Summary
Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.
Abstract
Microglia vormen de resident macrofaag-achtige cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en, als zodanig, zijn kritisch belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen zoals CNS rijping in ontwikkeling, multiple sclerose en ruggenmergletsel. Microglia kan worden geactiveerd en aangeworven om actie van neuronale verwonding of stimulatie, zoals axonale schade gezien in MS of ischemische hersentrauma als gevolg van een beroerte. Deze immunocompetente leden van het CZS zijn ook gedacht aan rollen in synaptische plasticiteit onder niet-pathologische omstandigheden. We gebruiken protocollen voor het kweken microglia van de neonatale en volwassen weefsels die bedoeld zijn om het aantal levensvatbare cellen te maximaliseren terwijl het minimaliseren verstorende variabelen, zoals de aanwezigheid van andere CNS celtypes en celkweek vuil. We maken gebruik van grote en duidelijk herkenbaar CNS componenten (bijv. cortex, ruggenmergsegmenten), die het gehele proces haalbaar en reproduceerbaar maakt. Het gebruik van volwassen cels is een geschikt alternatief voor het gebruik van neonatale hersenen microglia, zoals veel ziekten bestudeerde vooral invloed de postnatale ruggenmerg. Deze kweeksystemen zijn ook bruikbaar voor het effect van verbindingen die ofwel kunnen remmen of bevorderen microgliale activering direct testen. Aangezien microgliale activering de resultaten van ziekte kan vormen in het volwassen CZS, is er een behoefte in vitro systemen waarin neonatale en volwassen microglia kunnen worden gekweekt en onderzocht.
Introduction
Microglia vormen de bewoner immune cellen van het CNS, de meeste overeenkomst vertonen perifere macrofagen in structuur en functie 1. Het is onlangs aangetoond dat postnatale microgliale cellen afkomstig uit primitieve myeloïde progenitoren en worden gegenereerd voordat de achtste embryogenese, upending de vorige idee dat postnatale hematopoietische voorlopers zijn de bron van microglia in de volwassen hersenen 2. Zij spelen belangrijke rollen in verscheidene neurologische ziekten en kunnen snel inspelen op infectie of letsel door het vrijgeven van pro-inflammatoire of anti-inflammatoire cytokines 3. Aldus omvatten microglia een zelfstandige eenheid in het CZS kan worden gemanipuleerd ziekteprogressie beïnvloeden. Ontwikkelen van robuuste, reproduceerbare methoden het isoleren en kweken neonatale of volwassen microgliale cellen belangrijk voor toekomstige studies.
Microglia is bekend kritisch spelers in een aantal hersenen pathologieën. Recenter roles zijn in opkomst voor de cellen in de normale ontwikkeling van de hersenen en de functie als microglia fagocyteren overtollige neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus 1, 4. Microglia kan ook moduleren verschillende neurologische aandoeningen die het ruggenmerg beïnvloeden, zoals MS, neuropathische pijn, en dwarslaesie 5-7. Ruggenmerg microglia reageren verschillend tegenover hersenen microglia in response op activering signalen 8, 9, waarschijnlijk als gevolg van verschillen in de lokale omgeving. Dus is het belangrijk een geschikte stand in vitro systeem voor cultuur en studie ruggenmerg microglia. Neonatale microglia tot significant meer van de pro-inflammatoire cytokine stikstofoxide dan bij volwassen cellen na in vitro stimulatie met IFN-γ en TNF-a 10,11 verder benadrukt dat volwassen cellen gebruiken om microglia bestuderen in de context van bepaalde ziekten.
Het protocol we gebruiken in het lab te culture neonatale microglia is een variant van recente methoden die gebruik schudden van gemengde gliale culturen in een poging om de microglia van het oppervlak van de celkweek kolf 12 verwijderen. Ook beschrijven we een methode om cultuur microglia van de volwassen muis ruggenmerg gebaseerd op een protocol eerst beschreven door Yip, et al. 13. Deze methode levert een snellere manier om de cultuur volwassen cellen in vergelijking met andere beschikbare protocollen 14. De resulterende voorbereiding is 70% microglia, de overige percentage bestaat uit astrocyten. Hoewel de zuiverheid van onze cultuur is lager in vergelijking met andere gepubliceerde methoden 13, dit kweeksysteem is nuttig voor het verkennen van microglia in kweek reactie op diverse activerende stimuli en voor de studie van ziekten die vooral invloed het ruggenmerg en die een sterke ontstekingsreactie is een van de hoofdkenmerken.
