Summary
Fibrin-matriser inneholdende vekstfaktorer ble anvendt for å beholde podet neural stamceller i områder med fullstendig ryggmarg transeksjon. Podet celler helt fylt lesjon hulrom og differensiert i flere nevrale celletyper, inkludert nevroner som utvidet axons inn host ryggmargen over lange avstander.
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) kan selv fornye og differensiere i nevroner og gliaceller. Transplanterte NSCs kan erstatte tapte nerveceller og gliaceller etter ryggmargsskade (SCI), og kan danne funksjonelle releer å koble på ryggmargssegmenter over og under en lesjon. Tidligere studier innpoding nevrale stamceller har vært begrenset av ufullstendig transplantatoverlevelse i den ryggmargslesjon hulrom. Videre sporing av pode celle overlevelse, differensiering, og prosessen forlengelse hadde ikke blitt optimalisert. Til slutt, i tidligere studier, dyrkede rotte NSCs ble typisk rapportert til å differensiere i gliaceller når podet til den skadede ryggmargen, i stedet for neuroner, med mindre skjebne ble kjørt til en bestemt celletype. For å løse disse problemene, har vi utviklet nye metoder for å forbedre overlevelse, integrering og differensiering av NSCs til nettsteder med enda alvorlig SCI. NSCs ble nylig isolert fra embryonale dag 14 ryggmargen (E14) fra en stabil transgen Fischer 344 rotte linje som uttrykker grønn fluorescent protein (GFP) og ble innebygd i en fibrin matrise som inneholder vekstfaktorer; denne formulering beregnet til å beholde podet celler i lesjonen hulrom og støtte celleoverlevelse. NSCs i fibrin / vekstfaktor cocktail ble implantert to uker etter thorax nivå-3 (T3) komplett ryggmargs transections, og dermed unngå perioder på betennelse. Resulterende grafts helt fylt lesjon hulrom og differensiert i begge nevroner, som utvidet axons i verten ryggmargen enn bemerkelsesverdig lange avstander, og gliaceller. Grafts av dyrkede humane NSCs uttrykker GFP resultert i tilsvarende funn. Således er metoder som er angitt for å bedre neural stamcelle poding, overlevelse og analyse av in vivo-resultater.
Introduction
Ryggmargsskade (SCI) ofte skader ikke bare hvite substans traktene som bærer signaler til og fra hjernen, men også den sentrale grå materie, forårsaker segmental tap av interneurons og motoriske nerveceller. Konsekvensen av SCI er tap av både motorisk og sensorisk funksjon under lesjonen. Dessverre gjør den voksne sentralnervesystemet (CNS) ikke spontant regenerere, noe som resulterer i permanente funksjonelle underskudd ett. Derfor er rekonstruksjon av den skadde voksne ryggmargen og bedring i motorisk, sensorisk og autonom funksjon et viktig mål for SCI forskning. Nevrale stamceller (NSCs), enten direkte isolert fra embryonale eller voksen CNS, er overbevisende kandidat celler til å erstatte tapte nerveceller og gliaceller. Videre disse cellene har potensial til å danne nye funksjonelle releer for å gjenopprette aksonal ledning på tvers av en lesjon området 2,3.
