Summary
치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.
Abstract
현미경에서 수동 세포 수는 세포 생존 능력을 평가하는 중요한 수단이지만 시간이 많이 소요되므로 고가이다. 컴퓨터 생존 분석 장비의 측면에서 비용이 더 빠르고 더 객관적인 수동 세포 수보다 수 있습니다. 본 보고서는 이러한 세 생존 분석의 사용을 설명합니다. 이러한 분석의 두 적외선이며, 하나는 발광입니다. 두 적외선 분석은 16 비트 오디세이 이미 저에 의존하고 있습니다. 한 적외선 분석은 세포 기질에 대한 사파이어의 얼룩과 함께 핵의 DRAQ5 얼룩을 사용하고 700 nm의 채널을 시각화한다. 다른 적외선 분석, 인 - 셀 양식, 세포 골격 단백질 (α-tubulin의 또는 미세 소관 관련 단백질 2)에 대한 항체를 사용하여 800 nm의 채널을 레이블. 세 번째 생존 분석은 ATP를 위해 일반적으로 사용되는 발광 분석이지만, 우리는 비용을 절약하는 데 권장되는 볼륨의 내무반을 사용합니다. 이들 측정은 모두 선형 및 세륨의 개수와 상관 관계LLS 도금,하지만 감도에 따라 다릅니다. 세 가지 분석법은 시간 소모적 현미경을 회피하고 전체를 잘 샘플링함으로써 샘플링 에러를 감소시킨다. 마지막으로, 분석의 모든 쉽게 짧은 시간 프레임 내에서 수행되는 실험의 많은 수 있도록, 실험의 단부 중 하나 일 이내에 완료 될 수있다. 그러나, 그들은 모두 세포 수는 치료, 때때로, 특히 셀룰러 ATP에 대한 충족되지 않은 가정 후, 신호 강도에 비례하여 유지한다는 가정에 의존한다. 세포가 증가하거나 치료 후 감소 사이즈면 더욱이,이 세포 수에 영향을주지 않고 신호 강도에 영향을 미칠 수있다. 우리는 수동 계산을 포함한 모든 가능성의 분석은,주의 사항의 숫자에서 고통 결론하지만 컴퓨터 생존 분석은 초기 투자 가치가 있습니다. 세 가지 분석을 함께 사용하면 세포의 구조와 기능에 대한 포괄적 인 뷰를 생성합니다.
Introduction
생물 과학에서 가장 일반적인 생존 분석은 세포 수를 포함한다. 이것은 2013년 4월 29일 및 2013년 4월 30일의 키워드 중 하나 "시험관"또는 "문화"로 PubMed를 등장 최고 (가장 최근) (200) 출판물의 분석에 의해 입증된다. 이 간행물의 수동 세포 수의 계산을 포함하여 23.5 % 사용하는 세포 수의 분석은 자동화 된 세포 수는 이미징 소프트웨어를 사용하여 계산하고 트리 판 블루 배제. 라이브 / 데드 분석은이 책의 1 %에 사용되었다. MTT (3 - (4,5 - 디메틸 티아 졸 -2 - 일) -2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드)하여 출판물의 개수 대사 생존력에 대한 분석은 11 %였다. 문학의이 조사는 또한 세포 수의 분석과 함께 같은 MTT 등의 분석을 사용하여 출판물의 수는 3.5 %였다 있음을 보여줍니다. 휴대폰 번호와 함께 세포 기능을 평가, 그 자체로 하나의 생존 분석을 사용하는 추세는 휴대 전을 평가하기위한 최선의 선택을 보인다에도 불구하고ntegrity. 나머지 세포가 기능 또는 그들이 잘 1,2에 존재에도 불구하고 건강한 수없는 경우가 있기 때문에 그 자체로 세포 수는 충분하지 않다. 반대로, 같은 ATP와 같은 기능적 수단 증가 또는 세포의 수가 병렬 변화의 부재에서 저하 될. 휴대폰 번호에서 대사 판독 값의 연결을 풀기는 ATP와 MTT 분석이 유일한 생존 분석으로 사용하지 말아야하는 것이 좋습니다. 본 보고서에서는, 세포 구조와 대사 기능을 모두 조사 세 생존 분석은 감당할 수있는 그 자체로 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 뷰에 대해 설명합니다.
우리의 분석의 두 개는 700과 800 nm의 채널에서 형광을 측정하는 적외선 이미 저를 필요로합니다. 잡음은 높은 신호 - 대 - 잡음 비 (3)에 이르는, 적외선 파장에서 낮다. 우리가 사용하는 오디세이 화상 카메라는 4.5 로그 동적 범위와 16 translatin의 비트 깊이적외선의 2 (16) 또는 65,536 그늘에 g. 이뿐만 아니라, 각각의 파장에 대해 색이 8 또는 256 음영을 수득 8 비트 컬러 이미징, 대조 할 수있다. 따라서, 16 비트 영상은 미세한 해상도를 가지고 있습니다. 원래 적외선 이미지는 종종 프레젠테이션 게시 된 보고서에 (800 NM)과 적색 (700 nm의) 녹색 모조 착색되는 것을 주목해야한다. 오디세이 화상 카메라는 일반적으로 웨스턴 블로 팅과에서 셀 서부 4-7 모두에 사용됩니다. 에서 셀 포름 알데히드 고정 된 세포에 서부는 관심의 단백질에 대한 일차 항체를 사용하여 적외선 형광 보조 항체 차례로 레이블을 지정. 이 기술은 인산화 엔드 포인트 6에 특히 유용한 것으로 알려져있다. 우리의에서 셀 서부에서, 우리는 세포 골격 단백질 α-튜 불린 또는 800 nm의 채널에서 신경 미세 소관 관련 단백질 2 (MAP2)에 대한 고정 된 세포를 얼룩. 이들 단백질은 높은 신호 - 대 - 잡음 비를 수득 할 정도로 풍부하다. 우리는 또한 700에있는 우리의 판을 얼룩DRAQ5의 얼룩과 사파이어 얼룩 세포질에 대한 핵에 대한 나노 채널. 세포 골격 단백질과 DRAQ5 + 사파이어 얼룩 두 따라서 세포 구조를 반영합니다.
제 생존력 분석은 대사 기능을 측정하여 호출 "셀 역가 글로."이 루시페라아제 기반 분석에서, 발광 값 ATP 농도에 정비례한다. ATP 분석은 일반적으로 가능한 세포에게 8-12을 정량화하는 데 사용됩니다. 셀 당 ATP 출력 독소 치료의 함수로 변경할 수 있기 때문에, 분석의 이름으로 단어 "역가"를 포함하는 것은 다소 명칭이 잘못된 것입니다 및 휴대폰 번호 8에 비례하므로 항상이다. ATP 농도는 13 시간주기 리듬에 의해 세포 분열 (14) 및 세포 분화 (15)에 의해 영향을받을 수있다. ATP 대사의 강력한 측정하기 때문에 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된 ATP 분석을 수행 간단하고 유용합니다생존 16-21, 자체 수를 셀하지 않을 경우. 서부 따라서 혼자 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 사진을 얻을 수에서 셀 적외선을 보완하기 위해이 분석을 사용하여.
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Protocol
프로토콜의 개략도는도 1에 도시되어있다.
1. 셀 도금
다른 도금 밀도 (그림 2)에서 96 - 웰 플레이트에 플레이트 세포. N2A 신경 모세포종 세포주, 플레이트 2.5K, 5K, 10K, 3 또는 6 우물 / 그룹에 잘 당 15,000 세포에 선형성을 확인하십시오. 쥐의 기본 대뇌 피질의 뉴런, 플레이트 25K, 50K, 100K, 3 또는 6 우물 / 그룹에 잘 당 200K 세포에서 선형성을 확인하십시오. 세포주 또는 그 일차 전지는 다른 도금 밀도, 플레이트 그 세포 유형에 대한 최적의 세포 밀도의 주위에 건강한 보면.
주 : 본 연구에서는 N2A 세포가 낮은 증발을 위해 설계 플레이트에 200 ㎕의 미디어에 100 ㎕의 미디어 및 기본 대뇌 피질의 신경 세포에서 도금했다. 세포 처리, 미디어, 혈청, 항생제, 독소의 치료에 대한 자세한 내용은 Unnithan 등을 참조하시기 바랍니다. N2A의 CEL에 대한LS 8 Posimo 등. 기본 피질 문화 22.
