Summary
治疗性化合物通常先在体外用可行性分析研究。盲细胞计数由人类观察者可以是在细胞数量的微小变化高度敏感，但不评估功能。计算机化的可行性分析，如下所述，可以客观地评估在结构和功能。
Abstract
在显微镜手动细胞计数评估细胞活力的敏感装置，但费时，因此价格昂贵。计算机化的可行性分析是昂贵的设备方面，但可以更快，更客观的比手工细胞计数。本报告介绍了使用三个这样的可行性分析。两个这些测定是红外线和1是发光。两个红外检测依赖于一个16位的奥德赛成像仪。一个红外检测使用的DRAQ5染色的细胞核结合蓝宝石染色为细胞质和可视化在700 nm的通道。其他红外测定中，一个胞内western，使用抗细胞骨架蛋白（α-微管蛋白或微管相关蛋白2）和标识它们在800 nm处的通道。第三个可行性分析是对ATP一种常用的发光检测，但是我们用四分之一的推荐量，以节省成本。这些测量都是线性的，并与CE的数量关联LLS镀金，但有所不同的敏感性。所有这三个实验规避耗时显微镜和样品的整个井，从而减少抽样误差。最后，所有的测定法可以很容易地一天实验结束时内完成，从而允许更大数目的要在短的时间范围进行了实验。然而，它们都依赖于假定的细胞数目保持在比例处理，即有时不能满足，特别是对细胞内ATP的假设后的信号强度。此外，如果细胞增加或治疗后减少的规模，这可能会影响信号强度，而不影响细胞数量。我们的结论是所有的可行性分析，包括手动计数，从一些需要注意的地方受苦，但计算机化的可行性分析是非常值得的初始投资。使用所有这三个实验同时产生细胞结构和功能的全面视图。
Introduction
在生物科学中最常见的活力测定包括细胞计数。这是由顶部（最近的）出版物200中出现的医学用关键字或者“ 体外 ”或“文化”对2013年4月29日和二〇一三年四月三十〇日的分析证实。这些出版物中，有23.5％的人使用细胞计数分析，包括人工细胞数计数，用图像处理软件自动细胞计数数和台盼蓝排斥。的活/死测定法用在这些出版物中的1％。使用MTT（3 - （4,5 - 二甲基吡啶-2 - 基）-2,5 - 二苯基溴化）的出版物的数量测定的代谢活力为11％。文学的这项调查还显示，使用试验，如MTT法与细胞计数分析相结合的出版物的数量仅为3.5％。尽管使用一个可行性分析本身，评估与细胞的号码组合细胞功能的趋势似乎评估蜂窝我最好的选择ntegrity。由自己的细胞计数是不够的，因为剩余的细胞可能不是功能性的或，即使它们是存在于井1,2 健康。相反，功能性的措施如ATP可以增加或减少在没有在细胞的数量平行的变化。从细胞数的代谢读数的解偶联表明，ATP和MTT法不应该被用来作为唯一的可行性分析。在本报告中，三可行性分析的调查既细胞结构和代谢功能进行了描述，对细胞的完整性更全面的视图，而不是本身的任何一个检测可以负担得起。
我们的两个实验都需要一个红外成像仪测量荧光在700和800 nm的渠道。噪音低的红外线的波长，从而导致更高的信号-噪声比3。我们使用奥德赛成像仪拥有4.5日志的动态范围和位深度为16，translatin克至2 16或65,536色调红外线。这可以对比对8位彩色成像，这仅仅能提供2 8或256彩色浓淡的每个波长的光。因此，16位成像具有较高的分辨率。应当指出的是，原始红外图像通常伪彩色绿色（800纳米）和红色（700纳米），在列报发表的报告。奥德赛成像器通常既用于Western印迹和在细胞西部片4-7。在细胞西部片甲醛固定的细胞用第一抗体针对感兴趣的任何蛋白质和依次用红外荧光二抗标记它们。这种技术是已知的磷酸化端点6中特别有用。在我们的内嵌式西部片，我们固定染色细胞骨架蛋白α-微管蛋白或神经元微管相关蛋白2（MAP2）在800 nm的通道。这些蛋白质是足够丰富，得到高的信号噪声比。我们还弄脏我们的盘子在700纳米通道的原子核与DRAQ5染色和用于与蓝宝石染色细胞质中。无论是细胞骨架蛋白和DRAQ5 +蓝宝石污渍从而反映细胞结构。
第三生存试验测量的代谢功能，被称为“细胞滴度格洛”在此荧光素酶为基础的检测，发光值是成正比的ATP水平。 ATP测定法是常用来量化活菌8-12。然而，包括在测定中的名称的字“效价”是有些用词不当，因为每个细胞ATP的输出可以作为毒素处理的函数改变，因此不总是按比例细胞数8。 ATP水平也受昼夜节律13和细胞分裂14和细胞分化15。然而，这里显示的ATP检测是简单的执行和有用的，因为ATP是一个强大的测量代谢可行性16-21，如果不是细胞数本身。使用此法，以配合红外内嵌式西部片因此产生的细胞的完整性更全面的了解比任何单纯的一个实验。
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Protocol
的协议的原理图如图1所示。
1。细胞电镀
板的细胞在96孔板中以不同的接种密度（ 图2）。有关的N2a成神经细胞瘤细胞系，板2.5K，5K，10K，和每孔15000细胞在3或6孔/组的线性度检查。在大鼠原代皮质神经元，板25k，50K，100K，每200K良好的细胞在3个或6孔/组的线性度检查。如果细胞系或感兴趣的原代细胞看起来很健康在不同的接种密度，板在和周围的最佳细胞密度的细胞类型。