Al de beschreven protocollen zijn goedgekeurd door de Stony Brook University IACUC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissectie (Dag 0)
- Induceren anesthesie aan p0-2 muis pups met onderkoeling. Veeg de hoofden van de pups met een Kimwipe gedrenkt in 70% ethanol om het weefsel te desinfecteren.
- Verwijder de koppen met een schaar, met 4 pups per 10 cm petrischaal. Plaats de hoofden in een petrischaaltje met buffer ijskoude Hank's.
- Veranker de koppen met gebogen pincet door de oogkassen en verwijder voorzichtig de huid die de schedel met rechte microforceps.
- Verwijder de schedelbeenderen met rechte microforceps, met behulp van voorzichtigheid om niet doorboren of beschadiging van de cortex. De meest effectieve manier is om de verwijdering te beginnen bij het cerebellum, dat zich aan de voet van de kop, omdat dit gebied worden genegeerd beginnen.
- Verwijder de hersenen met een kleine spatel, en plaats de (4) hersens in een frisse petrischaaltje met buffer ijskoude Hank's.
- Alle stappen vanaf dit moment benutten microforceps en worden uitgevoerd onder een dissectie microscoop. Beginnend op de ventrale kant van de hersenen, het weefsel verankeren van die van het cerebellum en maak twee kleine insnijdingen aan weerszijden van de middenhersenen. Wees voorzichtig niet om helemaal te snijden door het weefsel, zoals de cortex hebben betrekking op de middenhersenen in deze regio.
- Zachtjes plagen de middenhersenen en de kleine hersenen in een stuk van de twee cortex. De twee cortex zou een concave vorm.
- Scheid de twee cortex en oriënteren een enkele cortex met de mediale zijde voor verdere dissectie. De hippocampus is moeilijk waar te nemen, maar het ligt tegenover de bulbus olfactorius die verschijnt als een klein knobbeltje op het puntige uiteinde van de cortex.
- Verwijder de hippocampus, die een halve maan-vorm heeft. Flip de cortex naar de dorsale zijde bekijken.
- Gebruik van de bulbus olfactorius als uitgangspunt, verwijder alle meninges en de bulbus olfactorius zich van de cortex.
- De ontleed cortex moet in 15 ml conische buizen geplaatst worden met 14 ml van colDe d Hank gebufferde zoutoplossing op ijs.
2. Cel Cultuur (Dag 0)
- Grondlaag 10 cm weefselkweek schalen met 5 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL) verdund in geautoclaveerd water gedurende 3 uur bij 37 ° C.
- Aspireren PDL, en wassen platen eenmaal met geautoclaveerd water. Droge plaat onder de UV in de weefselkweek kap voor 20 minuten. Deze stap moet alleen worden verricht voorafgaand aan de dissectie proces.
- Aspireren Hank's buffer van buisjes die de cortex van 4 hersens elk, gelden 4 ml 1x trypsine / EDTA-oplossing, vermaal weefsel met p1000 tip, en plaats buizen in 37 ° C incubator gedurende 15 minuten.
- Voeg 4 ml van complete microglia media per buis aan de enzymatische spijsvertering, mix, stop en spin down inhoud op 1.5K rpm gedurende 5 minuten.
- Aspireren supernatant en herhaal wassen met 4 ml van complete media. Resuspendeer cellen in 10 ml compleet microgliale medium (DMEM met 10% FBS, 1% natrium pyruvaat, 0.08% gentamycine) en filtreer door een 40 micron mesh cel zeef.
- Plaat bij een dichtheid van 8 cortex per 10 ml in een 10 cm weefselkweek plaat en in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 (zie Adult Microglia protocol).
(Dag 3)
- Verander media in alle celkweek gerechten met volledige microglia media.