- 제 96 - 웰 플레이트에 도금을 반복합니다. 하나의 플레이트 ATP (그림 2A)에 대해 분석하고, 적외선 분석 (그림 2B)와 다른 것입니다. 세포가 세포 내 ATP 측정을 위해 열린 용해되어야하기 때문에 하나는 ATP와 적외선 분석에 대해 동일한 플레이트를 사용할 수 없습니다.
- 최적의 도금 밀도 (; 그림 2B 2 열)에서 적외선 분석의 배경 빼기 적어도 3 여분의 우물을 판에해야합니다.
- 행과 H 및 열 1에서 12의 외부 우물에 더 저렴하게 세포가없는 미디어 나, 멸균 물을 추가합니다. 생존 미디어 증발 온도 구배의 영향으로 낮은 여기 자주로, 가장자리를 따라 우물의 데이터에 의존하지 마십시오. 마이크로 플레이트와 이러한 문제는 일반적으로 가장자리 효과 (23, 24)라고합니다. 비어있는이 우물을 보관하지 마십시오다음 행 B와 G 및 열 2 (11)는 가장자리 효과로 고통 때문이다.
가장자리 효과는 CO 2 인큐베이터 (24)로 전송하기 전에 주변 조건에서 실온에서 갓 시드 플레이트 잠복기에 의해 감소 될 수있다. 또한, Carralot의 최근 연구는 단일 제어 칼럼 (23)를 사용하여 마이크로 플레이트에 대한 수학 보정 방법에 대해 설명합니다. 올리버와 동료는 열 구배 (25)을 줄이기 위해 특별히 설계된 강제 공기 microtitration 판 인큐베이터를 사용했습니다. 에지 효과가 중요한 관심사 인 경우, 마이크로 안정성 챔버 (예를 들어, BT & C 법인)은 높은 습도와도 온도 구배를 가진 균일 한 미세 환경을 만들기 위해 구입하실 수 있습니다. - 추가적인 시약 희석액 이상의 도금 밀도가 테스트되기 때문에도 1에 도시 된 것보다 더 많은 웰이 필요한 경우, 배경 공제 에지 웰을 사용한다.
- 부착을 위해 밤새 대기세포 분석 및 후술 이튿날 아침의.
2. 발광 ATP 분석
- 버퍼 기판의 재구성 및 배양 시간에 대한 세포 역가 글로 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
- 각각 도금 미디어의 100 또는 200 ㎕의 50 또는 150 ㎕의 매체를 제거합니다. 약간 적은 50보다 μL은 잘 배후에 남아있을 것입니다. 1:2 희석에 열을 2-6 (그림 2A)에 시약 (기판 플러스 버퍼)의 25 μl를 추가합니다.
참고 : 제거가 차별적으로 우물을 통해 ATP 분석 시약을 희석 또는 농축 수 후 미디어의 가변 볼륨이 남아. 모든 멀티 채널 피펫 팁에있는 액체의 수준이 상당 수 있도록주의하십시오. 즉시 정확성을 보장하기 위해 ATP 분석 시약을 추가하기 전에 피펫와 함께 접시에 걸쳐 선택 우물에 남아있는 액체를 측정합니다. 높은 변동성 미디어 에바의 차등 요금에서 존재하는 경우플레이트의 표면을 가로 질러 ATION 모든 이전 미디어를 제거하고 즉시 ATP 분석 시약의 첨가 전에 모든 웰에 신선한 미디어 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 동일 부피를 추가한다. 판 증발의 변수 수준에서 고생하는 경우, 코스타 (Costar) 코닝의 낮은 증발 접시로 전환하려고합니다. 후자의 번호판,도 2에 도시 된 60 웰 내부는 0.995 %의 평균에서 0.41 미디어 증발 밤새 ± 고통. 분석시의 매체 볼륨 무시할 가변성 따라서있다. - 위에 설명 된대로 열에서 7 ~ 11, 행 B D를 통해, 뒤에 50 μl를 떠나 충분한 용지를 제거하고, 1:1 희석 시약의 50 μl를 추가합니다.
- 열에서 7 ~ 11, G 통해 행 E는 미디어 100 μl의 세포를 떠나 1:1 희석 다시, 시약 100 μl를 추가합니다. 이 회사는 시약 100 μL 미디어 100 μL에 1:1로 희석해야하는 것이 좋습니다.
참고 : 위해비용을 절약하기 위해서는 볼륨에 희석 모두 이러한 권장 사항을 절단 할 수 있습니다. 그러나,이 일을하기 전에, 그것은 분석의 선형성과 민감도를 감소시키지 않도록. - 하나의 특정 볼륨과 시약의 희석 배수가 만족스러운 것으로 판명되면, 이후의 모든 실험에서 그들과 함께 스틱. 만족스러운 데이터에 대한 기준은 결과 섹션에 설명되어 있습니다.
- 사용되지 않는 재구성 시약은 다시 냉동과 비용을 절약하기 위해 나중에 사용할 수 있습니다. 제조 업체에 따르면, 재구성 시약은 활동 ~ 3 % 손실 21 주 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 각각 도금 미디어의 100 또는 200 ㎕의 50 또는 150 ㎕의 매체를 제거합니다. 약간 적은 50보다 μL은 잘 배후에 남아있을 것입니다. 1:2 희석에 열을 2-6 (그림 2A)에 시약 (기판 플러스 버퍼)의 25 μl를 추가합니다.
- 2 분 또는 10 분 동안 경동 셰이커에 대한 궤도 셰이커에 접시를 놓습니다. 플레이트의 일부 다른 측정에 대해 분석되고 그것이 흔들릴 수없는 경우에만 그 우물에 단순 상하해서 피펫 팅으로 교반 매체. 그러나,이 공정 중에 생성 된 과도한 거품 르미을 방해nescent 출력.
- 10 분 시약을 첨가 한 후, 백색 96 - 웰 플레이트에 웰 내용물의 60 μl를 옮긴다. 그들은 위로 검출기를 향해 빛을 반사하기 때문에 발광 값은 명확한 또는 검은 색 판에 비해 흰색 번호판 높다.
참고 : 우리의 경험에서, 세포가 다른 판에 비해 분명 코스타 (Costar) 판을 낮은 증발에 더 남아있다. 이러한 특정 번호판은 흰색 벽으로 판매하지 않습니다. 둘째, 벽 불투명하고 맑은 바닥 판은 완전히 명확 판보다 더 비싸다. 하나는 흰색 번호판에 발광 액체를 전송하는 경우, 흰색 번호판을 세척 할 수있는 모든 실험에 대한 새로운 흰색 번호판을 사용하는 비용 절감, 재사용. 액체를 전송하기 때문에 장기적으로 저렴 옵션입니다. - 전에 플라스틱 전송 피펫 전구에서 강제 공기, 바람직하게는, 바늘 판을 읽거나 어떤 공기 방울을 팝. 1 초 적분 시간 (회사 추천!와 루미의 판 읽기NDS 0.25-1 초 충분한 적분 시간). ATP 분석 시약을 첨가 한 후, 판 10 ~ 12 분을 읽어보십시오. 길버트와 동료 (26)에 의해 그림과 같이 발광 신호, 빠른 붕괴 속도와 과도하기 때문에 타이밍, 다른 접시에 걸쳐 비교를 위해 중요합니다.
- 10 분 시약을 첨가 한 후, 백색 96 - 웰 플레이트에 웰 내용물의 60 μl를 옮긴다. 그들은 위로 검출기를 향해 빛을 반사하기 때문에 발광 값은 명확한 또는 검은 색 판에 비해 흰색 번호판 높다.
- (도 3 참조) 산점도에서 세포 수의 함수로서 플롯하고, 각 그룹에있는 3 또는 6 우물에서 발광 값을 평균. 해당하는 각 데이터 포인트에서 (11G - 2G, 우물 11B - - 11D, 11E 우물 우물 2B) 제 1 평균 적절한 빈 우물의 배경 발광 값을 뺍니다. 이 초기 실험 (그림 2A)에 각각 도금 밀도에 대한 세 가지 그룹이 될 것입니다. ATP 수준은 선형 적으로 이러한 그룹 중 하나 또는 모두에 세포 밀도와 상관 관계가 될 수있다. 여전히 비용에 저장하는 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다 시약의 높은 희석을 진행합니다. 만족스러운 결과에 대한 기준을 설명하는 난N 결과 섹션.
