Summary
דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על ידי
Abstract
מאמר זה מתמקד בכל הר הכלאה באתרו (לוואי) של עוברי דג הזברה. הטכנולוגיה מאפשרת מאחלי ההערכה של ביטוי גנים הן במונחים של חלוקת רקמה ושלב התפתחותי. פרוטוקולים מתוארים לשימוש ברצון של עוברי דג הזברה באמצעות בדיקות RNA antisense שכותרתו עם digoxigenin. בדיקות נוצרות על ידי שילוב של נוקלאוטידים digoxigenin צמודים באמצעות שעתוק במבחנה של תבניות גנטיות שכבר משובטות ולינארית. את chorions של עוברים שנקטפו בשלבי התפתחות הוגדרו יוסרו לפני דגירה עם בדיקות ספציפיות. בעקבות הליך כביסה כדי להסיר את החללית עודפת, עוברים מודגרת עם נוגדן אנטי digoxigenin מצומדות עם phosphatase אלקליין. על ידי שימוש במצע chromogenic לphosphatase אלקליין, ניתן להעריך ביטוי ספציפי גן. בהתאם לרמה של ביטוי גני ההליך כולו יכול להסתיים תוך 2-3 ימים.
Introduction
דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חיה רב עוצמה לפיתוח המחקר של החולייתנים, מחלות, התנהגות, ובשימוש בסמים ההקרנה 1-3. ניתן להשיג עוברי דג הזברה במספרים גדולים ממעבר אחד. הפריה והתפתחות מתרחשת ברחם לשעבר ואת העוברים הברורים אופטי לפתח במהירות. אירועי התפתחות קריטיים מתרחשים במהלך 48 שעות הראשונה לאחר ההפריה (hpf). זה כולל את המראה של האיבר primordia וייזום של cytodifferentiation. ניתן להשיג מציאה או על ביטוי של חלבונים באמצעות microinjection של עוברים עם antisense morpholino (MO) oligonucleotides או mRNA בהתאמה בשלב תא אחד או שניים (0.75 hpf).
משאלתו של עוברי דג הזברה מאפשרת המחקר של ביטוי מרחב ובזמן של גנים ספציפיים של עניין. יישום של טכניקת המאחלים בעקבות microinjection של עוברים עם mRNA או MO ליותר מ-exprESS או רמות חלבון ספציפיות מציאה מגלה רגולציה ההפרש של גנים אחרים.
שינויים בדפוסי ביטוי גנים יכולים להיות מתואמים עם שינויים פנוטיפי ולחשוף את הפונקציה של גני המטרה במהלך organogenesis מוקדם. מאז ניתן להכין בדיקות ומאוחסנות מראש, ניתן ליישם את טכניקת ש כדי לחשוף דפוסי ביטוי גנים לפחות 20 גנים בכל פעם, באמצעות צלחות שש היטב וסלים בהתאמה אישיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כל הר הכלאה באתרו של עוברי דג הזברה
1.1 הכנת העוברים
- איסוף עובר בשלבי ההתפתחות הנדרשים. אנא ראה קימל ואח'. 5 לתיאור שלב עוברי.
- הסר chorions באופן ידני באמצעות מלקחיים (מלקחיים השענים דומון לא. 5).
- תקן את העוברים בפתרון 4% מparaformaldehyde (PFA) המורכב ב PBS (בופר פוספט) הלילה ב 4 ° C.
- לשטוף עם PBS עוברים לפחות פי 3 ל5 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר.
- עוברי חנות במתנול 100% (MeOH) ב -20 ° C עד משמש ליישום עתידי של טכניקות, כולל כל הר בכלאה באתרו.
- הקפאה מבוימת עוברים בחנקן נוזלי למיצוי וחנות RNA ב -80 ° C.
- לחלץ RNA מעוברים מבוים ולסנתז cDNA להגברת PCR ושיבוט שלאחר מכן. 1.2 סינתזה של RNA Digoxygenin בדיקות שכותרתו
- ההגברה PCR ושיבוט גן לתבנית בדיקה. תגובת הגדרת PCR עם נפח כולל של 50 μl כפי שמוצג בטבלה 1. השתמש ה-DNA הגנומי יותר או פחות cDNA בתגובת PCR כתבנית. כולל 10 דקות הארכה זמן על 72 מעלות צלזיוס לאחר המחזור האחרון כדי לוודא שמוצרי PCR התגובה הם באורך מלא ו3 'adenylated על מנת לאפשר שיבוט TOPO.
