Summary
神経疾患のトランスジェニックおよびノックアウトマウスモデルは、正常および異常な神経生理学における遺伝子の役割を研究するために有用である。この記事では、長期増強、自由神経病理のマウスモデルを振る舞うトランスジェニックおよびノックアウトで学習と記憶を、根底にある細胞メカニズムを研究するために使用することができる方法を説明します。
Abstract
シナプス伝達効率の長期増強の研究は、潜在的な細胞メカニズム基本的な学習や情報記憶装置として、それが魅力的にする特性を有する活性依存性シナプス現象は、長い間、海馬、扁桃体の様々な神経回路の生理機能を解明するために使用されている、および他の辺縁系および皮質構造。これを念頭において、神経疾患のトランスジェニックマウスモデルは、学習、感情情報とに関与する神経回路網における正常および異常なシナプスの通信における遺伝子の役割をより深く理解を開発するために長期増強（LTP）の研究を行うために有用なプラットフォームを表す処理。この記事では、確実に自由に行動するマウスではLTPを誘導するための方法論を説明します。これらの方法論は、自由神経変性疾患のマウスモデルの挙動を、トランスジェニックおよびノックアウトの研究において使用され得る。
Introduction
遺伝子を操作する技術の開発がほぼすべての神経変性および神経疾患のトランスジェニックおよびノックアウトマウスモデルを生産している。これは、以前にマウス動物モデルに大きいげっ歯類種において使用される電気生理学的研究技術の翻訳を必要としている。一つのこのような神経生理学的な調査技術は、種々の神経病理学的疾患に関与する神経回路網内のシナプス結合の有効性を試験するために使用長期増強（LTP）である。このプロトコルは、自由にマウスを振る舞うにおけるLTPの信頼性のある電気生理学的調査のための手法について説明します。他のものよりもこのプロトコルの利点は、単純で実装が容易であることであり、それはそれは高価なコンピュータ制御のマイクロドライブシステムや電界効果トランジスタのヘッドステージの使用どちらも必要としないこともなく、低コストであり、我々の知る限りでは、慢性電気生理学的記録トンの最初のビデオプロトコルですO自由にマウスを振る舞うにLTPを研究。この目的のために、我々は、この記事内で自由に行動するマウスでは長期増強を研究するための簡単な方法を説明します。これらの方法論は容易に神経病理学的疾患のトランスジェニックおよびノックアウトマウスモデルに変換することができます。
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Protocol
このプロトコルは、3と18歳30〜50 gでおよその体重ヶ月）のマウスに適しています。マウスは、ジャクソン·ラボラトリー（バーハーバー、ME）から得ることができる。すべての外科的および実験プロトコルは、トリニティカレッジ動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関するNIHのガイドに合わせてあった。
1。動物の準備および外科的処置
- ケタミン（25 mg / ml）を、キシラジン（2.5 mg / ml）を、およびアセプロマジン（0.5 mg / mlの）を含む麻酔のカクテルを用意してください。その後、ペダル引っ込め反射を使用して麻酔の深さを安定して維持するために45分ごとに0.2ミリリットル/ kgを注射により補充腹部の右下の象限には1ml /体重kgを注入する。
- 電気シェーバーを使用して頭蓋に毛を剃ることで手術の麻酔をかけたマウスを準備します。剃毛面積は耳の中央に目の真ん中を含める必要があります。 whiskeを剃るしないようにしてください彼らは、マウスのバレル感覚系の一部であるとしてRS。
- 頭に剃毛領域にベタジン続いイソプロピルアルコールを適用するために綿棒を使用してください。そして、また、綿棒を使用して、乾燥から眼球を防止するために、目にミネラルオイルを少量適用する。
- 定位フレーム装置に動物の頭をマウントするために、乳児ラットの耳の袖口の代わりに、定期的な耳のバーを使用します。これを行うには、まず左耳の袖口に左耳をマウントします。ゆっくり優しく片手で動物の頭を支え、もう一方の手で耳のカフを進めることによって、右袖口に右耳を和らげる。次に、動物の身体の下に加熱パッドを配置し、体温を維持するために86°Fに設定します。
