Summary
Den zebrafisk, en lille tropisk fisk, er blevet en populær model for at studere genfunktion under hvirveldyr udvikling og sygdom. Det tidsmæssige og rumlige ekspression af målgener kan bestemmes ved
Abstract
Denne artikel fokuserer på hel-mount in situ hybridisering (WISH) i zebrafisk embryoner. Den WISH teknologi letter vurderingen af genekspression både vævsfordeling og udviklingsstadiet. Protokollerne beskrevet for brugen af WISH af zebrafisk embryoner med antisense RNA-prober mærket med digoxigenin. Prober genereres ved at inkorporere digoxigenin-linked nukleotider gennem in vitro-transkription af genet skabeloner, der er blevet klonet og lineariseret. De chorions af embryoner høstet ved definerede udviklingsstadier fjernes før inkubation med specifikke prober. Efter en vask procedure for at fjerne overskydende probe, er embryoner inkuberet med anti-digoxigenin-antistof konjugeret med alkalisk phosphatase. Ved at anvende et kromogent substrat for alkalisk phosphatase, kan specifik genekspression vurderes. Afhængig af størrelsen af genekspression hele proceduren kan afsluttes inden for 2-3 dage.
Introduction
Den zebrafisk (Danio rerio) er dukket op som en stærk dyremodel for studiet af hvirveldyr udvikling, sygdom, adfærd og in-medikamentscreeningsanalyse 1-3. Zebrafisk embryoner kan opnås i stort tal fra et enkelt passage. Befrugtning og udvikling sker ex utero og optisk klare embryoner udvikle sig hurtigt. Kritiske udviklingsmæssige hændelser forekommer i de første 48 timer efter befrugtning (HPF). Dette omfatter fremkomsten af orgel primordier og påbegyndelsen af cytodifferentiation. Knockdown eller over-ekspression af proteiner kan opnås gennem mikroinjektion af fostre med antisense morpholino (MO) oligonucleotider eller mRNA henholdsvis den ene eller to celle stadiet (0,75 HPF).
Ønsket om zebrafisk embryoner letter undersøgelse af spatio-temporale ekspression af specifikke gener af interesse. Anvendelse af WISH teknikken efter mikroinjektion af fostre med mRNA eller MO at over-udtrykess eller knockdown specifikke protein niveauer afslører differentieret regulering af andre gener.
Ændringer i genekspression mønstre kan korreleres med fænotypiske ændringer og afslører funktionen af målgener i den tidlige organogenese. Da prober kan fremstilles og lagres på forhånd, kan ISH teknik anvendes til at afsløre genekspressionsmønstre i mindst 20 gener ad gangen med seks-brønds plader og specialfremstillede kurve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Whole-mount in situ hybridisering af Zebrafisk embryoner
1.1 Forberedelse af embryoner
- Saml embryoner på de krævede udviklingsstadier. Se Kimmel et al. 5 for vorden beskrivelse.
- Fjern chorions manuelt ved hjælp pincet (Dumont Urmagere pincet no. 5).
- Lave embryoer i en 4% opløsning af paraformaldehyd (PFA), som består i PBS (phosphatbufret saltvand) natten over ved 4 ° C.
- Vask embryoer med PBS mindst 3x i 5 minutter hver ved stuetemperatur.
- Opbevar embryoner i 100% methanol (MeOH) ved -20 ° C indtil anvendt til fremtidig anvendelse af teknikker, herunder hel-mount in situ hybridisering.
- Freeze iscenesat embryoner i flydende nitrogen for RNA-ekstraktion og opbevares ved -80 ° C.
- Uddrag RNA fra iscenesat embryoner og syntetisere cDNA for PCR-opformering og efterfølgende kloning. 1.2 Syntese af digoxygenin-mærkede RNA-prober
- PCR-amplifikation og genkloning for sonde skabelon. Opsætning PCR-reaktion med en samlet volumen på 50 pi som vist i tabel 1.. Bruge mere genomisk DNA eller mindre cDNA i PCR-reaktionen som template. Omfatte 10 min forlængelse tid ved 72 ° C efter den sidste cyklus for at sikre, at PCR reaktionen er fuld længde og 3 'adenyleret for at lette TOPO kloning.
- Verificere størrelsen af PCR-produktet ved hjælp af agarosegelelektroforese. Den anslåede størrelse af PCR-produktet til probesyntese er tæt på 1 kb.
