Summary
Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit edilebilir
Abstract
Bu makale Zebra balığı embriyolarının in situ hibridizasyon (DİLERİZ) in tüm montaj odaklanır. WISH teknoloji doku dağılım ve gelişim aşamasında açısından hem de gen ifadesinin değerlendirilmesi kolaylaştırır. Protokoller digoksijenin ile etiketlenmiş antisens RNA probları kullanılarak zebrabalıkları embriyoların WISH kullanımı tarif edilmektedir. Problar klonlanmış ve lineerize edilmiş gen şablonlar in vitro transkripsiyon yoluyla digoksigenin-bağlı nükleotit ilave edilerek oluşturulur. Belirlenen gelişim aşamalarında hasat embriyoların chorions spesifik problar ile inkübasyondan önce kaldırılır. Aşırı prob kaldırmak için bir yıkama işlemi sonrasında, embriyolar alkalin fosfataz ile konjuge edilmiş anti-digoksigenin antikor ile inkübe edilir. Alkalin fosfataz için bir kromojenik substrat kullanılarak, belirli bir gen ekspresyonu tespit edilebilir. Gen ifade seviyesine bağlı olarak tüm işlem 2-3 gün içinde tamamlanabilir.
Introduction
Zebra balığı (Br.rerio) omurgalı geliştirme, hastalık, davranış çalışma için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya, ve-ilaç tarama 1-3 oldu. Balığı embriyolar, tek bir geçiş yerinden çok sayıda temin edilebilir. Gübreleme ve geliştirme eski rahim ve optik açık embriyoların hızla geliştirmek oluşur. Kritik gelişimsel olaylar ilk 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) meydana gelir. Bu organın taslakları ortaya ve hücre farklılaşması ve başlanması. Proteinlerin demonte veya aşırı ifadesi, morfolino antisens (MO) oligonükleotidlerle embriyoların mikroenjeksiyon yoluyla elde ya da bir ya da iki hücreli aşamada (0,75 HPF) sırasıyla mRNA olabilir.
Zebra balığı embriyoların DİLERİZ ilgi belirli genlerin uzay-zamansal ifade çalışma kolaylaştırır. DİLERİZ tekniğin uygulama aşırı ifade için mRNA veya MO ile embriyo mikroenjeksiyon takipess veya demonte özel protein düzeyleri diğer genlerin diferansiyel düzenleme ortaya koymaktadır.
Gen ekspresyonu değişiklikleri fenotipik değişikliklerle ilişkili ve erken organogenez sırasında hedef genlerin işlevini ortaya olabilir. Probes hazırlanmış ve önceden depolanmış olabilir, çünkü ISH tekniği altı oyuklu plakalar ve özel yapılmış sepet ile aynı anda en az 20 gen için gen ekspresyonu ortaya çıkarmak için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zebra balığı Embriyolar Yerinde Hibridizasyon Tüm montaj
Embriyolar 1.1 hazırlanması
- Gerekli gelişim aşamalarında embriyolar toplayın. Embriyonik aşamada açıklaması için Kimmel ve ark. 5 bakınız.
- Elle forseps (Dumont Saatçiler yok. 5 Forceps) kullanarak chorions çıkarın.
- PBS içinde yapılan paraformaldehid% 4 çözelti (PFA) embriyolar saptamak 4 ° C de bir gece (fosfat tamponlu tuzlu eriyik)
- En az 3 kat, oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca PBS ile embriyolar yıkayın.
- In situ hibridizasyon bütün montaj dahil olmak üzere tekniklerin yönelik uygulama için kullanılana kadar -20 ° C'de% 100 metanol (MeOH) içerisinde deposu embriyolar.
- Freeze -80 ° C de RNA çıkarma ve mağaza için sıvı azot içinde embriyolar sahnelenen
- Sahnelenen embriyolardan RNA Özü ve PCR ve sonraki klonlama için cDNA sentez. Digoxygenin-etiketli RNA Problar 1.2 sentezi
- Prob şablonu için PCR ve gen klonlama. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, 50 ul'lik toplam hacmi Kur PCR reaksiyonu. Genomik ya da daha fazla DNA şablon olarak PCR reaksiyonunda az cDNA kullanın. 72 C'de 10 dakika uzatma süresi dahil ° C PCR reaksiyon ürünleri TOPO klonlama kolaylaştırmak amacıyla adenylated tam uzunlukta ve 3 'olduğundan emin olmak için, son çevrimin aşağıdaki.