주 : 본 연구에 사용 된 미디어로,이 분석 배경 값이 높지하고 빈 우물을 생략 할 수있다. 그러나, 제조 업체 프로 메가는 서로 다른 문화 매체와 발광의 차이를보고합니다. 본 연구는 HyClone 사 태아 클론 III, N2A 세포 및 기본 대뇌 피질의 문화에 대한 소 혈청에 대한 소 태아 혈청의 합성 버전을 사용합니다. 제조 업체에 따르면, 혈청은 발광 값을 감소하지만 분석의 감도를 감소하지 않습니다. 이것은 중요한 관심사 인 경우 그럼에도, 분석시에 PBS 대신 미디어 ATP 분석 시약을 희석.- 세포가 밤새 열 걸쳐 고르게 성장을 표시하는 경우, 도금의 6 시간 내에서 시금보십시오. 그러나 분석의 보통 시간 (치료 후 예를 들어, 24 시간)의 밀도가 선형성을 달성해야하는 밀도는 것을 명심.
3. InfrareD의 분석 실험
- 도금 후 아침, 흄 후드에서 실온에서 제 2 플레이트에 세포를 고정합니다. 포름 알데히드는 발암 물질이기 때문에이 단계에서 장갑을 착용하고 화학 폐기물로 정착 처리해야합니다. 1:1 희석에서 기존 미디어에 0.1 M 인산 버퍼에 4 % 포름 알데히드와 4 %의 자당을 추가합니다. 매체는 또한 전체 강도 고정액에 고정하기 전에 PBS로 씻어 수 있습니다. 어느 기술이 잘 작동합니다.
- 20 분 동안 고정액에서 부화 후 정착액을 제거하고 200 μl의 PBS로 3 회 세척한다.
- 분석은 같은 날에 개최하지 않을 경우 4 ° C에서 0.2 % 나트륨 아 지드와 PBS에 접시를 저장합니다. 그렇지 않으면, 분석을 진행하고 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 차단 솔루션에있는 세포를 놓습니다.
- PBS에서 물고기 혈청 오디세이 블록 1:1로 희석하고 셀 permeabilizer로 0.3 % 트리톤-X 100을 추가합니다. 충분히 차단 솔루션뿐만 아니라 기본 및 보조 antibo을DY 솔루션 35 μl를 각 웰에 피펫 할 수 있도록. 거품이 많이 피펫 동안 관찰되는 경우, 그렇지 않으면 거품이 아래로 바인딩에서 세포와 블록 항체에 도달, 각 웰에 대한> 50 μl를 확인합니다. 과도한 비누 거품이 잘 중간에 흠 원형 반점으로 나타납니다. 이 경우 피펫을 조정하려고합니다.
- 실온에서 30-60 분 동안이 블로킹 용액에 배양한다.
주 : 차 항체와 동일한 종에서 5 % 소 혈청 알부민 또는 정상적인 혈청 또한 물고기 혈청 블록의 선정에 저장 솔루션을 차단로서 사용될 수있다. 솔루션을 차단하는 항체의 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 각각의 항체에 대한 최적의 블록이 가장 경험적으로 결정합니다.
참고 : 일부 연구자들은 배양시 셰이 커에서 셀 서양 판 놓습니다. 그러나, 이것은 필요하지 않다.
- 항-α-tubulin에 대한 1:10,000 희석 : 기본 항체를 확인(마우스 단일 클론, 표 1) 및 안티 MAP2 (마우스 단일 클론, 표 1)에 대한 1:2,000 희석. 이 항체는 이러한 세포 모델에서 관심의 단백질에 특정한 특이도는 면역 세포 화학 염색을 위해 필수적입니다.
참고 : MAP2는 신경 세포 마커와 혼합 된 아교 / 연결을 문화에 적합합니다. 성상 세포는 그들의 숫자는 초기 신생아시기 27, 28 년을 정점으로, 배아 일 18에서 먼저 표시하기 때문에 여기에 표시된 출생의 문화 또한 일부 아교 (~ 25 %)를 포함합니다. 하나는 성상 세포 및 신경 세포 ATP와 DRAQ5 + 사파이어 분석을 구별 할 수 없습니다. 별도 뉴런과 성상을 측정 Mullett와 동료 4,29에 의해 설명 된대로, 800 및 700 nm의 채널에서 동시 MAP2와 GFAP 염색을 사용, DRAQ5 + 사파이어를 떠나하기 위해. 문화의 모든 세포가 평가되어야 할 경우, 같은 α-튜 블린, β-액틴, 또는 GAPDH로 팬 세포 마커를 사용합니다.
참고 :이 희석은 N2A 및 기본 대뇌 피질의 세포에 최적화 된 모든 모델에 일반화되지 않을 수 있습니다. 따라서 적어도 2 차 항체의 희석, 플레이트의 왼쪽 절반에 하나, 오른쪽 절반에 하나 (그림 2B 참조)보십시오. 또한, 3 우물 각각 차 항체의 3-4 희석을 시도합니다. 예를 들어, 항체 인서트 시트 추천 희석은 두 가지 변화 형벌 수있다. 면역 세포 화학에 대한 추천 희석 1:500 인 경우 즉,도 1:250 및 1:1000 희석 인자를 시도한다.- PBS와 0.3 % 트리톤-X를 추가 1:1 오디세이 블록에 항체를 희석. 비용을 절감하기 위해, 인큐베이션 마지막에이 용액을 제거하여 단계 3.2.1에서 셀에인가 된 차단 용액에 항체를 만드는 시도. 이 일을하는 동안 PBS에 세포를 유지, 그들은 건조하지 않아야합니다.
- 하나 1 ~ 2 시간 실온에서 하룻밤 또는 4 ℃에서 차 항체에 품다 약하게 B에 대한항체과 풍부한없는 단백질을 inding, 하룻밤 배양 신호를 높일 수 있습니다.
참고 : 각 보조 항체 농도 (우물 2B-2D 및 우물도 2b에 2 E-2G)에서 배경 빼기위한 솔루션을 차단에 최소 3 우물을 남겨주세요. 어떠한 차 항체에이 우물을 노출시키지 마십시오. 이들은 차 항체에 의한 비특이적 결합의 정도를 공개하고 신호대 잡음 비율의 계산에 유용하다. 이차 항체는 비특이적 결합의 높은 수준을 초래할 것이라는 우려가있는 경우에, 또한 주 또는 보조하거나 항체에 노출되지만 세척의 같은 번호를 수신하지 않는 대조군 웰을 포함한다. 이러한 웰과 "보조 전용"웰 간의 차이만으로는 이차 항체로 인한 비특이적 결합의 정도를 밝힐 것이다. 마우스 N2A 세포에 대한 우리의 테스트에서였다 혼자 항 마우스 이차 항체와 신호 강도 0.557 ± 0.032, 안티 - 토끼 신호혼자 차 항체가없는 차 항체와 신호, 0.357 ± 0.003 0.533 ± 0.041이었다, 수 있으며, 1 차 및 2 차 항체 신호는 11.867 ± 0.911이었다. 마우스 세포에 대한 항 마우스 이차 항체를 사용하는 경우에도 우리는 이렇게 비특이적 결합의 높은 수준을 관찰하지 않았습니다. 여러 제조업체의 적외선 차 항체가있다, 우리는 고도의 상호 흡착 사람을 구입하는 것이 좋습니다. 이차의 IgG 항체의 농도가 소스에 따라 변할 수 있음을주의한다.
- 또한, 10 분 각 당 200 ㎕의 PBS의 3 세척과 기본 항체를 씻으십시오. 차 항체는 0.2 % 나트륨 아 지드에 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 솔루션이 빛을 개최 할 때 파편의 작은 반점이 명백해질 때까지 재사용 할 수 있습니다. 이는 비용을 절감하기위한 것입니다. 비용이 문제가되지 않는 경우, 사용할 때마다 신선한 항체를 확인합니다.
