Summary
Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.
Abstract
A microglia residentes são as células de macrófagos, como do sistema nervoso central (SNC) e, como tal, têm um papel extremamente importante nos processos fisiológicos e patológicos, tais como a maturação do SNC em desenvolvimento, a esclerose múltipla, e lesão da medula espinal. Microglia podem ser ativados e recrutado para a ação por lesão neuronal ou estimulação, como dano axonal visto em MS ou trauma cerebral isquêmica resultante de acidente vascular cerebral. Estes membros imunocompetentes do SNC também são pensados para ter papel na plasticidade sináptica em condições não patológicas. Empregamos protocolos para microglia cultura de tecidos neonatais e adultos que são destinadas a maximizar o número de células viáveis, minimizando variáveis interferentes, tais como a presença de outros tipos de células do sistema nervoso central e os restos de cultura de células. Nós utilizamos grandes e facilmente discernível componentes do SNC (por exemplo, do córtex, os segmentos da medula espinal), o que torna todo o processo viável e reprodutível. O uso da célula adultas uma alternativa adequada para o uso de neonatal microglia do cérebro, como muitas patologias estudados afectam principalmente a medula espinal pós-natal. Esses sistemas de cultura são também úteis para testar directamente o efeito dos compostos que podem inibir ou estimular a activação da microglia. Uma vez que a activação da microglia, podem moldar os resultados da doença no SNC adulto, existe uma necessidade de sistemas in vitro em que a microglia neonatal e adulto podem ser cultivadas e estudadas.
Introduction
A microglia são as células imunitárias residentes do SNC, que mais se assemelham macrófagos periféricos em estrutura e função 1. Foi recentemente demonstrado que as células microgliais pós-natais derivar de progenitores mielóides primitivos e são gerados antes do oitavo dia da embriogênese erigir a noção anterior que progenitores hematopoiéticos pós-natais são a fonte da microglia no cérebro adulto 2. Eles desempenham um papel-chave em várias doenças neurológicas e pode responder rapidamente a uma infecção ou lesão, liberando citocinas pró-inflamatórias ou anti-inflamatória 3. Assim microglia abranger uma unidade autónoma no SNC, que podem ser manipuladas para afectar a progressão da doença. Desenvolvimento de métodos robustos e reprodutíveis para isolar e cultivar células microgliais recém-nascidos ou adultos é importante para estudos futuros.
Microglia é conhecido por ser jogadores críticos de um número de patologias cerebrais. Mais recentemente, o roles são emergente para as células em desenvolvimento e a função normal do cérebro, como microglia fagocitam excesso de células progenitoras neurais a partir de giro dentado do hipocampo de 1, 4. Microglia também pode modular várias condições neurológicas que afetam a medula espinhal, tais como MS, dor neuropática, e lesão medular 5-7. Microglia da medula espinal reagem de forma diferente em relação ao cérebro microglia em resposta a sinais de ativação 8, 9, provavelmente devido às diferenças no ambiente local. Assim, é importante estabelecer um adequado sistema in vitro para estudar a cultura e microglia espinal medula. Microglia Neonatal produzir significativamente mais do óxido nítrico citocina pró-inflamatória em comparação com células adultas após estimulação in vitro com o IFN-γ ou TNF-a, 10,11 destacando ainda mais a necessidade de utilizar células adultas para o estudo da microglia no contexto de certas doenças.
O protocolo que empregamos no laboratório de cuLTURE microglia neonatal é uma variação dos métodos recentes que utilizam a agitação de culturas mistas de glia, num esforço para remover a microglia da superfície do frasco de cultura de célula 12. Também descrevemos um método de cultura da microglia de ratinho adulto a medula espinal por meio do protocolo descrito pela primeira vez por Yip et ai 13. Este método proporciona uma maneira mais rápida de células adultas de cultura em comparação com outros protocolos disponíveis 14. A preparação resultante é de 70% a microglia, sendo a percentagem restante é constituída por astrócitos. Embora o grau de pureza da nossa cultura é menor em comparação com outros métodos publicados 13, este sistema de cultura é útil para explorar a microglia cultura em resposta a vários estímulos de activação, bem como para o estudo de doenças que afectam principalmente a medula espinal e no qual um forte resposta inflamatória é uma característica principal.