- Vær særlig opmærksom på at undgå nuklease forurening ved at udføre eksperimentet under sterile forhold og bruge nukleasefrit vand. I tilfælde af at flere produkter bliver overholdt, gel rense passende størrelse PCR-produkt før man går videre med kloning ved hjælp af TOPO TA Cloning Kit. Optimere PCR-reaktionen at eliminere forekomsten af udtværing og multiple bånd.
- Udfør TOPO kloning reaktion som anført i tabel 2.. Kombiner TOPO Vector og PCR-produkt og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Inkorporere / indføre TOPO kloning produktet i en skud kompetente celler. Thans proces kaldes transformation.
- Inkuber de transformerede celler ved 37 ° C i mindst 1 time ved 260 rpm for at sikre ekspressionen af de antibiotiske resistensgener. Plade omdannelsen mix (50-100 ul) på forvarmet Luria Bertani (LB) agarplader indeholdende 50 ug / ml ampicillin og X-gal. Inkuber ved 37 ° C natten over.
- Bestemme tilstedeværelsen af insertet baseret på udseende af hvide eller lyseblå kolonier. TOPO vektor indeholder lacZ-genet, som koder for β-galactosidase. I nærvær af X-gal, danner produktionen af β-galactosidase blå farve. DNA ligeret ind i plasmidet forstyrrer dannelsen af funktionelle β-galactosidase og hvide kolonier produceres. Hvide kolonier eller lyseblå kolonier bekræfte tilstedeværelsen af indsatsen.
- Pluk de hvide kolonier fra agarplade med sterile pipettespidser og placere dem i den sterile 10 ml rør indeholdende 4 ml LB medier og kultur ved 37 ° C i ryster INCUBAtor natten over ved 200 rpm.
- Oprense plasmid-DNA ved hjælp af plasmid-DNA Kit ifølge producentens instruktion.
- Linearisere cDNA følgende plasmidoprensning ved fordøjelse 5 ug af cDNA for hver probe med det passende restriktionsenzym, der har et unikt lokaliseret 3 '(for sense prober) eller 5' (for antisense prober) til indsatsen.
- Rense lineariserede DNA under anvendelse af phenol / chloroform-ekstraktion metode. Tilføj lige volumen phenol / chloroform, toppunkt kraftigt i 30 sekunder, centrifugering i 3 minutter ved 13.000 rpm ved 4 ° C. Overfør øvre vandige fase i rent glas og tilføje lige så stort volumen chloroform. Spin i 3 min ved 13.000 rpm ved 4 ° C. Overfør øvre vandige fase i rent glas. Tilsæt 10% natriumacetat (3 M) og 2,5 x volumen af 100% ethanol til udfældning DNA og opbevares ved -20 ° C natten over. Spin i 15 min ved 13.000 rpm ved 4 ° C. Fjernelse af ethanol og vaskes pelleten med 75% ethanol. Protokollen kan stoppes, og DNA kan stORed ved -20 ° C og genoptaget næste dag. Spin i 10 min ved 10.000 rpm ved 4 ° C. Fjern supernatanten omhyggeligt og tørre pelleten i 2 minutter ved stuetemperatur. Pellet resuspenderes i 10 pi DEPC behandlet vand og inkuberes ved 55 ° C i 20 min. Kvantificere DNA-koncentration ved hjælp af UV-spektrofotometer.
- Vurdere renheden ved agarosegelelektroforese ved anvendelse af 1 ul af DNA på 1% agarosegel og kørt i omkring 30 min.
- Opsæt RNA mærkning reaktion. Brug af en RNase fri reaktionshætteglas, 1-5 ug oprenset template-DNA tilføje til steril, RNase-fri, DEPC-behandlet, dobbelt destilleret vand til et volumen på 13 ul. Chill reaktionen hætteglasset på is og tilsæt følgende reagenser (se tabel 3):
- Reagenset blandes forsigtigt derefter indsamle nederst ved kort centrifugering ved 2.000 rpm i 30 sekunder ved stuetemperatur og inkuberes reaktionsblandingen i 2 timer ved 37 ° C.
- Fjern template-DNA ved tilsætning af 2 pi RNase-frit DNase I. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og standser reaktionen ved tilsætning af 2 pi 0,2 M EDTA (pH 8,0).
