oyuk) aracı olarak gösterilmiştir.

Tablo 1. Anti-ICAM nanocarriers göre α-Gal Transepitelyal taşıma con arasında anti-ICAM / ^125I-α-Gal NCS. Hücre üzerinden taşımaakıcı Caco-2 tekli katmanları, 3 saat ve 24 saat sonra değerlendirildi. Örnek Sonuçlar de tarif edildiği gibi, apikal bazolateral ve hücre fraksiyonlarının Radyoizotop içeriği, nakil ile ilgili çeşitli değerlere dönüştürüldü. Ghaffarian ark çoğaltılamaz., J. (1), 25-33 (2012) Rel. 163 Kontrollü.

Discussion

Yukarıda tartışılan yöntemler kullanılarak, hücresel engelleri arasında hedef NCS taşıma çalışmak için bir hücre modeli bu durumda kana GI lümeninden taşıma değerlendirilmesi için uygun olan Caco-2 epitel hücreleri için, verilen örnekte olduğu gibi, kurulabilir ağızdan ilaç verme sistemleri. Transwell ekler GI epitel hücre mono tabakaları kültürleme bir hücre geçirgenliği bariyer oluşumu teyit TEER ölçümü ve sıkı kavşaklar floresan bağışıklık boyamasım sağladı. Daha sonra, ¹²⁵ ile hedefleme ve terapötik ajanların Radyoetiketleme ben hücre mono tabakaları içine ve GI genelinde hedeflenen NC'ler hızlı ve hassas ölçümü sağladı. Son olarak, mekanik çalışmalar bir paraselüler taşıma güzergahı karşı bir veziküler yoldan meydana olup olmadığını değerlendirmek için endositik inhibitörleri, Teer ve bir albumin paraselüler sızıntı deneyi kullanılarak uygulanmıştır.

Benzer modellerin kurulmasında önemli bir parametre içalışılan hücresel bariyeri fizyolojik doğasını yansıtmalıdır bir hücre tipi s seçim. İnsan ya da hayvan kaynaklı çeşitli epitelyal ve endotelyal hücreleri, ^16,18-20 ticari olarak mevcuttur. Burada açıklandığı gibi, bu tek başına tek bir kültür olarak yetiştirilebilir veya diğer hücre tipleri ile bu hücrelerin gibi ko-kültürler ^16,18-20 (örneğin, hücreler, bağışıklık hücreleri, perisitler, vb mukus salgılayan). Bu tür ko-kültür şeklinde, uç koşullar Transwell hücre ortamı ^16,18-20 farklılaşma faktörleri için ilgili büyüme oranları ve gereksinimleri ayarlamak için modüle edilebilir. Örneğin, kan-beyin bariyeri modeli gözenekli filtrenin karşı yüzeyi üzerinde, beyin, mikrovasküler endotel hücreleri ve astrositler ve perisitlerin ko-kultivasyonuna içerebilir ve her hücre tipi için ayrı ayrı her bir ortam odasına ¹⁹ yerleştirilmelidir. Buna ek olarak, hücre hattı ile ilgili olarak, hücre dışı matris bileşenleri req edilebilirgözenekli membran ^18-20 için etkili hücre eki için edinilmiş. Bu nedenle her bir modelle değerleri elde edilmiş ve bu yöntemler, her durum için optimize edilmiş olması gerekir, kontrol geçirgenliği olan bariyer parametreleri ve nakil oranları ve mekanizması ile ilgili farklı bazal düzeylerini verecek dikkate almak önemlidir.