Til dags dato har det ikke vært en detaljert forklaring av den anatomiske, electrophysiological og atferdsmessige effekter av nevronale relé dannelsen av transplanterte NSCs etter alvorlig SCI. Det er flere grunner til dette: For det første, transplanterte NSCs eller fosterets CNS vev overleve dårlig når podet inn store lesjon hulrom. Tidligere studier viser betydelig tidlig celle tap, etterlot store tomme cystisk lesjon hulrom 4,5. I noen studier podet cellene deretter vil dele og fylle lesjon hulrom 4,5, men dette kan skje etter en forsinkelse på dager til uker, og påfølgende lesjon nettstedet fylling kan ikke være komplett eller konsistent. For det andre, et effektivt system for sporing som gir lyd data på mobilnettet overlevelse, differensiering / modning, og utvekst av transplantert NSCs manglet. De fleste tidlige studier utnyttet antegrad og retrograd merking for å spore aksonale anslag fra transplantasjoner 2,3. Imidlertid er disse teknikker bare delvis og ofte uklart merket aksonale projeksjoner som følge av podet celler, og tracer-metode er subject for å artifakter forårsaket av fargestoffet lekker forbi de implanterte celler. Andre grupper brukte menneskelige spesifikke nevronale markører å merke aksonale anslag etter transplantasjon menneskelige foster NSCs inn skadde gnager ryggmarg 5,6 av. Men i disse studiene, de xenografts ikke konsekvent overleve godt. Nylig ble viral levering av GFP reporter genet brukes til å merke kultur NSCs 7,8. Men GFP uttrykk var ofte inkonsekvent og kan bli nedregulert 7. Nylig har anvendelse av transgene donor mus eller rotter stabilt uttrykte reporter-genet, GFP, eller human placental alkalisk fosfatase, er dramatisk forbedret sporing av transplanterte nevrale stamceller / stamceller in vivo 9,11. Tredje, flere studier tyder på at in vitro dyrkede rotte NSCs avledet fra enten embryonale eller voksen CNS utelukkende differensiere i gliacellene linjene når transplantert inn i miljøet av den intakt eller skadet voksen spinal cord 7,12,13, til tross for det faktum at disse nevrale stamceller er i stand til å differensiere til neuroner og gliaceller både in vitro, noe som indikerer at lokale omgivelser kan diktere skjebnen til stamceller. Alternativt kan dyrkede NSCs, spesielt de som stammer fra voksen CNS, har iboende defaulty eiendom å differensiere i gliacellene linjene i vivo 13.
På grunn av begrensningene omtalt ovenfor, vår gruppe har nylig utviklet en ny protokoll for å forbedre embryonale NSC sporing, overlevelse, og differensiering / modning i den hardt skadde voksne ryggmargen. Kort fortalt, vi begynte med en stabil transgen Fischer 344 rotte inbreed linje som uttrykker en GFP reporter gen som opprett GFP uttrykk etter in vivo transplantasjon 14. Deretter brukte vi fersk isolerte NSCs fra embryonale dag 14 Fischer 344 ryggmarg, et utviklingsstadium som beholder potensial til å generere både nerveceller og gliaceller. Til slutt, vi innebygdfersk dissosiert NSCs inn en fibrin matrise som inneholder vekstfaktorer 15-17 å beholde cellene og jevnt distribuere dem i en stor lesjon hulrom, med formål å støtte pode celle overlevelse, differensiering og integrasjon. Grafts ble anbrakt i områder av T3 fullstendige tran, to uker etter ryggmargsskade. Disse podet celler konsekvent fylt komplett transider og differensiert i rikelig nevroner som utvidet stort antall axoner i vertsryggmargen over lange avstander 18. Lignende resultater ble oppnådd ved hjelp av dyrkede humane nevrale stamceller grafts til immun-mangel rotter 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyre protokoller er godkjent av VA-San Diego Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). NIH retningslinjer for laboratorie dyr omsorg og trygghet er strengt fulgt. Dyr har fri tilgang til mat og vann gjennom hele studien og er tilstrekkelig behandlet for å minimere smerte og ubehag.
En. Utarbeidelse av Fibrin komponenter som inneholder vekstfaktor Cocktails
- Oppløs 25 mg rotte fibrinogen i 0,5 ml PBS for å oppnå 50 mg / ml 2 x stamløsning (se Materialer tabell). Fibrinogen er vanskelig å oppløse, og bør plasseres i en 37 ° C inkubator-eller vannbad og rystes hver 5-10 min i 1-2 timer.
- Oppløs 100 UN rat trombin i 2 ml 10 mM steril CaCl 2 for å oppnå 50 U / ml 2 x stamløsning.
- Oppløs vekstfaktorer i PBS ved følgende konsentrasjoner for å oppnå 100 ul stamløsning: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (høy lagerkonsentrasjon som intratekal tilførsel in vivo
- Oppløs 25 mg MDL28170 (calpain-inhibitor) i 1,3 ml DMSO for å oppnå 50 mM DMSO-stamløsning, og deretter fortynne 50x i PBS for å oppnå en mM stamløsning.
- Bland 100 ul av hver vekstfaktorkomponent og 100 pl av MDL28170 (1 mM stamoppløsning) for å gi 1,000 ul vekstfaktor-cocktail-oppløsning (figur 1).
- Bland 500 ul fibrinogen 2x stamløsning med 500 pl vekstfaktor-cocktail for å oppnå 25 mg / ml fibrinogen-arbeidsoppløsning inneholdende vekstfaktorer og alikvoter inn i 10 eller 20 pl for lagring ved -70 ° C. Løsningen er stabil i opp til 12 måneder ved -70 ° C.
