Summary
De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden bepaald
Abstract
Dit artikel richt zich op de hele-mount in situ hybridisatie (WISH) van zebravis embryo's. De WISH-technologie vergemakkelijkt de beoordeling van genexpressie, zowel in termen van weefsel distributie en het ontwikkelingsstadium. Protocollen worden beschreven voor het gebruik van WISH van zebravis embryo's met behulp van antisense-RNA-probes gelabeld met digoxigenine. Probes worden gegenereerd door het opnemen van digoxigenine gekoppelde nucleotiden door in vitro transcriptie van genen sjablonen die gekloond zijn en gelineariseerd. De chorions van geoogst op bepaalde ontwikkelingsstadia embryo's worden vóór incubatie met specifieke probes verwijderd. Na een wassen procedure om de overmaat probe te verwijderen, worden embryo geïncubeerd met anti-digoxigenine antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase. Door toepassing van een chromogeen substraat voor alkalische fosfatase, kan genexpressie worden bepaald. Afhankelijk van het niveau van genexpressie de gehele procedure kan worden voltooid binnen 2-3 dagen.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) heeft zich ontpopt als een krachtige diermodel voor de studie van gewervelde ontwikkeling, ziekte, gedrag, en in-drug screening 1-3. Zebravis embryo's worden verkregen in grote aantallen uit een kruising. Bevruchting en ontwikkeling plaatsvindt ex utero en het optisch heldere embryo's ontwikkelen zich snel. Kritische ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen zich voordoen tijdens de eerste 48 uur na de bevruchting (HPF). Dit omvat het voorkomen van orgaan primordia en de start van cytodifferentiation. Knockdown of over-expressie van eiwitten kan worden bereikt door micro-injectie van embryo's met antisense morfolino (MO) oligonucleotiden of mRNA respectievelijk de cel stadium een of twee (0.75 HPF).
De wens van zebravis embryo's vergemakkelijkt de studie van de spatio-temporele expressie van specifieke genen van belang. Toepassing van de WISH techniek na micro-injectie van embryo's met mRNA of MO tot over-express of knockdown specifiek eiwit niveaus onthult differentiële regulatie van andere genen.
Veranderingen in genexpressie patronen kunnen worden gecorreleerd met fenotypische veranderingen en onthullen de functie van doelwitgenen tijdens vroege organogenese. Aangezien probes kunnen worden bereid en van tevoren, kan de ISH techniek toegepast op genexpressiepatronen onthullen ten minste 20 genen tegelijk met zes putjes en op maat gemaakte manden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whole-mount in situ hybridisatie van zebravis embryo's
1.1 Voorbereiding van de embryo's
- Verzamel embryo's in de gewenste ontwikkelingsstadia. Zie Kimmel et al.. 5 voor embryonaal stadium beschrijving.
- Verwijder chorions handmatig met behulp van een pincet (Dumont Horlogemakers Pincet geen. 5).
- Fix embryo in een 4% oplossing van paraformaldehyde (PFA) bereid in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) gedurende een nacht bij 4 ° C.
- Wassen met PBS embryo tenminste 3x gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur.
- WINKEL embryo in 100% methanol (MeOH) bij -20 ° C tot ze werden gebruikt voor toekomstige toepassing van technieken waaronder hele-mount in situ hybridisatie.
- Freeze opgevoerd embryo in vloeibare stikstof voor RNA extractie en bewaar bij -80 ° C.
- Extraheren van RNA opgevoerd embryo en synthetiseren cDNA voor PCR-amplificatie en daaropvolgende klonering. 1.2 Synthese van digoxigenine-gelabelde RNA probes
- PCR-amplificatie en genklonering voor sonde template. Setup PCR reactie met totaal volume van 50 pl zoals getoond in Tabel 1. Met meer genomisch DNA of cDNA minder in de PCR-reactie als matrijs. Onder 10 min verlengingstijd bij 72 ° C na de laatste cyclus om te controleren of de PCR-reactieproducten zijn volle lengte en 3'geadenyleerd om TOPO klonering.