Todos os protocolos descritos foram aprovados pelo Stony Brook University IACUC.
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Protocol
1. Dissecção (Dia 0)
- Induzir a anestesia para P0-2 filhotes de rato com hipotermia. Limpe as cabeças dos filhotes com um Kimwipe embebido em álcool 70% para desinfecção do tecido.
- Retire as cabeças com um par de tesouras, usando quatro filhotes por 10 centímetros placa de cultura. Coloque as cabeças em uma placa de Petri contendo tampão de gelada Hank.
- Ancorar as cabeças usando uma pinça curva através das órbitas dos olhos e remova cuidadosamente a pele que cobre o crânio com micropinças retas.
- Retire os ossos do crânio com micropinças em linha reta, tendo o cuidado para não perfurar ou danificar o córtex. A maneira mais eficaz é a iniciar a remoção de partida perto do cerebelo, a qual está localizada na base da cabeça, que esta região será descartado.
- Remover o cérebro, com uma pequena espátula, e colocar os (4) os cérebros numa placa de petri fresca contendo solução tampão gelada de Hank.
- Todas as etapas deste ponto em diante utilizar micropinças e são realizadas sob a divulmicroscópio cção. Começando no lado ventral do cérebro, ancorar o tecido, mantendo o cerebelo e fazer duas pequenas incisões em cada lado do mesencéfalo. Tenha cuidado para não cortar todo o caminho através do tecido, como o córtex cobrir o mesencéfalo nesta região.
- Gentilmente provocar o mesencéfalo e cerebelo em um pedaço das duas corticais. Os dois córtices deve formar uma forma côncava.
- Separe as duas corticais e orientar um único córtex com o lado medial para posterior dissecação. O hipocampo pode ser difícil observar, mas está localizado no lado oposto do bulbo olfactivo, que aparece como um nódulo pequeno na extremidade pontiaguda do córtex.
- Remover o hipocampo, que tem uma forma de crescente. Virar o córtex mais para ver do lado dorsal.
- Usando o bolbo olfactivo como um ponto de partida, remover todas as meninges e o próprio bulbo olfactivo do córtex.
- Os córtices dissecados devem ser colocados em tubos cónicos de 15 ml com 14 ml de colsolução salina tamponada de Hank d em gelo.
2. Cultura de Células (Dia 0)
- Pré-revestimento de placas de 10 cm de cultura de tecido com 5 ug / ml de poli-D-lisina (PDL) diluído em água esterilizada durante 3 horas a 37 ° C.
- Aspirar PDL, e as placas de lavagem uma vez com água autoclavada. Secar sob a placa de UV no capuz de cultura de tecidos durante 20 min. Este passo deve ser realizado imediatamente antes do processo de esvaziamento.
- Aspirar o tampão de Hank de tubos de ensaio contendo os córtices a partir de 4 cérebros cada, aplicar 4 ml de solução de tripsina / EDTA 1x, tritura-se o tecido com p1000 ponta, e coloque os tubos em 37 ° C incubadora durante 15 min.
- Adicionar 4 ml de mídia microglia completos por tubo para parar a digestão enzimática, misturar e spin para baixo conteúdo em 1.5K rpm por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e repetir lavagem com 4 ml de meio completo. Suspenda as células em 10 ml de meio completo microgliais (DMEM com 10% de FBS, piruvato de sódio a 1%, 0,08% de gentamicina), e através de um filtro de 40 micron filtro de células da malha.
- Placa a uma densidade de 8 córtices por 10 ml de uma placa de cultura de 10 cm de tecido e colocar num incubador de cultura de tecido a 37 ° C e 5% de CO 2 (Ver Adulto Microglia protocolo).
(Dia 3)
- Mudança de mídia em todos os pratos de cultura de células com a mídia microglia completos.