- Udfælde reaktionsprodukterne ved tilsætning af 2,5 pi 4 M LiCI og 75 pi 100% ethanol. Bland opløsningen og holde ved -20 ° C i 45 min or opbevaret ved -20 ° C natten over og protokollen genoptaget næste dag.
- Centrifugeres suspensionen i 30 minutter ved 13.000 rpm ved 4 ° C, derefter vaskes bundfaldet med 500 pi 70% ethanol opbevaret ved -20 ° C, centrifugeres i yderligere 10 minutter, tør i 2 min, og resuspender i 50 ul og inkuber efter 30 min ved 37 ° C.
- Kontroller sonden kvalitet og integritet ved at køre 1-2 ml på 1% agarosegel i omkring 30 min. Dette bekræftes af tilstedeværelsen af enkelt produkt kører på den forventede størrelse på gelen.
- Kvantificere koncentrationen af sonden ved at måle mængden af RNA ved hjælp af spektrofotometer. Udbyttet fra denne reaktion er omkring 10 ug af RNA (100-200 ng / ul).
- DAG 1
- Rehydrering
- Forbered kurve med nylonnet (mindre end 1 mm porestørrelse) og Eppendorf-rør. Konstruér kurvene ved cutting Eppendorf rør (1,5 ml) for at fjerne de koniske ender. At identificere de enkelte kurve bruger forskellige farvede rør og fjerne det øverste fælge fra halvdelen af dem.
- Skære små stykker nylonnet at dække de afskårne ender af Eppendorf-rør. Stick afskårne ender af rørene til den nylonnet ved opvarmning på en elektrisk varmeplade (indstillet mellem medium til høj) i et stinkskab. Når afkølet fjerne overskydende nylonnet fra kurvene og gemme dem i 100% methanol ved stuetemperatur.
- Forbered successive fortyndinger af methanol i PBS (75% [vol / vol [methanol, 50% [vol / vol] methanol og 25% [vol / vol] methanol) ved hjælp af de første tre brønde i de seks-brønds plader efterfulgt af 100% PBST (fosfatbufferet salt med 0,1% Tween-20) i de næste tre brønde.
- Subject embryoner til in situ hybridisering procedure ved hjælp af de specialfremstillede kurve som vist i Figurea 1a og b. Brug RNase-fri løsninger op til hybridization skridt i 6-brønds plader (4 ml / hul). For at opnå dette, placere op til 6 kurve i den første brønd. Placer kurv med rim først, efterfulgt af kurvene uden fælge i forskellige farver arrangeret efter hinanden. Brug af denne ordning op til 6 genekspressionsmønstre kan bestemmes samtidigt.
- Placer dehydrerede embryoner af samme udviklingsstadiet til samme kurven (se figur 1).
- Rehydrate embryoner ved at flytte kurve fra én brønd i de seks-brønds plade til den næste (5 min for hvert trin). Bruge seks brønde fyldt med passende buffer. Embryoner underkastes hver fortynding gang. På denne måde embryoner vaskes 6x, 5 min / vask. Rehydrering af dehydrerede embryoer opnås ved at erstatte methanol med PBS og derefter ved at vaske 3 x med 100% PBST.
- Permeabilisering Digest de rehydrerede embryoner med proteinase K (10 ug / ml) ved stuetemperatur for at gøre dem permeable som vist i tabel 4
Embryonale Stage (timer efter befrugtning) Fordøjelse Periode (proteinase K) Op til 6 15 sek 6-12 30 sek 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min Tabel 4.. Permeabilisering reaktion.
- Postfiksering og PBST Vasker
- Fix embryoner ved inkubation i 4% paraformaldehyd (vægt / vol) i 1x PBS i 20 min.
- Fjern resterende paraformaldehyd ved at vaske embryoner 3x, 5 min / vask i 1x PBST.
- Acetylering Forbered acetylering blanding (125 pi triethanolamin og 27 pi eddikesyreanhydrid i 10 ml ddH2O) og inkuber embryoner to gange i 10 min hver. For at minimere endogene fosfataseaktivitet forberede acetylation blandingen frisk, når det kræves. For at fjerne overskydende reagens vaskes embryoner to gange i PBST (10 min / vask)
- Præhybridisering Prehybridize embryoner ved at overføre embryoner fra kurve til 1,5 ml sterile Eppendorf-rør og inkubering med 200 ul hybridiseringsblanding for 2-4 hr i en 70 ° C vandbad.