- その後、左右にヘッド側を移動しようとすることによって、二国間の剛性をチェックする。動物は頭部が硬質であるときに適切に定位フレームに取り付けられており、左右に移動することはできませんが、簡単に上下に旋回することができます。
- 優しく休む切歯は鼻/歯の棒の歯の開口部内に静かにしっかりと休んでいることを確認しながら、鼻/歯のバーアセンブリ上でマウスの鼻。
- 滅菌メスを使用して、耳の中央に目の途中から始まる正中切開を行います。メスでは45°の角度に保持し、それが過度の出血の原因になりますように、基礎となる筋膜を通してではなく、頭蓋骨を切断するのに十分な圧力をかけることがされていることを確認してください。
- 筋膜を分離し、頭蓋骨を露出させた綿棒を使用してください。頭蓋骨はブレグマの観光スポットとラムダ（ 図1A）はっきり見えるはずです。動物はブレグマとラムダのランドマークが同じ背腹（DV）の位置（+ 0.1ミリメートル）であるように、鼻/歯のバーを調整することにより、頭蓋骨のフラットな位置にあることを確認してください。
- 露光部に滅菌生理食塩水を少量つけて軽く頭蓋骨をきれいに綿棒を使用しています。その後、完全に空気乾燥頭蓋骨のため2〜3分待って先に進む前に。
- ブレグマとラムダのDVの位置を測定するために左に定位腕に針を取り付けます。これら2ランドマークのDVの位置は、互いの0.1ミリメートル以内でなければなりません。そうでない場合、定位フレームのノーズバーは、これを達成するために上下に調整することができる。
- その前後（AP）、横方向（LAT）と背腹（DV）の測定値を記録するためにブレグマの針の位置を決めます。針がちょうど頭蓋骨に触れ、それを貫通していないことを確認してください。
- ターゲット構造の座標を決定するために、そのような「定位座標でのマウス脳」として、1をマウス脳アトラスを使用します。内側有孔質路（MPP）海馬の角の束と歯状回（DG）で、ラムダの相対それぞれブレグマは、（ 表1も参照）。その後、頭蓋骨にこれらの点をマークするために細かいボールペンや鉛筆を使用しています。
- また、頭蓋骨の反対側の2つのより多くのポイントをマークします。これらの点WHICHグランド（GND）と参照（REF）となる正中線から約3mmであるべきであり（ 図1A、表1）は 、互いに対して長手方向に位置する。
- 左定位アームから針マーカーを削除し、定位マウントを搭載した電気歯科用ドリルに交換してください。各マークされた点の上にドリルを置き、直径約0.5ミリメートルの小さなバーホールを作る。掘削時には、反復的な上下運動を使用し、ドリルが脳表面を露出させるために頭蓋骨を貫通したか否かを頻繁に確認する。
- 慎重にしっかり、彼らはそれを貫通することなく皮質表面に触れていることなど（ 図1A（＃0-80ステンレス製小ねじ1/8、ヘッドフィリマイナス）対側の穴（GNDとREF）のそれぞれにネジ電極をドライブ）。これらの2つのネジ電極はグランドと参考になる。
- マウントは、電気で刺激電極と記録左右の定位腕にデ·ホルダー、。
- 電気生理学的差動アンプ（ゲイン= 1,000 = 1 HZ-3 kHzのバンドパスフィルタ）に現在の独立した電気生理学的な刺激と記録電極端子に刺激電極端子を接続し、誘発反応の目視検査のためのデジタルオシロスコープに。また、差動増幅器にGNDとREF電極端子を接続する。
- 優しくゆっくりと視覚的に600〜800 UAの刺激ショック誘発反応をモニターしながら、0.5ミリメートル刻みで刺激的記録電極の両方低い。彼らはそれぞれの目標のDV位置に到達し、ステレオタイプの信号はオシロスコープ（ 図1B）上で観察されるまで、各電極を下げ続けています。
- その後、所定の位置に電極端子を保持するためのキャップを作るために歯科アクリルセメントを使用し、肌に触れるあらゆる歯科用セメントを拭き取るべきであるすぐに。歯科用セメントが完全に硬化したら、クリーン齧歯類ケージに定位フレームから動物を転送します。コア温度を維持するために、加熱ランプまたはパッドを使用してください。
- それが意識を取り戻すまで、動物ごとに時間を監視します。フルニキシンの注入は、鎮痛薬として投与することができる。
