Summary
私たちは、新生児の大脳皮質および成体脊髄から実行可能なミクログリアの効率的かつ迅速に分離/培養のための方法を概説します。皮質ミクログリアの解剖とメッキが行われて、その後のミクログリアの収穫で、90分以内に達成することができます〜初期切開後10日。
Abstract
ミクログリアのような、そのようなCNS開発の成熟、多発性硬化症、および脊髄損傷などの生理学的および病理学的プロセスにおいて非常に重要な役割を担っている、中枢神経系（CNS）の常駐マクロファージ様細胞であると。ミクログリアが活性化され、そのようなMSや脳卒中に起因する虚血性脳外傷で見られる軸索損傷などの神経損傷または刺激によって行動に動員することができます。 CNSこれらの免疫担当メンバーは、非病的条件下でのシナプス可塑性における役割を持つと考えられている。我々は、他のCNS細胞型および細胞培養デブリの存在のような交絡因子を最小にしながら生細胞数を最大にすることを目的としている新生児および成体組織から培養ミクログリアのためのプロトコルを採用している。我々は、全体のプロセスが実現可能となり再現大きく、容易に識別可能なCNSコンポーネント（ 例えば皮質脊髄セグメント）を利用する。成体細胞の使用多くの病状は主に出生後の脊髄に影響を与える研究としてsが、新生児の脳のミクログリアの使用に適した代替手段です。これらの培養系はまた、直接ミクログリア活性化を阻害または促進することができる化合物の効果を試験するために有用である。ミクログリアの活性化が成体CNS疾患の結果を形作ることができるので、新生児および成人ミクログリアを培養し検討することが可能なインビトロ系での必要性が存在する。
Introduction
ミクログリアは、最も密接に構造と機能1に周辺マクロファージに類似し、CNSの居住者の免疫細胞である。それは、最近生後ミクログリア細胞は出生後の造血前駆細胞は成人の脳2ミクログリアの源であることを以前の概念をupending、原始骨髄前駆細胞から派生し、胚発生の八日前に生成されていることが実証されている。彼らは、いくつかの神経疾患において重要な役割を果たしているとすぐに炎症誘発性または抗炎症性サイトカイン3を解放することによって感染症やけがに対応することができます。したがって、ミクログリアは、疾患の進行に影響を与えるために操作することができるCNS内のスタンドアロンユニットを包含する。分離するために、堅牢で再現性のある方法と文化新生児または成人のミクログリア細胞の開発は、今後の研究にとって重要である。
ミクログリアは、脳病変の数が重要なプレーヤーであることが知られている。より最近では、リングライトESは海馬1、4の歯状回からミクログリア貪食過剰神経前駆細胞として正常な脳の発達と機能にセルに浮上している。ミクログリアは、そのような5-7 MS、神経因性疼痛、および脊髄損傷などの脊髄に影響するいくつかの神経学的条件をも調節することができる。脊髄ミクログリアは、ローカル環境の違いにおそらく活性化信号8,9に応答して脳ミクログリアと比較して異なって反応する。このようにして培養するインビトロ系で適切を確立し、脊髄ミクログリアを検討することが重要である。新生児ミクログリアは、IFN-γ、またはTNF-10,11さらには、特定の疾患のコンテキストでミクログリアを研究するために、成人の細胞を使用する必要性を強調してin vitro刺激後に成体細胞と比較して炎症性サイトカインの窒素酸化物のかなり多くを生成する。
我々は、CUにラボで採用するプロトコルlture新生児ミクログリアは、細胞培養フラスコ12の表面から小膠細胞を除去する目的で、混合膠細胞培養の揺れ利用する最近の方法の変形例である。我々はまた、最初のイップら 13で記述されたプロトコルに基づいて、成体マウスの脊髄からの培養ミクログリアにメソッドを記述します。この方法は、他の利用可能なプロトコルは14と比較して、文化の大人の細胞に迅速な方法を提供します。得られた製剤は70％であるミクログリア、残りのパーセンテージはアストロサイトから構成されている。私たちの文化の純度が他の公開された方法13に比べて低いが、この培養系は、主に脊髄に影響を与える病気の研究のために、強力なその中でだけでなく、様々な活性化刺激に文化応答にミクログリアを探索するのに便利です炎症反応は、主な機能です。
説明されているすべてのプロトコルはストーニーブルックの大学によって承認されているTY IACUC。
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Protocol
1。解剖（0日目）
- 低体温とP0-2マウス仔に麻酔を誘導する。組織を消毒するために70％エタノールに浸したキムワイプで子犬の頭を拭いてください。
- 10センチ培養プレートあたり4仔を用いた、はさみで頭を取り外します。氷冷ハンクスバッファーを含むペトリ皿に頭を置きます。
- 眼窩を通して湾曲したピンセットを使用してヘッドを固定し、慎重に真っ直ぐmicroforcepsと頭蓋骨をカバーする皮膚を除去。