- Controleer de grootte van het PCR product met agarose gelelektroforese. De geschatte grootte van het PCR-product van probe synthese bijna 1 kb.
- Wees extra voorzichtig met nuclease besmetting te voorkomen door het uitvoeren van het experiment onder steriele omstandigheden en het gebruik van nuclease gratis water. Indien meerdere producten worden waargenomen, gel-zuiveren geschikte grootte PCR product alvorens klonen met de TOPO TA Cloning Kit. Optimaliseren van de PCR reactie om het uiterlijk van uitsmeren en meerdere banden elimineren.
- Voer de TOPO klonering reactie zoals aangegeven in tabel 2. Combineer TOPO vector en PCR product en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Nemen / te introduceren het TOPO klonering product in een schot competente cellen. TZijn proces heet transformatie.
- Incubeer de getransformeerde cellen bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur bij 260 rpm om de expressie van het antibioticum resistentiegenen waarborgen. Plaat de transformatie mix (50-100 ul) op vooraf verwarmd Luria Bertani (LB) agarplaten die 50 ug / ml ampicilline en X-gal. Incubeer bij 37 ° C geïncubeerd.
- Bepaal de aanwezigheid van de insert op basis van het uiterlijk van wit of lichtblauw kolonies. De TOPO vector bevat lacZ gen dat β-galactosidase codeert. In aanwezigheid van X-gal, productie van β-galactosidase vormt blauwe kleur. DNA geligeerd in het plasmide verstoort de vorming van functionele β-galactosidase en witte kolonies geproduceerd. Witte kolonies of lichtblauw kolonies bevestigen de aanwezigheid van het insert.
- Kies de witte kolonies van de agar plaat met steriele pipet tips en plaats ze in de steriele ml buis 10 met 4 ml LB media en cultuur bij 37 ° C in het schudden incubatietor s nachts bij 200 rpm.
- Zuiveren plasmide-DNA met plasmide-DNA kit volgens instructies van de fabrikant.
- Lineariseren cDNA volgende plasmidezuivering door digestie 5 ug van cDNA voor elke probe met het geschikte restrictie-enzym dat een unieke plaats gelokaliseerd 3 '(voor sense probes) of 5 "(voor antisense probes) het inzetstuk.
- Zuiver het gelineariseerde DNA met fenol / chloroform extractie methode. Voeg gelijk volume fenol / chloroform, vertex krachtig gedurende 30 seconden, centrifugeren gedurende 3 min bij 13.000 rpm bij 4 ° C. De bovenste waterige fase in schone buis en voeg gelijk volume van chloroform. Draai gedurende 3 minuten bij 13.000 rpm bij 4 ° C. De bovenste waterige fase in schone buis. Voeg 10% natriumacetaat (3 M) en 2,5 x volume 100% ethanol precipitaat DNA en bewaar bij -20 ° C overnacht. Draai gedurende 15 minuten bij 13.000 rpm bij 4 ° C. Verwijder de ethanol en was het pellet met 75% ethanol. Het protocol kan worden gestopt en DNA kunnen worden sTORed bij -20 ° C en de volgende dag hervat. Draai gedurende 10 minuten bij 10.000 rpm bij 4 ° C. Verwijder het supernatant voorzichtig en droog de pellet gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 10 pl DEPC behandeld water en incubeer bij 55 ° C gedurende 20 minuten. Kwantificeren DNA-concentratie met behulp van de UV-spectrofotometer.
- Beoordeel de zuiverheid agarose gelelektroforese met 1 pl DNA op 1% agarose gel en actief gedurende ongeveer 30 minuten.