- 1시 1분 오디세이 블록에 1:1,000 또는 1:2,000으로 차 항체를 희석 : 0.3 % 트라이와 PBSt-X (그림 2B). 판의 아래쪽에 접시와 1:2,000의 위쪽 절반에 1:1,000 희석을 추가합니다. 이 농도는 추가 비용을 저장할 수 있지만이에 커밋하기 전에 선형성를 확인하기 위해 감소 될 수있다.
참고 : 배경 빼기 우물 (그림 2B에서 2 열)에 대한 적절한 보조 항체 솔루션을 추가해야합니다.- 두 번째 단백질은 DRAQ5 + 사파이어, 마우스가 아닌 다른 종의 차 항체와 800 nm의 채널에서 700 nm의 염소 항 - 마우스 IgG와 두 번째 단백질 α-tubulin의 또는 MAP2 레이블 세포의 위치에 정량 할 것이다. 800 nm의 채널은 700 nm의 채널보다 배경이 관심의 가장 중요한 단백질에 예약해야합니다.
- 멀리 빛의 서랍에 실온에서 1 시간 동안 차 항체에 품어.
- 또한, 10 분 각 당 200 ㎕의 PBS의 3 세척과 보조 항체를 씻어.
- DRAQ5 + 사파이어 솔루션을합니다. 접시의 왼쪽 절반을, DRAQ5 1:10,000 (0.5 μM 최종 농도)를 희석 PBS의 사파이어 1:1000 0.3 % 트리톤-X와 (열 3-6, 그림 2B). 판의 오른쪽 절반을, DRAQ5 1:20,000 (0.25 μM)를 희석 사파이어 1:2000 (열 7 - 10 일, 그림 2B).
주 : 대신에 5 밀리미터 주식의 1 ㎜의 주식에 판매하는 데 사용 DRAQ5을. 일부 이전에 발행 된 보고서는 따라서 DRAQ5 8 1:4,000 또는 1:2,000 희석을 사용했다.- 이 판을 동시에 정량되는 경우, 비용을 절감하기 위해, 동일한 DRAQ5 + 사파이어 해법은 제 1 플레이트를 벗어 피펫 팅과 제에 추가, 시퀀스에서 두 플레이트에 이용 될 수있다. 같은 솔루션이 방법으로 두 번 사용되는 경우에, 1 일 안에 그들을 사용합니다. 희석 DRAQ5 + 사파이어 솔루션은 4 ° C에 저장하거나 나중에 사용하기 위해 냉동 할 수 없습니다.
- 멀리 F 실온에서 30 분 동안 이러한 솔루션에서 부화롬 빛. 시간이 짧고 DRAQ5 + 사파이어 솔루션 단계 3.5 차 항체 솔루션에 이러한 얼룩을 추가하고 1 시간 동안 품어, 다른 보조와 다른 접시에 재사용 할 수 없습니다됩니다.
참고 :이 우물은 700 nm의 채널에 스테인드해서는 안대로 배경 빼기 우물 (그림 2B에서 2 열)에 DRAQ5 + 사파이어 솔루션을 추가하지 마십시오.
- 10 분 각 웰 당 200 ㎕의 PBS와 플레이트 배를 씻으십시오. 플레이트는 적외선 이미징이 완료된 후 다른 가시 범위 이차 항체로 염색하는 경우는 최종 PBS 세척에 0.2 % 아 지드 화 나트륨을 넣어.
- 오디세이 이미 저 플레이트를 검사합니다. 강도 5 및 169mm 해상도에서 접시를 검색하여 시작합니다. "중간 품질"또는 "낮은 품질"설정 하나는 충분하다. 이 회사는 자세한 여기 / 방출 필터 정보를 공개하지 않습니다. 그러나, 배출 필터는 약 20 nm의 폭이며 7 중심 아르제조 업체에 따라 20 ~ 820 nm의.
참고 : 연구자가 다른 마커로 얼룩을 계속 할 수 있으므로 그것은 아직 젖어있는 동안 판을 스캔 할 수 있습니다. 그러나,이 회사는 건판이 덜 잘 - 투 - 잘 신호 확산 될 자사의 온라인 프로토콜에 제안합니다. 데이터를 비교하는 것은 젖은 후 건조 모두를 스캔하는 경우, 증발 후 남은 염 가장자리를 따라 높은 배경 형광으로 이어질 수 있기 때문에 우물에서 모든 PBS를 제거해야합니다.- 오디세이 이미 저를 스캔하고 접시의 바닥을 통해. 우물의 바닥 판에 자신의 두께와 깊이가 다양 할 수 있기 때문에 다른 제조 업체의 후판 다른 초점 오프셋을 요구할 수있다. 다른 초점 오프셋에서 스캔을 시도하고 볼 위치를 가장 높은 신호 대 잡음 비율과 상쾌한 호주 (초점 대부분의) 신호가 달성된다 : 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm. findin을 확인하기 위해 통치자와 접시의 바닥에서 우물의 깊이를 측정하는 것도 시도오디세이에 GS. 우물의 바닥에있는 플라스틱 눈금자 측정을 추가로 높이를 추가 할 수 있음을 기억하십시오. 본 연구에 사용 된 코스타 (Costar) 플레이트는 4.0 mm의 오프셋 초점을 요구한다.
- 접시의 이미지에 오른쪽 크기의 격자를 배치 및 Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 소프트웨어에서 셀 웨스턴 기능을 사용합니다. 가장 높은 형광 값을 찾기 위해 다른 초점 오프셋에서 같은 우물의 "통합 강도"값을 검사합니다. ( "아니오 차 음성 대조군"웰 대 면역 염색 웰스 신호) 높은 신호 대 잡음비를 산출 오프셋 초점 이하 선택할 하나이다.
- 오프셋 하나의 초점에 결정되면, 더 작은 단위로 다시 스캔합니다. 밝은 신호가 3.5 및 4.0 mm였다 예를 들어, 3.6, 3.7, 3.8에서 스캔을 시도하고, 3.9 mm 및 신호 강도가 더 개선이 있는지. 오프셋 초점이 잘못되면, 빈 (PL)의 12 열에서 신호 강도대신에 평평한 라인의 U 자형 곡선으로 표시됩니다 (모든 열이 동일한 신호를해야 할 때) 먹었다. 이 플라스틱 판에 문제가 계속되면, 유리 바닥 판을보십시오.
- 700 및 800 nm의 채널에있는 모든 해당 데이터 점에서, 배경 빼기 우물 (2G - - 2D 또는 우물 우물 2E 2B 그림 2B)의 통합 강도의 평균을 뺍니다. 이어서 웰의 각 그룹에 대해 통합 된 신호 세기의 평균. 셀 밀도에 대해 산점도로서 데이터를 플롯 (도 3 참조).
- 일차 및 이차 항체와 후속 실험 한 각 희석에 정착하는 DRAQ5 + 사파이어의 두 가지 희석액의 결과의 두 가지 희석액의 결과를 비교. 선형성이 달성되지 않으면, 다른 강도로 스캔을 시도한다. 강도 3 대신 5 7 다시 스캔하고 데이터를 다시 분석합니다. 데이터는 그 강도 중 한 곳을 개선하지만, 경우여전히 만족하지 그 강도 정도 씩 다시 검사.
- 소프트웨어가 우물에 흰 반점을 보여줍니다 이미지를 분석하지 않도록주의하십시오, 그 장소는 이미 저의 범위를 벗어나 포화 신호를 의미. 이 경우 낮은 강도로 스캔합니다.
- 선형성이 달성되지 않은 경우, 그들은 성장 또는 하룻밤을 다른 컬럼에 불균일하게 죽을 수 있기 때문에 도금의 6 시간 내에서 세포를 해결하기 위해 또한보십시오. 또한 다른 도금 밀도, 다른 검사 강도, 시약 희석 요인, 바닥이 유리 접시, 핵 전용 얼룩 등 자체 DRAQ5, 또는 항-α-튜 블린 또는 방지 MAP2 이외의 다른 항체의 추가 최적화를 시도합니다.
