Summary
Sebrafisk, en liten tropisk fisk, har blitt en populær modell for å studere gen-funksjon i løpet av virveldyr utvikling og sykdom. Den tidsmessige og romlige ekspresjon av målgener kan bestemmes ved
Abstract
Denne artikkelen fokuserer på hel-mount in situ hybridisering (WISH) av sebrafisk embryoer. Den WISH-teknologi forenkler vurderingen av genuttrykk både i form av vev distribusjon og utviklingsstadiet. Protokoller er beskrevet for bruk av WISH av sebrafisk embryoer ved hjelp av antisense-RNA-prober merket med Digoxigenin. Prober blir generert ved å innlemme Digoxigenin-bundne nukleotider gjennom in vitro transkripsjon av genet maler som er klonet og lineært. De chorions av embryoer høstes ved definerte utviklingsstadier er fjernet før inkubasjon med spesifikke prober. Ved å følge en prosedyre vasking for å fjerne overskudd sonde, blir embryoene ble inkubert med anti-Digoxigenin-antistoff konjugert med alkalisk fosfatase. Ved å ansette en kromogent substrat for alkalisk fosfatase, kan spesifikk genekspresjon bli vurdert. Avhengig av nivået av genuttrykk hele prosedyren kan gjennomføres innen 2-3 dager.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som en kraftig dyremodell for studier av virveldyr utvikling, sykdom, atferd, og i narkotika screening 1-3. Sebrafisk embryoer kan fås i store tall fra en enkelt kryss. Befruktning og utvikling skjer ex utero og optisk klare embryoer utvikler seg raskt. Kritiske utviklingsmessige hendelser inntreffer i løpet av første 48 timer etter befruktning (HPF). Dette inkluderer utseendet på orgel primordia og initiering av cytodifferentiation. Knockdown eller over-ekspresjon av proteiner kan oppnås ved mikroinjeksjon av embryoene med antisense-morfolino (MO) oligonukleotider eller mRNA på henholdsvis ett eller to cellestadiet (0.75 HPF).
Den WISH av sebrafisk embryo letter studiet av spatio-tidsbaserte uttrykk av spesifikke gener av interesse. Bruk av WISH teknikken etter mikroinjeksjon av befruktede egg med mRNA eller MO å over-uttress eller knockdown spesifikke protein nivåer avslører differensial regulering av andre gener.
Endringer i genuttrykk mønstre kan være korrelert med fenotypiske endringer og avdekke funksjon av målet gener under tidlig organogenesis. Siden prober kan være forberedt og lagret på forhånd, kan det ISH teknikk brukes for å avdekke genuttrykksmønster i minst 20 gener på en gang ved hjelp av seks-brønners plater og skreddersydde kurver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Hel-mount In Situ Hybridisering av sebrafisk embryoer
1.1 Utarbeidelse av embryo
- Samle embryoer på de nødvendige utviklingsstadier. Vennligst se Kimmel et al. 5 for fosterstadiet beskrivelse.
- Fjern chorions manuelt ved hjelp av tang (Dumont Urmakere Forceps no. 5).
- Fix embryoer i en 4% løsning av paraformaldehyd (PFA) gjort opp i PBS (fosfatbufret saltvann) over natten ved 4 ° C.
- Vask embryoer med PBS minst 3 ganger i 5 minutter hver ved romtemperatur.
- Lagre befruktede egg i 100% metanol (MeOH) ved -20 ° C inntil brukt for fremtidig anvendelse av teknikker som hel-mount in situ hybridisering.
- Freeze iscenesatt embryoer i flytende nitrogen for RNA ekstraksjon og oppbevar ved -80 ° C.