- Agaroz jel elektroforez kullanılarak PCR ürününün büyüklüğü kontrol edin. Prob sentezi için PCR ürününün tahmini boyutu 1 kb civarındadır.
- Steril koşullar altında deney yapan ve nükleaz ücretsiz su kullanarak nukleaz kirlenmesini önlemek için özel dikkat gösterin. Birden fazla ürün gözlemlenmesi durumunda, TOPO TA klonlama kiti kullanılarak klonlama ile devam etmeden önce uygun büyüklükte PCR ürünü jel arındırmak. Bulaşması ve çoklu bant görünümü ortadan kaldırmak için optimize PCR reaksiyonu.
- Tablo 2'de belirtildiği gibi TOPO klonlama reaksiyon gerçekleştirin. Vektör ve TOPO PCR ürünü, birleştirin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Bir atış yetkili hücrelere TOPO klonlama ürün tanıtmak / dahil. Tbu işlem dönüşümü olarak adlandırılır.
- Antibiyotik direnç genlerinin ekspresyonunu sağlamak için 260 rpm'de, en az 1 saat boyunca 37 ° C 'de, dönüştürülmüş hücreler inkübe edin. Levha önceden ısıtılmış Luria Bertani (LB) 50 ug / ml ampisilin ve X-gal ihtiva eden agar plakaları üzerine dönüşüm karışımı (50-100 ul). 37 ° C de bir gece inkübe edilir.
- Beyaz veya açık mavi kolonilerin görünüşüne göre uç varlığını belirlemek. TOPO vektörü β-galaktosidaz kodlayan lacZ geni içerir. X-gal'ın olarak, β-galaktosidaz üretimi mavi renk oluşturur. Fonksiyonel β-galaktosidaz ve beyaz koloniler oluşumu bozan plasmid içine ligatlandı ve DNA üretilir. Beyaz koloniler veya açık mavi koloniler ucun varlığını doğrulamak.
- Steril pipet uçları kullanılarak agar plaka beyaz koloniler seçin ve sallayarak inkübasyon içinde 37 LB medya ve kültür 4 ml içeren steril 10 ml tüp ° C koyun200 rpm'de gece tor.
- Üreticilerin talimatlarına göre plazmid DNA kiti kullanılarak plazmid DNA arındırın.
- Elemanı 3 '(duyu problar için) veya 5' (antisens prob için) yer alan eşsiz bir bölgesi vardır, uygun sınırlama enzimi ile her bir prob için cDNA, 5 ug sindirilmesi ile cDNA aşağıdaki plazmid saflaştırma Linearize.
- Fenol / kloroform ekstraksiyon yöntemi kullanılarak doğrusallaştırılmış DNA arındırın. 4 13,000 rpm'de 3 dakika ° C ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde tepe, fenol / kloroform spin eşit hacimde Temiz tüpe üst sulu faz transfer ve kloroform eşit miktarda ekleyin. 4 ° C'de 13,000 rpm'de 3 dakika boyunca Spin Temiz bir tüp içine üst sulu faz transfer. Bir gece boyunca -20 ° C'de çökelti DNA ve saklamak için% 10 sodyum asetat (3 M) ve% 100 etanol içinde 2.5 x hacim eklemek. 4 ° C'de 13,000 rpm'de 15 dakika için Spin Etanol çıkarın ve% 75 etanol ile pelet yıkayın. Protokol durdurulabilir ve DNA st edilebilir-20 ° C'de ORed ve ertesi gün devam etti. 4 ° C'de 10,000 rpm'de 10 dakika için Spin Dikkatlice süpernatantı ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca pelet kurutun. 20 dakika boyunca 55 ° C'de DEPC su tedavi ve inkübe 10 ul pelletini. UV spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçmek.
- % 1 agaroz jel üzerinde, DNA 1 ul kullanarak ve yaklaşık 30 dakika boyunca çalışan agaroz jel elektroforezi ile saflığını değerlendirmek.