- Preadsorption af antistof Fjern omkring 50 fostre fra kurvene og overføre dem til et 1,5 ml sterile Eppendorf-rør. Inkuber med anti-DIG-AP (1:500) antistof under anvendelse blokerende buffer (1x PBST 2% kalveserum [vol / vol], 2 mg / ml bovint serumalbumin [BSA]) ved stuetemperatur i 2-4 timer, og derefter opbevares ved 4 ° C natten over. Fjern fra inkubatoren i morgen end tillade embryoner til at nå stuetemperatur.
- Hybridisering Tilføj 100-200 ng probe til de præhybridiseres embryoner og inkuberes natten over ved 70 ° C i vandbad.
- Rehydrering
- DAG 2
- SSC (Saline-natriumcitrat) Vasker
- Place 50 ml rør af hybridiseringsblandingen (HM), 2x SSC og 0,2 X SSC i et bæger med vand i et 70 ° C vandbad og forvarm dem i mindst 20 min. Fjern hybridisering reaktionsblandingen indeholdende proben, tilsættes 1 ml forvarmet hybridiseringsblanding til rørene og inkuberes i 15 min ved 70 ° C. Fyld seks-brønds plader med forskellige fortyndinger af forvarmet HM i 2x SSC ved at erstatte 100% HM gennem 50% til 25% HM at fjerne overskydende reagenser.
- Mens vi venter, fylde seks-brønds plader med 2x SSC for vaske og holde dem ved 70 ° C.
- Efter 15 min sted embryoner fra tube til kurvene opbevares i seks brønde fyldt med fortyndings HM med 2x SSC og vaske hybridiserede embryoner ved at flytte kurven fra en brønd til den næste (15 min hver i en 70 ° C vandbad). Vask embryoner 2x, 15 min / vask, i 100% 2x SSC ved 70 ° C.
- Sæt et andet vandbad ved 65 ° C. Fyld seks-brønds plader med 0,2 X SSC i høj stringens vasker at undgå uspecifik hybridisering af udskrift med proben.
- Efter embryonerne vasket to gange med 2 x SSC ved 70 ° C, følger yderligere to 30 minutters vaske i 0,2 X SSC ved 65 ° C.
- PBST Vasker Forbered seks-brønds plader med successive fortyndinger af 0,2 X SSC i PBST som følger: 75% (vol / vol) 0,2 X SSC, 50% (vol / vol) 0,2 X SSC, 25% (vol / vol) 0,2 x SSC, og de resterende to-brønde med 100% PBST. Vask de hybridiserede embryoner ved at bevæge kurven fra en brønd til den næste (5 min for hvert trin ved stuetemperatur under anvendelse af en rocker).
- Præinkubationsmetoden Preincubate embryoner til 3-4 timer ved stuetemperatur i blocking buffer (1x PBST 2% kalveserum [vol / vol], 2 mg / ml BSA).
- Inkubering med anti-DIG antistof inkuberes embryoner med en opløsning af anti-DIG-AP-antistof (1:5000) i blokerende buffer natten over ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
- SSC (Saline-natriumcitrat) Vasker
- DAG 3
- PBST Vasker Forbered seks-brønds plader med 4 ml / brønd PBST. Vask rugede embryoner ved at flytte kurvene i de seks-brønds plade indeholdende PBST 6x i perioder på 15 minutter. Embryoner kan opbevares ved 4 ° C, og protokollen genoptaget næste dag.
- Prestaining Prestain embryoner ved vask 2x i 15 minutter med prestaining buffer ved stuetemperatur med forsigtig omrøring før inkubering i nærvær af BCIP (5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat) og NBT (nitroblåt tetrazolium). BCIP og NBT er de anvendte substrater til farveudvikling af alkalisk phosphatase-aktivitet. Da prober fastgjort med alkalisk phosphatase the udvikling af lilla farve indikerer ekspressionen af målgenet. Embryoner kan opbevares ved 4 ° C, og protokollen genoptaget næste dag.
- Farvning
- Inkuber embryoer ved stuetemperatur i mørke med BCIP og NBT i 30 min.
- Overvåg farvningsreaktionen hver 30 min ved hjælp af et stereomikroskop. Reaktionstider varierer fra 15 min-16 timer afhængig af niveauet af genekspression. Reaktionstider er kortere for højt udtrykte gener og længere tid for svagt udtrykte gener. Sense prober vil opfange signaler, hvis genet af interesse udtrykker komplementær antisense (AS) udskrifter.