- Opgezet RNA labelingsreactie. Met behulp van een RNase vrij reactiebuis, voeg 1,5 ug gezuiverd template DNA steriel, RNase-free, DEPC-behandeld, dubbel gedestilleerd water tot een volume van 13 pl. Chill de reactieflacon op ijs en voeg de volgende reagentia (zie tabel 3):
- Meng het reagens voorzichtig vang onderaan door korte centrifugatie bij 2000 rpm gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur geïncubeerd en het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Verwijder de mal DNA door toevoeging van 2 ul RNase-free DNase I. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en stop de reactie door toevoeging van 2 pi 0,2 M EDTA (pH 8,0).
- Neerslaan van de reactieproducten door toevoeging van 2,5 pi 4 M LiCl en 75 pi 100% ethanol. Meng de oplossing en bewaar bij -20 ° C gedurende 45 min or bewaard bij -20 ° C gedurende de nacht en het protocol hervat de volgende dag.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 30 min bij 13.000 rpm bij 4 ° C, dan was het pellet met 500 ul 70% ethanol bij -20 ° C, centrifugeer gedurende 10 min, 2 min drogen en resuspendeer in 50 pl en incubeer 30 min bij 37 ° C.
- Controleer de probe kwaliteit en integriteit van actief 1-2 ml op 1% agarose gel gedurende 30 minuten. Dit wordt bevestigd door de aanwezigheid van enkel product draait op de verwachte grootte op de gel.
- Kwantificeer de concentratie van de probe door het meten van de hoeveelheid RNA gebruikt spectrofotometer. De opbrengst van deze reactie is ongeveer 10 ug RNA (100-200 ng / ul).
- DAG 1
- Rehydratie
- Bereid korf voor nylon (minder dan 1 mm poriegrootte) en Eppendorf buizen. Construeren de manden door cutting Eppendorf buisjes (1,5 ml) aan de conische uiteinden verwijderen. Om de identiteit van afzonderlijke manden maken gebruik van verschillende gekleurde buizen en verwijder de bovenste randen van de helft van hen.
- Knip kleine stukjes nylon aan de afgesneden einden van de Eppendorf buizen te dekken. Plak de afgesneden uiteinden van de buizen aan de nylon door het verwarmen ze op een elektrische kookplaat (ingesteld tussen medium tot hoog) in een zuurkast. Eenmaal afgekoeld verwijder de overtollige nylon uit de manden en bewaar ze in 100% methanol bij kamertemperatuur.
- Bereid door verdunning van de methanol in PBS (75% [volume / volume [methanol, 50% [volume / volume] methanol en 25% [v / v] methanol) met behulp van de eerste drie putjes van de zes-well platen, gevolgd door 100% PBST (fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween-20) in de komende drie putjes.
- Onder voorbehoud embryo's in situ hybridisatie de procedure met behulp van de op maat gemaakte manden, zoals aangegeven in Figurea 1a en b. Gebruik RNase-free oplossingen tot de hybridisatietie stap in 6-well platen (4 ml / putje). Om dit te bereiken, plaatst u tot 6 manden in het eerste putje. Plaats mand met rand eerst, gevolgd door manden zonder velgen in verschillende kleuren achter elkaar geregeld. Met deze opstelling tot 6 genexpressiepatronen kunnen gelijktijdig worden bepaald.
- Plaats gedroogde embryo's van hetzelfde ontwikkelingsstadium van dezelfde korf (zie figuur 1).
- Hydrateren embryo door het bewegen manden van een putje in de zes-well plaat de volgende (5 minuten voor elke stap). Gebruik zes putten gevuld met geschikte buffer. Embryo's worden eenmaal onderworpen aan elke verdunning. Op deze manier embryo's worden gewassen 6x, 5 min / wasbeurt. Rehydratatie van gedroogde embryo wordt gerealiseerd door vervanging van methanol met PBS en vervolgens 3x wassen met 100% PBST.