- RNA etiketleme reaksiyon ayarlayın. Bir RNaz serbest reaksiyon şişesi kullanılarak, 13 ul'lik bir hacme kadar DEPC ile muamele edilmiş, iki kez damıtılmış su, steril, RNaz içermeyen için şablon saflaştırılmış DNA 1-5 ug ekleyin. Buz üzerinde reaksiyon şişesi soğuk ve (bkz. Tablo 3), aşağıdaki reaktifler ekleyin:
- Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 2,000 rpm'de santrifüj ile kısa altında toplanır ve 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir Reaksiyon karışımı, daha sonra yavaşça reaktif karışımı ° C
- 37 ° C'de 30 dakika boyunca 2 ul RNase içermeyen DNase I inkübe ekleyerek, şablon DNA çıkarın ve 2 ul 0.2 M EDTA (pH 8.0) ilave edilerek, reaksiyon durur.
- 2.5 ul 4 M LiCI ve 75 ul% 100 etanol ilave edilerek reaksiyon ürünleri hızlandırabilir. Çözüm karıştırın ve 45 dakika o için -20 ° C'de tutmakR, -20 ° C'de saklanan aşırı gece ve protokol ertesi gün devam etti.
- 2 dakika boyunca kuru bir 10 dakika boyunca -20 ° C de muhafaza santrifüj 500 ul% 70 etanol ile pelet yıkama, daha sonra 4 ° C'de 13,000 rpm'de 30 dakika boyunca santrifüje süspansiyonu, 50 ul içinde yeniden süspanse ve inkübe 37 ° C'de 30 dk
- Yaklaşık 30 dakika boyunca% 1 agaroz jeli üzerinde 1-2 ml çalıştırarak prob kalite ve bütünlüğünü doğrulamak. Bu jel üzerinde beklenen boyutta çalışan tek bir ürünün varlığı ile teyit edilir.
- Spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ölçerek prob konsantrasyonunu ölçmek. Bu reaksiyondan elde edilen RNA verimi 10 mg (ul / 100-200 ng) ile ilgilidir.
- 1. GÜN
- Rehidrasyon
- Naylon örgü (en az 1 mm gözenek boyutu) ve Eppendorf tüpler kullanılarak sepet hazırlayın. Cuttin tarafından sepetleri ConstructEppendorf tüpleri gr (1.5 mL) konik uçları kaldırın. Bireysel sepetleri farklı renkli tüpleri kullanmayın belirlemek ve üst kaldırmak için bunların yarısından itibaren jantlar.
- Eppendorf tüpleri arasında kesik uçlara kapsayacak şekilde naylon örgü küçük parçalar. Bir davlumbaz bir elektrik sıcak plaka (yüksek, orta arasında ayarlanabilir) bunları ısıtarak naylon örgü için tüplerin kesim uçları sopa. Soğuduktan sonra sepet gelen aşırı naylon örgü çıkarın ve oda sıcaklığında% 100 metanol saklayın.
- % 100 ardından altı oyuklu plakalar ilk üç kuyu kullanarak PBS içinde metanol art arda seyreltmeleri (% 75 [hacim / hacim [metanol,% 50 [hacim / hacim] metanol ve% 25 [hacim / hacim] metanol) hazırlanması PBST (fosfat% 0.1 Tween-20 içeren tamponlu tuz) önümüzdeki üç kuyularda.
- In situ figureâ 1a ve b'de gösterildiği gibi, özel yapılmış sepet kullanılarak melezleştirme prosedürü tabi embriyolar. Hibridizasyon için RNaz ücretsiz çözümler kullanın6-delikli plakalardaki yon Adım (4 ml / oyuk). Bu amaca ulaşmak için, iyi ilk 6 sepet kadar yerleştirin. Jant ile yer sepeti ilk ardışık düzenlenmiş farklı renklerde jantlar olmadan sepetleri izledi. 6 adede kadar gen ekspresyonu için bu düzenleme kullanılarak eş zamanlı olarak tespit edilebilir.
- Aynı sepet (bkz. Şekil 1) için aynı gelişim aşamasının susuz embriyolar yerleştirin.
- Altı-plaka de bir sonraki (her adım için 5 dakika) sepet taşıyarak embriyolar rehidrate. Uygun bir tampon ile dolu altı kuyu kullanın. Embriyolar kez her seyreltme tabi tutulur. Bu şekilde embriyolar 6x, 5 dak / yıkama yıkanır. Susuz embriyoların rehidrasyon ve daha sonra% 100 PBST ile 3 kez yıkanarak PBS ile metanol değiştirilmesi ile elde edilir.