- Stop reaktion efter den ønskede farvningsintensitet er nået, standses reaktionen ved at overføre kurve indeholdende embryoner til brønde indeholdende stopopløsning (1x PBS, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween). Dette vil undgå yderligere udvikling af farve. Skyl embryoner til 10 min 2x på en rocker med blide aggrænsning ved stuetemperatur.
- Postfiksering
- Inkuber embryoner i paraformaldehyd 4% (vægt / volumen) i PBS i 20 min.
- Vask embryonerne (5 min / vask) tre gange med PBST med henblik på at fjerne resterende paraformaldehyd. Opbevar de faste embryoner i stop-løsning i mørke ved 4 ° C.
- Montering, Observation og Image Acquisition
- Overfør embryoner til en seks-brønds plade indeholdende 100% glycerol med den mindst mulige volumen PBS. Placer seks-brønds plade på en rocker og ryst forsigtigt natten over ved stuetemperatur i mørke.
- Placer embryoner i 100% glycerol og derefter observere signal under et stereomikroskop.
- Anskaf billeder og gem som Tiff filformat eller enhver anden type, der tillader produktion af høj kvalitet billeder ved hjælp af billedet software som Photoshop (figur 3-6).
- For at opnå dobbelt mærkning den ovenfor beskrevne metode fra 1,1 - 1.3.1.7 anvendes men omfatter samtidig inkubation af både digoxygenin og fluorescein mærkede prober under hybridisering.
- Følg samme procedure til post hybridisering vasker nemlig SSC og PBST vask (trin 1.3.2.1 og 1.3.2.2), og blokering inkuberinger (trin 1.3.2.3). Udfør antistof og farvning reaktioner sekventielt som beskrevet nedenfor.
- Inkuber embryoner med AP-koblet anti-digoxigenin antistof (1:5000) ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
- Vask og inkuberes med BCIP-NBT (trin 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
- Efter detektion, embryoner vaskes to gange med PBST ved stuetemperatur i 20 min.
- Inkuber embryoer ved 65 ° C i PBST med 1 mM EDTA i 30 minutter for at inaktivere anti-digoxigenin antistof.
- Inkuber embryoner i 100% methanol efterfulgt af rehydrering i 75%, 50% og 25% methanol with PBST og tilbage til PBST i 1 time.
- Inkuber embryoer natten med AP-koblet fluorescein (1:2.000) i blokerende buffer ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
- Vask embryoner med PBST (trin 1.3.3.1) og præ-pletten embryoner 2 gange i 15 minutter med præ-farvning puffer (0,1 M Tris-HCI, pH 8,2) ved stuetemperatur med forsigtig omrøring før inkubering i nærvær af hurtig rød . Protokol kan stoppes og embryoner kan opbevares ved 4 ° C med forsigtig omrøring og genoptaget næste dag.
- Opløs en Fast Red tablet i 2 ml farvningsbuffer umiddelbart før brug.
- Start farvning reaktionen ved at placere embryoner i farvningsbuffer med Fast Red reagens.
- Stop farvning reaktion, når den ønskede farvningsintensitet er nået. Det kan tage fra nogle få timer ved stuetemperatur til en eller to dage natten når farvning ved 4 ° C. Stands reaktionen straks, hvis farvningsintensiteten ikke videreudvikle eller begynder at vise ikke-specifikity sammenlignet med den forstand kontrol.
- Følg procedurerne ovenfor for de resterende trin, nemlig stillingen fiksering, montering, observation og image erhvervelse (steps1.3.3.5 og 1.3.3.6).
| Reagens | Volumen |
| Template-DNA | 100 ng |
| PCR-buffer (10x) | 5 pi |
| dNTP'er (10 mM) | 2 pi |
| Primere (10 mM) | 1 uM hver |
| Tilsæt vand til et slutvolumen | 49,7 pi |
| Taq Polymerase (5 enhed / & #956; l) | 0,3 gl |
| Reaktion bind | 50 pi |
Tabel 1.. PCR amplifikationsreaktion.
Tabel 2.. TOPO kloning reaktion.
| Reagens | Volumen |
| NTP mærkning blanding (10x) | 2 pi |
| Transskription buffis (10x) | 2 pi |
| Protector RNase-inhibitor | 1 pi |
| RNA-polymerase SP6 eller | |
| RNA-polymerase T7 | 2 pi |
| Slutvolumen | 20 pi |
Tabel 3. RNA mærkning reaktion.