Örneğin burada tarif edilenler gibi Transwell uçlar, yaygın olarak apikal bir bazolateral bölmeye ya da tam tersi ^{5,10-12,16,17,} hücre mono tabakaları üzerinde malzeme taşıma incelemek için kullanılmıştır. Iki bağımsız bölmeyi sunmuyoruz ve dolayısıyla hücre sıralama gerçekçi bir görünüm vermek değil gibi sistem bu formu taşıma engellemez, çünkü bu klasik kuyu veya lamelleri kültür hücreleri tarafından elde edilemez. Örneğin, doğal olarak bazolateral zardan salınması için tahsis edilmiş malzemeler zor rezonans yapma, bir lamel modeldeki diğer hücre bölmelerine shunted edilebilirhücre üzerinden taşıma mekanizmasını lve. Ayrıca, lamelleri aksine, transwell yapılandırma hücre farklılaşması ve membran ^10,11,16-19 kutupları ile bağlantılı fizyolojik olarak uygun özelliklere yol açmaktadır. Örneğin, transwells yetişen Caco-2 hücreleri mikrovilinin varlığı ve sıkı kavşaklar, kubbe oluşumu ve fırça sınır enzimlerin ^10,11,17 üretimi dahil olgun enterositlerin özelliklerini gösterirler. Diğer parametreler, örneğin GI epitel hücreleri çalkalama kullanılarak transwells olarak uygulanan ya da ^10, pompalar (örn. mukus akışı ve kasılma hareketleri) ve vasküler endotel hücreleri (örneğin kan akışı), durumunda, kesme stresi gibi fizyolojik olarak daha uygun bir fenotip, uyarabilir ^{, 16,} ve ko-kültürler, belirli hücre tipleri ^16,18-20 için gerekli büyüme ve farklılaşma faktörleri üretmek. Bununla birlikte, tek bir hücre hatları genellikle e, vücut dokularında hücrelerden farklı olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. G. Farklı düzeylerde bazı belirleyicilerini ifade ve dolayısıyla, mevcut çeşitli fonksiyonları ve düzenlemeler olabilir. Örneğin, Caco-2 hücreleri, bu gibi CYP3A4, bir ilaca metabolize eden enzim ^10,17,23 olarak in vivo ağız terapötik, aktivasyonu ve taşınması için gerekli olan tüm taşıyıcı proteinler ve enzimler içermez. Daha iyi fizyolojik koşulları ^17,23,24 yansıtacak şekilde, bu durumda, hücre hattı alt-klon, transfeksiyon ya da transkripsiyonel maddelerin eklenmesi modüle eden hücre çizgisi kullanılabilir.

Optimal transwell modeli seçme, geçirgen filtrenin çeşitli özellikleri dikkate alınmalıdır. Geçirgen filtreler, farklı gözenek boyutlarda mevcuttur 0,4-8 mikron arasında değişen, ve taşınan yükün boyutunu karşılamak gerekir. Gözenekler 3 mikron veya daha büyük, hücre yayılması, che için kullanılır iken Örneğin, küçük gözenek boyutları (0,4-3 um), tipik olarak, küçük kimyasal bileşiklerin taşıma çalışmaları için kullanılırmotaxis ve motilite çalışmaları hangi mikrobiyal olarak, bağışıklık ve göç hücreleri taşınır. Bazı hücreler, tek tabaka oluşumunu engellediği, tohum üzerine gözeneklerden geçiş olabilir Gözenek boyutu ve yoğunluğu, aynı zamanda, hücre yoğunluğu ve farklılaşmasını etkiler. Buna ek olarak, geçirgen hücre canlılığı ve tek tabaka oluşumu değerlendirmesi için destek etkiler görüntüleme netliği, ve hücre ekin malzemesi. Polietilen tereftalat (PET) filtreleri tersine faz kontrast mikroskobu altında görünürlüğü, polikarbonat filtreler saydam sağlayan saydamdır. Gelişmiş hücre eki için, kolajen ya da fibronektin ile kaplanmış geçirgen destek ticari olarak mevcuttur. (Örneğin, 6 oyuklu plakalar içerisinde) daha büyük bir çapı, hücre mono tabakasının paraselüler sızıntısına artış eğilimi sayede Ayrıca, farklı bir kuyucuğu için ayarlanır filtre çapı, geçirgenlik etkileyebilir.