- Utdrag RNA fra iscenesatte embryo og syntetisere cDNA for PCR forsterkning og påfølgende kloning. 1.2 Syntese av Digoxygenin-merket RNA prober
- PCR forsterkning og genet kloning for probe mal. Setup-PCR-reaksjon med totalt volum på 50 pl som vist i tabell 1. Bruk mer genomisk DNA eller mindre cDNA i PCR reaksjon som mal. Omfatte 10 min forlengelse tid ved 72 ° C etter den siste syklus for å sikre at PCR reaksjonsproduktene er fulle lengde og 3 'adenylated for å lette kloning TOPO.
- Kontroller størrelsen av PCR-produktet ved hjelp av agarosegel-elektroforese. Den estimerte størrelse av PCR-produktet for sonde syntese er nær 1 kb.
- Spesiell forsiktighet for å unngå forurensning nuklease ved å utføre forsøket under sterile betingelser og ved hjelp av nuklease fritt vann. I tilfelle at flere produkter blir fulgt, gel-rense riktig størrelse PCR produkt før du fortsetter med kloning ved hjelp av TOPO TA Cloning Kit. Optimalisere PCR-reaksjonen for å eliminere forekomsten av smøre-og flere band.
- Utfør TOPO kloning reaksjon som angitt i tabell 2.. Kombiner TOPO vektor og PCR-produkt, og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Innlemme / introdusere TOPO kloning produktet i en skudd kompetente celler. Thans prosessen kalles transformasjon.
- Inkuber de transformerte cellene ved 37 ° C i minst en time ved 260 rpm for å sikre ekspresjonen av de antibiotiske resistensgener. Plate transformasjonen blanding (50-100 ul) på forvarmet Luria Bertani (LB) agar-skåler inneholdende 50 ug / ml ampicillin og X-gal. Inkuber ved 37 ° C over natten.
- Bestemme tilstedeværelsen av innsatsen basert på utseende av hvite eller lys blå kolonier. TOPO-vektor inneholder lacZ-genet som koder for β-galaktosidase. I nærvær av X-gal, danner produksjon av β-galaktosidase blå farge. DNA ligert inn i plasmidet forstyrrer dannelsen av funksjonelle β-galaktosidase-hvite kolonier og blir produsert. Hvite kolonier eller lys blå kolonier bekrefte tilstedeværelse av innsatsen.
- Plukk de hvite kolonier fra agar plate ved hjelp av sterile pipettespisser og plassere dem i sterile 10 ml tube inneholder 4 ml LB-medium og kultur ved 37 ° C i risting incubator natten ved 200 rpm.
- Rens DNA ved bruk av plasmid-DNA-sett i henhold til produsentens instruksjon.
- Linearisere cDNA plasmid følgende rensning ved å fordøye 5 ug cDNA for hver sonde med det passende restriksjonsenzym som har et unikt sete lokalisert 3 '(sense for prober) eller 5' (for antisens-prober) på innsatsen.
- Rense lineær DNA ved hjelp av fenol / kloroform ekstraksjon metoden. Legg like stort volum fenol / kloroform, verteks kraftig i 30 sek, sentrifugering i 3 min ved 13.000 rpm ved 4 ° C. Overfør øvre vannfase i rent rør og legg like stort volum kloroform. Spinn i 3 min ved 13 000 rpm ved 4 ° C. Overfør øvre vannfase i rent rør. Tilsett 10% natrium-acetat (3 M) og 2,5 ganger volum av 100% etanol for å utfelle DNA og oppbevar ved -20 ° C for over natten. Sentrifugering i 15 minutter ved 13000 rpm ved 4 ° C. Fjern etanol og vaskes pelleten med 75% etanol. Protokollen kan stoppes og DNA kan stORed ved -20 ° C og gjenopptatt neste dag. Spinn i 10 min ved 10 000 rpm ved 4 ° C. Supernatanten fjernes forsiktig og tørke pellet i 2 min ved romtemperatur. Resuspender pelleten i 10 pl DEPC behandlet vann og inkuberes ved 55 ° C i 20 min. Kvantifisere DNA-konsentrasjon ved anvendelse av UV-spektrofotometer.