(Dag 10)
- Voeg 400 microliter 60 mM lidocaïne in HBSS (tot microglia los) in medium 10-cm weefselkweek platen en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10-15 minuten.
- Verzamel de media / celsuspensie van de plaat, en een keer was de plaat met buffer Hank's. Verzamel de wasbuffer om de resterende microglia herstellen.
- Voeg 5 mM EDTA (pH 8,0) aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 50 uM of een 1/100 verdunning.
- Spin down celsuspensie bij 1000 xg (1500 rpm) gedurende 5 min en resuspendeer in 1 ml DMEM met 1% FBS.
- Tel het aantal levensvatbare cellen (zoals per volwassene Microglia 3.1/3.2) en splitsen cellen in weefselkweek platen bij de gewenste experimentele dichtheid. Ongeveer 1x10 6 microglia worden geoogst van een 10 cm plaat met de cortex van 4 hersenen. Voor immunofluorescentie, is een dichtheid van 2.5x10 4 cellen per 18 mm dekglaasje aanbevolen.
- Laat minstens 24 uur voor microgliacellen vooraf volledig terugkeren naar hun vertakte, rusttoestand te gebruiken.
Protocol Tekst: (Adult Microglia)
1. Tissue Collection
- Coat weefselkweekplaten met Poly-D-Lysine (PDL) gedurende 3 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. Was de plaatjes een keer met geautoclaveerd water onmiddellijk vóór gebruik.
- Euthanaseren muis door CO 2 stikken en gaan na of euthanasie is voltooid. Reinig ruggenmerg met 70% ethanol.
- Met behulp van een schaar snijden de huid op de top van het ruggenmerg, dan overgaan tot het ruggenmerg geknipt uit regio T1 tot T12. Snijdende resterende spier uit van de zijden van het ruggenmerg.
- Langzaam snijd de wervels met microscissors als je houd het ruggenmerg zachtjes met je vingertoppen. Wees voorzichtig niet te doorboren het ruggenmerg als het weefsel is erg zacht. Extract langzaam het ruggenmerg met behulp microforceps.
- Dompel het ruggenmerg in een petrischaaltje met ijskoude HBSS. Met behulp van een lichtmicroscoop verwijder alle zichtbare hersenvliezen behulp microforceps
- Snijd het ruggenmerg in transversale segmenten klein genoeg om meerdere fragmenten te genereren. De dikte van de fragmenten niet meer dan 2 mm zijn om efficiënte spijsvertering. Breng het ruggenmerg stukken aan een 15 ml conische buis met 1 ml ijskoude HBSS. Houd de buis op ijs tot de spijsvertering stap.
2. Vertering van Tissue
- Aspireren HBSS van 15 ml conische buis met ruggenmergweefsel. Wees voorzichtig om geen stukje weefsel te zuigen.
- Voeg 1 ml van trypsine (2.5 g / L bestraalde varkens trypsine en 0,2 g / L EDTA in HBSS) en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Om te stoppen met de spijsvertering verwijder de trypsine en voeg 3 ml van de primaire microglia medium dat serum om de enzymatische afbraak te stoppen bevat.
- Pipet op en neer om het weefsel te verwijderen. Filter de celsuspensie met behulp van een 40 um cel zeef.
3. Cel Tellen en Plating
- Meng gelijke hoeveelheid celsuspensie en DAPI oplossing.
- Telling cellen met een hemocytometer.
- Plaat bij een dichtheid tussen 5-7x10 5 cellen / ml in PDL-gecoate 35 x 10 mm schalen. Plating een lagere dichtheid voorkomen celgroei zelfs wanneer cellen werden gekweekt in platen met 12 putjes die een kleiner gebied moeten tegen 35 x 10 mm schalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van rustende en geactiveerde microgliale cellen wordt getoond in figuur 1. De microglia werden gevisualiseerd 24 uur na plating (figuur 1a) en vertonen wijdvertakt (rust) morfologie. Blootstelling aan de priming reagens bacterieel lipopolysaccharide (LPS) resulteert in veranderingen in de morfologie microglia cellen geactiveerd worden (Figuur 1b).
