Summary
Matrici di fibrina che contengono fattori di crescita sono stati usati per mantenere le cellule staminali neurali innestate nei siti di completo recisione del midollo spinale. Cellule trapiantate completamente riempite la cavità della lesione e differenziate in diversi tipi di cellule neurali, tra cui i neuroni che si estendevano assoni nel midollo spinale ospite su lunghe distanze.
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) possono auto-rinnovarsi e differenziarsi in neuroni e glia. NSC trapiantate possono sostituire i neuroni persi e glia dopo la lesione del midollo spinale (SCI), e possono formare relè funzionali di ri-collegare segmenti del midollo spinale sopra e sotto una lesione. Precedenti studi innesto cellule staminali neurali sono stati limitati dalla sopravvivenza dell'innesto incomplete all'interno del midollo spinale cavità lesione. Inoltre, il monitoraggio della sopravvivenza cellulare dell'innesto, differenziazione, e l'estensione processo non era stata ottimizzata. Infine, in studi precedenti, NSC ratto coltivate erano tipicamente riferite a differenziarsi in cellule gliali quando innestato al midollo spinale danneggiato, piuttosto che neuroni, salvo destino è stato guidato per un tipo cellulare specifico. Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato nuovi metodi per migliorare la sopravvivenza, l'integrazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali ai siti di ancora grave SCI. NSC sono stati appena isolati da embrionale giorno 14 del midollo spinale (E14) da un transgenico Fischer 344 linea di ratto stabile esprimere fl verdeuorescente proteina (GFP) e sono stati incorporati in una matrice di fibrina contenente fattori di crescita; questa formulazione mirava a conservare cellule innestate nella cavità lesione e supportare la sopravvivenza cellulare. NSC in fibrina / fattore di crescita cocktail sono stati impiantati due settimane dopo toracico livello 3 (T3) completi transections midollo spinale, evitando periodi di picco di infiammazione. Innesti risultanti completamente riempito la cavità della lesione e differenziate in entrambi i neuroni, che si estendevano assoni nell'ospite midollo spinale sopra straordinariamente lunghe distanze, e glia. Innesti di cellule staminali neurali umane in coltura che esprimono GFP portato a risultati simili. Così, i metodi sono definiti per migliorare neurale innesto di cellule staminali, la sopravvivenza e l'analisi dei risultati in vivo.
Introduction
Lesioni del midollo spinale (SCI), spesso danni non solo tratti di sostanza bianca che trasportano i segnali da e verso il cervello, ma anche la materia grigia centrale, causando la perdita segmentale degli interneuroni e motoneuroni. La conseguenza di SCI è perdita sia funzioni motorie e sensoriali sotto della lesione. Purtroppo, il sistema nervoso centrale adulto (CNS) non rigenera spontaneamente, con conseguente deficit funzionali permanenti 1. Pertanto, la ricostruzione dei feriti midollo spinale adulto e il miglioramento in motoria, sensoriale e della funzione autonomica è un obiettivo importante della ricerca SCI. Cellule staminali neurali (NSC), sia direttamente isolata da embrionale o adulto CNS, sono cellule candidati validi per sostituire i neuroni perduti e glia. Inoltre, queste cellule hanno il potenziale di formare nuovi relè funzionali per ripristinare conduzione assonale attraverso un 2,3 sito della lesione.