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Representative Results
이들 실험에서 속도 제한 요인은 ATP 분석이 비교적 짧은 기간이기 때문에, 적외선 염색법이다. 적외선 분석을 위해, 우리는 여덟 96 - 웰 플레이트 (그림 1 참조) 4 판 각각의 압도적 인 두 개의 일괄 처리에 의해 하루 만에 염색 검사 할 수 있다는 것을 기대하고 있습니다. 이 추정은 고정의 20 분을 가정, 세탁 30 분, 세척의 30 분 뒤에 2 시간 차 항체 배양을 차단 30 분, 액체의 30 분 뒤에 1 시간 차 항체 배양은 30 분 DRAQ5는 + 사파이어 30 다음 세척, 4 판에 대한 스캔 시간의 34 분의 분. 열 다섯 추가 분은 네 개의 개별 판의 엇갈린 피펫을 설명하기 위해 세척 그림 1에 반영됩니다. 데이터 분석을위한 시간이 추정에 포함되지 않습니다. ATP 분석 측정은 모든 적외선 플레이트 병렬로 발생하는 경우, 열두 판은 하루에 정량 할 수있다 - 적외선 얼룩 여섯s와 ATP 수준에 대한 여섯.
회귀 분석에서 만족 데이터 (그림 3)에 대한 기준, 프로토콜 섹션에서 언급 한 바와 같이, 도금 밀도 및 신호 강도 (0.05 ≤ 두 개의 꼬리 P) 사이에 유의 한 상관 관계가 있습니다. 발광 또는 적외선 신호의 변화의 크기는 셀의 수의 변화에 비례한다. 이상적으로, 5K 세포는 약 절반 발광 또는 10K 세포의 ATP 수준이해야하고, 15K 세포 등 10,000 세포보다 약 50 % 큰 값을 가져야한다. 이 비례는 분석의 민감도를 반영하고 판정 R 2 값 또는 계수 구별된다. 회귀선이 실제 데이터 포인트에 근접 얼마나 잘 R 2 만 측정합니다. 데이터가 선형하더라도, 신호 강도의 상대적인 변화는 세포 수의 변화의 크기에 비례하지 않을 수있다. 이 w를 발생할 수 있습니다암탉 회귀선은 분석이 매우 구분하지 않습니다 것을 제안, 높은 R 2 만 낮은 경사가 있습니다. 따라서, 유의 한 상관 관계 데이터의 비례의 기준을 모두 만족해야한다. 마지막으로, 최적의 도금 밀도 주변의 신호 강도의 변화는 기기 및 분석의 동적 범위 내에 속하는 것이다. 동적 범위가 가장 크고 가장 작은 값 사이의 비율이다. 오디세이 화상 카메라는 4.5 로그 동적 범위를 가지고 있으며, 포화 신호는 결과가 더 이상 계량화 연구원을 경고하기 위해 평소 빨간색이나 녹색 이미지 대신에 밝은 흰 색으로 나타납니다. 분석 자체 중에 동적 범위 때문에 같은 특정 세포 유형에 대한 최대 및 최소 도금 밀도 등의 문제로 좁다. 세포 밀도가 증가하는 경우에 하나의 플레이트가 벗어나 있기 때문에, 이러한 분석에 대한 포화 곡선이 하나 더 이상의 차이가 해결 될 수없는 상기 도금 밀도를 계시범위 이미 저 또는 때문에 세포가 하룻밤 밀집 살아남을하지 않습니다. 한 플레이트는 세포 밀도를 감소시키는 경우와 마찬가지로, 하나의 신호에서 더 이상의 변화가없는보다 최저 셀 밀도를 측정 할 수있다. 분석의 동적 범위는 최소 및 해결 될 수있는 셀 / 웰의 최대 수 사이의 도금 밀도를 포함한다. 우리의 세포가보고되는 것 이상의 밀도에서 잘 생존하지 않기 때문에 우리는이 특정 분석의 전체 동적 범위를 측정하지 않았습니다.
최적화 후, 우리는 지금 1:2000 희석에 항 - 마우스 IgG와, 1:10,000 희석에 항-α-튜 불린과 N2A 마우스 신경 모세포종 세포를 염색하고, 1:20,000과 1:2,000에서 DRAQ5 + 사파이어 솔루션으로, 각각. 우리는 또한 50 μL 미디어에서 ATP 분석 시약의 25 μl를 사용합니다. 이러한 조건 하에서 결과를도 3A, B, 및 C에 도시되어 befor에 게시 된전자 8. 세 분석에서의 신호 강도를 현저 웰 당 세포의 수와 상관 관계가 있었다. 세 가지 분석이 매우 선형했지만, 그들은 감도에 상응하지 않았다. 예를 들어, 잘 당 5K 세포가 아니라 당 10,000 세포로 적외선 염색의 정확히 절반의 양을 가지고 있지 않았다. 적외선 분석과는 대조적으로, ATP 분석은 도금 밀도의 변화에 더 민감했다. 즉, 발광는 5K에서 잘 당 2,500 개 셀에 5K하고 10,000에서 대략 절반으로 떨어졌다. ATP 분석의 가장 높은 감도에 이러한 연구 결과에도 불구하고, 세포의 건강의 더 넓은 그림을 얻을 가능성에 대한 세 가지 분석을 수행하는 것이 가장 좋습니다.
우리는 지금 1:1,000 희석 항 - 마우스 IgG와 1:2,000 희석에 방지 MAP2와 쥐 기본의 연결을 문화 얼룩, 각각 1:10,000과 1:1,000,에서 DRAQ5 + 사파이어 솔루션을, 25을 사용 50 μL 미디어 (그림에서 ATP 분석 시약의 μL3D, E 및 F). 700 nm의 채널 100,000 잘 당 200K 세포 사이에 약간의 차이가 있기 때문에 DRAQ5 + 사파이어 분석에서 신호 강도는 세 가지 분석의 가장 선형이었다. 그러나, 700 nm에서 신호 강도가 아니라 당 100,000 세포에서는 세포의 수에 비례하여 잘했고 우리는 항상 어쨌든 잘 당 100,000 세포에서 신경 세포의 배양 접시. 그럼에도 불구하고, 우리는 또한 DRAQ5 + 사파이어 분석 (아래 참조) 다른 두 가지 분석 등의 독소 치료에 민감하지 않습니다 것을 관찰했다. DRAQ5 + 사파이어 대조적으로, 신호 강도 및 MAP2 ATP 분석법 모두 도금 밀도 잘 비례 하였다. 그것은 ATP 분석 시약의 큰 부피가 웰 당 200K 셀에 결과를 향상시킬 수 있음을 주목해야한다. 자세한 시약이 있기 때문에, 다른 말로하면, 발광 출력은 웰 당 100,000 세포의 값의 정확히 200 %까지 상승 할 수있다. 그러나, 우리는 experime에 대한 그 높은 도금 밀도에서 대뇌 피질의 문화를 접시 결코국세청. 우리는 또한 MAP2와 ATP 수준이 아니라 당 20K 세포도 22 당 120K 세포에 이르기까지 신피질 신경 도금 밀도의 20 % 변화에 민감한 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 연구자들은 오히려 때문에 조직과 세포 처리에 간 실험실 변화의 실험에서 최적의 조건을 사용하는 것보다 자신의 실험실에서 이러한 분석을 테스트해야합니다.