- Vurdere renheten ved agarosegelelektroforese ved anvendelse av 1 pl av DNA på 1% agarosegel og kjørt i omtrent 30 min.
- Sett opp RNA merking reaksjon. Ved hjelp av en RNase-fri reaksjonshetteglasset, tilsett 1-5 ug av renset DNA til sterile, RNase-fri, DEPC-behandlet, dobbelt destillert vann til et volum på 13 pl. Chill reaksjonshetteglasset på isen og legge til følgende reagenser (se tabell 3):
- Bland reagens forsiktig deretter samlet på bunnen ved sentrifugering ved 2000 korte rpm i 30 sekunder ved romtemperatur og inkubere reaksjonsblandingen i 2 timer ved 37 ° C.
- Fjern det mal-DNA ved tilsetning av 2 pl RNase-fri DNase I. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og stoppe reaksjonen ved tilsetning av 2 pl 0,2 M EDTA (pH 8,0).
- Utfelle reaksjonsproduktene ved tilsetning av 2,5 pl 4 M LiCl og 75 pl 100% etanol. Blande løsningen og oppbevar ved -20 ° C i 45 min or lagret ved -20 ° C over-natten og protokollen gjenopptas neste dag.
- Sentrifuger suspensjonen i 30 min ved 13 000 rpm ved 4 ° C, deretter vaskes pelleten med 500 mL 70% etanol lagret ved -20 ° C, sentrifuger i en ytterligere 10 min, tørr i 2 min, og resuspender i 50 pl og inkuber ved 30 min ved 37 ° C.
- Kontroller sonden kvalitet og integritet ved å kjøre 1-2 ml på 1% agarose gel i ca 30 min. Dette bekreftes av tilstedeværelse av enkelt produkt som kjører på den forventede størrelsen på gel.
- Kvantifisere konsentrasjonen av proben ved å måle mengden av RNA ved hjelp av spektrofotometer. Utbyttet fra denne reaksjon er omtrent 10 ug RNA (100-200 ng / ul).
- DAG 1
- Rehydrering
- Forbered kurver ved hjelp av nylon mesh (mindre enn 1 mm porestørrelse) og Eppendorf-rør. Konstruere kurver av cutting Eppendorf-rør (1,5 ml) for å fjerne de koniske ender. Å identifisere individuelle kurver bruke forskjellige fargede rør og fjerne det øverste felger fra halvparten av dem.
- Skjær små biter av nylon-nett for å dekke de kappede ender av Eppendorf-rør. Stick de skårne ender av rørene til nylon mesh ved å varme dem på en elektrisk kokeplate (som ligger mellom middels til høy) i en avtrekkshette. Når avkjølt fjerne overflødig nylonmesh fra kurvene og lagre dem i 100% metanol ved romtemperatur.
- Forbered suksessive fortynninger av metanol i PBS (75% [vol / vol [metanol, 50% [vol / vol] metanol og 25% [vol / vol] metanol) ved hjelp av de første tre brønnene av den seks-brønns plater, etterfulgt av 100% PBST (fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20) i de neste tre brønner.
- Subject embryoer til i situ hybridisering prosedyren ved hjelp av skreddersydde kurver som vist i Figurea 1a og b. Bruk RNase-frie løsninger opp til hybridizasjon skritt i 6-brønn plater (4 ml / brønn). For å oppnå dette, plassere opptil seks kurver i den første brønnen. Sted kurv med rim først, etterfulgt av kurver uten felger i forskjellige farger arrangert fortløpende. Ved hjelp av denne ordningen opp til seks genuttrykk mønstre kan bestemmes samtidig.
- Plasser dehydrerte embryoer av samme utviklingstrinn til samme kurv (se figur 1).