Bir Transwell modeli appropria de dahil olmak üzere, bir kez kurulduğundahücre tipi, ortam bileşimi ve geçirgen filtrenin te seçimi, hücre mono tabakasının durum Teer kullanılarak kültürlenmesi ve deneysel aşamalarında değerlendirilebilir. 2) kültürleme koşulları, örneğin yukarıda belirtilen özellikleri transwell, tohum yoğunluğu, kültür ortamı kompozisyon ve pH gün gibidir;, 3) fiziksel faktörler Ancak TEER değerleri, hücre tipi, kaynağa ve geçit dizi ile ilişkili 1) doğal biyolojik faktörlere göre değişiklik , sıcaklık gibi ortam hacmi, numune alma zamanlama ve ajitasyon / yıkama derecesi ve 4) hücre birleşme bütünlüğünü (örneğin, sitokinler, bağışıklık hücreleri, oksidatif stres, ilaç katkı maddeleri, vs) modüle eden ¹⁰ patolojik ve / veya kimyasal ^{faktörlerin, 16,17.} Nedeniyle Teer, bariyer oluşumu düzenli kültür süresince ve deneysel manipülasyonlar sonra Teer izleyerek her bir sistem kurulmalıdır belirten minimum taban değerini etkileyen çeşitli biyolojik ve çevresel faktörler. Va150-1,600 Ω x ^{16 cm2} arasında olabilir bariyer oluşturulması için yeterli sayılır frengi, aynı zamanda taşınacak olan maddenin büyüklüğüne bağlı olduğunu maddenin pasif difüzyon paraselüler sınırlı olduğu gibi, TEER ≥ 350 Ω x ise ² cm gibi burada (200 nm) gösterilen olanlar gibi nispeten büyük NC'ler pasif difüzyon engel gibi görünüyor, bu sıkı mono tabakalar (örneğin, ≥ 700 Ω cm x ²⁾ gerekli olduğu daha küçük ilaç verme sistemleri için geçerli olmayabilir. Bu esas tutulan miktar değeri, aynı zamanda, _{H2O 2,} peptidler delici, kalsiyum kenetleme maddeleri (ör. EDTA), protein kinazlar ve fosfatazlar, ve diğer çeşitli düzenleyici moleküller de dahil olmak üzere ^25-27, geçirgenlik bariyeri bozan için kontrolleri kullanılarak değerlendirilebilir.

TEER için tamamlayıcı, birçok geçirgenlik deneyleri tek tabaka bütünlüğünü doğrulamak ve paraselüler transpo değerlendirmek için varrt. Albumin gibi, bu tür ölçmek ve bilinen geçirgenlik oranlarını (P _app) karşılaştırmak için bir UV floresan, veya radyoaktif etiket ile akuple edilebilir manitol, Lucifer sarı, inulin ve dekstranlar gibi çeşitli boyutlarda diğer zara-geçirmez izleyici moleküller, Bu eriyiklerin değerleri. Paraselüler taşıma değerlendirirken, bu çalışma kapsamında taşınan bileşiğine göre daha küçük olan bir izleme molekül kullanmak önemlidir. Örneğin, 200 nm partiküllerin paraselüler taşıma gibi bizim örneğimizde kullanılan albümin gibi küçük, ama yine de nispeten büyük moleküllere paraselüler sızıntıya neden yeterince hücrelerarası kavşaklar açacak. Bunun aksine, bu tür dendrimerler (~ 5 nm) daha küçük ilaç dağıtım araçlarının paraselüler taşıma mannitol gibi molekülleri <5 nm kullanılarak değerlendirilmelidir. Paraselüler kaçak çalışmalar bu nedenle hücre kavşak açılış boyutunu gösterir, henüz vadesi uzun kuluçka süreleri onlar hücre iltisakından geçici aksaklıklarını tespit edemezTIONS.