注意：在本研究中，的N2a细胞铺板在100μl介质和原代皮质神经元在200μl介质上而设计的低蒸发板。有关电池的处理，培养基，血清，抗生素和毒素治疗的详细信息，请参阅Unnithan 等 。为的N2a CELLS 8和Posimo 等 。原发性皮质文化22。
- 重复该镀上的第二的96孔板。一个板将被测定ATP（ 图2A），而另一个与红外分析（ 图2B）。人们可以不使用相同的板的ATP和红外线检测由于细胞必须对细胞内ATP的测量被裂解开。
- 请务必板块在红外检测为背景减除至少3个额外的井在最佳接种密度（第2列; 图2B）。
- 新增无介质或细胞，更廉价，无菌水外井排A和H和列1和12。避免依赖于从沿边缘井数据，存活率通常是低级这里从媒体蒸发和温度梯度的影响。这些问题与微孔板通常被称为边缘效应23,24。不要让这些井空因为再行B和G和列2和11遭受的边缘效应。
边缘效应可以通过在环境条件下孵育新鲜接种板在室温下转移到CO 2培养箱中24之前被降低。此外，最近的一项研究Carralot介绍了使用一个单一的控制列23酶标板的数学校正方法。奥利弗和他的同事使用了一种特别设计的强制空气微量滴定板孵化器，以减少热梯度25。如果边缘效应是显著的关注，微孔板稳定性试验箱（ 如：BT＆C股份有限公司）就可以买到创建一个均匀的微环境湿度高，温度均匀梯度。 - 如果需要比图1所示更多的井，因为额外的试剂的稀释或多个接种密度将被测试，用于减去背景边缘的孔中。
- 等待通宵附件细胞和测定法，如下所述第二天早晨的。
2。发光的ATP含量
- 按照细胞滴度格洛制造商的建议与缓冲基材的重建和孵育时间。
- 从100或200微升电镀媒体，删除50或150微升媒体分别。略少于50微升将在井中留在后面。加入25微升的试剂（衬底加缓冲液）中，以1:2稀释的列2-6（ 图2A）。
注：媒体变卷后留下去除可能的差异跨井稀释或浓缩的ATP检测试剂。小心，以确保液体中的所有多通道移液器吸头的水平是等价的。立即加入ATP检测试剂，以确保准确性之前测量在整个板中选择孔中的剩余液体用吸管。如果存在从媒体的蒸发罐差别税率高变异横跨板的表面振动性，除去所有旧的介质，并立即加入ATP检测试剂之前的新鲜培养基或磷酸盐缓冲盐水（PBS）中相同的体积加至所有孔中。如果从板块蒸发变量的水平受到影响，尝试切换到从Costar公司康宁的低蒸发板。在后者的板，在图2所示的60内部的井只遭受从平均0.995％±0.41介质蒸发过夜。还有从而在测定时在媒体音量变化可以忽略不计。 - 在列7到11中，行B至D，除去足够的媒体，留下50微升的后面，如上面详述的，并以1:1的稀释度加入50微升的试剂。
- 列7至11，行E到G，离开细胞在100μl的媒体和1:1稀释加入100μl试剂，再次。公司建议，将100μl试剂应该在100μl的媒体进行1:1稀释。
注：为了为了节省成本，也能够在数量和在稀释切断这些建议。然而，在此之前，确保它不降低测定的线性度和灵敏度。 - 一旦一个特定的量和所用试剂的稀释因子被发现是令人满意的，坚持使用他们的所有后续实验。该标准令人满意的数据在结果部分说明。
- 未使用的试剂配制可再冷冻并使用在稍后的日期，以节省成本。据生产商，再造试剂可以储存在-20℃下进行21周，活动〜3％的损失。
- 从100或200微升电镀媒体，删除50或150微升媒体分别。略少于50微升将在井中留在后面。加入25微升的试剂（衬底加缓冲液）中，以1:2稀释的列2-6（ 图2A）。
- 将板在定轨摇床上，持续2分钟或章动振荡机中10分钟。如果该板的一部分被检测为不同的测量，并且是不可动摇的，搅拌的介质用简单的向上和向下的移液仅在感兴趣的孔中。然而，在此步骤中产生过多的气泡将与LUMI干扰nescent输出。
- 加入试剂后10分钟，转移60微升的孔内容到白色96孔板中。发光值较高的白酒板块较透明或黑色的板，因为它们反射光线向上直到检测。
注：根据我们的经验，细胞生存的低蒸发更好，清晰Costar平板比其他板块。这些具体的板不与白色的墙壁出售。其次，不透明壁和水清见底板是不是完全清楚的板更贵。如果一个发光液体转移到白色板，白色面板可洗涤并重复使用，从而节省了使用新的白色板为每一个实验的成本。液体转移因此，从长远来看更便宜的选择。 - 弹出气泡之前读取该板用针，或者最好是用由塑料移液管灯泡的强制空气。读板，上有1秒的积分时间（该公司recomme光度计NDS 0.25-1秒为足够的积分时间）。读加入ATP检测试剂后板10-12分钟。定时是用于在不同的板比较关键的，因为该发光信号是瞬时与快速衰变速率，如由吉尔伯特和同事26。
- 加入试剂后10分钟，转移60微升的孔内容到白色96孔板中。发光值较高的白酒板块较透明或黑色的板，因为它们反射光线向上直到检测。
- 从3个或6个孔中各基团和情节中，作为细胞数在散点图的函数的平均发光值（参见图3）。从每个相应的数据点首先减去相应的空井的平均本底荧光值（11G井2B - 2G，井11B - - 11D和11E井）。会出现在这个初始实验（ 图2A）三个不同的群体对每个电镀密度。 ATP水平可以被线性地与细胞密度在1这些基团的部分或全部。继续进行的最高稀释度的试剂仍然给人满意的结果，以节省成本。令人满意的结果的标准描述我n个结款。