Ad oggi, non c'è stata una spiegazione dettagliata del anatomica, electrophysiological ed effetti comportamentali della formazione relè neuronale da cellule staminali neurali trapiantate dopo il grave SCI. Ci sono diverse ragioni per questo: primo, NSC trapiantati o fetale del tessuto del sistema nervoso centrale sopravvivere male quando innestati in grandi cavità della lesione. Precedenti studi mostrano sostanziale perdita di cellule presto, lasciando grandi cavità lesione cistica vuoti 4,5. In alcuni studi le cellule innestate dovessero successivamente dividono e riempire la cavità lesione 4,5, ma questo potrebbe verificarsi dopo un ritardo di giorni o settimane, e successivo riempimento sito della lesione non sia completa o coerente. In secondo luogo, un sistema di monitoraggio efficiente che fornisce dati attendibili sulla sopravvivenza cellulare, differenziamento / maturazione, e di conseguenza trapiantato cellule staminali neurali era carente. La maggior parte dei primi studi utilizzati anterograda e retrograda etichettatura per tracciare le proiezioni assonali di trapianti di 2,3. Tuttavia, queste tecniche solo parzialmente e spesso proiezioni assonale poco chiaro etichettati derivanti da cellule innestate e metodi traccianti sono soggettivit di artefatti di perdite di colorante oltre le cellule impiantate. Altri gruppi utilizzati marcatori neuronali specifici umane per etichettare proiezioni assonale dopo il trapianto di cellule staminali neurali fetali umani in roditori feriti midollo spinale 5,6. Tuttavia, in questi studi, gli xenotrapianti non hanno sempre sopravvivono bene. Recentemente, la consegna virale del gene reporter GFP è stato usato per etichettare le cellule staminali neurali in coltura 7,8. Tuttavia, l'espressione della GFP era spesso incoerente e può essere down-regolato 7. Recentemente, l'uso di topi o ratti donatori transgenici che esprimono stabilmente il gene reporter GFP, o la fosfatasi alcalina placentare umano, ha notevolmente migliorato l'inseguimento di trapiantate neurali cellule staminali / progenitori in vivo 9,11. In terzo luogo, diversi studi indicano che le cellule staminali neurali di ratto coltivate in vitro derivate da embrioni o adulto CNS differenziano esclusivamente in linee gliali quando trapiantati in ambienti della cor midollo intatto o feriti adultid 7,12,13, nonostante il fatto che queste cellule staminali neurali sono capaci di differenziarsi in neuroni e glia sia in vitro, indicando che ambienti locali possono dettare il destino delle cellule staminali. In alternativa, le cellule staminali neurali in coltura, in particolare quelli derivati da SNC adulto, possono avere intrinseche proprietà defaulty di differenziarsi in linee gliali in vivo 13.
A causa delle limitazioni di cui sopra, il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un nuovo protocollo per migliorare embrionale inseguimento NSC, la sopravvivenza e la differenziazione / maturazione nel midollo spinale adulto gravemente ferito. In breve, abbiamo iniziato con una linea transgenica Fischer 344 ratti Inbreed stabile che esprime un gene reporter GFP che sostiene espressione GFP dopo il trapianto in vivo 14. Successivamente, abbiamo utilizzato NSC appena isolati dal giorno embrionale 14 Fischer 344 midollo spinale, una fase di sviluppo che mantiene il potenziale per generare sia i neuroni e glia. Infine, si conficcaronoNSC appena dissociate in una matrice di fibrina che contiene fattori di crescita 15-17 per mantenere le cellule in modo uniforme e distribuirli all'interno di una grande cavità della lesione, con l'obiettivo di sostenere la sopravvivenza delle cellule del trapianto, differenziazione e integrazione. Gli innesti sono stati collocati in luoghi di T3 resezione completa, due settimane dopo la lesione del midollo spinale. Queste cellule innestate costantemente riempite siti transezione complete e differenziate in neuroni abbondanti che si estendevano gran numero di assoni in molte midollo spinale su lunghe distanze 18. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando colture di innesti di cellule staminali neurali umane immunodeficienza ratti 18.
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Protocol
Tutti i protocolli animali sono approvati da VA-San Diego Institutional Animal Care ed uso commissione (IACUC). Linee guida NIH da laboratorio la cura e la sicurezza degli animali sono rigorosamente seguite. Gli animali hanno libero accesso a cibo e acqua durante lo studio e sono adeguatamente trattati per ridurre al minimo il dolore e il disagio.