- בדוק את גודלו של המוצר ה-PCR באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose. הגודל המשוער של המוצר ה-PCR לסינתזת חללית קרוב לקילו 1.
- קח טיפול מיוחד כדי למנוע זיהום nuclease על ידי ביצוע הניסוי בתנאים סטריליים ושימוש במי nuclease חינם. במקרה שמוצרים רבים הם נצפו, ג'ל לטהר את המוצר ה-PCR בגודל המתאים לפני שתמשיך עם שיבוט באמצעות ערכת שיבוט ת"א TOPO. לייעל את תגובת PCR לחסל את המראה של מריחות ולהקות רבות.
- בצע את תגובת שיבוט TOPO כפי שמצוין בטבלה 2. שלב TOPO וקטור ומוצר ה-PCR ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- לשלב / להציג את מוצר שיבוט TOPO לתוך אחד תאים מוסמכים ירה. Tתהליך השינוי שלו נקרא.
- דגירה התאים שינו על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 ב 260 סל"ד, כדי להבטיח את הביטוי של גנים עמידים לאנטיביוטיקה. צלחת שינוי התמהיל (50-100 μl) על prewarmed וריא Bertani (LB) צלחות אגר המכילות 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין וX-gal. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לקבוע את קיומו של הכנס המבוסס על מראה של מושבות כחולות לבנות או בהירות. וקטור TOPO מכיל lacZ גן אשר מקודד β-גלקטוזידאז. בנוכחותו של X-gal, ייצור של β-גלקטוזידאז יוצר צבע כחול. ה-DNA ligated לתוך פלסמיד משבש את היווצרות מושבות β-גלקטוזידאז ופונקציונליים לבנים מיוצר. מושבות לבנות או תכלת מושבות לאשר את קיומו של הכנס.
- פיק המושבות הלבנות מהצלחת אגר באמצעות טיפים פיפטה סטרילית ולמקם אותם בצינור סטרילי 10 מ"ל המכיל 4 מ"ל של תקשורת LB ותרבות על 37 מעלות צלזיוס בincuba הרועדתטור הלילה ב 200 סל"ד.
- לטהר DNA פלסמיד באמצעות ערכת פלסמיד דנ"א בהתאם להוראות היצרנים.
- Linearize טיהור פלסמיד cDNA הבא על ידי לעכל 5 מיקרוגרם של cDNA עבור כל בדיקה עם אנזים ההגבלה המתאים שיש לו אתר ייחודי הממוקם 3 '(לבדיקות תחושה) או 5' (לבדיקות antisense) להוספה.
- לטהר את הדנ"א לינארית בשיטת מיצוי פנול / כלורופורם. הוסף נפח שווה של ספין פנול / כלורופורם, קודקוד נמרץ למשך 30 שניות, במשך 3 דקות ב13,000 סל"ד ב 4 ° C. העבר את השלב מימי עליון לתוך צינור נקי ולהוסיף נפח שווה של כלורופורם. ספין 3 דקות ב 13,000 סל"ד ב 4 ° C. העבר את השלב מימית עליון לתוך צינור נקי. הוסף 10% נתרן אצטט (3 מ ') ונפח 2.5x של אתנול 100% ל-DNA ומשקע החנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ספין במשך 15 דקות ב 13,000 סל"ד ב 4 ° C. הסר אתנול ושטוף את הכדור עם 75% אתנול. הפרוטוקול ניתן לעצור וניתן ST-DNAכבד ב -20 מעלות צלזיוס והמשיך ביום שלמחרת. ספין של 10 דקות ב 10,000 סל"ד ב 4 ° C. הסר את supernatant בזהירות ולייבש את גלולה למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. Resuspend גלולה ב10 μl מים DEPC טופלו ולדגור על 55 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לכמת ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV.
- להעריך את טוהר על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose באמצעות μl 1 של ה-DNA על 1% agarose ג'ל ופועלת במשך כ -30 דקות.