- パンクをしないか、または皮質を損傷に注意して使用し、ストレートmicroforcepsと頭蓋骨を取り外します。この領域は破棄されるように、最も効果的な方法は、頭の基部に位置している小脳の近く開始除去を開始することです。
- 小さなへらで脳を取り出し、氷冷ハンクス緩衝液を含有する新鮮なペトリ皿に（4）脳を配置。
- microforcepsを利用し、この時点から、すべてのステップはdisse下で行われているction顕微鏡。脳の腹側から始まる、小脳を保持することによって、組織を固定し、中脳の両側にある2つの小さな切開を行います。皮質は、この地域の中脳をカバーするように、組織を介してすべての道を切らないように注意してください。
- ゆっくり2皮質から一枚で中脳と小脳をいじめる。 2皮質は、凹面形状を形成する必要があります。
- さらに解剖のために内側の2つの皮質とオリエント一つの皮質を区切ります。海馬は、観察することが困難になる可能性がありますが、これは大脳皮質の先端に小さな結節として現れる嗅球の反対側に位置しています。
- 三日月形状をしている海馬を、削除します。背側を表示するには、皮質を裏返し。
- 出発点として、嗅球を使用して、すべての髄膜と皮質から嗅球自体を削除します。
- 解剖皮質はCOL 14mlの、15 mlコニカルチューブに配置する必要があります氷の上でDハンクス緩衝生理食塩水。
2。細胞培養（0日目）
- 37℃で3時間オートクレーブに水で希釈したポリ-D-リジン（PDL）5μgの/ mLでプレコート10センチ組織培養皿
- PDLを吸引し、オートクレーブ処理水で1回プレートを洗浄する。 20分間組織培養フード内UV下で乾燥したプレート。このステップは、切開プロセスの直前に行われるべきである。
- 4脳からそれぞれ皮質を含むチューブから吸引ハンクスバッファは、1×トリプシン/ EDTA溶液4mlを適用し、℃のインキュベーターで15分間37にP1000先端、および場所管と組織を摩砕。
- 酵素消化を停止するには、チューブあたり完全ミクログリア培地4mlの、ミックスを追加し、5分間1.5K rpmで内容をスピンダウン。
- 上清を吸引し、完全培地4mlで洗浄を繰り返します。マイクロ40を介して完全なミクログリア培地（10％FBS、1％ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM、ゲンタマイシン0.08％）、及びフィルタ10ml中の細胞を再懸濁しn個のメッシュセルストレーナー。
- 37における組織培養インキュベーター10cmの組織培養プレートと場所25.4 1ml当たり8皮質の密度でプレート℃、5％CO 2（アダルトミクログリアプロトコルを参照）。
（3日目）
- 完全ミクログリアメディアとすべての細胞培養皿内のメディアを変更します。
（10日目）
- 60mmの400マイクロリットル10cmの組織培養プレートの培地と10〜15分間室温（RT）でインキュベートにHBSS（ミクログリアを切り離す）にリドカインを追加します。
- プレートからメディア/細胞懸濁液を収集し、ハンクのバッファで一回プレートを洗浄する。残りのミクログリアを回復するために洗浄バッファーを収集します。
- 50μMの最終濃度まで細胞懸濁液に5mMのEDTAを（pH8.0）を追加したり、1/100希釈で。
- 5分間1,000×gで（1,500 rpm）で細胞懸濁液をスピンダウンし、1％FBSを1ミリリットルDMEM中で再懸濁する。
- （生細胞数をカウントアダルトミに従ってcroglia 3.1/3.2）、目的の実験密度における組織培養プレートに分割した細胞。約1×10 6ミクログリア4脳から皮質を含む10センチプレートから採取される。免疫については、18ミリメートルカバースリップあたり2.5×10 4細胞の密度が推奨されます。
- ミクログリア細胞は、少なくとも24時間は完全に使用する前に、その分岐し、安静時の状態に戻すことができます。
プロトコルテキスト：（大人ミクログリア）
1。組織採取
- 37℃で3時間、ポリ-D-リジン（PDL）でコート組織培養プレート°Cまたは一晩4℃でオートクレーブ処理水で1回使用直前にプレートを洗ってください。
- CO 2窒息と安楽死が完全であることを確かめることによって、マウスを安楽死させる。 70％エタノールで脊髄エリアを清掃してください。
- はさみのペアを使用すると、脊髄の上に皮をカットしてから、領域T1からT12に脊髄を切り取るに進みます。カット脊髄の辺の残りの筋肉オフ。
- 徐々にあなたはそっと指先で脊髄を保持としてmicroscissorsを使って脊椎を切った。組織が非常に柔らかいですとして脊髄穿刺しないように注意してください。ゆっくりmicroforcepsを使って脊髄を抽出します。
- 氷のように冷たいHBSSを含むペトリ皿で水没脊髄。光学顕微鏡を使用すると、microforcepsを使用して、すべての可視の髄膜を除去