1.3 Whole-mount in situ hybridisering
I n situ hybridisering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af protokol med 50 embryoner pr kurven (per gen / per eksperimentel betingelse) udtryk mønster af dette gen kan opnås et eksperiment. Næsten alle de embryoner viser lignende ekspressionsmønstre for et bestemt gen. Repræsentative eksempler på in situ hybridisering farvning er vist i figur 3-6.
Både fornuft og anti-sense riboprober blev syntetiseret fra cDNA'erne svarende til PC5.1, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, FLK / kdrl 10, shh 11 dlx2 12, fkd7 / foxa1 13, har insulin 14,15, og trypsin 16 blevet konstrueret ved amplificering af et segment af den fuldlængde-mRNA ved anvendelse af Taq-DNA-polymerase og klonet ind i pCRII-TOPO (Invitrogen). Ægtheden af individuelle amplikoner blev bekræftet ved sekventering. Efter kontrol af klon orientering, blev tilsvarende antisense riboprober syntetiseretanvendelse af de protokoller 17 med modifikationer 18,19 som beskrevet her ved hjælp af enten Sp6 eller T7 RNA-polymeraser. Trin involveret i hel-mount in situ hybridisering er illustreret kortvarigt i figur 2. Purple farvning observeret efter hybridisering med riboprobe af interesse repræsenterer både den overflod og de steder udtryksformer særligt gen. For eksempel PC5.1 viser meget diskrete udtryk i den forreste og bageste del af otisk vesikel og laterale linie primordium på 24hpf og er stærkt lokaliseret i de anteriore og posteriore laterale line neuromasts ved 72 HPF (figur 3). I modsætning PC5.2 viser allestedsnærværende ekspression i CNS med tydelig regionalisering inden somitter, otiske vesikel og pronephric kanal og er overudtrykt i leveren og tarmen ved 96 HPF (figur 4). Fravær af genekspression ved anvendelse af respektive sense riboprober tjener som en negativ kontrol. (
Figur 1. Fremstilling og anvendelse af Eppendorf-nylon mesh kurve til at holde iscenesat embryoner. Et godt kan holde seks Eppendorf-nylon mesh kurve. Billedet viser 6 brønde sterile plader indeholdende seks Eppendorf-nylon trådkurveanvendes til successive fortyndinger af methanol i PBS.
Figur 2. Diagram, der viser de trin, der er involveret i hele-mount in situ hybridisering teknik. Efter fastsættelse iscenesat embryoner kan opbevares i methanol ved -20 ° C indtil anvendelse. Prober kan syntetiseres på forhånd og opbevares ved -80 ° C. Lagring prober i små prøver er tilrådeligt, hvis de skal bruges over lange perioder. Generelt hel-mount in situ hybridisering eksperimenter kan være afsluttet i 3 eller 4 dage. Den farvning reaktion for svagt udtrykte gener vil tage op til 16 timer ved stuetemperatur eller længere, når farvningsreaktionen foretages ved 4 ° C Klik her for at se større fIGUR.
Figur 3.. Ekspressionen af PC5.1 af hel-mount in situ hybridisering analyser blev udført under anvendelse af 24 HPF og 72 HPF iscenesat embryoner. (A) set fra siden 24 HPF embryoer viser meget diskrete ekspression af PC5.1 inden den forreste og bageste del af den otiske vesikel og sidelinje primordium hjælp PC5.1 antisense riboprobe. Ved 72 HPF specifik farvning blev observeret inden for de forreste og bageste sidelinje neuromasts. (B) Manglende genekspression hjælp PC5.1 fornuft riboprobe tjener som en negativ kontrol. Klik her for at se større figur .
gether.within-page = "altid"> 
Figur 4.. Ved 24 hpf og 96 hpf hel-mount in situ hybridisering analyser af PC5.2 blev udført ved hjælp af PC5.2 anti-fornuft og fornuft riboprober. (A) set fra siden 24 HPF embryoer viser allestedsnærværende ekspression i CNS, somitter otisk vesikel og pronephric kanal. Specifik farvning i leveren og tarmen ses ved 96 HPF hjælp PC5.2 antisense riboprobe. (B) Manglende genekspression hjælp PC5.2 fornuft riboprobe tjener som en negativ kontrol. Klik her for at se større figur .
oad/50644/50644fig5.jpg "width =" 500px "/>
. Figur 5 Whole-mount in situ hybridisering analyser ved 24 HPF hjælp SCL/tal-1 riboprobe viste farvning inden for de bilaterale craniale celler og i den mellemliggende cellemasse (ICM), gata-1 riboprobe farvning ses i ICM, den FLK / kdrl udtryk i baghjernen, vigtigste og intersegmental skibe, og i ICM. Den farvning for shh blev observeret i rygstrengen.