- Tablo 4 'de gösterildiği gibi geçirgenliği Digest oda sıcaklığında proteinaz K (10 mg / ml) ile rehidrate embriyolar geçirgen hale getirilmesinin
Embriyonik Evre (saat sonra döllenme) Sindirim Dönem (proteinaz K) 6'ya kadar 15 sn 6-12 30 sn 12-18 3 dk 24 12-15 dk 48 25-30 dk 72 40 dakika 96-120 50 dakika Tablo 4. Permeabilization reaksiyon.
- Postfiksasyon ve PBST Yıkama
- 20 dakika boyunca 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehid (ağırlık / hacim) içinde inkübe edilerek embriyolar düzeltildi.
- Embriyolar 3x yıkama artık paraformaldehid çıkarın, 5 1x PBST dakika / yıkama,.
- Asetilasyon, her biri 10 dakika için iki kere asetilasyon karışımı (10 mi GKD 2 O 125 ul, trietanolamin ve 27 ul asetik anhidrid) ve inkübe embriyolar hazırlayın. Gerektiğinde endojen fosfataz aktivitesi en aza indirmek için, taze asetilasyon karışım hazırlayın. Aşırı reaktif kaldırmak için, (10 dk / yıkama) PBST iki kez embriyolar yıkayın
- Prehybridization 1.5 ml steril Eppendorf tüplerine sepet embriyolar transfer ve 70 ° C su banyosunda 2-4 saat için 200 ul hibridizasyon karışımı ile kuluçka embriyolar Prehybridize.
- Antikor Preadsorption sepetleri yaklaşık 50 embriyo çıkarın ve bir 1.5 ml steril Eppendorf tüpleri aktarabilirsiniz. Blokaj tamponu ile anti-DIG-AP (1:500) antikoru (1x PBST,% 2 dana serumu [hacim / hacim], 2 mg / ml sığır serum albumini [BSA]) 2-4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 4 ° C gecede de saklayın. Bir sabah inkübatör kaldırd embriyolar oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
- Hibridizasyon prehybridized embriyoların prob 100-200 ng ekleyin ve 70 gece boyunca inkübe ° C su banyosunda.
- Rehidrasyon
- 2. GÜN
- SSC (Tuzlu-sodyum sitrat) yıkar
- Hibridizasyon karışımı Sıra 50 ml tüpler (HM), bir 70 ° C su banyosu içinde, su ve en az 20 dakika boyunca bunların ön ısıtılması ile beher 2x SSC ve 0.2x SSC. Prob hibridizasyonu içeren reaksiyon karışımı, kaldırma, tüpler, ön ısıtmalı melezleme karışımı, 1 ml, 70 ° C'de 15 dakika inkübe ° C , Ayıraç fazlasını uzaklaştırmak için% 25 HM ile en az% 50 ile% 100 HM ile değiştirerek 2x SSC, önceden ısıtılmış HM çeşitli seyreltileri ile altı oyuklu plakalar doldurun.
- Beklerken, yıkama için 2x SSC ile altı kuyucuğu doldurmak ve 70 onları tutmak ° C
- 15 dakika sonra yere sepet tüpten embriyolar seyreltme ile dolu altı plaka tutulur2x SSC ile HM s ve bir sonraki (70 ° C su banyosunda 15 dk) iyi birinden sepeti taşıyarak melez embriyolar yıkayın. 70 100% 2x SSC embriyolar 2x, 15 dakika / yıkama, yıkama ° C
- 65 başka bir su banyosu ° C ayarlayın Yüksek darlığı için 0.2x SSC ile altı kuyucuğu doldurun prob ile transkript spesifik olmayan hibridizasyon önlemek için yıkar.
- Embriyolar 70 ° 2x SSC ile iki kere yıkandı, sonra ° C, 0.2x SSC, 65 ek olarak iki 30 dakika yıkama takip ° C
- PBST Yıkama aşağıdaki gibi PBST 0.2x SSC, art arda seyreltmeleri ile altı oyuklu plakalar hazırlayın:% 75 (hacim / hacim) 0,2 X SSC,% 50 (hacim / hacim) 0,2 X SSC,% 25 (hacim / hacim) 0.2x SSC, ve kalan iki kuyu% 100 PBST ile. (Bir rocker kullanılarak oda sıcaklığında her bir adım boyunca 5 dakika) de bir sonrakine hareket ettirerek, sepetin melezleştirilmiş embriyolar yıkayın.