- Permeabilisatie Digest gerehydrateerd embryo's met proteinase K (10 ug / ml) bij kamertemperatuur voorkomen dat ze doorlaatbaar zoals getoond in tabel 4
Embryonale stadium (uren na de bevruchting) Spijsvertering Periode (Proteinase K) Tot 6 15 sec 6-12 30 sec 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min Tabel 4. Permeabilisatie reactie.
- Postfixatie en PBST Washes
- Fix embryo door incubatie in 4% paraformaldehyde (wt / vol) in 1x PBS gedurende 20 minuten.
- Verwijder achtergebleven paraformaldehyde door wassen embryo 3x, 5 min / wasbeurt, in 1x PBST.
- Acetylering Bereid acetylering mengsel (125 ui triethanolamine en 27 ul azijnzuuranhydride in 10 ml DDH 2 O) en incubeer embryo tweemaal per 10 minuten. Om endogene fosfatasewerking minimaliseren, bereiden de acetylering mengsel verse wanneer nodig. Tot overmaat reagens te verwijderen, wassen embryo's twee keer in PBST (10 min / wasbeurt)
- Prehybridisatie Prehybridize embryo's door het overbrengen van embryo's van manden tot 1,5 ml steriele Eppendorf buizen en incubatie met 200 ul hybridisatie mengsel gedurende 2-4 uur in een 70 ° C waterbad.
- Preadsorption van Antibody Verwijder ongeveer 50 embryo's uit de manden en overbrengen naar een 1,5 ml steriele Eppendorf buizen. Incubeer met anti-DIG-AP (1:500) antilichaam met blokkerende buffer (1x PBST, 2% kalfsserum [vol / vol], 2 mg / ml runderserumalbumine [BSA]) bij kamertemperatuur gedurende 2-4 uur, en bewaar bij 4 ° C overnacht. Haal ze uit de couveuse in de ochtend eend laten embryo's op kamertemperatuur komen.
- Hybridisatie In 100-200 ng probe de geprehybridiseerd embryo en incubeer overnacht bij 70 ° C in een waterbad.
- Rehydratie
- DAG 2
- SSC (Saline-natrium citraat) Wast
- Breng 50 ml buisjes met hybridisatiemengsel (HM), 2x SSC en 0,2 x SSC in een bekerglas met water in een 70 ° C waterbad en voorverwarmen ze ten minste 20 minuten. Verwijder de hybridisatie reactiemengsel dat de probe, voeg 1 ml voorverwarmd hybridisatiemengsel de buizen en incubeer gedurende 15 minuten bij 70 ° C. Vul zes-well platen met verschillende verdunningen van voorverwarmde HM in 2x SSC door het vervangen van 100% HM door 50% tot 25% HM om overtollige reagentia te verwijderen.
- Tijdens het wachten, vul zes-well platen met 2x SSC voor wasbeurten en houd ze bij 70 ° C.
- Na 15 min plaats de embryo's van de buis naar de manden bewaard in de zes well plaat gevuld met de verdunnings van HM met 2x SSC en was de gehybridiseerde embryo's door het bewegen van de mand van de ene put naar de volgende (15 min elk in een 70 ° C waterbad). Wassen embryo 2x, 15 min / wasbeurt in 100% 2x SSC bij 70 ° C.
- Stel een waterbad bij 65 ° C. Vul zes-well platen met 0,2 x SSC voor hoge-stringentie wassen om niet-specifieke hybridisatie van de probe met transcript voorkomen.
- Nadat de embryo's twee keer gewassen met 2x SSC bij 70 ° C, volgen nog twee 30 min wassingen in 0,2 x SSC bij 65 ° C.
- PBST Wassingen Neem zes-well platen met opeenvolgende verdunningen van 0,2 x SSC in PBST als volgt: 75% (vol / vol) 0,2 x SSC, 50% (vol / vol) 0,2 x SSC, 25% (vol / vol) 0.2x SSC, en de resterende twee putjes met 100% PBST. Was de gehybridiseerde embryo's door het bewegen van de mand van een putje tot het volgende (5 minuten voor elke stap bij kamertemperatuur met behulp van een rocker).