1. Preparazione di fibrina componenti contenenti fattore di crescita Cocktails
- Sciogliere 25 mg di ratto fibrinogeno in 0,5 ml di PBS per ottenere 50 mg / ml 2x soluzione stock (vedi tabella Materials). Il fibrinogeno è difficile da sciogliere e deve essere collocato in un incubatore a 37 ° C o bagnomaria e agitato ogni 5-10 minuti per 1-2 ore.
- Sciogliere 100 ratto trombina delle Nazioni Unite in 2 ml di 10 mM sterile CaCl 2 per ottenere 50 U / ml 2x soluzione stock.
- Sciogliere fattori di crescita in PBS alle seguenti concentrazioni di ottenere 100 microlitri soluzione stock: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (alta concentrazione magazzino in infusione intratecale in vivo
- Sciogliere 25 mg MDL28170 (inibitore della calpaina) in 1.3 ml di DMSO avere 50 soluzione stock DMSO mM, e poi diluire 50x in PBS per ottenere 1 mM soluzione stock.
- Mescolare 100 ml di ciascun fattore componente di crescita e 100 ml di MDL28170 (soluzione 1 mM) per produrre 1.000 ml soluzione fattore di crescita cocktail (Figura 1).
- Mescolare 500 ml di fibrinogeno 2x soluzione stock con 500 microlitri di crescita fattore di cocktail per ottenere una soluzione 25 mg / ml di fibrinogeno di lavoro contenente i fattori di crescita e le aliquote in 10 o 20 microlitri per la conservazione a -70 ° C. La soluzione è stabile fino a 12 mesi a -70 ° C.
- Allo stesso modo, mescolare 500 ml di trombina 2x soluzione stock con 500 microlitri fattore di crescita cocktail avere 25 soluzione di lavoro U / ml contenente trombina fattori di crescita e aliquota in simili volumi di 10 o 20 microlitri per la conservazione di unt -70 ° C fino a 12 mesi.
- Il giorno di innesto, collocare cocktail-fibrinogeno e fattore di crescita-trombina contenente in ghiaccio fino mescolato con le cellule.
2. T3 Spinal Cord transezione
- Anestetizzare femmina adulta Fischer 344 ratti o topi nudi atimici con metodi accettabili. I soggetti sono profondamente anestetizzati, quando la risposta alla coda e zampa pizzico sono completamente assenti. Nota: Usiamo tipicamente 150-200 g ratti Fischer o 180-220 g topi atimici, e un cocktail anestesia (2 ml / kg) di ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml) e acepromazina (0,25 mg / ml).
- Applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza o lesioni degli occhi, mentre gli animali sono sotto anestesia.
- Radere la zona toracica superiore e pulire la pelle con Betadine.
- Tagliare la pelle e muscolo utilizzando # 15 Lama, esporre T3 vertebra con un divaricatore chirurgico, ed eseguire una laminectomia a T3 vertebra per esporre T3 / 4 midollo spinale tramite un rongeur.
- Fare un longitudinale incisione mediana nella durata di circa 2 mm di lunghezza con una lama # 11.
- Posizionare iridectomia forbici sotto la dura tagliare il laterale destro intera midollo spinale. Fare un altro taglio sullo stesso lato 1,5 millimetri più cadually.
- Aspirare il tessuto del midollo spinale tra i due segmenti di taglio con un ottuso 23 G ago collegato al vuoto intensità moderata. Utilizzare verifica visiva per garantire la completa resezione ventralmente e lateralmente. Questo completerà un emisezione laterale.
- Per estendere la lesione ad una resezione del midollo spinale a tutta larghezza, posizionare incisioni specchio nel hemicord sinistra. Tentativo di lasciare la dura intatta, diverso dal primo taglio, per mantenere l'impresa matrice innesto / fibrina nel sito della lesione quando innestato due settimane più tardi.
- Suturare il muscolo, applicare la polvere antibiotica e fiocco la pelle.