注意：对于在本研究中使用的媒体，在该测定法的背景值不高，因此能够跳过空白孔。然而，制造商Promega公司的报告不同的培养基中发光的差异。本研究采用Hyclone公司胎儿克隆三，胎牛血清为的N2a细胞和初级皮质培养小牛血清合成版本。根据制造商，小牛血清减小发光值，但不降低该测定的灵敏度。然而，如果这是显著的关注，稀释在PBS代替媒体ATP的测定试剂在测定的时间。- 如果细胞出现生长不均匀跨列过夜，尽量在6小时镀层的测定它们。但是，记住，在检测的正常时间（例如，24治疗后HR）的密度是指线性度必须达到的密度。
3。 Infrareð测定
- 电镀后的早上，固定细胞在所述第二板在室温下在通风橱中。一定要戴手套，这一步和处置固定液为化学废物的，因为甲醛是一种致癌物质。在0.1M磷酸盐缓冲液中添加4％的甲醛和4％蔗糖，以1:1稀释的现有介质。媒体还可以用PBS冲洗掉固定在全强度的固定剂前。无论哪种方法效果很好。
- 孵育固定液中20分钟，然后取出固定液，并在200微升PBS洗涤3次。
- 用0.2％的叠氮化钠的储存板在PBS中于4℃下，如果测定将不会发生在同一天。否则，继续进行试验，然后将细胞阻断的解决方案，以尽量减少抗体的非特异性结合。
- 淡化鱼血清奥德赛块1:1的PBS，并添加0.3％的Triton X-100作为细胞渗透剂。创建足够的封闭液以及小学和中学antiboDY解决方案，使35微升可以很好地吸取到每个。然而，如果大量的气泡移液过程中的观察，使> 50微升每个反应孔，否则气泡到达成从结合的细胞和块的抗体。过度的肥皂泡沫将显示为未染色圆形光斑在阱的中间。尝试，如果发生这种情况，调整移液。
- 孵育在室温下30-60分钟，这封闭溶液。
注：来自相同物种作为第二抗体5％牛血清白蛋白或正常血清也可以用来作为封闭液保存在鱼血清块的成本。阻塞的解决方案可以影响抗体的性能。因此，对于每个抗体的最佳块是最好的经验确定。
注：一些研究者把内嵌式西片上呼风唤雨孵化期间。然而，这是没有必要的。
- 使第一抗体：1:10,000稀释的抗-α-微管蛋白（小鼠单克隆抗体， 表1）和1:2000稀释的抗-MAP2（小鼠单克隆抗体， 表1）。这些抗体是针对在这些细胞模型感兴趣的蛋白质，特异性为任何免疫细胞化学染色必不可少的。
注意：MAP2是一个标记为神经元和适合混合性神经元/神经胶质培养物。这里显示的产后的文化也含有一些胶质细胞（〜25％），因为星形胶质细胞首先出现在胚胎第18天，与他们的人数在高峰新生儿早期27,28。我们不能星形胶质细胞和神经元ATP和DRAQ5 +蓝宝石检测区分。为了分别测量神经元和星形胶质细胞，同时用MAP2和GFAP染色在800和700 nm的渠道，所描述的Mullett和同事4,29，留下了DRAQ5 +蓝宝石。但是，如果所有的细胞在培养要进行评估，使用一个泛细胞标记，如α-微管蛋白，β-肌动蛋白，或GAPDH。
注：这些稀释已优化的的N2a和初级皮层细胞，可能无法推广到每一个模型。因此，尝试在至少两个初级抗体稀释液，分别在板的左半部分和一个在右边一半（ 见图2B）。或者，尝试在每个3口井3-4稀释一抗。例如，在抗体的插入片的建议稀释可侧接有两个倍的变化。换句话说，如果对于免疫细胞化学的推荐稀释度为1:500，也尝试1:250和1:1000的稀释因子。- 抗体稀释1:1奥德赛块：PBS中，加入0.3％的Triton-X。为了节省成本，尽量使抗体在被施加到所述单元在步骤3.2.1通过在孵育结束时除去该溶液中的封闭溶液。保持细胞在PBS，而这样做，他们一定不能干。
- 孵育在一抗或者1-2小时，在室温或4℃过夜°C。对于弱binding抗体和蛋白质，是不丰富，孵育过夜可以帮助提高信号。
注：至少保留3口井堵塞的背景减法的解决方案在每个二级抗体浓度（井2B-2D和2E水井-2G 图2B）。不要这些井承受任何一抗任何责任。他们揭示了由次级抗体的非特异性结合的程度，并为信号与噪声的比值计算是有用的。如果存在这样的担忧，该第二抗体将导致高水平的非特异性结合的，还包括对照孔中未暴露于初级或次级抗体，但收到后洗涤的数目相同。这些井和“二次唯一的”井之间的差值将揭示的非特异性结合引起的二次抗体单独的程度。在我们对小鼠的N2a细胞测试，信号抗鼠二抗强独显0.557±0.032，与抗兔信号单独二抗为0.533±0.041，无二次抗体信号是0.357±0.003，与第一和第二抗体信号为11.867±0.911。我们在小鼠细胞使用抗鼠二抗，即使这样也没有观察到高浓度的非特异性结合的。有几个制造商的红外线的第二抗体;我们建议只买高交吸附的。注意，这取决于源次级IgG抗体的浓度可以变化。
- 以每孔，每10分钟洗涤3次的200微升PBS洗去一抗。初级抗体可在0.2％叠氮钠保存于4℃几周和重用，直至碎片的微小斑点变得明显时，溶液被保持到光。这只是做，以节省成本。如果成本不是问题，作出新的抗体，每次使用。
- 由1:1,000或1:2,000 1:1奥德赛块稀释第二抗体：PBS 0.3％三吨-X（ 图2B）。加入1:1000稀释的板和1:2,000的上半部分的底部板的一半。这些浓度可进一步减少，以节省成本，但承诺此之前检查线性度。