독성과 치료를 다음 이러한 분석법의 실용성을 예시하기 위해, 우리는 MG132, 프로 테아 좀 억제제 (도 4)로 처리 N2A 세포의 투여 량 - 반응 곡선을 나타낸다. MG132은 글루타티온 전구체를 N-아세틸 시스테인의 존재 또는 부재에 도포 하였다. 이 데이터는 또한 N-아세틸 시스테인 (30)의 보호 효과에 대한 우리의 최근 간행물에서 찾을 수 있습니다. 세포는 MG132 처리 다음 48 시간을 측정 하였다. MG132은 농도 의존적 DRAQ5 + 사파이어 신호 (그림 4A, D) 및 α-tubulin의 신호를 (감소
셀 역가 저런 형광 분석에 따르면, ATP 수준은 ATP 수치가 치료시 세포의 역가에 비례하는 것은 아니다 시연, MG132 (그림 4C)의 낮은 농도에서 제기되었다. ATP 데이터들은 N2A 세포 MG132로 처리 할 때 N-아세틸 시스테인은 또한 대사 기능을 보호한다는 점에서 예시 불구 유용하다. 이것은 t에 입증그는 N-아세틸 시스테인과 MG132의 IC 50 값에 이동. ATP의 IC 50 값은 3.05 μM MG132이었다 (논리 (50) = 0.48 ± 0.07, R 2 = 0.8616, 힐 기울기 = -1.0) 차량과 N-아세틸 시스테인 (논리 (50) = 0.96 ± 0.04, R 2 9.12 μM MG132와 = 0.9261, 힐 기울기 = -1.0). ATP의 상승을 주도 농도는이 분석에서 제외 하였다합니다. 분석의 모든 값을 포함하여 결정 계수를 낮추고 차량의 존재와 9.24 μM MG132에 4.03 μM MG132 (논리 (50) = 0.61 ± 0.09, R 2 = 0.7224, 힐 슬로프 = -1.4)에 IC 50 값을 증가 (로직 (50) = 0.96 ± 0.07, R 2 = 0.6607, 힐 슬로프 = -2.1) N-아세틸 시스테인 (그림 4C와 달리)의 존재.
이 세 가지 분석의 두 번째 예는 Figur의 차 문화에 대해 설명되어전자 5. 조직을 웰 당 100,000 세포에 도금, 해리, 래트 신피질 및 allocortex에서 microdissected 및 H 2 O 2에 병렬로 처리 하였다. 우리는 그들이 신경 퇴행성 질환 34-39에 차등 취약이 두 뇌 영역이 산화 스트레스의 자신의 처리와 다른 경우 가설을 시험했다. 이러한 데이터 중 일부는 이전에 발표 된 결과는 그 연구 (22)에서 자세히 설명합니다. DRAQ5 + 사파이어의 IC 50 값 (논리 (50) = 1.36 ± 0.07, R 2 = 0.7552, 힐 슬로프 = -0.95) 신피질에서 22.84 μM의 H 2 O 2 있었다 allocortex에서 24.63 μM의 H 2 O 2 (논리 (50) = 1.39 ± 0.03, R 2 = 0.9379, 힐 슬로프 = -1.74). MAP2에 대한 IC 50 값은 신피질에서 11.66 μM의 H 2 O 2했다 (논리 (50) = 1.07 ± 0.04, R 2 = 0.9332, 힐 슬로프 = -2.13) 29.76 μM의 H allocortex 2 O 2 (논리 (50) = 1.47 ± 0.04, R 2 = 0.8934, 힐 슬로프 = -4.45). ATP의 IC 50 값 (논리 (50) = 1.38 ± 0.03, R 2 = 0.8907, 힐 슬로프 = -2.56) 신피질에서 23.82 μM의 H 2 O 2 있었다 allocortex 44.5 μM의 H 2 O 2 (논리 (50) = 1.65 ± 0.03 , R 2 = 0.9204, 힐 슬로프 = -2.71). Allocortex는 H 2 O 2 μm의 50 이하의 농도에서 크게 신피질보다 산화 스트레스에 저항했지만, DRAQ5 + 사파이어 분석은 이러한 차이를 설명하기에 가장 민감했다. 이 후자의 분석이 MAP2는 달리 뉴런에서 아교를 구별 할 수 없다는 것을 반영 할 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이 그들이 출생 후 뇌의 22에서 수확 한, 우리의 문화는, 약간의 아교가 포함되어 있습니다. 놀랍게도, H 2 O 2 (75 μM 이상), 모든 MAP2의 높은 농도에서
마지막으로, 모든 세 분석법으로 intraplate 가변성을 설명하기 위해, 우리는도 6A-6G 및 C-I에 상술 투여 량 반응 곡선에서 두 번째와 세 번째 웰 '원시 데이터 포인트를 플롯 >. 마찬가지로 interplate 가변성을 설명하기 위해, 우리는도 6D-F 및 6J-L에서이 플레이트로부터 원시 데이터 포인트의 평균 (삼중 웰의 평균)을 플롯. 복제 우물과 독립적 인 실험에서 신호 강도는 모든 측정에 상당한 상관 관계를 보였다. 기본의 연결을 문화의 독립적 인 실험을 통해 원시 값에 약간의 변화는 우리가 이전 항체를 재사용하고 DRAQ5 + 사파이어 솔루션과 사용하지 않는 ATP 분석은 몇 번 시약 재 냉동 아마도 때문에이 있었다. 차 문화에 높은 interplate 변동성에 대한 또 다른 이유는 문화 자체의 품질이 될 수 있습니다. 다른 실험 일에 걸쳐 다양한 사후 간격 및 조직 처리는 분산에 기여할 수있다.
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보이는 적외선 분석 (B)에 대한 세 가지 생존 분석 (A) 및 타임 라인의 그림 1. 도식 그림. N2A 세포에 권장되는 절차입니다. DRAQ5 + 사파이어 해법은 다른 이차 항체로 염색 된 다른 플레이트상에서 재사용하지 않을 경우, 이들은 한 단계 절차를 줄이고, 최종 1 시간 배양을위한 항 - 마우스 이차 항체 용액과 조합 될 수있다. 여기 더 큰 이미지를 볼 수 있습니다.
ATP 분석 (A)와 프로 시저 절에서 설명하는 적외선 분석 (B)의 그림 2. 플레이트 형식입니다.하지만96 - 웰 플레이트는 이러한 분석은 시약 및 세포에 저장하는 등 384 웰 플레이트와 같은 다른 형식에 적용 할 수 있습니다, 도시되어있다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. N2A 마우스 신경 모세포종 세포에서 세 가지 생존 분석 (A, B, C) 또는 기본 출생 후 쥐 신피질 신경 세포 (D, E, F)에 대한 선형 회귀 분석. 각각의 분석을위한 신호 강도가 도금 밀도의 함수로서 플롯된다. 인 세트는 DRAQ5 + 사파이어 (A, D), α-튜 블린 (B), 또는 MAP2 (E) 얼룩 대표 적외선 이미지를 보여줍니다. 원시 강도 값은 각 이미지 아래에 나열되어 있습니다. 그 원시 값에 주개인도 그 실험 3 우물의 평균에서 3 ~ 4 독립적 인 실험의 평균과 다를 수 있습니다. 원래 적외선 이미지 (700 NM)이나 녹색 (800 nm의) 빨간 모조 착색했다. 각 실험은 세중의 우물에서 수행 DRAQ5 + 사파이어 배 반복 N2A 세포 및 기본 뉴런 모두에서 배 α-tubulin의 4 배에 MAP2에, 배 ATP에 N2A 세포에서, 그리고 한 신경 세포에서 ATP에 대한 배. 세중 우물의 데이터가 3 ~ 4 각 실험에 대해 하나의 최종 값을 평균 하였다. 이러한 3-4 최종 값의 평균값과 SEM을 그래프로 도시된다. SEM 막대가 표시되지 않도록 DRAQ5 + 사파이어 값이 낮은 표준 편차를 전시합니다. 판정 및 상관 관계의 중요성을 평가 두 검정 P 값 R이 계수들은 각각의 측정에 대해 설명된다. 데이터는 그래프 패드 프리즘 (버전 5.0)에서 분석 하였다. Unnith에 의해 신경 화학 국제, 61, 실렸던등 : 엘스 비어의 허가 P 356-368, "N-아세틸 시스테인과 신경 퇴행의 2 명중 높은 처리량 모델의 구조가". 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
MG132의 독성에 대한 N2A 세포의 그림 4. 보호. N2A 세포 항산화 N-아세틸 시스테인 (, 3 mM의 NAC)의 존재 또는 부재하에 프로 테아 좀 저해제 인 MG132의 표시된 농도로 처리 하였다. 세 생존 분석은 48 시간 이상 수행 하였다. MG132 (C)의 낮은 농도의 ATP 수준의 상승을합니다. DRAQ5 + 사파이어 염색 (A) O에 평행하게 증가하지R α-튜 블린 (B)는 분명했다. DRAQ5 + 사파이어와 α-tubulin의 얼룩 대표 적외선 이미지는 각각 D와 E에 빨간색과 녹색 모조 착색했다. 각 실험은 세중의 우물에서 수행 α-tubulin에 대한 DRAQ5 + 사파이어, 배에 배를 반복하고, ATP에 대한 3 배되었다. 세중 우물의 데이터가 3 ~ 4 각 실험에 대해 하나의 최종 값을 평균 하였다. 이 3 ~ 4 최종 값의 평균과 SEM가 표시됩니다. * P ≤ 물 대 N-아세틸 시스테인의 비교를 위해 0.05, 양방향 ANOVA 다음 Bonferroni 보정. 데이터는 그래프 패드 프리즘 (버전 5.0)에서 분석 하였다. 신경 과학, 255에서 재판, 장 등에 의해 :. 엘스 비어의 허가, P 19-32 "N-아세틸 시스테인, 열 충격 단백질에 의존하는 방식으로 proteotoxicity을 무디게" C큰 이미지를 보려면 여기를 핥아.