- Iniettare lattato (3 ml) di Ringer, Bannamine (2,5-5 mg / kg) e ampicillina (80-100 mg / kg) (vedi tabella Materials) immediatamente dopo l'intervento chirurgico e mairatti ntain in un incubatore caldo fino a quando viene ristabilita termoregolazione.
- Svuotare la vescica e iniettare la soluzione di Ringer e ampicillina due volte al giorno per circa due settimane fino all'istituzione della vescica reflex svuotamento (Figura 1B).
3. Preparazione di recente dissociata embrionali Giorno 14 Spinal Cord Neural Stem Cells
- Ottenere Inbreed transgenici GFP ratti F344 (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) dal Ratto delle risorse e Research Center, Università del Missouri.
- Iniettare 40 mcg des-Gly 10, [D-Ala 6]-luteinizante ormone rilasciante ormone Ethylamide (LHRH) diluito in PBS ad una concentrazione di 200 ug / ml per via intraperitoneale (IP) per maturo ratto femmina (8 settimane o più) dopo 2 induzione luce -3 ore per la sincronizzazione di raccolta degli embrioni.
- Accoppiarsi con un maturo GFP omozigote o eterozigote notte ratto maschio 4 giorni dopo l'iniezione.
- Raccogliere embrioni a giorni 13,5-14,5 postcoitusIn tampone HBSS freddo (pc), esaminare l'espressione GFP sotto un "Nightsea" torcia elettrica e filtri bicchieri (BLS1 - BlueStar torcia elettrica e filtro barriera modello VG1) o di un microscopio a fluorescenza.
- Sezionare midollo spinale in condizioni asettiche da ciascun feto GFP-positive e rimuovere le meningi sovrastanti e gangli spinali attaccato con le forbici iridectomia e gioiellieri pinza sottile.
- Raccogliere le midollo spinale sezionato in 2 ml di freddo tampone HBSS in un tubo cornical 15 ml e tenere in ghiaccio.
- Seguire riferimento # 20 di dissociare il midollo spinale sezionato:
- Brevemente, aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla provetta contenente midolli spinali sezionati (vari cordoni possono essere digeriti insieme, 1 cavo può generare cellule sufficiente per innesto di un soggetto) e digerire a 37 ° C per 10-12 min.
- Arrestare la reazione tripsina aggiungendo 10 ml di DMEM contenente 10% FBS al tubo e centrifugare il tessuto a 2.500 rpm per 2 min.
- Risospendere tessuto in 2 ml Neurobasal medio containing 2% B27, e triturare il tessuto del midollo spinale utilizzando sempre più piccoli fuoco lucido Pasteur pipette.
- Centrifugare le cellule a 2.500 rpm per 2 min, risospendere in 2 ml di terreno contenente Neurobasal B27, e celle filtranti con filtro cella filtro 40 micron.
- Contare le cellule con un emocitometro e dividere le celle equamente in due provette Eppendorf.
- Centrifugare le cellule e rimuovere completamente il surnatante (1-2 min sono tenuti a ritirare tutto il surnatante con una punta di vuoto basso) in modo che il cocktail di fattori di crescita non saranno diluiti rimanendo surnatante dopo cellula ri-sospensione.
- Risospendere ogni metà delle cellule del fibrinogeno o soluzione di lavoro trombina contenente fattori di crescita, rispettivamente, ad una concentrazione di 250.000 cellule / ml (conteggi pellet cellulare per circa ⅓ volume finale) e disporli sul ghiaccio prima trapianto (Figura 1A). Si noti che il fibrinogeno può spontaneamente gel quando miscelato con la cellulas prima di combinare con trombina presso il sito di lesione / innesto; per evitare gelificazione precoce, mescolare celle fibrinogeno immediatamente prima dell'innesto cellule in vivo.
4. Trapianto
- Reexpose la lesione T3 / 4 midollo spinale due settimane dopo resezione del midollo spinale.