- הגדרת תגובת תיוג רנ"א. שימוש בבקבוקון תגובת RNase חינם, להוסיף 1-5 מיקרוגרם של ה-DNA מטוהר התבנית לסטרילי, RNase ללא מים DEPC שטופל, כפולים מזוקקים להיקף של 13 μl. לצנן את בקבוקון התגובה על קרח ולהוסיף את ריאגנטים הבאים (ראה טבלה 3):
- מערבבים מגיב בעדינות ואז לאסוף בתחתית על ידי צנטריפוגה הקצרה ב 2000 סל"ד במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר ודגירה את תערובת התגובה במשך שעה 2 ב 37 ° C.
- הסר את תבנית ה-DNA על ידי הוספת 2 μl RNase ללא DNase I. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולעצור את התגובה על ידי הוספת 0.2 μl 2 M EDTA (pH 8.0).
- לזרז את מוצרי תגובה על ידי הוספת 4 μl 2.5 M LiCl ו75 100% אתנול μl. מערבבים את הפתרון ולשמור ב -20 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות or מאוחסן ב -20 ° C במשך הלילה והפרוטוקול התחדש למחרת.
- צנטריפוגה ההשעיה למשך 30 דקות ב 13,000 סל"ד ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף את הכדור עם 500 אתנול 70% μl מאוחסן ב -20 ° C, צנטריפוגות במשך 10 דקות נוספות, יבשה למשך 2 דקות, וresuspend ב50 μl ודגירה ב30 דקות ב 37 ° C.
- ודא את איכות הבדיקה ויושר על ידי הפעלת מ"ל 1-2 על 1% agarose ג'ל לכ -30 דקות. זה אושר על ידי נוכחותו של מוצר יחיד שפועל בגודל הצפוי בג'ל.
- לכמת את הריכוז של החללית על ידי מדידת הכמות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. התשואה מהתגובה הזו היא כ -10 מיקרוגרם של רנ"א (100-200 ng / μl).
- יום 1
- התייבשות
- הכן את הסלים באמצעות רשת ניילון (גודל נקבובית מ"מ פחות מ 1) וצינורות Eppendorf. לבנות את הסלים על ידי חיתוךגרם Eppendorf צינורות (1.5 מ"ל) כדי להסיר את קצות החרוטים. לזהות סלים בודדים להשתמש בצינורות בצבעים שונים ולהסיר את החלק העליון חישוקים ממחצית מהם.
- חותכים חתיכות קטנות של רשת ניילון כדי לכסות את קצות החתך של צינורות Eppendorf. להדביק את קצות החתך של הצינורות לרשת ניילון על ידי חימומם בצלחת חמה חשמלית (מוגדר בין בינונית לגבוה) במנדף. ברגע שהתקרר להסיר את רשת הניילון העודפת מהסלים ולאחסן אותם במתנול 100% בטמפרטורת חדר.
- הכן דילולים רצופים של מתנול ב PBS (75% [מתנול, 50%] מתנול [כרך / כרך [כרך / כרך ו 25%] מתנול [כרך / כרך) באמצעות שלוש הבארות הראשונות של הצלחות שש היטב ואחריו 100% PBST (בופר פוספט המכיל 0.1% Tween-20) בשלוש הבארות הבאות.
- עוברים כפופים לאתרו בהליך ההכלאה שימוש בסלים בהתאמה אישית כפי שמוצג בFigurea 1 א 'וב'. פתרונות RNase ללא שימוש עד hybridizaצעד tion ב6 גם צלחות (4 מ"ל גם /). כדי להשיג זאת מקום, עד 6 סלים בבאר הראשונה. סל עם שפת המקום ראשון ואחריו סלים ללא חישוקים בצבעים שונים המסודרים ברציפות. שימוש עד 6 דפוסי ביטוי גנים בהסדר זה יכול שייקבע בו זמנית.
- הנח עוברים מיובשים של אותו שלב התפתחותי לאותו הסל (ראה איור 1).
- רעננות עוברים על ידי העברת סלים מאחד גם בצלחת שש היטב ל( 5 דקות לכל שלב) הבאה. השתמש בשש בארות מלאות במאגר מתאים. עוברי נתונים לדילול כל פעם. בדרך זו עובר נשטפות 6x, 5 דקות / לשטוף. התייבשות של העוברים המיובשים מושגת על ידי החלפת מתנול עם PBS ולאחר מכן על ידי שטיפת 3x עם 100% PBST.