- På samme måte blandes 500 pl trombin 2x stamløsning med 500 pl vekstfaktor cocktail for å oppnå 25 U / ml trombin arbeidsoppløsning inneholdende vekstfaktorer og alikvoter inn i tilsvarende 10 eller 20 ul volumer til en lagringst -70 ° C i inntil 12 måneder.
- På dagen for poding, plasserer fibrinogen og trombin-inneholdende vekstfaktor cocktails på is inntil de blandet med cellene.
2. T3 Spinal Cord tran
- Anesthetize voksen hunn Fischer 344 rotter eller atymiske nakenrotter ved hjelp av akseptable metoder. Fag er dypt bedøvet, når respons på halen og pote klype er helt fraværende. Merk: Vi bruker vanligvis 150 til 200 g Fischer rotter eller 180-220 g atymiske rotter, og en anestesi cocktail (2 ml / kg) av ketamin (25 mg / ml), xylazin (1,3 mg / ml) og acepromazin (0,25 mg / ml).
- Påfør øye salve for å hindre tørrhet eller skade øynene mens dyrene er under anestesi.
- Barbere den øvre thorax området og rengjør huden med Betadine.
- Kutt i huden og muskelen bruker # 15 blad, utsett T3 ryggvirvel ved hjelp av et kirurgisk retractor, og utføre en laminektomi på T3 vertebra å eksponere T3 / 4 ryggmarg ved hjelp av en rongeur.
- Lag en lonlengderetningen midtlinjesnitt i dura på omtrent 2 mm lengde ved hjelp av en nr. 11 blad.
- Plasser iridektomi saks under dura å kutte høyre lateral hele ryggmargen. Lag en annen kutt på samme side 1,5 mm mer cadually.
- Sug ryggmargen vev mellom de to cut segmenter med en stump 23 G nål koblet til moderat intensitet vakuum. Bruk visuell kontroll for å sikre komplett tran ventralt og sidelengs. Dette vil fullføre en lateral hemisection.
- For å forlenge lesjon til en full bredde ryggmargen transection, plassere speil snitt inn i venstre hemicord. Forsøk å forlate dura intakt, annet enn det første kuttet, for å beholde firmaet pode / fibrin matrise i lesjonen området når podet to uker senere.
- Sutur muskelen, gjelder antibiotika pulver og stifte huden.
- Injisere Ringer-laktat (3 ml), Bannamine (2,5-5 mg / kg) og Ampicillin (80-100 mg / kg) (se Materialer tabell) umiddelbart etter operasjonen og maintain rotter i en varm inkubator inntil termoregulering er reetablert.
- Tømme blæren og injisere Ringers og Ampicillin løsning to ganger om dagen i ca to uker før etablering av refleks tømming av urinblæren (Figur 1B).
Tre. Utarbeidelse av Freshly Spaltet Embryonale Dag 14 Spinal Cord nevrale stamceller
- Skaffe inbreed transgene GFP F344 rotter (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) fra Rat Resource and Research Center, University of Missouri.
- Injiser 40 mg des-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing Hormone Releasing Hormone Ethylamide (LHRH) fortynnet i PBS ved en konsentrasjon på 200 pg / ml intraperitonealt (IP) per voksen hunnrotte (8 uker eller eldre) etter 2 -3 hr lys induksjon for synkronisering av embryo samling.
- Mate med en moden GFP homozygot eller heterozygot hannrotter over natten fire dager etter injeksjon.
- Samle embryoer på dager 13,5-14,5 postcoitus(Pc) i kaldt HBSS buffer, undersøke GFP uttrykk under en "NightSea" lommelykt og filterbriller (BLS1 - Bluestar lommelykt og modell VG1 barriere filter) eller et fluorescerende mikroskop.
- Dissekere ryggmargen ut aseptisk fra hver GFP-positive foster og fjerne overliggende hjernehinnene og festet ryggmargen med iridektomi saks og fine gullsmeder tang.
- Samle dissekert ryggmargen til 2 ml kaldt HBSS buffer i en 15 ml cornical rør og holde på is.