(Dia 10)
- Adicionar 400 microlitros de 60 mM de lidocaína em HBSS (para separar microglia) em meio de placas de cultura de tecidos de 10 cm e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 10-15 min.
- Recolher os meios de suspensão / célula a partir da placa, e lava-se a placa uma vez com tampão de Hank. Recolher o tampão de lavagem para recuperar restante da microglia.
- Adicionar EDTA 5 mM (pH 8,0) à suspensão de células até uma concentração final de 50 mM ou a uma diluição de 1/100.
- Girar suspensão de células a 1000 x g (1500 rpm) durante 5 minutos e re-suspensão em 1 ml de DMEM com FBS a 1%.
- Contar o número de células viáveis (como por Mi Adultocroglia 3.1/3.2) e células divididas em placas de cultura de tecidos na densidade experimental desejado. Aproximadamente 1x10 6 microglia são colhidas a partir de uma placa de 10 cm contendo os córtices a partir de 4 cérebros. Para imunofluorescência, recomenda-se uma densidade de 2.5x10 4 células por 18 milímetros lamela.
- Deixe pelo menos 24 horas para micróglias para voltar totalmente ao seu ramificada, estado de repouso antes de usar.
Protocolo Texto: (Adult Microglia)
1. Coleção de tecidos
- Placas de cultura de tecidos de revestimento com poli-D-lisina (PDL), durante 3 horas a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C. Lavar as placas uma vez com água esterilizada, imediatamente antes de usar.
- Eutanásia rato por asfixia CO 2 e verificar que a eutanásia é completa. Limpe a área da medula espinhal com etanol 70%.
- Utilizando um par de tesouras de cortar a pele na parte superior da medula espinhal; então proceder para cortar a coluna vertebral a partir da região T1 a T12. Cortaro músculo restante fora dos lados da medula espinal.
- Lentamente cortar as vértebras usando microtesoura como você segurar delicadamente a medula espinhal com os dedos. Seja o cuidado de não perfurar a medula espinhal, como o tecido é muito suave. Lentamente extrair a medula espinal utilizando microfórceps.
- Submerge da medula espinhal em uma placa de Petri contendo HBSS gelada. Usando um microscópio de luz remover todas as meninges visíveis usando micropinças
- Corte da medula espinhal em segmentos transversais pequenas o suficiente para gerar vários fragmentos. A espessura dos fragmentos não deve ser superior a 2 mm a fim de facilitar uma digestão eficiente. Transferir as peças da medula espinal para um tubo de 15 ml contendo 1 ml cónico de HBSS gelada. Manter o tubo em gelo até à etapa de digestão.
2. A digestão de tecidos
- Aspirar HBSS de 15 ml tubo cônico contendo tecido da medula espinhal. Tenha cuidado para não aspirar qualquer pedaço de tecido.
- Adicionar 1 ml de tripsina (2.5 g / L de tripsina irradiada porcino e 0,2 g / L de EDTA em HBSS) e incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Para parar a digestão remover a tripsina e adicionar 3 ml de meio de microglia primário que contém soro de travar a digestão enzimática.
- Pipeta cima e para baixo para retirar o tecido. Filtra-se a suspensão de células através de um filtro de 40 um da célula.
3. Contagem de células e chapeamento
- Misturar um volume igual de suspensão de células e solução DAPI.
- Contar as células utilizando um hemocitómetro.
- Placa com uma densidade de entre 5-7x10 5 células / ml em PDL revestidos 35 x 10 mm pratos. Galvanização a uma densidade mais baixa impediu o crescimento celular, mesmo quando as células foram cultivadas em placas de 12 poços que têm uma área menor em comparação com 35 x pratos de 10 mm.
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Representative Results
Um exemplo de células microgliais de repouso e activado é mostrado na Figura 1. A microglia foram visualizadas 24 horas após o plaqueamento (Figura 1a) e exibem morfologia ramificada (de repouso). A exposição ao reagente de iniciação, o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), resulta em alterações na morfologia da microglia, como as células ficam activadas (Figura 1b).