- Voorincubatie Preincubate embryo voor 3-4 uur bij kamertemperatuur in blocking buffer (1x PBST, 2% kalfsserum [vol / vol], 2 mg / ml BSA).
- Incubatie met anti-DIG antilichaam Incubeer embryo met een oplossing van anti-DIG-AP-antilichaam (1:5000) in blokkerende buffer gedurende de nacht bij 4 ° C onder zacht schudden.
- SSC (Saline-natrium citraat) Wast
- DAG 3
- PBST Wast Bereid de zes-well platen met 4 ml / putje PBST. Wassen bebroede embryo's door het bewegen van de manden in de zes-wells plaat met PBST 6x voor een periode van 15 minuten. Embryo's kunnen bij 4 ° C opgeslagen en het protocol hervat de volgende dag.
- Prestaining Prestain de embryo door 2x wassen gedurende 15 min met prestaining buffer bij kamertemperatuur onder zacht schudden vóór incubatie in aanwezigheid van BCIP (5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat) en NBT (nitroblauwtetrazolium). BCIP en NBT zijn de substraten voor de kleurontwikkeling van alkalische fosfatase activiteit. Aangezien probes zijn bevestigd met alkaline fosfatase the ontwikkeling van de paarse kleur geeft de expressie van het doelwitgen. Embryo's kunnen bij 4 ° C opgeslagen en het protocol hervat de volgende dag.
- Kleuring
- Incubeer embryo bij kamertemperatuur in het donker met BCIP en NBT gedurende 30 minuten.
- Toezicht op de kleuringsreactie elke 30 min met behulp van een stereomicroscoop. De reactietijden variëren van 15 min-16 uur, afhankelijk van het niveau van genexpressie. Reactietijden zijn korter voor sterk tot expressie gebrachte genen en langer zwak tot expressie gebrachte genen. Sense sondes zal detecteren signalen wanneer het gen van belang uitdrukt complementaire antisense (AS) transcripties.
- Stop Reactie Nadat de gewenste kleurintensiteit wordt bereikt, stopt de reactie door de overdracht van manden met de embryo's om putjes die de stop-oplossing (1x PBS, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween). Dit zal voorkomen dat de verdere ontwikkeling van de kleur. Spoel embryo's voor 10 min. 2x op een rocker met een zachte gitation bij kamertemperatuur.
- Postfixatie
- Incubeer de embryo paraformaldehyde 4% (w / v) in PBS gedurende 20 minuten.
- Was de embryo (5 min / wasbeurt) drie maal met PBST om resterende paraformaldehyde verwijderen. Bewaar de vaste embryo stop oplossing in het donker bij 4 ° C.
- Montage, observatie, en Image Acquisition
- Breng de embryo's een zes-well plaat met 100% glycerol met de laagst mogelijke volume PBS. Plaats de zes-well plaat op een wip en voorzichtig roeren overnacht bij kamertemperatuur in het donker.
- Plaats embryo's in 100% glycerol en observeer het signaal onder een stereomicroscoop dan.
- Acquire Images en opslaan als Tiff bestandsformaat of een ander type, die de productie van beelden van hoge kwaliteit mogelijk maakt door het gebruik van software-image zoals Photoshop (figuren 3-6).
- Bereiken dubbele labeling bovenstaande methode van 1.1 beschreven - 1.3.1.7 wordt gebruikt maar omvat gelijktijdige incubatie van zowel fluoresceïne en digoxigenine gemerkte probes in hybridisatie.
- Volg dezelfde procedure voor post-hybridisatie wast namelijk SSC en PBST wast (stappen 1.3.2.1 en 1.3.2.2) en het blokkeren incubaties (stap 1.3.2.3). Voer antilichaam en kleuring reacties opeenvolgend hieronder beschreven.