- Blo oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca ön kuluçkalama Preincubate embriyolarcking tamponu (1x PBST,% 2 dana serumu [hacim / hacim], 2 mg / ml BSA).
- ° C'de hafifçe çalkalanarak gece boyunca 4 ° tampon engelleme anti-DIG-AP antikoru (1:5,000) içindeki bir çözeltisi ile bir anti-DIG antikor inkübe embriyolar ile inkübasyon.
- SSC (Tuzlu-sodyum sitrat) yıkar
- 3. GÜN
- PBST Yıkama iyi 4 ml / PBST ile altı-iyi tabak hazırlayın. 15 dakikalık süre için 6x PBST ihtiva eden altı-plaka sepet hareket ederek inkübe edilmiş embriyolar yıkayın. Embriyolar, 4 ° C'de saklanan ve protokol ertesi gün devam edilebilir.
- BCIP varlığında (5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat) ve NBT (nitroblue tetrazolium) içinde kuluçkalamadan önce hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında prestaining tamponu ile 15 dakika boyunca 2 x yıkanarak embriyolar Prestain Prestaining. BCIP ve NBT alkalin fosfataz aktivitesinin renk gelişimi için kullanılan sübstratıdır. Sondalar Alkali fosfataz inci ile bağlı olduğundanmor renk e geliştirilmesi hedef genin ekspresyonunu gösterir. Embriyolar, 4 ° C'de saklanan ve protokol ertesi gün devam edilebilir.
- Boyanma
- 30 dakika boyunca BCIP ve NBT ile karanlıkta, oda sıcaklığında embriyolar inkübe edin.
- Boyama reaksiyon, bir stereo mikroskop kullanarak 30 dakika izler. Reaksiyon süresi genin ifade seviyesini bağlı olarak 15 dakika-16 saat arasında değişir. Reaksiyon süresi zayıf ifade genler için son derece olarak ifade edilen genlerin için daha kısa ve daha uzundur. Ilgi gen tamamlayıcı antisens (AS) transkript ifade ise Sense prob sinyalleri algılar.
- Arzu edilen boyama yoğunluğu sonra dur Reaksiyon ulaşıldığında, durdurma çözeltisi (1 x PBS, pH 5.5, 1 mM EDTA,% 0.1 Tween) ihtiva eden oyuklara embriyoları içeren sepet aktararak reaksiyonu durdurun. Bu renk daha da geliştirilmesi kaçınır. Nazik ag ile bir rocker 10 dakika 2x için embriyo durulamaOda sıcaklığında rehabilitasyonu amaçlayan.
- Postfiksasyon
- 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid (ağırlık / hacim) içinde embriyo inkübe edin.
- Kalıntı paraformaldehid çıkarmak için PBST ile embriyolar (5 dak / yıkama) üç kez yıkayın. 4 ° C de karanlıkta durdurma çözeltisi içinde sabitlenmiş embriyolar saklayın
- , Montaj Gözlem ve Resim Alma
- PBS mümkün olan en düşük hacmi ile% 100 gliserol ihtiva eden bir altı-plaka embriyolar aktarın. Bir rocker altı plaka koyun ve karanlıkta, oda sıcaklığında gece boyunca çalkalayın.
- % 100 gliserol embriyo yerleştirin ve daha sonra bir stereomikroskop altında sinyal gözlemlemek.
- Görüntüler Edinme ve TIFF dosya biçimi veya Photoshop (Şekil 3-6) olarak görüntü yazılımı aracılığıyla yüksek kaliteli görüntüler üretiminde izin başka bir türü olarak kaydedin.
- Çift elde etmek için 1.1 'den yukarıda tarif edilen yönteme markalama - 1.3.1.7 kullanılabilir, ancak hibridizasyon sırasında digoxygenin ve floresan işaretli problar eşzamanlı olarak inkübasyon içerir.
- Sonrası hibridizasyon yani SSC ve PBST yıkar (adımları 1.3.2.1 ve 1.3.2.2) ve engelleme inkubasyon (adım 1.3.2.3) yıkar için aynı prosedürü izleyin. Sıralı olarak aşağıda tarif edildiği gibi antikor ve boyama reaksiyonları gerçekleştirmek.