- Rehydrere embryoer ved å bevege kurver fra en brønn i seks-brønns plate til den neste (5 min for hvert trinn). Bruk seks brønner fylt med passende buffer. Embryoer utsettes for hver fortynning gang. På denne måten blir embryoene vasket 6x, 5 min / vask. Rehydrering av de dehydrerte embryoer er oppnådd ved å erstatte metanol med PBS og deretter ved vasking 3 ganger med 100% PBST.
- Permeabilization Digest de rehydrerte embryoer med proteinase K (10 pg / ml) ved romtemperatur for å gjengi dem gjennomtrengelige som vist i tabell 4.
Fosterstadiet (timer etter befruktning) Fordøyelse Periode (Proteinase K) Opptil 6 15 sek 6-12 30 sek 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min Tabell 4. Permeabilization reaksjon.
- Postfixation og PBST Vasker
- Fix embryoer ved inkubering i 4% paraformaldehyd (vekt / volum) i 1 x PBS i 20 min.
- Fjerne rester paraformaldehyd ved å vaske embryoer 3x, 5 min / vask, i 1x PBST.
- Acetylering Forbered acetyleringen blanding (125 ul triethanolamin og 27 mL eddiksyre i 10 ml DDH 2 O) og inkuberes embryoer to ganger i 10 minutter hver. For å minimere endogent fosfataseaktivitet, klargjøres acetylering blandingen frisk når det kreves. For å fjerne overflødig reagens, vaske embryoer to ganger i PBST (10 min / vask)
- Prehybridization Prehybridize embryoer ved overføring av embryo fra kurver til 1,5 ml sterile Eppendorf-rør og inkubering med 200 pl hybridiseringsblanding i 2-4 timer i et 70 ° C vannbad.
- Preadsorption av Antistoff Fjern ca 50 embryoer fra kurvene og overføre dem til en 1,5 ml steril Eppendorf-rør. Inkuber med anti-DIG-AP (1:500)-antistoff ved hjelp av blokkeringsbuffer (1x PBST, 2% kalveserum [vol / vol], 2 mg / ml bovint serumalbumin [BSA]) ved romtemperatur i 2-4 timer, og deretter lagres ved 4 ° C over natten. Fjern fra inkubatoren i morgen end tillate embryoer nå romtemperatur.
- Hybridisering til 100-200 ng av proben til prehybridisert embryoer og inkuber over natten ved 70 ° C i vannbad.
- Rehydrering
- DAG 2
- SSC (Saline-natrium Citrate) Vasker
- Plasser 50 ml rør av hybridiseringsblandingen (HM), 2 x SSC og 0,2 x SSC i et beger med vann i et 70 ° C vannbad og prewarm dem i minst 20 min. Fjern hybridisering reaksjonsblanding inneholdende sonden, tilsett 1 ml forvarmet hybridiseringsblanding til rørene og inkuber i 15 min ved 70 ° C. Fyll seks-brønns plater med forskjellige fortynninger av forvarmet HM i 2x SSC ved å erstatte 100% HM gjennom 50% til 25% HM for å fjerne reagensoverskudd.
- Mens du venter, fyll seks-brønners plater med 2x SSC for vasker og holde dem ved 70 ° C.
- Etter 15 min plass embryoene fra røret til kurvene holdt i seks brønn plate fylt med fortynnings av HM med 2x SSC og vaske den hybridiserte embryoer ved å flytte kurven fra en brønn til den neste (15 minutter hver i et 70 ° C vannbad). Vask embryoer 2x, 15 min / vask, i 100% 2x SSC ved 70 ° C.
- Still et annet vannbad ved 65 ° C. Fyll seks-brønns plater med 0,2 x SSC for høy stringens vasker for å unngå ikke-spesifikk hybridisering av transkripsjon med sonden.
- Etter at embryoene blir vasket to ganger med 2 x SSC ved 70 ° C, følger ytterligere to 30 min vaskinger i 0,2 x SSC ved 65 ° C.