그림 5. 과산화수소 독성 신피질과 allocortical 문화의 차동 취약점을 해결합니다. 출생 후 기본 모터와 감각 신피질와 entorhinal과 배 모양 allocortex의 Microdissections 잘 당 100,000 세포를 분해 및 도금했다. 시험관 2 일에, 세포는 H 2 O 2의 농도별로 처리 하였다. 플레이트는 48 시간 후 측정 하였다. 그 allocortex는 신피질보다 더 나은 이러한 배양 조건을 견디며 기준에서 높은 세포 수를 가지고 있습니다. 각 실험은 세중의 우물에서 수행 MAP2에 DRAQ5 + 사파이어, 배에 배를 반복하고, ATP에 대한 6X했다. 세중 우물의 데이터가 평균화3-6 각 실험에 대해 하나의 최종 값. 이러한 3-6 최종 값의 평균과 SEM가 표시됩니다. * P ≤ 신 대 allocortex, 양방향 ANOVA를 다음 Bonferroni 보정의 비교 0.05. 데이터를 그래프 패드 프리즘 (버전 5.0)에서 분석 하였다는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. MG132 및 H 2 N2A 세포와 대뇌 피질의 신경 세포에있는 O 2 용량 반응 곡선 Intraplate 및 interplate 상관 관계. 모든 개별 실험은 세중의 우물에서 실행되었다. 플레이트 (A 내의 재현성을 측정하기 위하여도 1 및 2를 복제로서 각 그룹 내의 제 웰이 원시 데이터는 플롯했다
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Discussion
우리는 세 가지 생존 분석의 신호 강도가 선형 및 도금 밀도와 상관 관계가 있음을 발견했다. 그러나, 모든 분석은 2 배 또는 도금 밀도의 1.5 배의 변화에 동등하게 구분합니다. N2A 세포의 경우, 적외선 분석은 특히 낮은 도금 밀도에서, ATP 분석보다 덜 민감하다. 적외선 분석이 ATP보다 덜 민감하지만, DRAQ5 + 사파이어 분석 및 α-튜 불린 분석은 그들이 N-아세틸 시스테인의 높은 보호에 미치는 영향을 밝혀 잘 일치합니다. 이 두 분석으로 적외선 신호의 투여 량 - 반응 손실이고 세 생존 곡선은 N-아세틸 시스테인으로 오른쪽으로 시프트 하였다. α-튜 불린과 ATP 분석이 DRAQ5 + 사파이어 분석 (Unnithan 등의 그림 4 참조보다 암모늄 클로라이드 등의 화합물에 더 민감하게 반응하는 것 등이 중첩는 항상 N2A 세포 치료의 모든 종류의 관찰되지 않습니다. 8 ). 따라서, 생존 phenotypES는 항상 동일하게 세 가지 분석으로 표시되지 않습니다. ATP 분석은 α-튜 불린과 DRAQ5 + 사파이어 분석, 강도가 셀 수를 반영하는 신호 가정보다 도금 N2A 세포의 수에 더 비례했지만 항상 독소 치료 후 만족하지 않았다. ATP 농도는 적외선 분석법에서 신호에 유사한 상승을 유도하지 않았다 독소 농도로 상승했다. 이러한 데이터는 프로 테아 좀 억제에 대한 응답으로 N2A 세포에서 보상 신진 대사 변화를 공개하고 자신의 권리에 유용하다. U 자형 ATP 투여 량 - 반응 곡선은 루미 시스 불리는 현상의 특성이다. 호 르미 시스는 독소와 다른 스트레스 40-42로 낮은 수준의 노출에 유리한 생물학적 반응으로 정의된다.
신경 세포의 경우, DRAQ5 + 사파이어 얼룩은 높은 도금 밀도의 MAP2와 ATP 분석보다 덜 민감했다. 그러나, DRAQ5 + 사파이어, MAP2, 그리고 ATP 분석은 CE에 비례하여 잘했다물론 당 100,000 세포에서 이하 기본 대뇌 피질의 신경 세포 LL 번호. 우리가 잘 당 100,000 세포에서 신경 세포를 접시. 피질의 신경 세포가 복제하는 것으로 알려져하지 않을 수도 있기 때문에, 우리는 100K 이하 도금 밀도에서 선형성에 대해 우려했다. DRAQ5 + 사파이어 분석은 50 μM의 H 2 O 2 이하의 농도로 MAP2 또는 ATP 하나보다 신피질과 allocortex의 차이에 덜 민감했다. 또한, ATP 수준은 H에 극적으로 떨어지지 않은 2 O 아마도 다시 ATP 출력의 보상 증가를 제안하는 다른 두 분석의 적외선 신호로 2 개의 트리트먼트. N2A 세포 및 기본 뉴런의 세 가지 분석 사이의 불일치는 총 해부학 적 구조가 영향을받는 전에 세포 기능이 변화 할 수 있음을 반영 할 수 있으며, 세포 골격 단백질을 포함하는 세포의 구조, 세포 자체가 손실됩니다 오래 전에 영향을받을 수 있습니다. 설득력 다중 생존 길버트에 의해 분석 및 동료에 대한 최근 데이터같은 헥스 핵 염색 및 ATP의 측정과 같은 다른 생존 대책이 부분적으로 만 간접적으로 전체의 26으로 생존 능력을 반영하는 특정 세포의 특성에 대한 정보를 얻을 수 있음을 보여줍니다. 따라서 우리는 많은 출판물이 할 대사 생존을위한 하나의 분석에 의존하는 동시에 모든 세 가지 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이러한 방법 중 어느 하나에 더 많은 정보를 위해, 우리는 각각의 세포를 계수하고 세포 수의 함수로서 세포 골격 단백질 발현 및 ATP 수준을 평가 추천한다.
같은 MTT 같은 대사 생존력 다른 분석법은 존재하지만, ATP 분석의 장점은 감도와 다이나믹 레인지에있다. MTT 분석은 ATP 측정 비교하여 생존 세포의 수를 과대 평가하고 43 개의 배 높은 IC (50)를 나타내고있다. 또한, 비소와 동료는보고 된 ATP 분석 할 수MTT 분석 미만 25K 세포 / 웰 (12)을 감지 할 수있는 반면, 웰 당 1563 세포의 하한치를 검출한다. 신호 대 잡음비 (무 세포와 웰 대 생균과 우물로부터 신호) ATP 44 만 7 MTT뿐만 230이다. MTT 이상의 발광 ATP 분석법의 또 다른 장점은 배양 시간이 훨씬 짧다는 것이다. 또한, 프로 메가에서 MTT 분석은 동일한 제조업체에서 셀 역가 저런 형광 분석은 우리의 권장 희석에 잘 당 0.09 센트를 비용 반면 아니라 당 0.28 센트의 요금으로 제공됩니다. 그러나, 모든 대사 분석에 한계가있다, 신진 대사 활동은 특히 괴사 동안 생존에서 커플 해제 할 수 있습니다. 이것이 문제가되는 경우에, 본 보고서의 분석은 멤브레인 무결성의 손실을 확인하기 위해, 락트산 탈수소 효소의 방출을 측정과 조합 될 수있다. 젖산 탈수소 효소 측정이 단순히 세포 매체에 만들어 짐에 따라이, 추가 플레이트를 포함하지 않을 것입니다.