- 4 de AP çiftli-anti-digoxigenin antikor (1:5,000) ° yavaşça sallanarak C ile embriyolar inkübe edin.
- Yıkama ve BCIP-NBT (adımları 1.3.3.1 - 1.3.3.6) ile kuluçkaya yatmaktadır.
- Algılama ardından, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında iki kez PBST ile embriyolar yıkayın.
- Anti-digoksigenin antikor etkisiz hale getirmek için 30 dakika boyunca 1 mM EDTA ile 65 ° C 'de PBST embriyolar inkübe edin.
- % 75,% 50, ve% 25 metanol zekâ rehidrasyon takip% 100 metanol embriyolar inkübe1 saat için PBST geri saat PBST ve.
- 4 ° C sıcaklıkta hafifçe çalkalanarak tampon engelleme AP çiftli floresein (1:2,000) ile gece boyunca inkübe embriyolar.
- PBST (adım 1.3.3.1) ve 2 kez önceden lekeleme tampon maddesi ile 15 dakika boyunca ön-leke embriyolar embriyo yıkayın hızlı kırmızı varlığında önceden kuluçkaya hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında (0.1 M Tris-HCI, pH 8.2) . Protokol durdurulabilir ve embriyolar saklanabilir 4 ° C sıcaklıkta hafifçe çalkalanarak ve ertesi gün devam etti.
- Kullanımdan hemen önce, tampon boyama, 2 ml bir Hızlı Kırmızı tablet çözülür.
- Hızlı Kırmızı reaktif ile boyama tamponu embriyolar yerleştirerek boyama reaksiyon başlar.
- Istenen boyama yoğunluğu ulaşıldığında boyama reaksiyonu durdurun. 4 boyanması zaman gece boyunca bir ya da iki gün için oda sıcaklığında bir kaç saat arasında sürebilir ° C Boyama yoğunluğu daha da geliştirmek veya spesifik olmayan göstermeye başlar yoksa hemen reaksiyon durdurunanlamda kontrol ile karşılaştırıldığında Sığ.
- Yani kalan adımları sonrası tespit için yukarıda belirtilen işlemleri, montaj, gözlem ve görüntü elde etme (steps1.3.3.5 ve 1.3.3.6) izleyin.
| Reaktif | Hacim |
| Şablon DNA, | 100 ng |
| PCR Buffer (10x) | 5 ul |
| dNTP (10 mM) | 2 ul |
| Astarlar (10 mM) | 1 uM, her |
| Bir son hacme kadar su ilave | 49.7 ul |
| Taq Polimeraz (5 adet / & #956; l) | 0.3 ul |
| Reaksiyon hacmi | 50 ul |
Tablo 1. PCR reaksiyonu.
Tablo 2. TOPO klonlama reaksiyon.
| Reaktif | Hacim |
| NTP etiketleme karışımı (10x) | 2 ul |
| Transkripsiyon tutkunuer (10x) | 2 ul |
| Koruyucu RNaz inhibitörü | 1 ul |
| RNA Polimeraz SP6 veya | |
| RNA Polimeraz T7 | 2 ul |
| Son Ses | 20 ul |
Tablo 3. RNA etiketleme reaksiyon.
Yerinde Hibridizasyon 1.3 Tüm montaj
ben n Situ Hibridizasyon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sepet başına 50 embriyo (gen / başına deneysel koşul için) söz konusu genin ifade deseni bir deneyde elde edilebilir olan protokolü kullanarak. Hemen hemen tüm embriyolar belirli bir gen için benzer ekspresyonu göstermektedir. In situ hibridizasyon boyama için temsili örnekler Şekil 3-6 'de gösterilmektedir.