- Incubeer embryo met AP-gekoppelde anti-digoxigenine antilichaam (1:5000) bij 4 ° C onder zacht schudden.
- Wassen en incubeer met BCIP-NBT (stappen 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
- Na detectie wassen embryo tweemaal met PBST bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Incubeer embryo's bij 65 ° C in PBST met 1 mM EDTA gedurende 30 min naar het anti-digoxigenine antilichaam inactiveren.
- Incubeer embryo in 100% methanol gevolgd door rehydratatie in 75%, 50% en 25% methanol with PBST en terug naar PBST gedurende 1 uur.
- Incubeer embryo nacht onder AP-gekoppelde fluoresceïne (1:2000) in blokkerende buffer bij 4 ° C onder zacht schudden.
- Wassen met PBST embryo (stap 1.3.3.1) en pre-embryo vlek 2 maal gedurende 15 min met pre-kleuring buffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) bij kamertemperatuur onder zacht schudden vóór incubatie in aanwezigheid van fast red . Protocol kan worden gestopt en embryo's worden opgeslagen bij 4 ° C onder zacht schudden en de volgende dag hervat.
- Los een Fast Red tablet in 2 ml buffer vlekken onmiddellijk vóór gebruik.
- Start de reactie door het plaatsen kleuring embryo in de kleuring buffer met Fast Red reagens.
- Stop de kleuring reactie wanneer de gewenste kleurintensiteit wordt bereikt. Het kan enkele uren bij kamertemperatuur een of twee dagen overnacht bij kleuring bij 4 ° C. Stop de reactie onmiddellijk als de kleurintensiteit niet verder ontwikkelen of begint aspecifieke tonenteit in vergelijking met de zinsbeheersing.
- Volg de hierboven beschreven voor de resterende stappen namelijk na fixatie, montage-, observatie-en beeldacquisitie (steps1.3.3.5 en 1.3.3.6).
| Reagens | Volume |
| Template-DNA | 100 ng |
| PCR Buffer (10x) | 5 pi |
| dNTPs (10 mM) | 2 pi |
| Primers (10 mM) | 1 uM elk |
| Voeg water tot een eindvolume van | 49.7 pi |
| Taq polymerase (5 eenheden / & #956; l) | 0,3 pl |
| Reaction Volume | 50 gl |
Tabel 1. PCR amplificatiereactie.
Tabel 2. TOPO klonering reactie.
| Reagens | Volume |
| NTP labeling mix (10x) | 2 pi |
| Transcriptie buffer (10x) | 2 pi |
| Protector RNase inhibitor | 1 ui |
| RNA polymerase of SP6 | |
| T7 RNA Polymerase | 2 pi |
| Final Volume | 20 gl |
Tabel 3. RNA labelingsreactie.
1.3 Whole-mount in situ hybridisatie
I n situ hybridisatie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol met 50 embryo's per mand (per gen / per experimentele conditie) het expressiepatroon van dat gen kan in een experiment worden bereikt. Bijna alle embryo's vertonen gelijkaardige expressiepatronen van een bepaald gen. Representatieve voorbeelden van de in situ hybridisatie kleuring wordt getoond in figuren 3-6.