- Følg reference # 20 for å distansere dissekert ryggmargen:
- Kort, tilsett 2 ml av 0,25% Trypsin-EDTA til røret inneholdende dissekert ryggmargen (flere ledninger kan fordøyes sammen, en snor kan generere nok celler til graft av en gjenstand) og fordøye ved 37 ° C i 10-12 min.
- Stans trypsin reaksjonen ved tilsetning av 10 ml DMEM inneholdende 10% FBS til røret og sentrifuger vev ved 2500 rpm i 2 min.
- Susp vev i 2 ml Neurobasal medium containing 2% B27, og Triturer ryggmargen vev ved hjelp av gradvis mindre brann-polert Pasteur pipets.
- Sentrifuger cellene ved 2500 rpm i 2 min, resuspender i 2 ml medium inneholdende Neurobasal B27, og filter-celler med en 40 mikrometer cellefilter sil.
- Telle celler med en hemocytometer og dele cellene likt i to Eppendorf-rør.
- Sentrifuger cellene og fjerne supernatanten (1-2 min er pålagt å trekke tilbake all supernatant med en lav vakuum spissen) så de vekstfaktor cocktails vil ikke bli utvannet av gjenværende supernatanten etter celle re-suspensjon.
- Resuspender hver halvdel av cellene i fibrinogen eller trombin arbeidsoppløsning inneholdende vekstfaktorer, henholdsvis, til en konsentrasjon på 250.000 celler / mL (cellepelleten teller ca ⅓ endelig volum) og plassere dem på is før transplantasjon (fig. 1A). Legg merke til at fibrinogen kan spontant gel når det blandes med celles før kombinere med trombin ved lesjon / pode nettstedet; for å unngå for tidlig geldannelse, bland celler i fibrinogen umiddelbart før celle pode in vivo.
4. Transplantasjon
- Reexpose den lesioned T3 / 4 ryggmarg to uker etter ryggmargen transection.
- 5 mL fibrinogen-celler og 5 mL trombin-celler kan være direkte injisert inn i ni poeng av lesjon området gjennom forseglet arrvev og intakt dura uten gjenåpning lesjonen nettstedet.
- Bruke en 27 G nål for å lage hull 9 på overflaten av arrvev og intakt dura 1-2 uker etter lesjonen: 3 i senter (en i midtpunktet, og to i lateraler, og i avstand 0,5 mm fra hverandre) og 3 i begge rostral og 3 i caudal grensesnitt (ca 0,5 mm rostral eller kaudal til midten av lesjonen).
- Deretter injisere halvt volum fibrinogen celle løsning i tre sentrale punkter i lesjonen nettstedet og en kvart volum inn tre poeng av rostral grensesnitt og aquarter volum inn tre poeng av hale grensesnitt.
- Deretter, umiddelbart injisere throbmbin celler inn i de samme stedene. Den blanding av fibrinogen og trombin-celler celler inne lesjonen området vil danne fibrin-gel for å holde celler i lesjoner side og vekstfaktor cocktails vil understøtte overlevelsen av celler. Cellene blir injisert ved hjelp av trukket glass pipetter som er koblet til en PicoSpritzer (General Valve, Inc.).
- Transplant dyrkede humane NSCs 21 i den samme fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, og bruke fibrin-og vekstfaktor cocktails laget fra humane reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP immunohistological merking viser at podet rotte NSCs resuspendert i fosfatbufret saltvann (PBS) (mangler en fibrin-matrise og vekstfaktor) overlevde dårlig i T3 transeksjon, for å bare feste til lesjonen / vert margin og at det meste av lesjonen side tomt uten podet celler (Figur 2A). Overlevelsen av NSCs forbedres ved samtidig podet med fibrin-matriser alene, men transplantatet ikke fullstendig fyller opp en stor lesjon hulrom (data ikke vist). Derfor har vi innebygd NSCs inn fibrin matriser inneholder vekstfaktor cocktails å forbedre deres overlevelse, fylling av store lesjon hulrom og differensiering inn i nerveceller og gliaceller etter ryggmargen transection 15-17. Grafts av enten rotte eller menneskelige NSCs konsekvent og fylle lesjonen hulrom når vurderes syv uker etter pode 18 (Tall 2B-C).