. Figur 6 Whole-mount in situ hybridisering analyser ved 34 HPF hjælp dlx2 riboprobe afslørede udtryk dlx2 i telencephalon, diencephalon, hypothalamus og kraniel ectomesenchymal buer, den fkd7/foxa1 udtryk ved 24 HPF ses primært i gulvet psent og hypochord, insulin farvning er observeret i det endokrine pancreas og trypsin udtryk i eksokrine pancreas.
Figur 7.. Tilstrækkelig permeabilisering og passende hybridiseringstemperatur er afgørende for klare in situ hybridisering signaler. Whole-mount in situ hybridisering analyser ved 24 HPF og 48 hpf hjælp af en shh riboprobe afslørede udtryk i notochord og gulvpladen uden baggrund signal, når embryoner permeabiliseres af proteinase K fordøjelse i 12-15 minutter og hybridiseret ved 70 ° C. Ufuldstændige ekspressionsmønstre og høje baggrund signaler blev observeret, når embryonerne blev underkastet utilstrækkelig fordøjelse (5 min proteinase K-behandling) eller hybridiseret ved lav temperatur (60 ° C). Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet forbedrede metoder til at visualisere RNA med høj opløsning. Den in situ hybridisering procedurer gennemføres ved hjælp af simple skræddersyede kurve med porøse bunde (Figur 1). Embryoer behandlet ved hjælp af RNase-fri løsninger i plader med 6 brønde ved stuetemperatur under sterile betingelser.
At adskille embryoner kurve er fremstillet af forskellige farvede Eppendorf-rør. Kurve med eller uden en fælg bruges til nem orientering og til at identificere de embryoner i kurven som svarende til en bestemt probe.
Præhybridisering ved 65 ° C og hybridisering ved 70 ° C med 50% deioniseret formamid blev fundet at være særlig vigtigt at opnå høj opløsning signaler. Derudover inkubere embryoner to gange med alkalisk Tris-buffer i 15 min efter PBST vasker efter inkubation med anti-DIG-antistof og før inkubering i nærvær af BCIP ogNBT letter fremkomsten af høj kvalitet klare signaler. I vores hænder vi oplevede at permeabiliseringen og fastsættelse af embryoer til det optimale tidspunkt og hybridisering ved 70 ° C var meget kritisk at opnå klare signaler. Utilstrækkelig permeabilisering producerede høje baggrund signaler. Udvidet permeabilisering eller utilstrækkelig fastsættelse resulterede i nedbrydningen af embryoner hvorimod forlænget fastsættelse hæmmede signaldetektion. Hybridisering mellem 55-60 ° C også produceret høje baggrund signaler (figur 7).
Sense-sonden vil detektere et signal til AS transkriptet hvis genet af interesse koder for antisense (AS) udskrifter. Efter farvningen reaktionen stoppes placere embryoner i methanol i 30 min eller længere konverterer signalet til en ægte lilla farve, og fjerner ikke-specifik farvning. Faste embryoner kan opbevares i mørke i stop-opløsning ved 4 ° C i adskillige måneder.
Fordelene og disadvantages af ØNSKE
Ønske er en effektiv teknik til at karakterisere både den tidsmæssige og rumlige udtryk for target gener under embryogenese og larvestadier. Denne protokol tillader også visualisering af RNA-ekspression af to gener eller co-lokalisering af RNA og proteinekspression på samme tid ved hjælp af passende modifikationer afhængig af det eksperimentelle mål. Denne høje opløsning protokol kan anvendes til at detektere RNA-ekspression i mange væv og celletyper. Det kan bruges til påvisning af meget lave rigelige RNA-species med minimale baggrund signaler. Men for at visualisere nøjagtig ekspression af gener i indvendige rum af væv kræver in situ hybridisering ved hjælp af vævssnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