- Permeabilization לעכל את עוברי rehydrated עם proteinase K (10 מיקרוגרם / מ"ל) בטמפרטורת חדר כדי להבהיר להם חדירים כפי שמוצגים בטבלה 4
שלב עובריים (לאחר הפריה שעות) תקופת עיכול (proteinase K) עד 6 15 שניות 6-12 30 שניות 12-18 3 דקות 24 12-15 דקות 48 25-30 דקות 72 40 דקות 96-120 50 דקות לוח 4. תגובת permeabilization.
- רוחצת Postfixation וPBST
- תקן את העוברים על ידי דוגרים בparaformaldehyde 4% (wt / כרך) ב 1x PBS במשך 20 דקות.
- הסר paraformaldehyde השיורי על ידי שטיפת עוברי 3x, 5 דקות / לשטוף, בPBST 1x.
- Acetylation מכין את תערובת acetylation (125 triethanolamine μl ו27 אנהידריד אצטית μl ב 10 מ"ל DDH 2 O) ועוברי דגירה פעמיים עבור כל 10 דקות. כדי למזער את פעילות phosphatase אנדוגני, להכין את תערובת acetylation טרי בעת צורך. כדי להסיר מגיב עודף, לשטוף את עוברי פעמיים בPBST (10 דקות / לשטוף)
- Prehybridization Prehybridize עוברים על ידי העברת עוברים מסלים לצינורות 1.5 מ"ל סטרילי Eppendorf ודוגרים עם 200 תערובת ההכלאה μl עבור 2-4 שעות ב70 ° C אמבט מים.
- Preadsorption של נוגדן הסר כ -50 עוברים מהסלים ולהעביר אותם לצינורות 1.5 מ"ל סטרילי Eppendorf. דגירה עם אנטי DIG-AP (1:500) נוגדן באמצעות חיץ חסימה (1x PBST, 2% עגל בסרום [כרך / כרך], 2 מ"ג / מיליליטר שור סרום אלבומין [BSA]) בטמפרטורת חדר למשך 2-4 שעות, ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C למשך הלילה. הסר מן החממה בבוקרד לאפשר לעוברים להגיע לטמפרטורת חדר.
- הכלאה הוסף 100-200 ng של חללית לעוברי prehybridized ודגירת הלילה על 70 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- התייבשות
- יום 2
- SSC (ציטראט מלוחים נתרן) רוחץ
- 50 צינורות מקום מ"ל של תערובת ההכלאה (HM), 2X SSC ו0.2X SSC בכוס עם מים ב70 ° C אמבט מים וprewarm במשך לפחות 20 דקות. הסר את תערובת תגובת ההכלאה המכילה את החללית, להוסיף 1 מ"ל של תערובת ההכלאה prewarmed לצינורות ודגירה במשך 15 דקות ב 70 ° C. מלא צלחות שש היטב עם דילולים שונים של HM prewarmed ב2x SSC על ידי החלפת 100% HM דרך 50% עד 25% HM כדי להסיר חומרים כימיים עודפים.
- בזמן ההמתנה, למלא צלחות שש היטב עם 2x SSC לשוטף ולשמור אותם על 70 ° C.
- לאחר 15 דקות מקום את העוברים מהצינור לסלים המשיכו בצלחת גם השש מלאות בדילולים של HM עם 2x SSC ולשטוף את עוברי הכלאה על ידי העברת סל מאחד גם ל( 15 דקות כל אחד ב70 ° C אמבט מים) הבאה. שטוף עוברי 2x, 15 דקות / לשטוף, ב100% 2x SSC ב 70 ° C.
- קבע עוד אמבטיה מים ב 65 ° C. מלא צלחות שש היטב עם 0.2X SSC לחומרא שוטף גבוה כדי למנוע הכלאה ספציפיות של תמליל עם החללית.
- לאחר את העוברים נשטפים פעמיים עם 2x SSC על 70 מעלות צלזיוס, לעקוב אחר שני שוטף 30 דקות נוספות ב0.2X SSC על 65 ° C.