注意：一定要添加相应的二级抗体溶液的背景减除井（ 图2B 2列）。- 如果第二种蛋白将被检测到位DRAQ5 +蓝宝石，标记细胞中的α-微管蛋白或MAP2与700nm的山羊抗小鼠IgG和第二蛋白质与来自一个物种比鼠标等初级抗体在800nm的信道。在800纳米通道具有比700nm的信道背景少，并应保留用于所关注的最关键的蛋白质。
- 孵育中的二抗1小时，在室温下，在抽屉避光保存。
- 以每孔，每10分钟洗涤3次的200微升PBS冲洗二次抗体。
- 使DRAQ5 +蓝宝石的解决方案。对于该板的左半部分，稀DRAQ5 1:10000（0.5μM的最终浓度）和蓝宝石1:1000在PBS中与0.3％的Triton-X（列3 - 6， 图2B）。对于该板的右半部分，稀DRAQ5 1:20,000（0.25μM）和蓝宝石1:2000（列7 - 10， 图2B）。
注：用于在一个1毫米的股票被出售，而不是一个5毫米的股票DRAQ5。因此，一些此前公布的报告中使用1:4,000或1:2,000稀释DRAQ5 8。- 为了节省成本，如果两个板同时被检测，同样DRAQ5 +蓝宝石解决方案可用于在序列中的两个板，吹打其关闭所述第一板和将其加入到第二个。如果相同的解决方案，将用这种方式被使用两次，使用它们在一天之内。摊薄DRAQ5 +蓝宝石解决方案不能被保存在4℃或冷冻以备后用。
- 在培养这些解决方案为30分钟，在室温下，远离fROM光。如果时间很短，DRAQ5 +蓝宝石解决方案将不被重用在其他板块不同的次级，添加这些污渍在步骤3.5的二级抗体溶液孵育1小时。
注意：不要DRAQ5 +蓝宝石解决方案添加到背景减法井（ 图2B 2列），因为这些油井不应该在700 nm的通道被染色。
- 用200μlPBS中，每孔洗涤平板3次，每次10分钟。把0.2％叠氮化钠的PBS中最后清洗，如果板是将要染色的其它可见光范围的二级抗体后的红外成像完成。
- 扫描平板上的奥德赛成像仪。通过扫描板的强度5和169 mm分辨率开始。无论是“中等质量”或“低质量”的设置就足够了。该公司没有公布详细的激发/发射过滤器的信息。然而，发射滤波器是约20纳米宽，都围绕720和820纳米，根据制造商。
注：这是可能的扫描板，同时还湿的调查人员可能希望继续污染其与其他标记。然而，该公司建议在其网上协议，干板导致较少的富裕以及信号传播。如果您扫描他们两个湿，然后干燥到比较数据时，一定要删除所有的PBS从井里因为蒸发后剩下的盐会导致沿边缘高背景荧光。- 奥德赛成像仪扫描并通过该板的底部。来自不同制造商的板可要求不同的聚焦偏移，因为孔的底部可以在其厚度和深度变化的板。尝试扫描在不同的聚焦偏移，看看那里的最高信号噪声比和干脆的（最重点）信号达到2.5毫米，3.0毫米，3.5毫米，4.0毫米。也尝试测量井深从板用尺子底部确认发掘的GS上的奥德赛。请记住，在塑料中的井的底部可以添加额外的高度，以直尺测量。在本研究中使用的Costar平板要求以焦点为4.0mm的偏移。
- 使用该软件的内嵌式西方函数将合适大小的网格将其安置在板的图像和数据导出到Microsoft Excel。考察在不同焦点的偏移量相同的井“积分强度”的价值观，以找到最高荧光值。焦点偏移产生（在免疫染色井信号对“无主阴性对照”孔）的最高信号与噪声的比值是1，选择以下。
- 一旦一个焦点偏移后决定，以较小的增量再次扫描。例如，如果各路信号是在3.5和4.0毫米，试着扫描在3.6，3.7，3.8，和3.9毫米，看看是否有信号强度进一步提高。如果焦点偏移是错误的，跨在一个空PL的12列中的信号强度吃了（当所有列应该有平等的信号）将显示为一个U形曲线，而不是一条直线。如果这仍然是用塑料板有问题，尝试玻璃底板。
- 从在700和800纳米通道的每个对应的数据点;减去积分强度的平均值中减去背景井（2G孔2B - - 2D或井2E 图2B）。然后对各组油井的平均化积分信号强度。绘制的数据作为对细胞密度的散点图（ 见图3）。
- 比较第一和第二抗体和DRAQ5 +蓝宝石的两种不同的稀释度，以解决在每一个稀释用于随后的实验结果的两个不同稀释度的结果。如果线性度没有实现，尝试扫描以不同的强度。重新扫描与强度3和7，而不是5和重新分析数据。如果数据改善在这些强度的1，但仍然不能令人满意，重新扫描周围的强度增量。
- 要小心，不要分析图像，其中软件显示白点在井;这些斑点表示饱和信号输出成像的范围。扫描以较低的强度，如果发生这种情况。
- 如果线性度没有实现，也尝试修复在6小时镀层的细胞，因为它们可能会增长或在不同的列死不均匀过夜。也可以尝试不同的接种密度，不同的扫描强度，试剂的稀释因素，玻璃底船板，DRAQ5本身为核心，只有色斑，或者比抗α-微管蛋白或抗MAP2不同抗体的进一步优化。
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Representative Results
在这些实验中的限速因素是红外线染色，作为ATP测定法的持续时间相对短暂。用于红外测定法，我们预计8 96孔板可染色和扫描在一天之内由交错两批各4板（ 见图1）。这个估计假定固定20分钟，洗涤30分钟，阻断，2小时初级抗体孵育后洗涤30分钟的30分钟，1小时的第二抗体温育后洗涤30分钟，30分钟DRAQ5 +蓝宝石后跟30清洗，以及扫描时间为4片34分钟的分钟。另外十五分钟分解成图1为洗涤，以占四个独立板块的交错移液。时间进行数据分析，不包括在此估计。如果将并行发生的每一个红外线板的ATP分析测量，12板可用于检测在一天 - 六为红外染色s和六项ATP水平。