- 5 microlitri fibrinogeno-cellule e 5 trombina-cellule microlitri potrebbero essere iniettate direttamente in nove punti del sito della lesione attraverso il tessuto cicatriziale sigillato e dura intatto senza riaprire il sito di lesione.
- Utilizzare un ago G 27 per creare 9 fori sulla superficie del tessuto cicatriziale e dura intatta 1-2 settimane dopo la lesione: 3 in centro (una nel punto centrale e due laterali in, e distanziati 0,5 millimetri a parte) e 3 in entrambi rostrale e 3 interfaccia caudale (circa 0,5 millimetri rostrale o caudale al centro della lesione).
- Poi iniettare metà volume di soluzione di cellule fibrinogeno in tre punti centrali del sito della lesione e un volume quarto in 3 punti dell'interfaccia rostrale e aqVolume uarter in 3 punti dell'interfaccia caudale.
- Poi, iniettare immediatamente le cellule throbmbin negli stessi punti. La miscela di cellule fibrinogeno e trombina cellule all'interno del sito della lesione formerà fibrina gel per contenere celle nel sito di lesione e cocktail fattore di crescita sosterrà la sopravvivenza delle cellule. Le cellule vengono iniettate con pipette di vetro tirati collegati ad una PicoSpritzer (General Valve, Inc.).
- Trapianto di cellule staminali neurali umane in coltura 21 nella stessa procedura sopra descritta, e utilizzare fibrina e fattori di crescita cocktail a base di reagenti umani.
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Representative Results
GFP etichettatura immunoistologico dimostra che le cellule staminali neurali ratto innestato risospese in tampone fosfato (PBS) (manca una matrice di fibrina e fattori di crescita) sono sopravvissuti male nel sito resezione T3, solo attaccarsi al margine della lesione / host e lasciando la maggior parte del sito della lesione vuota senza cellule innestate (Figura 2A). La sopravvivenza di NSC migliorata quando co-innestato con matrici di fibrina solo, ma l'innesto non completamente compili una grande cavità lesione (dati non mostrati). Pertanto, si conficcarono NSC in matrici di fibrina contengono un cocktail di fattori di crescita per migliorare la loro sopravvivenza, riempiendo di grandi cavità della lesione e la differenziazione in neuroni e glia dopo la recisione del midollo spinale 15-17. Innesti di entrambi ratto o di cellule staminali neurali umane in modo coerente e completamente riempire la cavità della lesione, valutata sette settimane post-trapianto 18 (Figure 2B-C).
Abbiamo eseguito uno studio corso di tempo per esaminare in anticiposopravvivenza e riempimento della cavità lesione dopo il trapianto di cellule staminali neurali in matrici di fibrina con cocktail di fattori di crescita. L'analisi istologica ha rivelato che le cellule staminali neurali esprimono GFP sopravvissero ben 24 ore dopo il trapianto (Figure 3A-B). Il NSC innestato gradualmente divenne più denso nel tempo per riempire completamente la cavità lesione transected entro la prima settimana dopo il trapianto probabilmente dovuta alla proliferazione 21 (figure 3C-H). Inoltre, innestate NSC integrato bene all'interfaccia host / lesione e sembra diminuire regioni di GFAP immunoreattività ai margini della cavità lesione (Figura 3).
Una porzione di cellule staminali neurali trapiantate differenziate in neuroni NeuN esprimono sette settimane dopo il trapianto (Figure 4A-B). Inoltre, i neuroni del midollo spinale innesto derivato estese gran numero di assoni nell'ospite midollo spinale in entrambe le direzioni rostrale e caudale su lunghe distanze 18 < / Sup> (Figura 4C). Assoni derivati innestate estese rostralmente e caudale sia attraverso la materia bianca e materia grigia nel ospitante midollo spinale (figure 4D-E).
Schema Figura 1. Sperimentale e Time Line. A) Schema adattato da Popovich 22 (Cell, 2012) illustra il trapianto di cellule staminali neurali con gel di fibrina che contiene il fattore di crescita cocktail in tutto transected midollo spinale. B) linea del tempo sperimentale. Analisi comportamentali e electriophysiological possono essere eseguite dopo il trapianto di cellule e prima di perfusione. Il tempo di sopravvivenza dei soggetti può essere variabile. Clicca qui per ingrandire la figura .