- רוחצת PBST הכן את צלחות שש היטב עם דילולים רצופים של 0.2X SSC בPBST כדלקמן: 75% (כרך / כרך) 0.2X SSC, 50% (כרך / כרך) 0.2X SSC, 25% (כרך / כרך) 0.2X SSC, ושתי בארות שנותרו עם 100% PBST. לשטוף את עוברי הכלאה על ידי העברת סל מאחד למשנהו היטב (5 דקות לכל שלב בטמפרטורת חדר באמצעות נדנדה).
- עוברי Preincubate Preincubation עבור שעות 3-4 בטמפרטורת החדר בblocking חיץ (1x PBST, 2% עגל בסרום [כרך / כרך], 2 מ"ג / מיליליטר BSA).
- דגירה עם עוברי דגירה נוגדן אנטי לחפור בו תמיסה של נוגדן אנטי DIG-AP (1:5,000) בחסימת מאגר הלילה בשעה 4 ° C עם תסיסה עדינה.
- SSC (ציטראט מלוחים נתרן) רוחץ
- יום 3
- רוחצת PBST הכן את צלחות שש היטב עם 4 מ"ל / היטב PBST. שטוף עוברי מודגרות על ידי העברת הסלים בצלחת שש היטב המכילה PBST 6x לתקופות של 15 דקות. ניתן לאחסן את עוברים על 4 מעלות צלזיוס ובפרוטוקול התחדש למחרת.
- Prestaining Prestain את העוברים על ידי שטיפת 2x במשך 15 דקות עם prestaining חיץ בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה לפני הדגירה בנוכחות BCIP (פוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl) וNBT (nitroblue tetrazolium). BCIP וNBT הם מצעים המשמשים לפיתוח הצבע של פעילות phosphatase אלקליין. מאז בדיקות מחוברות עם ה phosphatase אלקלייןפיתוח דואר של צבע סגול מציין את הביטוי של גן המטרה. ניתן לאחסן את עוברים על 4 מעלות צלזיוס ובפרוטוקול התחדש למחרת.
- הכתמה
- דגירה עוברים בטמפרטורת חדר בחושך עם BCIP וNBT למשך 30 דקות.
- לפקח התגובה מכתים כל 30 דקות באמצעות stereomicroscope. זמני תגובה משתנים מ15 דקות, 16 שעות תלוי ברמה של ביטוי גנים. זמני תגובה קצרים יותר לגנים הביעו מאוד ועוד לגנים חלשים לידי ביטוי. בדיקות Sense תהיה לזהות אותות אם הגן של עניין מבטא antisense משלימה (AS) תעתיקים.
- קצות לאחר עוצמת הכתמים הרצויה הושגו, לעצור את התגובה על ידי העברת סלים המכילים את העוברים לבארות המכילות להפסיק פתרון (1x PBS, pH 5.5, 1 mM EDTA, 0.1% Tween). זה ימנע פיתוח נוסף של הצבע. יש לשטוף את העוברים ל2x 10 דקות על כיסא נדנדה עם AG העדינה itation בטמפרטורת חדר.
- Postfixation
- דגירה עובר בparaformaldehyde 4% (wt / כרך) ב-PBS למשך 20 דקות.
- לשטוף את העוברים (5 דקות / לשטוף) שלוש פעמים עם PBST על מנת להסיר paraformaldehyde שיורית. אחסן את העוברים הקבועים בלהפסיק פתרון בחושך ב 4 ° C.
- הרכבה, תצפית, ורכישת תמונה
- להעביר את העוברים לצלחת שש היטב המכילה 100% גליצרול באמצעות הנפח המינימאלי האפשרי של PBS. מניחים את הצלחת שש היטב על כיסא נדנדה ועדינות להתסיס לילה בטמפרטורת חדר בחושך.
- הנח עוברים ב100% גליצרול ולאחר מכן לבחון את האות תחת stereomicroscope.
- לרכוש תמונות ולשמור כקובץ בפורמט TIFF או כל סוג אחר המאפשר ייצור של תמונות באיכות גבוהות באמצעות השימוש בתוכנת תמונה כגון פוטושופ (איורים 3-6).
- כדי להשיג כפול תיוג השיטה שתוארה לעיל מ1.1 - 1.3.1.7 משמש אך כולל דגירה בו זמני של שני בדיקות שכותרת העמסת digoxygenin ובמהלך ההכלאה.