Anlamında ve anti-anlamda hem riboprobes PC5.1 karşılık gelen cDNAs, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, flk / kdrl 10, shh 11, dlx2 12, fkd7 gelen sentezlendi / foxa1 13, insülin 14,15, 16 ve tripsin, Taq DNA polimeraz kullanılarak, tam uzunluktaki bir mRNA kademeli amplifikasyonuyla inşa edilmiş ve pCRII-TOPO (Invitrojen) içine klonlanmıştır. Bireysel amplikonların orijinal dizi analizi ile teyit edilmiştir. Klon yönelim doğrulama sonra, ilgili antisens riboprobes sentezlendiya da SP6 ya da T7 RNA polimeraz kullanılarak burada tarif edilen değişiklikler 18,19 ile 17 protokolleri kullanarak. In situ hibridizasyon bütün montaj ile ilgili aşamalar, Şekil 2'de kısaca gösterilmiştir. Ilgi Spastine Özgü Riboprop ile hibridizasyon sonrası gözlenen mor boyama bolluk ve özellikle gen ifade siteleri hem de temsil eder. Örneğin PC5.1 için 24hpf de otik vezikül ve yanal çizgi primordium ön ve arka parçası içinde çok ayrık ifade gösterir ve güçlü 72 hpf (Şekil 3) ile ön ve arka yanal çizgi neuromasts yerleşmiştir. Aksine PC5.2 gösterir Somitlerin, otik vezikül ve Pronephric kanal içinde ve farklı bölgeselleşme ile CNS içinde her yerde ifade yüksek 96 hpf (Şekil 4) de karaciğer ve bağırsak içinde ifade edilir. İlgili anlamda riboprobes kullanılarak gen ifadesinin bulunmaması negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. (
Şekil 1. Tutmak için hazırlık ve Eppendorf-naylon kullanımı örgü sepet embriyolar düzenledi. Bir iyi altı Eppendorf-naylon örgü sepet tutabilir. Dosyasını altı Eppendorf naylon örgü sepet ihtiva eden 6-çukurlu steril plakalar gösterirPBS içinde metanol art arda seyreltmeleri için de kullanılır.
Şekil 2. In situ hibridizasyon tekniği tüm montaj dahil adımları gösteren diyagram. Tespit aşamalı sonra, kullanılıncaya kadar embriyolar, -20 ° C'de metanol içinde saklanabilir. Sondalar önceden sentezlendi ve -80 tutulabilir ° C Onlar uzun süre kullanılan istiyorsak küçük hacimde depolama sondalar tavsiye edilir. In situ hibridizasyon deneylerinde genel olarak tüm montaj 3 veya 4 gün içinde tamamlanabilir. Zayıf ifade genler için boyama reaksiyon boyama reaksiyon 4 de yapılmaktadır zaman artık oda sıcaklığında 16 saat kadar sürebilir ya da olacak ° C büyük f görmek için buraya tıklayınŞEKIL.
Şekil 3. Situ hibridizasyon analizlerinde tüm montaj tarafından PC5.1 ifadesi 24 hpf ve 72 hpf sahnelenen embriyoları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 24 hpf embriyoların (a) Yanal görünümü ön içinde PC5.1 çok ayrık ifade göstermek ve PC5.1 antisens Spastine Özgü Riboprop kullanarak otik vezikül ve yanal çizgi primordium posterior kısmı. 72 hpf spesifik boyanması ön ve arka yanal çizgi neuromasts içinde gözlenmiştir. (B) PC5.1 anlamda Spastine Özgü Riboprop kullanarak gen ifadesinin olmaması bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
gether.within-page = "her zaman"> 
Şekil 4. PC5.2 in situ hibridizasyon analizleri 24 hpf ve 96 hpf tüm montaj anda PC5.2 anti-duyu ve duyu riboprobes kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (A) 24 hpf embriyoların Yanal görünümü CNS içinde her yerde ifade göstermek, otik vezikül ve Pronephric kanal Somitlerin. Karaciğer ve bağırsak belirli boyama PC5.2 antisens Spastine Özgü Riboprop kullanarak 96 hpf görülmektedir. (B) PC5.2 anlamda Spastine Özgü Riboprop kullanarak gen ifadesinin olmaması bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
"oad/50644/50644fig5.jpg" width = "500px />
. Şekil 5 SCL/tal-1 Spastine Özgü Riboprop kullanarak 24 hpf situ hibridizasyon analizlerinde Tüm montaj ikili kafatası hücreleri içinde ve ara hücre kütlesi (ICM) boyama gösterdi; gata-1 Spastine Özgü Riboprop boyama ICM görülür; flk Beyin, ana ve intersegmental damarları içinde ve ICM / kdrl ifade. Shh için boyama Notokordun gözlenmiştir.