- PBST Vasker Forbered seks-brønners plater med suksessive fortynninger av 0,2 x SSC i PBST som følger: 75% (vol / vol) 0,2 x SSC, 50% (vol / vol) 0,2 x SSC, 25% (vol / vol) 0.2x SSC, og de resterende to brønner med 100% PBST. Vask den hybridiserte embryoer ved å flytte kurven fra en brønn til den neste (5 min for hvert trinn ved romtemperatur ved hjelp av en vippe).
- Preinkubering Preincubate embryoer for 3-4 timer ved romtemperatur i blocking buffer (1x PBST, 2% kalveserum [vol / vol], 2 mg / ml BSA).
- Inkubering med anti-DIG Antistoff Inkuber embryoer med en oppløsning av anti-DIG-antistoff-AP (1:5,000) i blokkerende buffer over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring.
- SSC (Saline-natrium Citrate) Vasker
- DAG 3
- PBST Vasker Forbered seks-brønners plater med 4 ml / brønn PBST. Vask inkuberte embryoer ved å flytte kurvene i seks-brønn plate inneholder PBST 6x for perioder på 15 min. Embryoet kan lagres ved 4 ° C og protokollen gjenopptatt neste dag.
- Prestaining Prestain embryoene ved å vaske 2x i 15 min med prestaining buffer ved romtemperatur med forsiktig omrøring før inkubasjon i nærvær av BCIP (5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat) og NBT (nitroblue tetrazolium). BCIP-og NBT er de underlag som brukes for fargefremkalling av alkalisk fosfatase-aktivitet. Siden prober er festet med alkalisk fosfatase the utvikling av purpur farge angir ekspresjon av målgenet. Embryoet kan lagres ved 4 ° C og protokollen gjenopptatt neste dag.
- Flekker
- Inkuber embryoer ved romtemperatur i mørke med BCIP og NBT i 30 min.
- Overvåke farvereaksjon hvert 30 min ved hjelp av et stereomikroskop. Reaksjonstiden varierer fra 15 min-16 timer avhengig av nivået av genekspresjon. Reaksjonstiden er kortere for høyt uttrykte gener og lengre for svakt uttrykt gener. Sense-prober vil detektere signaler hvis genet av interesse uttrykker komplementær antisens (AS) transkripter.
- Stopp reaksjon etter ønsket fargeintensitet er nådd, stoppe reaksjonen ved å overføre kurver som inneholder embryoene til brønner som inneholder stop-løsning (1x PBS, 5,5 pH, 1 mM EDTA, 0,1% Tween). Dette vil unngå videre utvikling av fargen. Skyll embryo i 10 min 2x på en rocker med mild agitation ved romtemperatur.
- Postfixation
- Inkuber embryoene i 4% paraformaldehyd (vekt / volum) i PBS i 20 min.
- Vask de embryoer (5 min / vask) tre ganger med PBST for å fjerne gjenværende paraformaldehyd. Oppbevar de faste embryoer i stop-løsning i mørke ved 4 ° C.
- Montering, observasjon, og Image Acquisition
- Overfør embryoene til en seks-brønners plate inneholdende 100% glyserol ved hjelp av minst mulig volum av PBS. Plasser den seks-brønns plate på en vippearm og forsiktig omrøre over natten ved romtemperatur i mørket.
- Plasser embryo i 100% glyserol og deretter observere signalet under et stereomikroskop.
- Acquire Images og lagre som TIFF filformat eller en annen type som tillater produksjon av høy kvalitet gjennom bruk av image programvare som Photoshop (Tall 3-6).
- For å oppnå dobbel merking av metoden beskrevet ovenfor fra 1,1 - 1.3.1.7 er brukt, men omfatter samtidig inkubering av både digoxygenin og fluorescein merkede prober under hybridisering.