- בצע את אותו התהליך להכלאת הודעה שוטפת כלומר שוטף SSC ו PBST (צעדים ו1.3.2.1 1.3.2.2) וחסימת incubations (צעד 1.3.2.3). לבצע תגובות נוגדנים ומכתימות ברצף כפי שיפורטו להלן.
- דגירה עם נוגדן עוברי AP מצמידים-אנטי digoxigenin (1:5,000) על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- לשטוף ודגירה עם BCIP-NBT (צעדים 1.3.3.1 1.3.3.6 -).
- בעקבות גילוי, לשטוף פעמיים עם עוברי PBST בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
- דגירה עובר על 65 מעלות צלזיוס בPBST עם 1 מ"מ EDTA למשך 30 דקות כדי להשבית את הנוגדן אנטי digoxigenin.
- דגירה עוברים ב100% מתנול ואחרי התייבשות ב75%, 50%, ו -25% מתנול שנינותשעות PBST ובחזרה לPBST במשך שעה 1.
- דגירה הלילה עם עוברי AP מצמידים העמסה (1:2,000) בחסימת המאגר על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- לשטוף עם עוברי PBST (שלב 1.3.3.1) ועוברים מראש כתם 2 פעמים למשך 15 דקות עם חיץ מראש מכתים (0.1 מ 'טריס-HCl, pH 8.2) בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה לפני הדגירה בנוכחות אדומה מהר . אפשר לעצור את הפרוטוקול וניתן לאחסן עוברים על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה והתחדש למחרת.
- להמס טבליה אחת מהירה באדום 2 מ"ל של חיץ מכתים מייד לפני השימוש.
- להתחיל את התגובה מכתימה על ידי הנחת עוברים בחיץ הצביעה עם מגיב אדום מהיר.
- לעצור את התגובה מכתימה כאשר מגיעים לעוצמת הכתמים הרצויה. זה עלול לקחת בין כמה שעות בטמפרטורת חדר ליום או יומיים לילה כאשר מכתימים ב 4 ° C. לעצור את התגובה מיידית אם עוצמת מכתים לא לפתח או מתחילה להראות שאינם ספציפיתity בהשוואה לשליטה הגיונית.
- פעל על פי נהלים שפורטו לעיל לשלבים הנותרים כלומר קיבעון הודעה, הרכבה, תצפית ורכישת תמונה (steps1.3.3.5 ו1.3.3.6).
| מגיב | נפח |
| תבנית ה-DNA | 100 ng |
| PCR חוצץ (10x) | 5 μl |
| dNTPs (10 מ"מ) | 2 μl |
| פריימרים (10 מ"מ) | 1 מיקרומטר כל אחד |
| מוסיף מים עד נפח סופי של | 49.7 μl |
| פולימראז תקי (5 יחידה / & #956; L) | 0.3 μl |
| נפח תגובה | 50 μl |
טבלת מס '1. תגובת ההגברה PCR.
טבלת 2. תגובת שיבוט TOPO.
| מגיב | נפח |
| תערובת תיוג NTP (10x) | 2 μl |
| חובב תמלולאה (10x) | 2 μl |
| מגן RNase מעכב | μl 1 |
| RNA פולימראז SP6 או | |
| RNA פולימראז T7 | 2 μl |
| נפח סופי | 20 μl |
טבלת 3. תגובת תיוג רנ"א.
1.3 Whole-Mount הכלאה באתר
"Jove_title"> 2. פעמיים אני n הכלאה באתר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הפרוטוקול עם 50 עוברים לסל (לגן / לתנאי ניסוי) דפוס הביטוי של גן שניתן להשיג בניסוי אחד. כמעט כל העוברים מראים דפוסי ביטוי דומים לגן מסוים. דוגמאות מייצגות של במכתים הכלאה באתר מוצגות איורים 3-6.