在回归分析满意的数据（ 图3）的标准，所提到的协议部分，包括铺板密度和信号强度（2 尾 p≤0.05）有显著相关。改变发光或红外信号的大小也应该成比例地变化，细胞数目。理想情况下，5K细胞应该有大约一半的发光或10K的细胞的ATP水平，和15K的细胞应该具有较大的约50％的值超过10K的细胞， 等等 。这个比例反映了测定的灵敏度和距离确定中的R 2值或系数明显。 ，R 2只的措施以及如何回归线接近真实的数据点。即使数据是线性的，在信号强度的相对的变化可能不按比例的变化，细胞数目的大小。这可能发生瓦特母鸡回归线具有高R 2，但低的斜率，这表明该测定是不很敏感。因此，显著的相关性和数据的比例的标准，都应该被满足。最后，围绕最优铺板密度变化的信号强度应落在仪器和测定的动态范围内。动态范围的最大和最小可能的值之间的比率。奥德赛成像仪拥有4.5日志的动态范围和饱和信号显示为一个明亮的白色来代替通常的红色或绿色的图像，以提醒该结果不再量化研究员。在测定过程中本身的动态范围是因为问题，如最大和最小铺板密度对任何给定小区类型更窄。如果一个人的指示牌，增加细胞密度，对于这些实验的饱和曲线，就会发现该电镀密度高于其没有进一步的差异就可以解决，或者是因为他们出范围成像器或因为细胞不拥挤过夜无法生存。类似地，如果一个板减少的细胞密度，可以测量的最小的细胞密度低于没有进一步的变化信号。该测定的动态范围只包括最小和细胞/孔的可分辨极限之间的接种密度。我们还没有测量到的全动态范围为这些特定的实验，因为我们的细胞以外的所报告的密度不生存良好。
优化后，我们现在弄脏的N2a小鼠神经母细胞瘤细胞的抗-α-微管蛋白在1:10,000稀释，用抗小鼠IgG在1:2000稀释，并用DRAQ5 +蓝宝石溶液在1:20,000和1:2,000，分别。我们还使用25微升ATP的测定试剂在50μl介质。在这些条件下的结果示于图3A，B和 C和已公布江前E 8。在所有三个测定信号强度以每孔细胞数为显著相关。虽然所有三个实验是高度线性的，他们没有在灵敏度相同。例如，每孔5K细胞不具有红外线染色的正好一半的量为每孔10K的细胞。与此相反的红外线测定中，ATP测定法是变化的铺板密度更敏感。换句话说，发光从10K下跌了大约一半到5K，并从5K到每孔2.5K细胞。尽管在ATP检测的最高灵敏度这些发现，最好是执行所有三个实验的可行性，以获得细胞健康的一个更广阔的画面。
我们现在正处在一个1:2,000稀释，用抗小鼠IgG在1:1,000稀释染色的大鼠原代神经元培养物用抗MAP2，并与DRAQ5 +蓝宝石溶液在1:10,000和1:1,000，分别与使用25微升在50μl介质（ 图中的ATP的测定试剂的3D，E和F）。在DRAQ5 +蓝宝石检测信号的强度是最少的线性所有三个检测的，因为有100K和每孔20万细胞在700 nm的通道之间的差别不大。然而，在700 nm处的信号强度很好的比例低于每孔10万细胞的细胞数目，我们总是在每孔10万细胞板培养的神经元呢。然而，我们还观察到，在DRAQ5 +蓝宝石测定是不敏感的毒素疗法与其他两个试验（见下文）。在对比DRAQ5 +蓝宝石，信号强度是更好的比例与接种密度为两个MAP2和ATP测定。应当指出的是，ATP检测试剂的体积更大可以以每孔20万细胞改善的结果。换句话说，发光输出可以提高到以每孔10万细胞中的值完全相同的200％，因为有更多的试剂。但是，我们从来没有在那么高的接种密度为experime板皮质培养NTS。我们也已经发现，微管相关蛋白和ATP的水平，以在新皮层神经元的铺板密度的20％的变化，从每孔20K的细胞以每孔22 120K细胞敏感。然而，其他调查人员应在自己的实验室中测试这些分析，而不是使用，因为在组织和细胞处理间实验室变异的最佳条件从我们的实验。
为了说明这些测定下列毒素治疗的效用，我们表明与MG132，蛋白酶体抑制剂（ 图4）处理后的N2a细胞的剂量-反应曲线。 MG132是在谷胱甘肽前体N-乙酰半胱氨酸的存在或不存在下应用。这些数据也可以在我们最近的出版物上的N-乙酰半胱氨酸30的保护作用找到。分析细胞48小时以下MG132治疗。 MG132剂量依赖性地降低DRAQ5 +蓝宝石信号（ 图4A中的D）和α-微管蛋白的信号（
根据细胞滴度格洛测定中，ATP水平提出了在低浓度的MG132（ 图4C）的，这表明ATP水平不一定是在处理时按比例细胞滴度。 ATP的数据，因为它们表明，N-乙酰半胱氨酸也保护新陈代谢功能时的N2a细胞与MG132处理仍然是有用的。这证明在T他移入MG132的IC50 值为与N-乙酰半胱氨酸。对ATP的IC 50值为3.05μMMG132（逻辑50 = 0.48±0.07，R 2 = 0.8616，希尔斜率= -1.0）与汽车和9.12微米MG132与N-乙酰半胱氨酸（逻辑50 = 0.96±0.04，R 2 = 0.9261，希尔斜率= -1.0）。需要注意的是，导致升高的ATP的浓度被排除在该分析中。包括在分析中所有值降低判定系数和车辆的存在和9.24微米MG132增加的IC50 值至4.03微米的MG132（逻辑50 = 0.61±0.09，R 2 = 0.7224，希尔斜率= -1.4） （逻辑50 = 0.96±0.07，R 2 = 0.6607，希尔斜率= -2.1）中的N-乙酰半胱氨酸（与图4C对比度）的存在。