Um exemplo de contagem das células de revestimento é mostrada na Figura 2. Devido à presença de resíduos celulares, DAPI Fluoromount (em vez de azul de tripano) foi adicionado a um volume igual de suspensão de células e colocou-se num hemocitómetro para a contagem de células, como descrito no ponto 4, 13. Células DAPI positivas foram visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência. Utilização da configuração de campo claro facilitou uma contagem precisa do número de células presentes (Figura 2). Cerca de 7x10 5 células por ratinho foram obtidos da medula espinhal.
conteúdo "> As células foram colocadas em PDL revestidos 35 x 10 milímetros placas de cultura de tecido. Descobrimos que o revestimento com PDL foi um passo fundamental, pois as células não aderir / crescer menos que as placas foram revestidas. Microglia prender totalmente a placa de cultura Após cerca de dois dias de cultura (Figura 3). espinal medula de ratinhos MacGreen, que expressa GFP sob o controlo da microglia / macrófagos promotor CSF-1R, foi utilizado para esta experiência.
Figura 1. Imagem representativa da microglia neonatal após dois dias em cultura. Microglia foram cultivadas a partir de p0 C57/BL6 rato filhotes, e banhado em lamelas não revestidos a uma densidade de 2,5 x 10 5 células / ml. Uma, c. Microglia não tratados que tenham retornado a um repouso, estado ramificada, b, d . A microglia tratados com 100 ng / ml de LPS durante 4 horas, e mostram, uma forma activada amebóides; Iba1 (verde, um marcador específico para uma proteína de superfície de macrófagos / células microgliais), tem sido utilizada para visualizar as células, enquanto as imagens de campo brilhante foram usadas para mostrar populações totais celulares. Fluoromount DAPI foi utilizado para visualizar os núcleos e indicar a pureza da cultura.
Figura 2. A contagem das células. Fluoromount DAPI foi misturada com um volume igual de suspensão de células e colocou-se num hemocitómetro. Juntamos a claro e a configuração de fluorescência para visualizar as células positivas DAPI hemocitômetro e a grade para uma contagem de células precisas.
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Figura 3. Imagens representativas de adulto microglia espinal medula, após dois dias de cultura. um. espinal medula de um MacGreen ratinho foi utilizado para o processo de cultura. As células foram plaqueadas numa PDL revestido 35 x 10 mm prato de cultura de tecidos a uma densidade de 7x10 5 células / ml. B. Imagem de campo brilhante da microglia espinal medula, após dois dias de cultura. Microglia (setas azuis) e astrócitos (setas vermelhas) são mostrados. Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
A microglia modular CNS funcionamento normal, bem como as respostas inflamatórias a diversas patologias. Funcional remodelação sináptica por microglia tem sido implicado na manutenção da homeostase do cérebro normal 15. Durante a cascata neurogênica participam na depuração de células progenitoras neurais do giro denteado do hipocampo 4, 16. Por conseguinte, é necessário desenvolver um sistema de cultura no qual a estudar microglia neonatal e adulto, que vai cobrir a vasta área do desenvolvimento e na vida adulta, durante o qual a microglia ter várias funções discretas. Delineamos um método rápido e eficiente para a cultura microglia da medula espinhal e do cérebro adulto neonatal. Fomos capazes de obtenção de preparações de células no adulto, que foram de 70% a microglia, com a percentagem restante constituída por astrócitos, e a pureza das preparações de microgliais neonatais que se aproximam de 100%.
Dado o papel that astrócitos têm na regulação do estado de activação da microglia 17-19, é importante optimizar as condições de cultura para melhorar a pureza da cultura. Embora a combinação da suspensão de células com um volume igual de solução DAPI Fluoromount permite uma contagem de células precisa, não é possível distinguir a microglia de outros tipos de células, usando este método. Para melhorar a pureza da preparação da microglia adulto, GFP Dynabeads revestidos podem ser incubadas com a suspensão de células derivada de MacGreen ratinhos, no qual as células mielóides já expressa GFP 20. Outra sugestão seria a placa da suspensão de células em placas de cultura misto que não tenham sido previamente revestidas com PDL a impedir a fixação astrocitário 13. No entanto, verificou-se que não há células crescem sobre a placa, a menos que tenham sido previamente revestidas, que nas nossas mãos é aplicável a ambas as células neonatal e adulto.