riboprobes השכל ונגד התחושה היו מסונתז מcDNAs המתאים לPC5.1, PC5.2 6, 7, 8,9 SCL/tal-1 Gata-1, FLK / kdrl 10, 11 שש, dlx2 12, fkd7 / Foxa1 13, 14,15 אינסולין, וטריפסין 16 נבנו על ידי הגברת קטע של ה-mRNA באורך מלא באמצעות DNA פולימראז תקי, ומשובטים לתוך pCRII-TOPO (Invitrogen). האותנטיות של amplicons הבודדים אושרה על ידי רצף. לאחר האימות של הנטייה השיבוט, riboprobes antisense המקביל היו מסונתזתוך שימוש בפרוטוקולים 17 עם שינויי 18,19 כפי שמתואר כאן או באמצעות SP6 או polymerases RNA T7. צעדים מעורבים בכל הר הכלאה באתר מומחשים בקצרה באיור 2. כתמים סגול נצפו לאחר הכלאה עם riboprobe עניין מייצגים גם את השפע ואת האתרים של ביטוי של גן מסוים. למשל PC5.1 מראה ביטוי מאוד דיסקרטי בחלק הקדמי והאחורי של שלפוחית otic וprimordium קו הרוחב ב24hpf והוא מאוד מקומי בתוך neuromasts קו הצד הקדמי והאחורי של 72 hpf (איור 3). בניגוד PC5.2 מופעים ביטוי בכל מקום בתוך מערכת העצבים המרכזית עם הממד האזורי ברור בתוך somites, שלפוחית otic וצינור pronephric וזוכה לביטוי בכבד ובמעי בגיל 96 hpf (איור 4). העדרו של ביטוי גנים בעת שימוש riboprobes תחושת בהתאמה משמש כביקורת שלילית. (
איור 1. הכנה ושימוש בEppendorf-ניילון סלי רשת למחזיקים מבוימים עוברים. אחד גם יכול להחזיק שישה סלי רשת Eppendorf-ניילון. התמונה מראה את הצלחות סטריליות 6 גם מכילות שישה סלי רשת Eppendorf-ניילוןמשמש לדילולים רצופים של מתנול בPBS.
איור 2. תרשים מראה מעורבים בכל ההר בטכניקת הכלאה באתרו את הצעדים. לאחר תיקון מבוים יכולים להיות מאוחסנים בעוברי מתנול ב -20 ° C עד שימוש. יכולות להיות מסונתזת בדיקות מראש ונשמרו ב -80 ° C. בדיקות אחסון בaliquots הקטנים מומלצת אם הם לשימוש לאורך תקופות ארוכות. באופן כללי כל הר בניסויי הכלאה באתרו ניתן להשלים ב 3 או 4 ימים. התגובה מכתימה לגנים חלשים לידי ביטוי תיקח עד 16 שעות בטמפרטורת חדר או יותר כאשר תגובת מכתים נעשית על 4 מעלות צלזיוס לחץ כאן לצפייה בF הגדול יותר igure.
איור 3. הביטוי של PC5.1 ידי כל ההר בניתוחי הכלאה באתר בוצע באמצעות 24 hpf ו72 hpf עוברים מבוימים. () תצוגה לרוחב של 24 עוברי hpf להראות ביטוי מאוד דיסקרטי של PC5.1 בתוך קדמי ו חלק אחורי של שלפוחית otic וprimordium קו רוחב באמצעות riboprobe antisense PC5.1. ב 72 מכתים ספציפי hpf נצפה בתוך neuromasts קו הצד הקדמי ואת אחורי. (ב) היעדרות של ביטוי גנים באמצעות תחושת riboprobe PC5.1 משמשת כביקורת שלילית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
gether.within עמודים = "תמיד"> 
איור 4. בגיל 24 ו 96 hpf כל ההר hpf בניתוחי הכלאה באתרו של PC5.2 בוצע באמצעות PC5.2 riboprobes תחושה אנטי ותחושה. (א) תצוגה לרוחב של 24 עוברי hpf להראות ביטוי בכל מקום בתוך מערכת העצבים המרכזית, somites שלפוחית otic וצינור pronephric. מכתים ספציפי בכבד ובמעיים נראה בגיל 96 hpf באמצעות riboprobe antisense PC5.2. (ב) היעדרות של ביטוי גנים באמצעות תחושת riboprobe PC5.2 משמשת כביקורת שלילית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
oad/50644/50644fig5.jpg "width =" 500px "/>
. איור 5 Whole-Mount בניתוחי הכלאה באתרו ב 24 hpf באמצעות SCL/tal-1 riboprobe הראה מכתים בתוך תאי הגולגולת בין שתי המדינות ובמסת תאי ביניים (ICM); Gata-1 מכתים riboprobe נתפס בICM; FLK ביטוי / kdrl במוח האחורי, העיקרי, וכלי מיגזריות ובICM. מכתים שלשישה נצפה בnotochord.