Vi utførte en gang selvfølgelig studie for å undersøke tidligoverlevelse og fylling av lesjonen hulrom etter pode av NSCs innebygd i fibrin matriser med vekstfaktor cocktails. Histologisk analyse avdekket at GFP uttrykker NSCs levde vel 24 timer etter transplantasjon (3A-B). Podet NSCs ble gradvis mer tett over tid for å fylle den transected lesjon hulrom av den første uken etter transplantasjon trolig skyldes spredning 21 (Tall 3C-H). I tillegg podet NSCs integrert godt på verten / lesjon grensesnitt og syntes å redusere regioner i GFAP immunoreaktivitets på marginene av lesjonen hulrom (figur 3).
En del av podet NSCs differensiert i Neun-uttrykke nevroner sju uker etter transplantasjon (Tall 4A-B). I tillegg er pode-avledet ryggmargs neuroner utvidet stort antall axoner i verten ryggmargen i begge Rostral og hale retninger over lange avstander 18 < / Sup> (Figur 4C). Podet avledet axoner utvidet rostrally og caudally gjennom både hvit og grå materie i vertsryggmargen (Tall 4D-E).
Figur 1. Experimental Skjematisk og Time Line. A) Skjematisk tegning tilpasset fra Popovich 22 (Cell, 2012) illustrerer transplantasjon av nevrale stamceller med fibrin gel som inneholder vekstfaktor cocktail inn helt transected ryggmarg. B) Eksperimentell tidslinje. Atferdsmessige og electriophysiological analyser kan utføres etter celle pode og før perfusjon. Overlevelse av fagene kan være variabel. Klikk her for å se større figur .
.. Figur 2 Overlevelse og Fylling av Neural Stem Cell Grafts i T3 Komplett tran nettsteder GFP og GFAP fluorescerende immunolabeling i horisontale seksjoner demonstrerer (A) dårlig overlevelse av rotte E14 NSCs (grønn) re-suspendert i PBS mangler vekstfaktorer og fibrin matrise; BC) Utmerket overlevelse og fullstendig fylling av lesjon hulrom når (B) rotte eller (c) humane NSCs ble innleiret i fibrin-matriser inneholdende vekstfaktor cocktailer. Cell ble podet inn T3 tran nettsteder for syv uker. Scale bar, 310 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
6.5in "src =" / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3. Graftoverlevelse på tidlig tidspunkt poeng. AB) GFP og GFAP dobbel immunolabeling showet overlevelse og distribusjon av podet rotte NSCs i tran området, en dag etter implantasjon i en fibrin matrise. Boxed område i A er vist ved høyere forstørrelse i panel B. CD) Cell overlevelse og distribusjon er også tydelig på dag 2 og (EF) Dag 3 post-pode. GH) Av syv dager, celler fylle lesjon området og er tettere. Målestokk: A, C, E, G, 300 mikrometer; B, D, F, H, 62 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Differensiering og utvekst av Neural Stem Cell Grafts i T3 Komplett tran nettstedet. AB) GFP og Neun merking bekrefte omfattende neuronal differensiering / modning av podet rotte nevrale stamceller 7 uker etter pode. C) GFP og Neun immunolabeling avslører at GFP-uttrykke nevrale stamceller grafts utvide stort antall axoner i verten ryggmarg rostral og kaudal til transide (kaudal vist), to uker etter poding. DE) Høyere forstørrelse av eske områder av element C viser at store deler av verten ryggmarg inneholder pode-avledet aksonale projeksjoner på både hvite og grå materie. Målestokk: AB, 62 mikrometer; C, 700 mikrometer; DE, 62 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de største hindringene for NSC transplantasjon i den skadde ryggmargen er dårlig overlevelse i lesjonen sentrum. Eventuelle hull eller hulrom i lesjonen området potensielt kan redusere eller svekke dannelsen av funksjonelle nevrale releer mellom supra axoner og atskilt ryggmargssegmenter under skaden. Dessuten kan dårlig overlevelse av podet NSCs påvirke deres integrasjon med vertsvevet, og dermed redusere tilkobling av podet neuroner med verts neuroner. Potensielle mekanismer for å forklare celle tap omfatter cytotoksiske miljø skapt av akutt ryggmargsskade, sekundær degenerasjon av verten ryggmargen, og utilstrekkelig vascularization av den skadde region 4.