우리는 현미경에 수동 계산에 대한 대안으로 이러한 분석을 제시하지만 제대로 수행하는 경우, 후자는 샘플링 세포 수의 매우 민감하고 정확한 수단이 될 수 있습니다. 사실, 우리는 훽스트 염색 핵의 카운트 DRAQ5 + 사파이어 분석보다 N2A의 세포 수의 작은 변화에 더 민감 할 것으로 예상된다. 분석 모두 선형성 테스트 실패하면, 수동 카운트는 필수적이다. 이것의 좋은 예는 우리가 더 많이 드는 45를 계산을 수행하는 우리의 기본 성상 세포 배양 모델입니다. 세포 수의 데이터를 해석 할 때 그러나 수동 카운트의 고유의 편견은 컴퓨터 분석의 고유 한 결함이 옆으로 닦았 안 것처럼 마음에 부담해야합니다. 생존 분석의 강점과 약점의 수는 따라서 아래에 설명되어 있습니다.
DAPI 또는 헥스 얼룩을 사용하는 경우 첫째, 수축과 응축 핵은 종종로 지정되어 있습니다세포 사멸 1. 그러나, 세포의 크기와 핵의 응축 부드러운 연속 선상 거짓말. 대조적으로, 삶과 죽음은 상호 배타적 이진 현상이다. 라이브 또는 죽어가는 세포의 두 매우 독특한 그룹이 관찰되지 않는 한, 이러한 Metamorph의 또는 ImageJ에뿐만 아니라 눈으로 이미징 소프트웨어와 같은 세포 사멸 임계 핵 직경 아래에있는 모든 세포를 계산하는 가장 좋은 것 같다. 우리는 돌이킬 수없는 세포 사멸 폭포가 시작되는 시점을 알 수 없기 때문에 물론, 임계 직경의 선택은 임의적이다. 또한, 정의에 의해 활성화 된 카스파 제 3도 세포 죽음 도중에 필요는 없다 아마도 고정 (46)의 시간에 아직도 살아로 계산되어야한다. 우리 적외선 분석법은 고정시 플레이트로서 여전히 살아 연결된 모든 셀을 처리함으로써 이러한 문제를 피한다. 만 멀리 떠있다 세포는 죽은 것으로 간주됩니다. 이 두 가지 범주 중 하나에 셀을 배치하고 공동 사용의 함정을 피할 수MPLEX, 핵의 직경과 같은 연속 함수.
둘째, 수동 카운트는 일반적으로 전체 웰의 작은 부분을 샘플링. 이 샘플링 편견으로 이어질, 평균의 경우에, 높은 수준의 오류가 있습니다. 우리의 생존 능력 분석, 전체 잘은 ATP에 대한 샘플링 및 전체 잘 부근에 적외선 분석으로 샘플링된다. 이 샘플링 패턴은 샘플 크기를 증가 및 수동 계산을위한 사진을 스냅하는 위치를 잘의 때로는 임의의 결정을 방지 할 수 있습니다. 사진이 잘의 중심으로 촬영하는 경우, 하나는 세포의 가장 워시 오프 독성의 가능성을 과대 평가로 이어지는, 발생하는 위치이 지역이 있음을 명심해야합니다. 반대로, 적외선 분석법는 우물의 극단적 인 모서리를 제외하는 96 - 웰 플레이트의 이미지 상에 그리드를 던진다. 원한다면, 웰 코너 그리드 원의 직경을 증가시킴으로써 포함될 수있다.
셋째, 사진 및 셀 카운터는 모두 수동 계산하는 동안 눈을 멀게한다. 세포가 독소로 치료 그러나, 일단, 그들은 종종 심지어 훈련받지 않은 눈에 아주 명백하다 형태 학적 변화를 가정합니다. 이것은 훨씬 더 도전 공정한 남아 렌더링합니다. 실명은 우리의 분석에 대한 요구 사항이 아닙니다.
넷째, 수동 수는 시간이 많이 소요되고 더 많은 급여의 주요 조사 비용. 급여는 연구를 수행의 가장 높은 비용 중 하나입니다. 오디세이의 한 판의 스캔 시간 설정 "엽차"긴 8 분이며, "낮은 품질"설정에 추가로 낮출 수있다. 그것은 오디세이 이미 저가 하나의 중고 데모 버전을 구입하는 경우에도 고가이지만, 일회성 고정비임을 주목해야한다. 반면에, 하나는 DAPI 또는 H 수동 세포 수에 대한 비교적 고가 표면 형광 현미경에 투자한다핵을 oechst 염색. 초기 비용에도 불구하고, 오디세이 이미 저 또한 정량적 인 방법으로 (47, 48)에서 서부 면역 블롯을 측정하는 다목적 기계입니다. 우리는 쥐 또는 마우스의 선조체 (striatum) 또는 telencephalic 피질과 같은 거시적 인 뇌 구조의 면역 염색의 quantifications의 오디세이의 사용을 채택했다. 이 접근법은 또한 다른 사람 (49)에 의해 사용되어왔다. 조직 이미징을위한 오디세이 이미 저의 약점은 최고 해상도는 21 μm의 것입니다. 따라서 개별 세포를 셀 수 없습니다 미세한 해부학 적 정보를 시각화하기위한 것이 아닙니다.
마지막으로, 적외선 분석 수동 카운트로 세포 수의 작은 변화에 민감하지 않을 수 있습니다. IC 50 값은 따라서 만 적외선 신호의 50 % 감소를 유도하는 농도로서, 세포 수의 정확히 50 % 감소를 유도하는 농도를 나타내는 것으로 간주 될 수 없다. 이주의해야 할 점은 아마 적용모든 가능성 현미경으로 각각의 세포 수를 우회 한 번에 전체를 잘 샘플 분석. 이러한 분석과 관련된 부정확는 비대, 위축, 또는 신호 강도에 영향을 미치는 기타 외관상의 변화의 함수가 될 수있다. 예를 들어, 일부 독소, α-튜 불린 각 셀 면역 독성의 함수로서 상승 수있다. 우리는 MG132 8의 매우 높은 농도로 처리 N2A 세포에서이 현상을 관찰했다. 이 관심사 인 경우, 예컨대 β-액틴 또는 GAPDH와 같은 다른 세포 골격 단백질 마커가 사용될 수있다. 또한, N2A 세포 바이폴라 프로세스 8,50,51을 형성하는 경향이 강조. 셀 크기의 변화, 세포 당 형광 신호 출력은 치료 그룹간에 다를 수 있습니다. 우리는 독소가 처리 된 세포에서 세포 서양에서 사용 된 것과 동일한 마커에 대한 면역 세포 화학 같은 표준 고해상도 현미경으로 검사 할 것을 추천합니다. 세포질은 치료에 따라 크기가 크게 변경하지만 경우핵, 우리는 핵을 계량하는 사파이어없이 DRAQ5 얼룩의 사용을 권장하지 않습니다. 다른 염료 및 기타 골격이나 다른 풍부한 단백질과 미래 연구는 이러한 장애를 극복하기 위해 보증됩니다.
우리는 모든 분석은주의 사항에서 고통과 감성에 대한 우려, 선형성, 표본 오차, 신호 대 잡음 비율, 인간의 편견이나 주관, 시간과 비용을 제기했다고 결론을 내린다. 또한, 모든 분석은 항상 충족되지 않는 가정에 의존하고 있습니다. 따라서, 적어도이 분석법은 세포 배양에 대한 치료 효과를 설명하는 데 사용되는 것이 대사 상태와 해부 가능성에 의존하는 일을 측정 한 추천합니다. 이러한 방식으로, 하나보다 효과적으로 치료 화합물의 구조와 기능 모두를 보호하는지 확인할 수있다.
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Disclosures
저자 중에 공개 할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 ATP 분석에서 시약의 볼륨에 저장하는 아이디어 Juliann Jaumotte을 인정합니다. 우리는이 연구에 대한 재정 지원을 제공하는 메리 카루소, 뎁 WILLSON, 재키 파러의 약학 Mylan는 학교에 최상의 행정 지원에 대한 깊이 감사하고 있습니다. 감사는 또한 Hunkele 두려워한 질환 재단과 파킨슨 병 및 운동 장애 차 신경 세포 연구의 재정적 지원을위한 재단에 기인한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
References
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