Bariyer bütünlüğünü değerlendiren başka bir mod görüntü bitişik hücreleri bağlamak sıkı bağlantıları olduğunu. Bu çalışmada, floresan mikroskobu için occludin immunohistokimyasal, ama sıkı birleşme bulunan çeşitli diğer proteinlerin birleşme yapışma molekülü (JAM), Claudin ve occludin ailelerin zar proteinleri de dahil olmak üzere, bu analiz için kullanılabilir. Burada, bir permeabilizasyon aşamasını atlamak için hücre-dışı alanını boyanmış, ancak, aynı zamanda, hücre içi alanları lekeli olabilir. Buna ilave olarak non-spesifik boyanması için kontrollerin kullanımı, floresan ikincil antikorlar sadece, sıkı kavşaklar yokluğu (burada, biz düşük Teer gösteren bir tek tabaka hücreleri kullanılır), ya da sıkı kavşak bozulması listelenen kavşak-modüle ajanlar kullanılarak kullanıyor yukarıda.

Transepitelyal taşıma bizim örnek biz ICAM-1-hedefli NCS kullanabilirsiniz, ancak transwell sistemi de diğer ilaç araç formülasyonunun taşıma kapasitelis, tedavi ve teşhis bileşiklerine, klinik çalışmalarda ya da temel yollarının anlaşılması için önemli etkileri olan, gövde, ya da bunların bir kombinasyonu bulunan doğuştan gelen bileşikler yer alır. Biz hücre tekli katmanları üzerinde taşıma ölçmek için yöntemler tarif NC kat hedefleyici ajan veya terapötik kargo radyoizotop etiketleme içerir, ancak bu strateji aynı zamanda doğrusal ya da dallı polimerler dahil olmak üzere çeşitli kimyasallar ve yapılar, dendrimerler, parçacıkları ile NCS izlemek için kullanılabilir , miseller, lipozomlar, ^4,5,28,29 vb. Fonksiyonel ya da yapısal bütünlüğünü etkilemeden, ilaç taşıyıcılar, aynı zamanda, kimyasal ve biyolojik terapötik sadece: Farklı izotopları (örneğin, ^{125I, 3H, 32P,} vb), küçük ve büyük moleküllerin geniş bir taşıma ölçmek için kullanılabilir büyük floresan etiketler farklı olarak bileşik. Radyoetiketleme karşılaştırıldığında daha fazla nicel hassasiyet ve hız sağlargibi jel elektroforezi, PCR, kütle spektrometrisi, HPLC, ve flüoresan spektrometresi gibi diğer taşıma araçları ölçmek stratejileri için. Bu etiket, aynı zamanda UV spektrofotometresi ve Western blot dahil olmak üzere alternatif protein aktivitesi deneyleri ile karşılaştırıldığında hızlı ve doğru serbest iyot içeriği, değerlendirerek degradasyon derecesi (bizim örneğimizde, örneğin protein hedefleme ajanı ve yük) belirlemek için kullanılabilir. Serbest iyot tamamen protein konformasyon ya da parçalanması yokluğunda oluşabilecek aktivitesinde değişiklikler yansıtmamaktadır Bununla beraber, yukarıda belirtilen alternatif yöntem ayrıca taşınan malzemenin bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir. Apikal odasına ücretsiz radyoizotoplarla bileşiklerin uygulanması Ayrıca, bu hücre tek ve taşınan fraksiyonları bulunan etiket gerçek bir protein yıkımı veya apikal alandan serbest iyot difüzyon sonucu belirsizdir. Bu sınırlamayı aşmak için, apikal NC konsantrasyon olabilirtaze ortam karşılığında apikal ortamının bunu takiben hücre mono tabakasında, taşıma ve değerlendirmek için bir takip süresi için bir ilişki sağlamak için kısa bir zaman aralığı için uygulanabilir. Orijinal havuzundan serbest radyoizotoplar bir miktar başlangıçta diğer fraksiyonlar halinde sızıntı olsa da, bu değer, herhangi bir takip süresi ile örneklerden belirlenir ve bir takip süresi ile ilgili koşullar çıkartılabilir.