Fibrin har blitt brukt til å levere celler, medikamenter og vekstfaktorer i forskjellige eksperimentelle modeller og klinisk anvendelse, siden det kan beholde celler og molekyler når det blir polymerisert 23.. En tidligere studie viste at menneskelig fibrinvevslimkan tjene som en BioMatrix å forbedre aksonal regenerasjon i subtotally transected ryggmargen uten å utløse påvisbare negative effekter 24. Vi brukte tidligere fibrin matriser til å legge benmargs stromale celler for transplantasjon inn i kronisk skadet ryggmarg 17. Podet cellene overlevde godt i kronisk lesjon området og integreres godt med verten ryggmarg parenchyma 17. Derfor har vi utvidet bruk av fibrin å legge NSCs for transplantasjon i store åpne lesjon nettsteder i transected ryggmargen. Selv om overlevelsen av podet NSCs forbedret med fibrin, overlevelsen av podet NSCs vært noe variabel og podet NSCs sjelden helt fylt stor lesjon hulrom.
Vi har derfor lagt en cocktail av vekstfaktorer i et forsøk på å forbedre overlevelse og spredning av NSCs i lesjonen nettstedet. Vekstfaktorer har blitt vist i en rekke studier for å støtte NSCs in vitro 25. While tillegg av vekstfaktorer til kulturer av NSCs kan endre sin skjebne, vi har ikke kvalitativt påvise tydelig endring i nevronale tetthet når vekstfaktor cocktails lagt til pode sammenligne med de delvis overlevde graft uten vekstfaktorer. En mer detaljert analyse er nødvendig før vi kan sette pris med sikkerhet påvirkning av vekstfaktor cocktails på celle skjebne. Under normal neural utvikling, overlevelsen og veksten av neuroner avhenger av neurotrofiske faktorer som ofte er utgitt av målvevet guide aksonal vekst og, i noen tilfeller påvirke neuronal overlevelse 26.
Lignende, men enklere vekstfaktor cocktails har blitt benyttet av andre grupper for å øke overlevelse og differensiering av NSCs både in vitro og in vivo 15,16. Dette arbeidet har generelt ført til mindre omfattende NSC overlevelse enn flere faktor tilnærming som vi har vedtatt. En viktig neste skritt i denne utviklingeninnsats er å innskrenke listen av vekstfaktorer i cocktail som er viktig å støtte NSC overlevelse, et forsøk som er i gang. Det er fullt mulig at et mer begrenset antall vekstfaktorer vil støtte like grader av graft overlevelse, et funn som ville forenkle denne eksperimentelle tilnærming og dens potensial oversettelse til studier på mennesker.
I tillegg til bruken av fibrin-matriser og vekstfaktor cocktails, kan suksess for poding in vivo til den alvorlige lesjoner området avhenge av mekaniske faktorer i lesjonen side. Vi gjør vårt ytterste for å opprettholde integriteten til den ekstremt tynne dural membran som ligger over den gnager ryggmargen etter lesjoner og pode, i et forsøk på å mekanisk beholde podet cellene i lesjonen nettstedet. Dermed gjør vi forsiktig og flittig innsats for å optimalisere konsekvent celle fylling av lesjonen nettstedet. Uten disse flere forsøk, er pode fylling ufullstendig. Disse teknikkene krever omfattende praktiskce.
I forsøket på å lære denne teknikken til andre, har vi identifisert noen utfordringer. Dersom cellene blir injisert inn i vertsryggmargen i stedet for lesjonen hulrom, så celler kan fortrinnsvis differensieres til gliaceller. I dette tilfellet, er antall nye axons sterkt redusert. Dersom stor omsorg og flid ikke er laget for å fylle lesjonen hulrom ved hjelp av flere ulike teknikker og innfallsvinkler som er beskrevet i de foregående ledd, er celle overlevelse mindre konsekvent og biologiske reaksjoner, inkludert axon utvekst, er begrenset. Dermed er det viktig å vie mye tid, flid og nitid teknikk for å lykkes med å bruke disse metodene. Når teknikkene er kjøpt, resultatene er svært konsekvent fra dyr til dyr, noe som gir muligheten til å studere den bemerkelsesverdige biologiske egenskapene til disse NSCs i sentralnervesystemet lesjon nettsteder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Rat Resource and Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, for å gi GFP rotter; Neuralstem Inc. for å gi humane nevrale stamceller. Dette arbeidet ble støttet av Veterans Administration, NIH (NS09881), kanadiske Spinal Research Organization, Den Craig H. Neilsen Foundation, og Bernard og Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