这三种测定法的第二个例子示于FIGUR原代培养物Ë5。组织从大鼠大脑皮层和allocortex显微解剖，分离，以每孔10万细胞，处理过的并联与H 2 O 2。我们测试了这两个脑区会在不同的氧化应激的处理，因为它们是差分脆弱的神经变性疾病34-39的假说。一些这些数据已被以前出版的，结果在该研究中22进一步讨论。该IC 50值DRAQ5 +蓝宝石分别为22.84微米H 2 O 2在新皮层（逻辑50 = 1.36±0.07，R 2 = 0.7552，希尔斜率= -0.95）和24.63微米H 2 O 2在allocortex（逻辑50 = 1.39 ±0.03，R 2 = 0.9379，希尔斜率= -1.74）。该IC 50值分别为MAP2 11.66微米H 2 O 2在新皮层（逻辑50 = 1.07±0.04，R 2 = 0.9332，希尔斜率= -2.13）和29.76微米H 2 O 2在allocortex（逻辑50 = 1.47±0.04，R 2 = 0.8934，希尔斜率= -4.45）。该IC 50值分别为ATP的23.82微米H 2 O 2在新皮层（逻辑50 = 1.38±0.03，R 2 = 0.8907，希尔斜率= -2.56）和44.5微米H 2 O 2在allocortex（逻辑50 = 1.65±0.03 ，R 2 = 0.9204，希尔斜率= -2.71）。 Allocortex是显著氧化应激比大脑皮层更耐在对H 2 O 2低于50μM的浓度，但DRAQ5 +蓝宝石测定是示出这种差异最不敏感。这可能反映了一种测定法无法从神经元的神经胶质细胞区分开，不像MAP2。如前面提到的，我们的培养物含有一些胶质细胞，因为它们是从出生后的脑22采收。出人意料的是，在高浓度的H 2 O 2（75微米以上），当所有MAP2
最后，为了说明与所有三个测定板内变异，我们从图6A-C和6G-I上述剂量响应曲线绘出的第二和第三阱“原始数据点 >。同样，为了说明板间变异性，我们的原始数据点的平均值（一式三份孔的平均值）从图6D-F和6J-L 2板绘制。在重复孔和整个独立实验的信号强度表现出显著的相关性的各项措施。有一个在整个初级神经元培养独立实验的原始值的一些变化，也许是因为我们重新使用旧的抗体和DRAQ5 +蓝宝石解决方案，并重新冻结未使用的ATP检测试剂几次。另一个原因是在原代培养的高板间变异可能是文化本身的质量。不同死后时间间隔和组织处理在不同实验天可能有助于变异。
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所有这三个可行性分析（一）和时间表红外分析（二）图1。示意图，显示的是对的N2a细胞中的推荐程序。如果DRAQ5 +蓝宝石的解决方案不会对被染色的不同的二抗其他板可以重复使用，它们可以与一个最后的1小时温育的抗小鼠第二抗体溶液进行组合，降低了过程通过一个步骤。 点击这里查看大图。
ATP的测定（A），并在该程序段中所述的红外分析（二）图2。板格式。虽然96孔板图示，这些检测可以适应其它的格式，如384孔板，以节省试剂和细胞。 点击这里查看大图。
图3。线性回归中的N2a小鼠神经母细胞瘤三种可行性分析（A，B，C）或原发性产后大鼠大脑皮层神经元（D，E，F）。信号强度的每个检测被绘制为铺板密度的函数。插图显示了DRAQ5 +蓝宝石（A，D），α-微管蛋白（B）或微管相关蛋白（E）染色的代表性红外图像。原始强度值列出的每个图像下方。注意，原始值单个井可以是从3孔的该实验的平均值和从3-4个独立实验的平均值不同。原来的红外图像进行伪彩色红（700纳米）或绿色（800纳米）。在一式三份孔进行每个实验重复3次为DRAQ5 +蓝宝石两个的N2a细胞和原代神经元，3个为α-微管蛋白，4倍于MAP2，3为ATP中的N2a细胞，并在神经元4倍为ATP。从一式三份孔的数据的平均值为各3-4实验1的最终值。这些3-4最终值的平均值和SEM显示在曲线图。请注意，DRAQ5 +蓝宝石值表现出低标准偏差，使扫描电镜杆是不可见的。决心和双尾P值评估的相关性的意义中的R 2系数也说明每项措施。数据是在的GraphPad棱镜（5.0版）进行分析。从国际神经化学，61，重印由Unnith一个等 ：P 356-368，由爱思唯尔权限“从神经退行性疾病与N-乙酰半胱氨酸，一个两打高通量模型救援”。 点击这里查看大图。
图4。保护的N2a细胞免受MG132毒性 。 N2A细胞用蛋白酶体抑制剂MG132中的抗氧化剂的N-乙酰半胱氨酸（NAC; 3毫摩尔）的存在或不存在指定浓度。所有这三个可行性分析是进行48小时后。注意上升ATP水平在低浓度的MG132（ 三）。在DRAQ5 +蓝宝石染色（A）o否增加平行[Rα-微管蛋白（B）是明显的。 ，该DRAQ5 +蓝宝石和α-微管蛋白污渍的代表红外图像进行伪彩色红色和绿色的D和E分别。一式三份井进行每个实验重复4倍的DRAQ5 +蓝宝石，4个α-微管蛋白，和3x对ATP。从一式三份孔的数据的平均值为各3-4实验1的最终值。这些3-4最终值的平均值和SEM显示。 * P≤0.05为N-乙酰半胱氨酸与水相比，Bonferroni校正以下两个因素方差分析。数据是在的GraphPad棱镜（5.0版）进行分析。从神经科学，255重印，江等人 ：“N-乙酰半胱氨酸减弱proteotoxicity在热休克蛋白依赖性”，页19-32，来自爱思唯尔许可。 ç舔这里查看大图。