- Følg samme fremgangsmåte for post hybridisering vasker nemlig SSC og PBST vask (trinn 1.3.2.1 og 1.3.2.2) og blokkerer inkubasjoner (trinn 1.3.2.3). Utfør antistoff og farging reaksjoner sekvensielt som beskrevet nedenfor.
- Inkuber embryoer med AP-koblet anti-Digoxigenin-antistoff (1:5,000) ved 4 ° C med forsiktig omrøring.
- Vask og ruge med BCIP-NBT (trinn 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
- Etter deteksjon, vaskes to ganger med PBST embryoer ved romtemperatur i 20 min.
- Inkuber embryoer ved 65 ° C i PBST med 1 mM EDTA i 30 min for å inaktivere den anti-Digoxigenin-antistoff.
- Inkuber embryoer i 100% metanol etterfulgt av rehydrering i 75%, 50% og 25% metanol vetth PBST og tilbake til PBST for 1 hr.
- Inkuber over natten embryoer med AP-koblet fluorescein (1:2,000) i blokkerende buffer ved 4 ° C med forsiktig omrøring.
- Vask embryoer med PBST (trinn 1.3.3.1) og pre-flekken embryoer to ganger i 15 minutter med pre-flekker buffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) ved romtemperatur med forsiktig omrøring før inkubasjon i nærvær av Fast Red . Protokollen kan stoppes og embryo kan lagres ved 4'C med svak omristing og gjenopptas neste dag.
- Oppløse en Fast Red tablett i 2 ml flekker buffer umiddelbart før bruk.
- Start flekker reaksjon ved å plassere embryo i farging buffer med Fast Red reagens.
- Stopp farvereaksjon når den ønskede fargeintensitet er nådd. Dette kan ta fra noen få timer ved romtemperatur til en eller to dager over natten ved beising ved 4 ° C. Stopp reaksjonen umiddelbart hvis fargeintensitet ikke utvikler seg videre eller begynner å vise ikke-spesifikkhet i forhold til den forstand kontroll.
- Følg prosedyrene beskrevet ovenfor for resten av trinnene nemlig innlegg fiksering, montering, observasjon og bildeopptak (steps1.3.3.5 og 1.3.3.6).
| Reagens | Volum |
| Mal DNA | 100 ng |
| PCR Buffer (10x) | 5 ul |
| dNTPs (10 mM) | 2 ul |
| Primere (10 mM) | 1 mikrometer hver |
| Tilsett vann til et sluttvolum på | 49,7 mL |
| Taq polymerase (5 enheter / & #956, l) | 0.3 ul |
| Reaksjon Volume | 50 pl |
Tabell 1. PCR forsterkning reaksjon.
Tabell 2. TOPO kloning reaksjon.
| Reagens | Volum |
| NTP merking blanding (10x) | 2 ul |
| Transkripsjon buffeh (10x) | 2 ul |
| Protector RNase inhibitor | 1 ul |
| RNA Polymerase SP6 eller | |
| RNA Polymerase T7 | 2 ul |
| Endelig Volume | 20 pl |
Tabell 3. RNA merking reaksjon.
1.3 Hel-mount In Situ Hybridisering
jeg n Situ Hybridisering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hjelp av protokollen med 50 embryoer per kurv (per genet / per eksperimentell tilstand) uttrykket mønster av det genet kan oppnås i ett eksperiment. Nesten alle embryoene viser lignende uttrykk mønstre for et bestemt gen. Representative eksempler på den in situ hybridisering farging er vist på figurene 3-6.