- いくつかの断片を生成するのに十分に小さい横断セグメントに脊髄をカット。断片の厚さが効率的な消化を容易にするために、2mm以下であってはならない。 1ミリリットル氷冷HBSSを含む15ミリリットルコニカルチューブに脊髄の部分を転送します。消化工程まで、チューブを氷上に保管してください。
2。ティッシュの消化
- 脊髄組織を含む15ミリリットルコニカルチューブからHBSSを吸引。組織のどの部分を吸引しないように注意してください。
- トリプシン（2の1ミリリットルを追加。5 HBSSのG / L照射ブタトリプシンおよび0.2グラム/ L EDTA）、37℃で30分間インキュベートする。
- 消化を停止するにはトリプシンを除去し、酵素消化を停止するために血清含むプライマリミクログリア培地3mlを加える。
- 組織を取り除くために、上下にピペット。 40μmのセルストレーナーを使用して細胞懸濁液をろ過する。
3。細胞計数とめっき
- 細胞懸濁液及びDAPI溶液を等量混合する。
- 血球計算板を用いて細胞を数える。
- PDLでコーティングされた35×10ミリメートル皿中5-7×10 5細胞/ mlの密度でプレート。細胞を、35×10 mmディッシュに比べて小さい面積を有する12ウェルプレートで培養した場合であっても低い密度でメッキは、細胞の成長を防止する。
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Representative Results
安静時および活性化小グリア細胞の例を図1に示されている。ミクログリアは、めっき後24時間を可視化した（ 図1a）と分岐し（安静時）の形態を示した。プライミング試薬への暴露は、細胞のようなミクログリアの形態変化における細菌リポ多糖（LPS）の結果は、（図1b）がアクティブになります。
めっき用細胞を計数するの例を図2に示す。細胞残渣の存在下、DAPI Fluoromount™を（代わりにトリパンブルー）による細胞懸濁液を等量に添加し、4で説明したように細胞計数、13用血球計に入れた。 DAPI陽性細胞を蛍光顕微鏡を用いて可視化した。本細胞（ 図2）の正確な数を容易に明るいフィールド設定の使用。周辺の7×10 5細胞を、マウスの脊髄ごとに得られた。
内容は ">細胞がPDLでコーティングされた35×10ミリメートル組織培養皿に播種した。我々は、細胞が付着/プレートがコーティングされていない限り、成長しなかったとして、PDLでそのコーティングは、重要なステップでしたが見つかりました。ミクログリアは、完全培養プレートに付着後約2日間培養（ 図3）。ミクログリア/マクロファージCSF-1Rプロモーターの制御下でGFPを発現するのは、この実験に用いたMacGreenマウスの脊髄。
図1。文化の中で2日後の新生児のミクログリアの代表的なイメージ。ミクログリアがP0 C57/BL6仔マウスから培養し、2.5×10 5細胞/ mlの密度でコーティングされていないカバーガラス上で培養した。に戻ってきた、C。未処理ミクログリア安静、分岐した状態と、b、dは 。ミクログリアは、4時間100 ngの/ mlのLPSで処理し、活性化され、アメーバの形状を示す、明視野像をするために使用している間Iba1（緑、マクロファージ/ミクログリア細胞表面タンパク質に特異的マーカー）は、細胞を可視化するために使用されている全体的な細胞集団を示す。 DAPI Fluoromount™を、核を可視化し、培養物の純度を示すために使用した。
図2。細胞計数。DAPI Fluoromount™を、細胞懸濁液を等量混合し、血球計に入れた。我々は、DAPI陽性細胞、正確なセル数のための血球グリッドを視覚化する明視野および蛍光設定を組み合わせる。
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図3。文化の中で2日後に成人の脊髄ミクログリアの代表的な画像。イ。MacGreenマウスの脊髄培養手順のために使用した。細胞を7×10 5細胞/ mlの密度でPDL被覆35×10ミリメートルの組織培養皿に播種した。脊髄ミクログリアのイ明視野像は培養中2日後。ミクログリア（青矢印）とアストロサイトは、（赤い矢印）が表示されますより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ミクログリアは、CNSの正常な機能だけでなく、様々な病態に炎症反応を調節する。ミクログリアによる機能性シナプスリモデリングは、正常な脳ホメオスタシス15の維持に関与している。神経性カスケードの間、彼らは、海馬4、16の歯状回から神経前駆細胞の隙間に参加しています。したがって、ミクログリアは、複数の個別の機能を有する全体の開発と成人の広大な帯状をカバーする新生児および成人ミクログリアを研究する中で培養システムを、開発する必要がある。私たちは、大人の脊髄および新生児の脳から文化ミクログリアに迅速かつ効率的な方法を説明してきました。我々は、70％のアストロサイトからなる残りの割合がミクログリアは100％に近い新生児ミクログリアプレップの純度であった成体の細胞調製物を得ることができた。