图5。新皮层和allocortical文化，以过氧化氢 的毒性鉴别漏洞 。的内嗅和梨状allocortex和产后主运动和感觉皮层的Microdissections解离并以每孔10万细胞。关于天体外 2，细胞用的H 2 O 2所示浓度。板分别测定48小时后。需要注意的是allocortex这些幸存的培养条件比大脑皮层更好，在基线具有较高的细胞数量。一式三份井进行每个实验重复4倍的DRAQ5 +蓝宝石，3倍的微管相关蛋白，与6X对ATP。从一式三份孔的数据的平均值为每个3-6实验最后一个值。这些3-6最终值的平均值和SEM显示。 * P≤0.05为新抗allocortex，Bonferroni校正以下两个因素方差分析比较。数据是在的GraphPad棱镜（5.0版）进行分析。 点击这里查看大图。
图6。板内和板间相关性的MG132和H 2的N2a细胞和皮层神经元O 2的剂量反应曲线 。所有个别实验在一式三份孔中运行。从各组中的第二两口井的原始数据绘制成重复1和2的板（A中测量的重复性，
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Discussion
我们已经发现，在所有三个活力检测的信号强度是线性的，并与铺板密度相关。然而，并非所有的试验都是同样敏感的2倍或铺板密度1.5倍的变化。供的N2a细胞，红外线检测比ATP测定法较不敏感，特别是在较低的接种密度。虽然红外检测比ATP敏感性较低，在DRAQ5 +蓝宝石分析和α-微管蛋白检测有较好的一致性，因为它们揭示的N-乙酰半胱氨酸的高度保护的影响。有红外信号的剂量 - 响应损失与两种测定和所有三个存活率曲线右移与N-乙酰半胱氨酸。这种重叠并非总是观察到的所有种类的N2a细胞的治疗，如在α- 微管蛋白和ATP检测似乎是如氯化铵的化合物比DRAQ5 +蓝宝石测定（参见图4中Unnithan 等人更敏感。8 ）。因此，可行性phenotypES并不总是同样由所有三个实验来表示。虽然ATP的检测是更好的比例的N2a细胞比镀α-微管蛋白和DRAQ5 +蓝宝石分析，即信号强度反映细胞数目的假设的数量并没有毒素治疗后总能得到满足。 ATP水平上涨的毒素浓度是没有引起类似的上升信号中的红外线检测。这些数据揭示的N2a细胞代偿性代谢变化的响应蛋白酶体抑制，并在他们自己的权利非常有用。在U形的ATP剂量 - 反应曲线是的现象称为兴奋效应特性。毒物兴奋效应的定义是有利的生物学反应，低强度接触到毒素和其他压力40-42。
对于神经元的DRAQ5 +蓝宝石染色较微管相关蛋白和ATP检测在高密度电镀不太敏感。然而，DRAQ5 +蓝宝石，微管相关蛋白和ATP测定法以及按比例CE在原代皮质神经元或低于每孔10万细胞LL数量。我们在每孔10万细胞板的神经元。从皮层的神经元不知道复制，因此，我们更关心的线性度在100K或更低的接种密度。该DRAQ5 +蓝宝石测定是在低于50μM的H 2 O 2浓度的新皮质和allocortex比任MAP2或ATP之间的差异不敏感。此外，ATP水平并没有因ħ下跌，极大地2 O 2的待遇，在其他两个实验的红外信号，也许再次提示代偿性增加ATP的产量。三个试验中的N2a细胞和初级神经元之间的差异可能反映了细胞的功能可以改变之前大体解剖结构的影响，以及细胞结构，包括细胞骨架蛋白，可以影响细胞本身失去了很久以前。由吉尔伯特多重活力检测和同事令人信服的最新数据说明了不同的可行性措施，如赫斯特核染色和ATP测量产生于特定的细胞特征，只有部分和间接地反映生存能力作为一个整体26的信息。因此，我们建议同时而不是执行所有三个实验依靠的代谢活力尽可能多的出版物做一个分析。有关这些措施的任何一个进一步的信息，我们建议统计单个细胞，然后评估细胞骨架蛋白的表达和ATP水平的细胞数的函数。
虽然有其他测定代谢活力，如MTT法，ATP的测定法的优点在于它的灵敏度和动态范围。 MTT测定法可以高估存活细胞的数量相比，ATP测量，并显示出的IC 50，其是2倍高43。此外，小资和他的同事报告说，ATP检测能检测每孔1563细胞的下限，而MTT法无法检测到少于2.5万个细胞/孔12。信号噪声比（从井用活细胞与井无细胞信号）仅7 MTT法，但230对ATP 44。的发光ATP检测过MTT法的另一个优点是，该温育时间要短得多。此外，自Promega的MTT法检测成本0.28美分，每孔而来自同一制造商的电池效价测定格洛费0.09美分每口井在我们推荐的稀释度。但是，也有局限性，所有代谢测定;代谢活性可以是从生存耦合，特别是在坏死。如果这是一个问题，在本报告中的测定可以用乳酸脱氢酶释放的测量相结合，以确定膜完整性的丧失。这将不涉及任何附加的板，如乳酸脱氢酶测量是在细胞外介质中简单地进行。