Både fornuft og anti-sense riboprobes ble syntetisert fra cDNAs tilsvarende PC5.1, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-en 8,9, FLK / kdrl 10, 11 Hysj, dlx2 12, fkd7 / foxa1 13, har insulin 14,15, trypsin og 16 blitt konstruert ved amplifisering av et segment av full-lengde mRNA ved hjelp av Taq-DNA-polymerase og klonet inn i pCRII-TOPO (Invitrogen). Ektheten av individuelle amplikonene ble bekreftet ved sekvensering. Etter verifikasjon av klone orientering, ble tilsvarende antisens riboprobes syntetisertbruker protokollene 17 med modifikasjoner 18,19 som er beskrevet her ved hjelp av enten SP6 eller T7 RNA polymerase. Trinnene involvert i hel-mount in situ hybridisering er illustrert i figur 2. kort. Lilla flekker observert etter hybridisering med riboprobe av interesse representerer både overflod og nettstedene til uttrykk bestemt gen. For eksempel PC5.1 viser veldig diskret uttrykk i fremre og bakre del av otic vesicle og sidelinje primordium på 24hpf og er sterkt lokalisert innenfor fremre og bakre lateral linje neuromasts med 72 HPF (figur 3). I motsetning PC5.2 show allestedsnærværende uttrykk i SNS med distinkte regionalisering innenfor somites, otisk vesikkel og pronephric kanal og er sterkt uttrykt i lever og tarm, ved 96 HPF (figur 4). Fravær av gen-ekspresjon ved bruk av respektive sense riboprobes tjener som en negativ kontroll. (
Figur 1. Utarbeidelse og bruk av Eppendorf-nylon mesh kurver til å holde iscenesatt embryoer. En brønn kan holde seks Eppendorf-nylon mesh kurver. Bildet viser 6-brønn sterile plater inneholder seks Eppendorf-nylon mesh kurverbenyttes for suksessive fortynninger av metanol i PBS.
Figur 2. Diagram som viser trinnene involvert i hel-mount in situ hybridisering. Etter fiksering trinnvis embryo kan lagres i metanol ved -20 ° C inntil bruk. Prober kan syntetiseres på forhånd og holdt ved -80 ° C. Lagring av sonder i små porsjoner er tilrådelig hvis de skal brukes over lengre perioder. Generelt hel-mount in situ hybridisering eksperimenter kan være ferdig i 3 eller 4 dager. Den flekker reaksjon for svakt uttrykt gener vil ta opp til 16 timer ved romtemperatur eller lenger når farvereaksjon foretas ved 4 ° C Klikk her for å se større figur.
Figur 3. Uttrykket av PC5.1 av hel-mount in situ hybridisering analyser ble utført med 24 HPF og 72 HPF iscenesatt embryoer. (A) Lateral syn på 24 HPF embryo viser svært diskret uttrykk for PC5.1 innenfor fremre og bakre del av otic vesicle og sidelinje primordium hjelp PC5.1 antisens riboprobe. Ved 72 HPF spesifikk farging ble observert i løpet av de fremre og bakre lateral linje neuromasts. (B) Fravær av genuttrykk ved hjelp PC5.1 forstand riboprobe fungerer som en negativ kontroll. Klikk her for å se større figur .
gether.within-page = "always"> 
Figur 4. Ved 24 HPF og 96 HPF hel-mount in situ hybridisering analyser av PC5.2 ble utført med PC5.2 anti-fornuft og følelse riboprobes. (A) Lateral syn på 24 HPF embryoer vise allestedsnærværende uttrykk innen CNS, somites otic vesicle og pronephric duct. Spesifikk farging i leveren og tarmen er sett ved 96 HPF hjelp PC5.2 antisens riboprobe. (B) Fravær av genuttrykk ved hjelp PC5.2 forstand riboprobe fungerer som en negativ kontroll. Klikk her for å se større figur .
oad/50644/50644fig5.jpg "width =" 500px "/>
. Figur 5 Whole-mount in situ hybridisering analyser ved 24 HPF hjelp SCL/tal-1 riboprobe viste flekker innenfor de bilaterale kraniale celler og i den mellomliggende cellemasse (ICM); gata-en riboprobe farging er sett i ICM, den FLK / kdrl uttrykk innenfor hindbrain, viktigste, og intersegmental fartøy og i ICM. Den farging for shh ble observert i ryggstreng.