役割股関節を考える星状細胞のTは、ミクログリア17-19の活性化状態を調節するには、培養物の純度を向上させるための培養条件を最適化することが重要であるている。 DAPI Fluoromount™を等量の細胞懸濁液を組み合わせることにより正確な細胞計数を可能にするが、この方法を用いて他の細胞型からミクログリアを区別することは不可能である。成人ミクログリア製剤の純度を向上させるために、GFP-被覆ダイナビーズは、その骨髄細胞既にGFPを発現する20 MacGreenマウス由来の細胞懸濁液と共にインキュベートすることができる。別の提案は、プレートに予めアストロサイトの付着を防止するために13 PDLで被覆されていない培養皿で混合された細胞懸濁液となる。しかし、我々は、彼らが以前に私たちの手の中に新生児と成人の細胞の両方に適用されて、コーティングされていない限り、細胞がプレート上に成長しないことを発見した。
ISOLのための方法を記述した多くのプロトコルどちらラットまたはマウス脳組織からATIONとプライマリミクログリアのメッキは、ミクログリアをデタッチし、それによって下流の実験12精製された集団を得るために混合グリア文化の揺れを利用。我々のプロトコルでは、揺れのステップを除いて、最も顕著に異なっており、代わりに正確に滴培養条件を通してミクログリアのみの人口の精製に焦点を当てた。我々の経験では、ミクログリアを除去するために混合グリア文化を振ることは有効であるが、1つの重要な欠点を持っています-とうミクログリアが完了休息形態12に戻り、多くの日数がかかるという事実。これは、活性化ミクログリアがかなり異なるサイトカインプロファイル21を有することを考えると問題となる可能性がある。我々のプロトコルでは、純粋なミクログリアを得るために少し長くしながら、全体で静止状態で細胞を維持しています。次の段落で説明大人準備と同じように、我々の方法の一つの欠点はpossiですすなわち他の細胞型、アストロサイトの小さな汚染ビリティ。
培養ミクログリア大人のための我々の手法は、メソッドが既存のとはかなり異なります。多くのプロトコルでは、密度勾配遠心分離（パーコール）と同様に、純粋なミクログリア人口22を得るために、フローサイトメトリーの使用の使用のために呼び出します。成人の脊髄から安定したミクログリアの文化を作成する手法では、従うべき研究者のために大幅に少ない時間がかかり、複雑なプロトコルのために作る技術、のいずれかを利用しない。成人ミクログリア準備の大半は脳組織から来たが、脊髄は、同じ種類の細胞から構成され-ので、我々のプロトコルは、前述の方法22に公正な比較を提示します。我々のプロトコルの1つのトレードオフは、アストロサイトorigiの大部分である細胞の残りの画分と、70％のミクログリアから成る、わずかに少ない純粋なミクログリアの準備ですN。この不一致は、潜在的に磁気ビーズに結合した伊庭-1及びF4/80としてミクログリア系統の非常に特異的細胞型マーカーを使用して、より純粋なミクログリアの単離する追加の工程を用いて克服することができる。
これは正常な発達におけるミクログリアの役割についての質問に答えるだけでなく、影響を及ぼす病態のための強固なアプローチでありながら、脊髄が新生児の脳から細胞を用いて実施し、されている影響を及ぼす神経疾患におけるミクログリアの役割を評価するほとんどの研究脳具体的には、我々はより多くの具体的な方法は、成人脊髄ミクログリアの機能を研究するために設立されなければならなかったと感じた。当社新生児方法は、特定の病理学的条件だけでなく、脳の正常な機能に関するほとんどの質問に答えるために非常に効率的な方法であり、成人の方法は免疫応答の変動を与えられたこのような研究のための新生児の細胞の使用に良い代替手段です脳と脊髄6-9から新生児ミクログリアと成人セル間とミクログリアの間にS。説明両方の方法から得られたミクログリアは、in vitroにおいても共培養研究（研究室のニューロンやオリゴデンドロサイトと我々は主に文化、それらを）に適した、そのアドレス、他の細胞型に対するミクログリアの効果と同様に、活性化への新生児と成人ミクログリア応答刺激。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は彼らのアドバイスや有益なコメントに対してTsirka研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、JCNにRB、NSF-3MT IGERTとLTにターナー論文のフェローシップ、およびNSF-3MT IGERTに、12PRE12060489を設定するためにR01NS42168によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
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