Zowel de sense en anti-sense riboprobes werden gesynthetiseerd uit het cDNA dat overeenkomt met PC5.1, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, flk / kdrl 10, shh 11 dlx2 12, fkd7 / foxa1 13 zijn insuline 14,15 en trypsine 16 geconstrueerd door het amplificeren van een segment van het mRNA van volledige lengte met Taq DNA polymerase en gekloneerd in pCRII-TOPO (Invitrogen). De authenticiteit van afzonderlijke amplicons werd bevestigd door sequencing. Na controle van de oriëntatie kloon, werden corresponderende antisense riboprobes gesynthetiseerdhet gebruik van de protocollen 17 met modificaties 18,19 zoals hier beschreven met behulp van de Sp6 of T7 RNA polymerase. Stappen in whole-mount in situ hybridisatie worden kort toegelicht in figuur 2. Paarse vlekken waargenomen na hybridisatie met riboprobe van belang vertegenwoordigt zowel de overvloed en de sites van de expressie van bepaalde genen. Bijvoorbeeld PC5.1 toont zeer discrete expressie binnen de voorste en achterste deel van de otic blaasje en laterale lijn primordium bij 24hpf en wordt binnen de anterieure en posterieure laterale lijn neuromasten sterk gelokaliseerd door 72 HPF (Figuur 3). In tegenstelling PC5.2 shows alomtegenwoordige expressie in het CZS met verschillende regionaliseringsprincipe op de somieten, otic blaasje en pronephric kanaal en sterk tot expressie in de lever en de darmen bij 96 hpf (figuur 4). Afwezigheid van genexpressie bij gebruik respectieve sense riboprobes dient als een negatieve controle. (
Figuur 1. Bereiding en het gebruik van Eppendorf-nylon manden te houden geënsceneerde embryo's. Een goed kan houden zes Eppendorf-nylon manden. De afbeelding toont de 6-well steriele platen met zes Eppendorf-nylon mandenelkaar opvolgende verdunningen van methanol in PBS.
Figuur 2. Schematische weergave van de stappen die betrokken zijn bij het hele-mount in situ hybridisatie techniek. Na vaststelling opgevoerd embryo's worden opgeslagen in methanol bij -20 ° C tot gebruik. Probes kunnen worden gesynthetiseerd op voorhand en bewaard bij -80 ° C. Het opslaan van sondes in kleine porties is aan te raden als ze zijn om gebruikt over lange periodes. In het algemeen geheel-mount in situ hybridisatie experimenten in 3 of 4 dagen worden voltooid. De kleuring reactie voor zwak tot expressie genen duurt maximaal 16 uur bij kamertemperatuur of langer bij de kleuring reactie wordt uitgevoerd bij 4 ° C hier hoger f bekijkenIGUUR.
Figuur 3. De expressie van PC5.1 door whole-mount in situ hybridisatie analyses werd uitgevoerd met behulp van 24 HPF en 72 HPF geënsceneerde embryo. (A) Zij mening van 24 HPF embryo's laten een zeer discrete uitdrukking van PC5.1 binnen de voorste en achterste deel van de otic blaasje en laterale lijn primordium behulp PC5.1 antisense riboprobe. Op 72 hpf specifieke kleuring in de anterieure en posterieure laterale lijn neuromasten werd waargenomen. (B) Afwezigheid van genexpressie met behulp PC5.1 zin riboprobe dient als een negatieve controle. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
gether.within-page = "altijd"> 
Figuur 4. Het HPF 24 en 96 HPF hele-mount in situ hybridisatie analyse van PC5.2 werd uitgevoerd met PC5.2 anti-sense en sense riboprobes. (A) Zij mening van 24 HPF embryo's tonen alomtegenwoordige expressie in het CZS, somieten otic blaasje en pronephric duct. Specifieke kleuring in de lever en de darm wordt gezien bij 96 hpf behulp PC5.2 antisense riboprobe. (B) Afwezigheid van genexpressie met behulp PC5.2 zin riboprobe dient als een negatieve controle. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
oad/50644/50644fig5.jpg "width =" 500px "/>
. Figuur 5 Whole-mount in situ hybridisatie analyses op 24 hpf behulp SCL/tal-1 riboprobe toonde kleuring binnen de bilaterale craniale cellen en in de tussenliggende celmassa (ICM); gata-1 riboprobe kleuring is te zien in het ICM, de flk / kdrl expressie binnen de hindbrain, hoofd-, en intersegmentele schepen en in de ICM. De kleuring voor shh werd waargenomen in het notochord.