. איור 6 Whole-Mount בניתוחי הכלאה באתר ב34 hpf באמצעות dlx2 riboprobe חשף ביטוי של dlx2 בtelencephalon, diencephalon, ההיפותלמוס, וקשתות ectomesenchymal גולגולת; ביטוי fkd7/foxa1 ב24 hpf הוא ראה בעיקר בעמ 'הרצפהמאוחר וhypochord; מכתים אינסולין הוא ציין בלבלב האנדוקרינית וביטוי טריפסין בלבלב אקסוקרינית.
permeabilization הולם איור 7. וטמפרטורת הכלאה המתאימה הם קריטיים לאותות ברורים בכלאה באתרו. Whole-Mount בניתוחי הכלאה באתרו ב 24 hpf ו48 hpf באמצעות riboprobe ששש גילה ביטוי בתוך notochord וfloorplate ללא אות רקע, כאשר עובר הם permeabilized ידי עיכול proteinase K עבור 12-15 דקות והכלאה על 70 ° C. דפוסי ביטוי שלמים ואותות רקע גבוהים נצפו כשאת העוברים היו נתונים לעיכול בינוני (טיפול 5 דקות proteinase K) או הכלאה בטמפרטורה נמוכה (60 מעלות צלזיוס). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו שיטות משופרות כדי להמחיש RNA עם רזולוציה גבוהה. בנהלי הכלאה באתר מתבצעים באמצעות סלי מחוייט פשוטים עם תחתית נקבובית (איור 1). עוברים מעובדים פתרונות RNase ללא שימוש בצלחות 6 גם בטמפרטורת חדר בתנאים סטריליים.
סלי עוברים להפריד עשויים מצינורות Eppendorf בצבעים שונים. סלסלות עם או בלי שפה משמשות להתמצאות קלה ולזהות את העוברים בתוך הסל כמקביל לבדיקה מסוימת.
Prehybridization על 65 מעלות צלזיוס וכלאה על 70 מעלות צלזיוס עם 50% לפוראמיד deionized נמצא להיות חשוב במיוחד כדי לקבל אותות ברזולוציה גבוהות. בנוסף דוגרים עוברים פעמיים עם חיץ טריס אלקליין במשך 15 דקות שוטף PBST הודעה לאחר דגירה עם נוגדן אנטי לחפור ולפני הדגירה ובנוכחותו של BCIPNBT מקל את המראה של אותות ברורים באיכות גבוהה. בידיים שלנו שחווינו שpermeabilization ותיקון של עוברים לזמן אופטימלי וכלאה על 70 מעלות צלזיוס היו מאוד קריטיים בקבלת אותות ברורים. permeabilization לקוי מופק אותות רקע גבוהים. permeabilization המורחב או תיקון לקוי גרם להשפלה של עוברים ואילו תיקון מורחב עכבות זיהוי אות. ההכלאה בין 55-60 מעלות צלזיוס גם הפיק את אותות רקע גבוהים (איור 7).
הבדיקה התחושה תזהה אות לAS תמליל אם הגן של עניין מקודד antisense (AS) תעתיקים. לאחר התגובה מכתים היא עצר הצבת עוברים במתנול למשך 30 דקות או יותר, ממירה את האות לצבע סגול אמיתי, ומסירה את הכתמים שאינם ספציפיים. ניתן לאחסן את עוברים קבועים בחושך בלהפסיק פתרון על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
את היתרונות וdisadvantages מאחל
רצון הוא טכניקה יעילה כדי לאפיין גם את הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה במהלך embryogenesis ושלבי זחל. פרוטוקול זה גם מאפשר הדמיה של ביטוי RNA של שני גנים או שיתוף לוקליזציה של RNA וביטוי חלבון באותו הזמן באמצעות שינויים מתאימים בהתאם למטרות הניסוי. פרוטוקול ברזולוציה גבוה זה יכול לשמש כדי לזהות ביטוי RNA ברקמות רבות וסוגי תאים. זה יכול לשמש לצורך זיהוי של מיני RNA שפע נמוכים מאוד עם אותות רקע מינימאליים. עם זאת, כדי להמחיש ביטוי מדויק של הגנים בתוך תאים פנימיים של רקמות דורש הכלאה באתר באמצעות קטעי רקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