Muitos protocolos que descrevem métodos para isoladorção e revestimento de microglia primário de qualquer rato ou camundongo tecido cerebral utilizar tremendo de culturas gliais mistos para separar a microglia e, assim, obter uma população purificada para experimentos a jusante 12. Nosso protocolo difere mais notadamente na exclusão da etapa de tremer, e em vez enfocando a purificação de uma população somente microglial através de condições de cultura precisamente tituladas. Na nossa experiência, agitando culturas gliais mistas, a fim de remover a microglia é eficaz, mas tem um inconveniente significativo - o facto de que a microglia agitada levar alguns dias para retornar para uma morfologia de descanso completo 12. Isso pode ser problemático, uma vez que a microglia activada tem um perfil de citocinas consideravelmente diferente 21. Nosso protocolo, tendo um pouco mais para obter microglia puro, mantém as células em um estado de repouso por toda parte. Tal como acontece com a preparação adulto discutido no próximo parágrafo, o único inconveniente de nosso método é a possibilidade de pequena contaminação de outros tipos de células, nomeadamente os astrócitos.
Nossa técnica para cultura adulto microglia varia consideravelmente de métodos pré-existentes. Muitos protocolos requerem o uso de centrifugação em gradiente de densidade (Percoll), bem como a utilização de citometria de fluxo para se obter uma população pura microglial 22. Em nosso método de criar uma cultura da microglia estável do adulto medula espinhal não utilizar qualquer técnica, que faz um tempo consideravelmente menor protocolo demorado e complicado para o pesquisador a seguir. Embora a grande maioria das preparações microgliais adultas provenientes de tecido do cérebro, na espinal medula é constituído pelos mesmos tipos de células - e, portanto, o nosso protocolo apresenta uma comparação válida para 22 métodos descritos anteriormente. Uma desvantagem no nosso protocolo é uma preparação microglial ligeiramente menos puro, que consiste em 70% a microglia, com a fracção restante sendo principalmente de células de astrócitos orin. Esta discrepância pode, potencialmente, ser superadas através de um passo adicional de isolamento da microglia mais puro utilizando tipo marcadores celulares muito específicos de linhagem, tais como microglia Iba-1 e F4/80 conjugados com pérolas magnéticas.
A maioria dos estudos que avaliam o papel da microglia em doenças neurológicas que afectam a medula espinal foram realizados utilizando células do cérebro neonatal e, enquanto esta é uma abordagem sólida para responder a perguntas sobre o papel da microglia no desenvolvimento normal, bem como as patologias que afectam o cérebro, especificamente, nós sentimos que um método mais específico teve que ser criada para estudar a função microglia na medula espinhal adulta. O nosso método neonatal é uma forma muito eficiente para responder à maioria das questões relativas ao funcionamento normal do cérebro, bem como em determinadas condições patológicas, o método de adulto e é uma boa alternativa à utilização de células neonatais para tais estudos, dada a variabilidade na resposta imunológicas entre microglia neonatal e adulto e entre células da microglia do cérebro e da medula espinal 6-9. A microglia obtido ambos os métodos descritos também são adequados para estudos in vitro de co-cultura (cultura que principalmente os com os neurónios ou os oligodendrócitos no nosso laboratório) que abordam o efeito da microglia em outros tipos de células, bem como a resposta da microglia neonatal e adulto para activar estímulos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Tsirka para os seus conselhos e comentários úteis. Este trabalho foi apoiado por R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, um NSF-3MT IGERT e uma dissertação comunhão Turner a LT, e NSF-3MT IGERT de JCN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
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