. Figuur 6 Whole-mount in situ hybridisatie analyses op 34 hpf behulp dlx2 riboprobe onthulde expressie van dlx2 in de telencephalon, diencephalon, hypothalamus, en craniale ectomesenchymal bogen, de fkd7/foxa1 uitdrukking op 24 hpf wordt vooral gezien in de vloer plaat en hypochord; insuline kleuring wordt waargenomen in de endocriene pancreas en trypsine meningsuiting in de exocriene pancreas.
Figuur 7. Adequate permeabilisatie en passende hybridisatietemperatuur zijn van cruciaal belang voor een duidelijke in situ hybridisatie signalen. Whole-mount in situ hybridisatie analyses op 24 hpf en 48 HPF met een shh riboprobe onthuld expressie binnen de notochord en vloerplaat zonder achtergrond signaal wanneer embryo's worden gepermeabiliseerd door proteinase K digestie 12-15 min en gehybridiseerd bij 70 ° C. Onvolledige expressiepatronen en hoge achtergrondsignalen waargenomen wanneer de embryo's werden onderworpen aan digestie matig (5 min proteinase K behandeling) en gehybridiseerd bij lage temperatuur (60 ° C). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben betere methoden ontwikkeld om RNA te visualiseren met een hoge resolutie. De in situ hybridisatie procedures worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige maat gemaakte manden met poreuze bodems (Figuur 1). Embryo's worden verwerkt met RNase-vrije oplossing in 6-well platen bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden.
Om scheiden embryo manden zijn gemaakt van verschillende gekleurde Eppendorf tubes. Manden met of zonder velg worden gebruikt voor eenvoudige oriëntatie en de embryo's in de korf als overeenkomend met een bepaalde probe bepalen.
Prehybridisatie bij 65 ° C en hybridisatie bij 70 ° C met 50% gedeïoniseerd formamide bleek bijzonder belangrijk om hoge resolutie signalen te verkrijgen. Daarnaast incuberen embryo tweemaal met alkalische Tris buffer gedurende 15 min na PBST wassen na incubatie met anti-DIG antistof en vóór incubatie in aanwezigheid van BCIP enNBT faciliteert de verschijning van hoge kwaliteit duidelijke signalen. In onze handen ondervonden we dat de permeabilisatie en vaststelling van embryo's voor de optimale tijd en hybridisatie bij 70 ° C waren zeer kritisch voor het verkrijgen van duidelijke signalen. Onvoldoende permeabilization geproduceerd van hoge achtergrond signalen. Uitgebreide permeabilisatie of inadequate bevestiging resulteerde in de afbraak van embryo dat uitgebreid vaststelling geremd signaaldetectie. Hybridisatie tussen 55-60 ° C produceerde ook hoge achtergrond-signalen (Figuur 7).
De sense probe een signaal voor de AS transcript detecteren als het gen van interesse codeert voor antisense (AS) transcripten. Na de kleurreactie gestopt plaatsen embryo in methanol gedurende 30 minuten of langer zet het signaal om een echte paarse kleur, en verwijdert niet-specifieke kleuring. Vaste embryo's kunnen worden opgeslagen in het donker stop oplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
De voordelen en disadvantages van WISH
WISH is een efficiënte techniek om zowel de ruimtelijke en temporele expressie van target genen tijdens de embryogenese en larvale stadia karakteriseren. Dit protocol maakt ook visualisatie van RNA expressie van twee genen of co-lokalisatie van RNA en eiwit expressie tegelijkertijd met geschikte wijzigingen afhankelijk van het experimentele doel. Deze hoge resolutie protocol kan worden gebruikt om RNA-expressie in veel weefsels en celtypen te detecteren. Het kan worden gebruikt voor de detectie van zeer lage overvloedig RNA species met minimale achtergrond signalen. Echter, om nauwkeurige expressie van genen in inwendige ruimtes van weefsels visualiseren nodig situ hybridisatie onder toepassing van weefselcoupes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