.. Figura 2 Sopravvivenza e riempimento di Neural Stem Innesti cella nel T3 Siti completa resezione GFP e immunomarcatura fluorescente GFAP in sezioni orizzontali dimostra (A) scarsa sopravvivenza di ratto E14 NSC (verde) risospeso in PBS privo di fattori di crescita e matrice di fibrina; aC) la sopravvivenza eccellente e completo riempimento di lesione della cavità quando (B) ratto o (C) le cellule staminali neurali umane sono stati incorporati in matrici di fibrina contenenti cocktail di fattori di crescita. Cella sono stati innestati nel T3 siti transezione per 7 settimane. Barra della scala, 310 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 3. Graft sopravvivenza a punti all'inizio Tempo. AB) GFP e GFAP doppia immunomarcatura spettacolo sopravvivenza e la distribuzione di NSC ratto innestate nel sito resezione, 1 giorno dopo l'impianto in una matrice di fibrina. Area Boxed in A è mostrato a più alto ingrandimento pannello B. CD) di sopravvivenza cellulare e della distribuzione è evidente anche in occasione della Giornata 2 (EF) 3 ° giorno post-trapianto. GH) Per sette giorni, le cellule si riempiono sito della lesione e sono più densi. Barra della scala: A, C, E, G, 300 micron; B, D, F, H, 62 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Differenziazione e conseguenza di Neural SteInnesti m cellulari in T3 completo transezione del sito. AB) GFP e l'etichettatura NeuN confermano vasta neuronale differenziazione / maturazione delle cellule staminali neurali ratto innestate sette settimane dopo il trapianto. C) GFP e NeuN immunomarcatura rivela che neurali innesti di cellule staminali-GFP che esprimono estendono gran numero di assoni nell'ospite rostrale del midollo spinale e caudale al sito di resezione (caudale mostrato), due settimane post-trapianto. DE) maggiore ingrandimento dalle aree in scatola di pannello C mostrano che vaste regioni del paese ospitante midollo spinale contengono innesto di derivazione proiezioni assonale sia in sostanza bianca e la sostanza grigia. Barra della scala: AB, 62 micron; C, 700 micron; DE, 62 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Uno dei principali ostacoli per NSC trapianto nel midollo spinale danneggiato è scarsa sopravvivenza al centro della lesione. Eventuali lacune o cavità nel sito della lesione potrebbe potenzialmente ridurre o indebolire la formazione di relè neuronali funzionali tra assoni sovraspinali e separati segmenti del midollo spinale al di sotto della lesione. Inoltre, la scarsa sopravvivenza delle cellule staminali neurali trapiantate può influenzare la loro integrazione con il tessuto ospite, e quindi ridurre la connettività dei neuroni trapiantati con i neuroni dell'ospite. Potenziali meccanismi per spiegare perdita di cellule includono l'ambiente citotossica creato da SCI acuta, degenerazione secondaria dell'host midollo spinale, e insufficiente vascolarizzazione della regione feriti 4.
Fibrina è stato usato per fornire cellule, farmaci e fattori di crescita in vari modelli sperimentali e applicazioni cliniche, dal momento che può conservare cellule e molecole quando diventa polimerizzato 23. Un precedente studio ha dimostrato che fibrina umana sigillantepuò servire come un biomatrice per migliorare la rigenerazione assonale nel subtotale transected midollo spinale senza provocare effetti negativi rilevabili 24. In precedenza avevamo usato matrici di fibrina per incorporare midollo osseo cellule stromali per il trapianto nel midollo spinale cronica feriti 17. Cellule trapiantate sopravvissero nel sito della lesione cronica e integrati bene con ospite il midollo spinale parenchima 17. Pertanto, abbiamo esteso l'uso di fibrina incorporare cellule staminali neurali per il trapianto in grandi siti di lesione aperta nel midollo spinale sezionato. Sebbene la sopravvivenza di cellule staminali neurali innestate migliorato con fibrina, la sopravvivenza di cellule staminali neurali innestate rimasto un po 'variabile e innestato NSC raramente completamente riempito grande cavità della lesione.