Taşıma mekanizmasının değerlendirilmesi açısından, aynı yöntemler (TEER, sızıntı deneyler ve sıkı birleşme boyama) paraselüler yol değerlendirmek için kullanılabilecek tek tabaka bütünlüğünü doğrulamak için tarif edildiği. Hücre üzerinden taşınması için, hücre içi dahil belirleyicilerinin farmakolojik inhibitörleri (örneğin transferrin klatrin yolları ile ilişkili, caveolar yolları, vb ilişkili kolera toksin B) kullanılabilir, bu sayede, özellikle belirleyicilerini inhibe etmek için etkili bir konsantrasyonu t ihtiyaço Her sistem için aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada kullanılan inhibitörlerine karşı alternatifler caveolae aracılı alım ³⁰ için spesifik klorpromazin ve potasyum tükenmesi, klatrin bağlı endositoz için özel ve genistein ve metil-β-siklodekstrin (MβCD) içerir. Farmakolojik inhibitörlerinin muhtemel, spesifik olmayan etkileri önlemek olan diğer stratejiler floresan veya radyoizotop etiketleme, kontrol olarak özel ligandların kullanımı (örneğin, transferrin veya kolera toksin B, yukarıda belirtildiği gibi) kullanılarak, bu belirleyiciler ile taşınan yük eş-lokalizasyonu, ve siRNA içeren Bu yolların düzenleyici elemanlar ekspresyonunu demonte.

Bu çalışmada, biz transepitelyal ulaşım konusunda kilit bir ön bilgi sağlamak, çeşitli parametrelere radyoaktivite verileri dönüştürmek için denklemleri göstermektedir. Örneğin, transepitelyal taşıma derecesi, NC'ler veya hücre başına taşınan molekülleri tarafından temsil edilir hücreleri bağlayan veya girer içerik taşıma etkinliği taşınan hücreye birleşik NC'ler veya molekül yüzdesi ile temsil edilir ve farklı çözünen arasında geçirgenliğe sahip karşılaştırma sağlar taşıma hızı, P _uygulaması tarafından gösterilecektir. Terapötiklerin büyük ölçekli teslimat (örneğin, in vivo uygulama için gerekli olan doz) için hedeflenen NC'ler potansiyelini anlamak amacıyla, bu denklemler bir makroskopik ölçekte taşıma değerlerini tahmin etmek için modifiye edilebilir. Örneğin, birim yüzey intestinal doku alanına (mg / cm ²⁾ yanı sıra, bir hastanın gastrointestinal yolu boyunca potansiyel teslimat başına taşınan terapötik bir yük miktarı, aşağıdaki denklemler ile tahmin edilebilir
Toplu kargo taşınan / cm ² doku = (CPM _Bazolateral / Spesifik Aktivite) / A
Ince bağırsak = [(CPM _Bazolateral / Spesifik Aktivite) × TA] / A genelinde taşınan kitle kargo

Spesifik Aktivite kargo ölçülen CPM / kütle birimi (3.1 Aşama Protokolü bakınız) temsil eder ve TA ince bağırsağın toplam emme yüzeyi temsil eder ve_content "> (2,000,000 ^cm2). nedenle, yöntem elde edilen veriler verir İlgili açısından taşıma tarif olası kantitatif analiz, geniş bir yelpazede yükselir.

Transwell ekler ve ilerleyen, daha iyi ulaşım fizyolojik karmaşıklığını yansıtan modelleri dinamik sıvı akışı ve kan damarları gibi, hava ile teması en aza indiren bir bölmeyi ihtiva sağlayan "Ussing" odacık ve mikroakışkan cihazları içerir. Bu modeller aynı zamanda doku eksplant önce vivo ^17,18 olarak doğrulama ex vivo çalışmalar için kültüre izin verir.

Sonuç olarak, bu çalışmada kullanılan yöntemler efficie açısından bir model bir ilaç verme sisteminin taşıma ile ilgili değerli ön bilgiler sağlamıştırDiğer yararlı, hücre mono tabakaları üzerinde. Biz daha sonra in vivo çalışmalar için önünü, ağızdan ilaç verilmesi bağlamında ICAM-1-hedefli nanocarrier platformun potansiyelini göstermiştir, henüz bulunan hücresel engelleri arasında taşınmasını gerektiren diğer sistemler için modifiye edilebilir, bu hücre kültürü modeli kullanılarak vücut.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90