2。 LTP誘導
- 動物5〜7日は手術から回復することができます。 （122センチ×43センチメートルX 43センチメートル）防音材を装備し、電極を接続する5チャンネルの回転整流子は、刺激/記録のセットアップにつながるファラデーケージからなる録音環境で動物を置きます。
- 動物は（1.17ステップ参照）刺激と記録の楽器に電極を接続する前に、録音環境で1〜2時間、順応することができます。
- 出力400 UAに、刺激のコントロールを設定し、必ず目を作る反応を誘発10の平均の振幅を記録刺激の間に少なくとも10秒経過した。誘発反応を定量化するために、図1（c）に示す方法を使用します。 600、800、千、1200、および1400 UAに対して、この手順を繰り返します。
- 刺激強度に対する誘発反応の平均振幅をプロットすることにより、入力/出力曲線を構築します。このプロットから測定された最大振幅の50％に相当する刺激強度を決定する。実験の残り50％の強度を使用してください。
- 次いで、50％の刺激強度を用いて、5の平均振幅を記録することによってベースラインを得る応答を15分間毎分誘発。もう一度確認して刺激の間に少なくとも10秒経過していることを確認します。
- その後、内側有孔質路には5Hzのバースト速度で400 Hzで配信10パルスの10バーストから成るテタヌス刺激を提供します。濡れた犬の揺れなど、発作の兆候のために密接に動物を監視します。動物は発作experimを持っている場合ENTは終了されるべきであり、その動物からのすべてのデータは、調査結果から除外されるべきである。
- その後、5の平均振幅が応答を30分posttetanization毎分を誘発記録し続けています。その後、ベースラインからの変化率（％）（ 図2）を計算することにより、ステップ2.5で得られたベースライン振幅に、この振幅を比較する。
- 実験の終了後、動物をイソフルラン系アメリカ獣医師会の安楽死に関するガイドラインと一致している方法の吸入によって安楽死させています。
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Representative Results
このプロトコルで使用される表1は、DGとMPPの座標を示している。図1（a）は、頭蓋骨上の標的構 造のためのマーキングを示し、。も示すグランドおよび基準電極の位置している。図1Bは、担当者が事前に両方の応答トレースを誘発示しています。と同じ動物におけるposttetanization。 posttetanization応答が。 図1Cは、応答振幅を定量するために使用される方法を示す図であるLTP誘導2を示すpretetanization応答よりも大きいことに注意喚起。実際、 図2は、前およびposttetanizationの期間に及ぶ時間にわたって応答振幅のパーセント変化を示す。これは、ピークLTP値が100％を超えたことに留意すべきである。強化された応答振幅以下の強直誘発のこれらの結果は、このプロトコルは、LTPの研究に成功したため、信頼性があることを示している自由に行動するマウスモデルにおいて。
表1。ターゲット構造の座標。前後（AP）は、歯状回（DG）とREF座標内側perforantパス（MPP）とGNDのものはラムダを基準にしていながら、ブレグマに対して与えられている。すべてのDV座標は硬膜下の皮質表面を基準にしています。
図1。電極位置と誘発反応の代表痕跡。マウスSKU上の電極の相対的な位置のA）の概略図llの。B）誘発反応の典型的なトレースは、前およびposttetanization。C）アルゴリズムは、誘発反応の振幅を定量するために使用される。
自由に行動するマウスのMPP-DGシナプスにおけるLTP誘導の図2。内側perforantパス歯状回シナプスにおけるLTP。代表的結果。 LTP誘導を示す誘発反応の振幅の反復刺激後の刺激の強化に注意してください。
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Discussion