. Figur 6 Whole-mount in situ hybridisering analyser ved 34 HPF hjelp dlx2 riboprobe avslørte uttrykk for dlx2 i telencephalon, diencephalon, hypothalamus, og kraniale ectomesenchymal buer, den fkd7/foxa1 uttrykk ved 24 HPF er sett hovedsakelig i gulvet psent og hypochord; insulin farging observert i det endokrine bukspyttkjertelen og trypsin uttrykk i eksokrin pankreas.
Figur 7. Tilstrekkelig permeabilization og hensiktsmessig hybridisering temperatur er avgjørende for klar in situ hybridisering signaler. Hel-mount in situ hybridisering analyser ved 24 HPF og 48 HPF ved hjelp av en shh riboprobe avslørte uttrykk innenfor notochord og gulvplaten uten bakgrunn signal når embryo blir permeabilized av Proteinase K fordøyelse i 12-15 min og hybridisert ved 70 ° C. Ufullstendig ekspresjonsmønster og høye bakgrunnssignaler ble observert når embryoene ble underkastet utilstrekkelig fordøyelse (5 min proteinase K-behandling) eller hybridisert ved lav temperatur (60 ° C). Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet forbedrede fremgangsmåter for å visualisere RNA med høy oppløsning. Den in situ hybridisering prosedyrer blir utført ved hjelp av enkle skreddersydde kurver med porøse bottoms (figur 1). Embryoer behandlet ved hjelp av RNase-frie løsninger i 6-brønners plater ved romtemperatur under sterile betingelser.
Å skille embryoer kurver er laget av forskjellige fargede Eppendorf-rør. Kurver med eller uten felg brukes for enkel orientering, og for å identifisere de embryoer innenfor den kurven som svarer til en spesiell sonde.
Prehybridization ved 65 ° C og hybridisering ved 70 ° C med 50% deionisert formamid ble funnet å være spesielt viktig for å oppnå høy oppløsning signaler. I tillegg inkubere embryoer to ganger med alkalisk Tris-buffer i 15 min stolpen PBST vasker etter inkubasjon med anti-DIG-antistoff og før inkubasjon i nærvær av og BCIPNBT letter utseende av høy kvalitet klare signaler. I våre hender opplevde vi at permeabilization og fastsettelse av embryoer for optimal tid og hybridisering ved 70 ° C var svært kritisk i å skaffe klare signaler. Utilstrekkelig permeabilization produsert høy bakgrunn signaler. Utvidet permeabilization eller mangelfull innfesting resulterte i degradering av embryoer mens utvidet feste hemmet signal deteksjon. Hybridisering mellom 55-60 ° C også produsert med høy bakgrunnssignaler (figur 7).
Den følelse sonde vil detektere et signal for transkripsjon AS hvis genet av interesse koder for antisens (AS) transkripter. Etter fargingen Reaksjonen stoppes plassere embryoer i metanol i 30 min eller lengre omdanner signalet til en ekte fiolett farge, og fjerner ikke-spesifikk farging. Faste embryoer kan lagres i mørket i stop-løsning ved 4 ° C i flere måneder.
Fordelene og disadvantages av WISH
WISH er en effektiv teknikk for å karakterisere både temporal og romlig uttrykk for målgener under embryogenese og larvestadiet. Denne protokollen tillater også visualisering av RNA-ekspresjon av to gener eller ko-lokalisering av RNA og protein uttrykk på samme tid ved bruk av egnede modifikasjoner avhengig av de eksperimentelle mål. Den høye oppløsningen protokollen kan brukes for å påvise RNA-ekspresjon i en rekke vev og celletyper. Den kan brukes til påvisning av meget lave rike RNA-arter med minimale bakgrunnssignaler. Imidlertid, for å visualisere nøyaktig ekspresjon av gener i innvendige kammer i vev krever in situ hybridisering ved vevssnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