Di conseguenza abbiamo aggiunto un cocktail di fattori di crescita, nel tentativo di migliorare la sopravvivenza e la proliferazione di NSC nel sito della lesione. I fattori di crescita sono state esposte in numerosi studi a supporto NSC in vitro 25. While l'aggiunta di fattori di crescita a colture di cellule staminali neurali in grado di cambiare il loro destino, non abbiamo qualitativamente rilevare cambiamento apparente nella densità neuronale quando cocktail di fattori di crescita aggiunti al trapianto confronto a quelli parzialmente sopravvissuto innesto senza fattori di crescita. Un'analisi più dettagliata è necessario prima di poter apprezzare con certezza l'influenza di cocktail di fattori di crescita sul destino delle cellule. Durante il normale sviluppo neuronale, la sopravvivenza e la crescita di neuroni dipendono da fattori neurotrofici che sono spesso rilasciati da guida tessuto bersaglio crescita assonale e, in alcuni casi, influenzano la sopravvivenza neuronale 26.
Simili ma semplici cocktail di fattori di crescita sono stati utilizzati da altri gruppi che permettono di migliorare la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali neurali in vitro ed in vivo 15,16. Questi sforzi hanno generalmente portato a meno estesa sopravvivenza NSC rispetto all'approccio multipla fattore che abbiamo adottato. Un passo essenziale successivo in questa evoluzionesforzo è quello di restringere la lista dei fattori di crescita nel cocktail che sono essenziali per sostenere NSC sopravvivenza, uno sforzo che è in corso. E 'del tutto possibile che un numero più limitato di fattori di crescita sosterrà uguali gradi di sopravvivenza del trapianto, una scoperta che potrebbe semplificare questo approccio sperimentale e la sua traduzione potenziale di studi umani.
Oltre all'uso di matrici di fibrina e cocktail di fattori di crescita, il successo di innesto in vivo al sito di lesione grave può dipendere da fattori meccanici nel sito della lesione. Facciamo ogni sforzo per mantenere l'integrità della membrana durale estremamente sottile che ricopre il roditore midollo spinale dopo lesioni e innesto, nel tentativo di mantenere meccanicamente cellule trapiantate nel sito della lesione. Quindi, facciamo sforzi attenti e diligenti per ottimizzare il riempimento delle cellule coerente del sito della lesione. Senza queste molteplici iniziative, riempimento innesto è incompleta. Queste tecniche richiedono una prace.
Nel tentativo di insegnare questa tecnica ad altri, abbiamo individuato alcune sfide. Se le cellule sono iniettati nell'ospite midollo spinale invece della cavità lesione, poi preferenzialmente cellule possono differenziarsi in cellule gliali. In questo caso, il numero di assoni emergenti è notevolmente ridotto. Se grande cura e diligenza non sono fatti per riempire la cavità della lesione utilizzando le molteplici tecniche e approcci descritti nei paragrafi precedenti, la sopravvivenza delle cellule è meno consistente e risposte biologiche, tra cui l'estensione assonale, sono limitati. Pertanto, è essenziale dedicare diverso tempo, diligenza e tecnica meticolosa utilizzare correttamente questi metodi. Una volta che le tecniche sono acquisite, i risultati sono molto coerenti tra animali, cedendo la capacità di studiare le notevoli proprietà biologiche di questi NSC nei siti di lesione sistema nervoso centrale.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Resource Rat e Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, per fornire topi GFP; Neuralstem Inc. per la fornitura di cellule staminali neurali umane. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, la Fondazione Craig H. Neilsen, e Bernard e Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