Een voorbeeld van het tellen van de cellen voor plating is weergegeven in figuur 2. Door de aanwezigheid van celafval werd DAPI Fluoromount (in plaats van trypan blauw) een gelijk volume van de celsuspensie toegevoegd en in een hemocytometer voor celtelling zoals beschreven in 4, 13. DAPI positieve cellen werden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Gebruik van het helderveld instelling vergemakkelijkt een nauwkeurige telling van de cellen aanwezig (figuur 2). Rond 7x10 5 cellen werden verkregen per muis ruggenmerg.
inhoud "> De cellen werden uitgeplaat in PDL-gecoate 35 x 10 mm weefselkweek gerechten. We vonden dat de coating met PDL was een cruciale stap, als cellen niet hechten / groeien, tenzij de platen waren bekleed. Microglia volledig hechten aan de cultuur plaat Na ongeveer twee dagen in kweek (Figuur 3). Het ruggenmerg van MacGreen muizen die GFP tot expressie brengen onder controle van de microglia / macrofaag CSF-1R promoter werd gebruikt voor dit experiment.
Figuur 1. Representatief beeld van neonatale microglia na twee dagen in kweek. Microglia werden gekweekt uit p0 C57/BL6 muisjongen en geplateerd op ongecoate dekglaasjes bij een dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen / ml. A, c. Onbehandelde microglia die zijn teruggekeerd naar een vertakte rustende staat, b, d . Microglia behandeld met 100 ng / ml LPS gedurende 4 uur en tonen een geactiveerde vorm amoeboid; Iba1 (groen, een marker voor specifiek macrofagen / microglia celoppervlakproteïne) is gebruikt om de cellen te visualiseren, terwijl helder veld beelden werden gebruikt tonen algehele celpopulaties. Fluoromount DAPI werd gebruikt om kernen zichtbaar en geven de zuiverheid van de kweek.
Figuur 2. Celtelling. DAPI Fluoromount werd gemengd met een gelijk volume van celsuspensie en in een hemocytometer. We combineerden het helderveld en fluorescentie instelling DAPI positieve cellen te visualiseren en de hemocytometer netwerk voor een nauwkeurig celtelling.
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3.jpg "/>
Figuur 3. Representatieve beelden van volwassen ruggenmerg microglia na twee dagen in de cultuur. een. Het ruggenmerg van een MacGreen muis werd gebruikt voor de kweek procedure. Cellen werden veld afbeelding van ruggenmerg microglia Bright uitgeplaat in een PDL-gecoate 35 x 10 mm weefselkweekplaat met een dichtheid van 7x10 5 cellen / ml. B. Na twee dagen in kweek. Microglia (blauwe pijlen) en astrocyten (rode pijlen) worden getoond. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia moduleren CNS normale werking en ontstekingsreacties verschillende pathologieën. Functionele synaptische remodeling door microglia is betrokken bij het handhaven van normale hersenen homeostase 15. Tijdens de neurogene cascade zij deelnemen aan de klaring van neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus 4, 16. Daarom is het noodzakelijk om een kweeksysteem waarin neonatale en volwassen microglia, waarvan de grote strook van en volwassen, gedurende welke microglia meerdere discrete functies dekt kan analyseren. We hebben een snelle en efficiënte methode geschetst om de cultuur microglia van de volwassen ruggenmerg en de hersenen bij pasgeborenen. We konden celpreparaten verkrijgen in de volwassene die 70% microglia met het resterende percentage bestaat uit astrocyten en de zuiverheid van de neonatale microgliale preps bijna 100% was.
Gezien de rol that astrocyten hebben bij het reguleren van de activeringstoestand van microglia 17-19, is het belangrijk dat de kweekomstandigheden optimaliseren om de zuiverheid van de kweek verbeteren. Hoewel het combineren van de celsuspensie met een gelijk volume van DAPI Fluoromount zorgt voor een nauwkeurig celtelling, is het niet mogelijk om microglia onderscheiden van andere celtypen met deze methode. Om de zuiverheid van de volwassen microgliale preparaat verbeteren, kan GFP beklede Dynabeads worden geïncubeerd met de celsuspensie verkregen uit MacGreen muizen waarvan myeloïde cellen reeds express GFP 20. Een andere suggestie zou zijn om het bord van de gemengde celsuspensie in cultuur gerechten die niet eerder zijn bedekt met PDL om astrocytaire gehechtheid te voorkomen 13. Wij hebben echter gevonden dat geen cellen groeien op de plaat indien deze eerder zijn bekleed, die in handen is van toepassing op zowel neonatale en volwassen cellen.