このプロトコルでは、自由に行動するマウスにおいてDG中でLTPを研究するための確実かつ簡単な方法を実証した。覚醒ラットにおけるLTPの多くの研究が3,4行われてきたが、非常に少数のは、主にマウスでは限られた頭蓋の不動産がもたらす技術的な複雑さとの平均重量を基準に、電極ヘッドステージの重みに目を覚ましたマウスで行われているマウス5。自由にマイクロドライブ電極システムや接合型電界効果トランジスタ、必ずしも動物6月10日に、電極ペイロード負担を増大ヘッドステージに統合（JFET）プリアンプも使用し、マウスを振る舞うにDGでのLTPが実証されているいくつかの研究。本プロトコルの意義は、それがマイクロドライブ電極システム又はJFETのヘッドステージの使用を避けるように自由に行動するマウスでDGにLTPを誘導するための既存の方法に対する改良を表していることである。
それが重要であるこのプロトコルの重要なステップを強調するために重要。これらを含める：それは両側性、剛性になるように、定位フレーム内でマウスの頭部の1）装着（それは練習と技術に精通している必要があり、このステップは最も困難な場合がある）、2）電極の最適な位置応答の大きさを最大化する缶そのブレグマとラムダを保証することによって、通常、ブレグマとラムダの背腹位置決めの差が0.1mm以下であるような定位フレームの歯の支柱を調整することによって達成することができ、同一平面内にある向上させること、3）の記録フェーズ中実験には、録音環境の新規性は、収集された誘発反応データの変動をほのめかす可能性があるため、動物は時間がレコーディング環境に慣らすことが推奨されます。4）電極の適切な選択は、信号品質や忠実度を向上させる：双極電極（ 0.2ミリメートルのステンレス鋼とステンレス鋼の皮下注射管0.5mmのチップ分離）を有するワイヤインサートは、単極電極（epoxylite絶縁一本鎖タングステン線）は神経組織に記録するために使用されるが刺激するために好ましい、5）マウスは、ケタミンの混合物の腹腔内注射を用いて麻酔することができる（25 mg / ml）を、キシラジン（2.5 mg / mlで）およびアセプロマジン（0.5 mg / mlで）。この麻酔薬混合物を次いで、麻酔の安定的な深さを維持するために、0.2ミリリットル/キログラムごとに45分で補足約20分で、通常は有効で1ml/kgの投与量で投与されるべきである。
言及クマこのプロトコルのいくつかの制限があります。このプロトコルは、イオンチャネルのメカニズムやLTPを補助することがあり、受容体タンパク質合成上の任意の洞察力を与えるものではありません。そのためわずかな情報が記録されている人口のニューロンの実際の数値に関して提供されています。他の制限は、誘発反応が起きて動物で収集されているので、それはascertすることが困難なことであるAINやストレス、取扱い、または偽の感覚運動活動により記録された信号の汚染などの要因の影響を詳細に分析。これらの制限は、応答は動物がそうでない静かな目覚め警戒状態として知られており、不活性であるがアラート状態である場合にのみ記録されている誘発ことを確実にすることによって克服することができる。
それにもかかわらず、このプロトコルに記載されている技術は、脳の電気的活動基盤となる動作を調べるための最も生理的に関連するプラットフォームを提供します。マウス脳アトラスの1で与えられるように、このプロトコルで概説した手順に従って、任意の脳構造は、適切な座標を用いて標的とすることができる。これは、成体ラット定位フレームは、適切な幼児ラットの耳の袖口ではなく、通常の耳バーの使用することを条件とし、マウスで使用することができることに注意することが重要です。耳の袖口は、マウスの耳にダメージを与えることなく、ヘッドを固定します。最後に、ここで紹介する方法論はreadilすることができますYは、神経疾患のホストのトランスジェニックおよびノックアウトマウスモデルでの電気生理学的な調査に翻訳。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
博士ジョセフブロンズィーノ、博士ハミーアブ·Hassaballah氏RJオースティン - ラフランス、そして氏ジェシカKoranda：著者は、次のことを認めることを願っています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
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