虽然我们介绍这些测定以替代手工计数在显微镜下，后者可以是一个高度敏感和准确的采样单元序号手段，如果适当地进行。事实上，我们预期的Hoechst染色细胞核的计数将是在的N2a细胞数量小的变化比DRAQ5 +蓝宝石检测更为敏感。当所有的试验失败的线性测试，手动计数是必不可少的。这方面的一个很好的例子就是我们的原代培养星形胶质细胞模型中，我们进行了更繁琐的人工计数45。然而，解释细胞计数数据时手动计数的固有偏见必须被铭记，就像电脑检测的固有缺陷不能置之不理。一些可行性分析的长处和短处以下，因此说明。
首先，如果DAPI或Hoechst公司污渍被雇用，皱缩和细胞核浓缩通常指定为凋亡1。然而，细胞大小，细胞核的缩合位于沿着一个光滑连续。与此相反，生命和死亡是相互排斥的，二元现象。除非是观察两个截然不同的活的或死亡的细胞群体，似乎最好的计数低于阈值的核直径为细胞凋亡与成像软件如的MetaMorph或ImageJ的，而不是用眼睛的所有细胞。当然，对于阈值直径的选择是任意的，因为我们不知道在什么时候一个不可逆的凋亡级联反应启动。此外，根据定义，甚至细胞，活化的胱天蛋白酶3不一定途中死亡和或许应该在固定46的时间计算为还活着。我们的红外检测避免这种担忧通过将连接到板，在固定的时间仍然住所有单元格。只有已飘然而去的细胞都算作死了。这会将细胞分化成两种不同的类别，并且避免使用共同的缺陷mplex，像核直径的连续函数。
第二，手动计数通常取样整个井的一小部分。这可能导致抽样偏差和，有时，高平均数的标准误差。与我们的生活力测定法，在整个井被采样为ATP和接近整个井采样与红外检测。这种采样模式增加样本量，避免了在哪里井抓拍的照片进行手动计数有时武断的决定。如果照片是采取了很好的中心，我们必须牢记，这个区域就是细胞的最冲洗过的发生，从而导致毒性的潜在高估。与此相反，红外线检测扔一格到96孔板中，只有不包括井的极端角的图像。如果需要的话，将孔的角部可以包括通过增加在网格中的圆的直径。
三，摄影师和细胞计数都应该在手动计数蒙蔽。然而，一旦细胞毒素治疗，他们通常认为是相当明显的，甚至到一个未经训练的眼睛形态的变化。这使得它更具挑战性，以保持平常心。失明不是我们的测定法的要求。
四，人工计数耗时和成本的主要研究者更多的薪水。薪金是进行研究的最高成本之一。扫描时间为一平板上的奥德赛仅8分钟长的“中等质量”的设置，可以在“低质量”的设置进一步降低。应当指出的是，奥德赛仪是昂贵的，甚至当一个人购买了用过的演示版本，但它是一次性的固定成本。另一方面，人们也有投资相对昂贵的落射荧光显微镜进行DAPI-或H的手动细胞计数oechst染细胞核。尽管初始成本，奥德赛成像仪是一种多用途的机器，也测量西方免疫印迹定量的方式47,48。我们已经适应了使用奥德赛的免疫染色在宏观脑结构，如大鼠或小鼠纹状体和端脑皮质量化。这种方法也被用于由他人49。奥德赛成像仪对组织成像中的一个弱点是，最高分辨率只有21微米。因此，不能指望单个细胞，并无意以可视化精细解剖细节。
最后，将红外线检测可能不那么敏感的细胞数作为手动计数的微小变化。该IC 50值，因此不能被认为是显示出引发细胞数的精确损失50％的浓度，但只作为，引出红外线信号的损失50％的浓度。这个警告可能适用于所有活力检测规避单个细胞计数采用显微镜和样品的整个井一次。用这样的测定相关的不精确性可能肥大，萎缩，或在外观上其他的变化会影响信号强度的函数。例如，用一些毒素，α-微管蛋白在每个小区中的免疫反应性可升毒性的功能。我们已经在非常高的浓度MG132 8的处理的N2a细胞中观察到了这种现象。如果这是值得关注的，其他的细胞骨架的标记蛋白质，如β-肌动蛋白或GAPDH的都可以使用。此外，强调的N2a细胞往往会形成双极型工艺8,50,51。与改变细胞的大小，每个细胞的荧光输出信号也将各治疗组差异。我们建议毒素处理过的细胞可以通过标准的高分辨率显微镜下对免疫细胞如在胞内western使用相同的标记物检查。如果胞浆治疗后变化较大的规模，但核不，我们建议您使用不带蓝宝石的污渍DRAQ5只量化核。用不同的染料，并与其他细胞骨架或其他丰富的蛋白质未来的研究来克服这些障碍。
我们的结论是所有测定的注意事项受苦，提出有关敏感性的担忧，线性度，抽样误差，信号与噪声的比例，人类的偏见或主观，时间和成本。此外，所有的检测依赖于并不总是满足的假设。因此，我们建议，至少两种测定被用于描述治疗对细胞培养的影响，1，测量代谢健康和一个依赖于解剖可行性。以这种方式，人们可以更加有效地确定治疗化合物是否同时保护结构和功能。
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Disclosures
没有一个作家有任何冲突披露。
Acknowledgments
我们承认Juliann Jaumotte为节省在ATP检测试剂的量的概念。对此，我们深表感谢玛丽卡鲁索，德布威尔森和成龙花拉和以药剂的Mylan公司为学校提供这些研究的财政支持高超的行政支持。还要感谢的Hunkele可怕的疾病基金会和帕金森氏症和运动障碍基金会主神经元研究的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
References
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