Vele protocollen beschrijven methoden voor isolatie en de beplating van de primaire microglia van zowel rat of muis hersenweefsel kunnen benutten schudden van gemengde gliale culturen aan de microglia los te maken en daardoor een gezuiverd bevolking voor downstream experimenten 12 te verkrijgen. Ons protocol verschilt het meest merkbaar in exclusief het schudden stap, en in plaats daarvan concentreren op het zuiveren van een microglia-only bevolking door middel van nauwkeurig getitreerd kweekomstandigheden. In onze ervaring, schudden gemengde gliale kweken teneinde de microglia verwijderen effectief, maar heeft een belangrijk nadeel - dat de geschud microglia neemt vele dagen te keren naar een volledige rust morfologie 12. Dit kan problematisch zijn aangezien geactiveerde microglia een heel ander cytokine profiel 21. Ons protocol, terwijl het iets langer duurt om pure microglia te verkrijgen, houdt de cellen in een rusttoestand overal. Zoals bij een volwassen prep besproken in de volgende paragraaf, het een nadeel van onze werkwijze is een mogelijkheidbaarheid van kleine besmetting van andere celtypen, namelijk astrocyten.
Onze techniek voor het kweken van volwassen microglia verschilt aanzienlijk van reeds bestaande methoden. Veel protocollen oproep voor het gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugatie (Percoll) en het gebruik van flowcytometrie om een zuivere populatie microglia 22 verkrijgen. In onze methode voor het creëren van een stabiele microgliale kweek van volwassen ruggenmerg niet goed gebruiken of techniek, waardoor een aanzienlijk minder tijdrovend en ingewikkeld protocol voor de onderzoeker te volgen. Terwijl de overgrote meerderheid van de volwassen microgliale preparaten uit hersenweefsel, is het ruggenmerg uit dezelfde celtypes - dus ons protocol een getrouw vergelijking met eerder beschreven werkwijzen 22. Een afweging in ons protocol is een iets minder zuiver microgliale preparaat bestaande uit 70% microglia, met de resterende fractie van cellen die voornamelijk uit astrocytaire oorsprongn. Deze discrepantie kan mogelijk worden overwonnen met behulp van een additionele stap van isolatie van meer pure microglia gebruik van zeer specifiek celtype markers van de microglia afstamming zoals Iba-1 en F4/80 geconjugeerd aan magnetische korrels.
De meeste studies die de rol van microglia in neurologische ziekten die het ruggenmerg zijn uitgevoerd met cellen van de neonatale hersenen en beoordelen terwijl dit een solide aanpak voor het beantwoorden van vragen over een rol van microglia in de normale ontwikkeling en ziekten bij de hersenen in het bijzonder, vonden we dat een meer specifieke methode moest worden opgericht om microglia functie in de volwassen ruggenmerg te bestuderen. De neonatale methode is een zeer efficiënte manier om de meeste vragen over het normale functioneren van de hersenen als in bepaalde pathologische omstandigheden te beantwoorden, en de volwassen methode is een goed alternatief voor het gebruik van neonatale cellen voor deze studies aangezien de variabiliteit in immunologische responss tussen microglia neonatale en volwassen cellen en tussen microglia van de hersenen en het ruggenmerg 6-9. Microglia verkregen uit beide beschreven werkwijzen zijn ook geschikt voor in vitro co-kweek studies (we voornamelijk kweken ervan met neuronen of oligodendrocyten in ons lab) adres dat het effect van microglia van andere soorten cellen alsook de neonatale en volwassen microglia reactie op activering stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen de leden van de Tsirka lab bedanken voor hun advies en behulpzaam opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door R01NS42168 naar SET, 12PRE12060489 aan RB, een NSF-3MT IGERT en een Turner Proefschrift fellowship aan LT, en NSF-3MT IGERT te JCN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -È, Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