. Şekil 6 dlx2 Spastine Özgü Riboprop kullanarak 34 hpf situ hibridizasyon analizlerinde Tüm montaj telencephalon, diensefalon, hipotalamus, ve kranial ectomesenchymal kemerlerin dlx2 ifade ortaya; 24 hpf fkd7/foxa1 ifade zemin p ağırlıklı olarak görülürgeç ve hypochord, insülin boyama ekzokrin pankreas endokrin pankreas ve tripsin ifadesinde görülmektedir.
Şekil 7. Yeterli geçirgenliği ve uygun hibridizasyon sıcaklık situ hibridizasyon sinyalleri net için önemlidir. Embriyolar tarafından permeabilize zaman bir shh Spastine Özgü Riboprop kullanarak 24 hpf ve 48 hpf situ hibridizasyon analizlerinde Tüm montaj arka plan sinyali olmadan Notokordun ve taban içinde ifade ortaya 12-15 dakika ve 70 ° C'de hibridize için proteinaz K tarafından sindirilmeye Embriyoların yetersiz sindirim (5 dk proteinaz K tedavisi) veya düşük sıcaklıkta melez maruz zaman eksik ekspresyonu ve yüksek arka plan sinyalleri gözlendi (60 ° C). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz yüksek çözünürlüklü RNA görselleştirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirdik. In situ hibridizasyon prosedürlerinde gözenekli alt (Şekil 1) ile basit bir ölçüye sepet ile gerçekleştirilmektedir. Embriyolar, steril koşullar altında, oda sıcaklığında 6 oyuklu plakalarda RNase içermeyen çözeltiler kullanılarak işlenir.
Ayırmak için embriyolar sepetleri farklı renkli Eppendorf tüpleri yapılır. Ya da bir ağız olmadan Sepetler kolay yönlendirme için kullanılan ve bir sonda olarak tekabül sepet içinde embriyolar tespit etmek.
65 Ön-hibritleme 70 ° C sıcaklık ve% 50 hibridizasyon ° deiyonize formamid C yüksek çözünürlüklü elde etmek için sinyallerin özellikle önemli olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak 15 dakika sonrası için PBST ile alkalin Tris tamponu ile iki kere embriyo inkübe bir anti-DIG antikoru ve BCIP varlığında, inkübasyon öncesi ile inkübasyondan sonra yıkar veNBT yüksek kaliteli net sinyallerin görünümünü kolaylaştırır. Bizim ellerde biz 70 en uygun zaman ve hibridizasyon için embriyo permeabilization ve sabitleme ° C net sinyaller elde çok kritik olduğunu yaşadı. Yetersiz geçirgenliği yüksek arka plan sinyalleri üretti. Uzun sabitleme sinyal algılama inhibe ise Genişletilmiş permeabilization veya yetersiz sabitleme embriyoların bozulması sonuçlandı. 55-60 arasında Hibridizasyon ° C de yüksek arka plan sinyalleri (Şekil 7) üretti.
Ilgi gen antisens (AS) transkript kodlar ise anlamda prob transkript AS için bir sinyal algılar. Boyama Reaksiyon, 30 dakika boyunca metanol içinde embriyo yerleştirme durdurulduğunda ya da daha uzun bir gerçek mor renge sinyaline dönüştüren ve non-spesifik boyama kaldırır sonra. Sabit embriyolar birkaç ay boyunca 4 ° C'de durdurma çözeltisi karanlıkta saklanabilir.
Avantajları ve disadvantagDİLERİZ es
DİLERİZ embriyogenez sırasında hedef genlerin zamansal ve mekansal ifade ve larva aşamalarını hem karakterize etmek için etkili bir tekniktir. Bu protokol, aynı zamanda, deney hedeflerine bağlı olarak uygun bir modifikasyon ile iki gen, ya da aynı zamanda RNA ve protein ekspresyonu co-lokalizasyon RNA ifade görselleştirme izin verir. Bu yüksek çözünürlük protokol birçok doku ve hücre tipi içinde RNA ekspresyonu tespit etmek için kullanılabilir. Bu, en az arka plan sinyali ile çok düşük bol RNA türlerinin tespiti için de kullanılabilir. Ancak, dokuların iç bölmeleri içinde genlerin doğru ifade görselleştirmek için doku bölümleri kullanarak in situ hibridizasyon gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
