Summary
שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות.
Abstract
תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים. נכון לעכשיו, אין מערכת תרבית תאים אמינה המאפשרת בידול spermatogenic במבחנה, ורוב המחקרים ביולוגיים של תאי spermatogenic דורשים קציר רקמות ממודלים של בעלי חיים כמו העכבר והחולדה. בגלל האשך מכיל סוגים רבים של תאים - גם הלא spermatogenic (יידיג, Sertoli, מיאלואידית, ותאי אפיתל) וspermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, spermatids העגול, עיבוי spermatids ותאי זרע) - מחקרים של המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתאי זרע דורש הבידוד והעשרה של תאים מסוגים שונים. שיטת STA-PUT מאפשרת להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של תאים - במקרה זה, מהאשכים - דרך שיפוע BSA ליניארי. סוגי תאים בודדים משקעים עם מהירות שקיעה שונה בהתאם לספירהגודל ll, והשברים מועשרים לתאים מסוגים שונים יכולים להיות שנאספו ומנוצלים בניתוחים נוספים. בעוד שיטת STA-PUT לא לגרום לשברים טהורים מאוד של סוגי תאים, למשל כמו ניתן להשיג עם שיטות מיון תא מסוימות, הוא מספק תשואה גבוהה בהרבה של תאים הכולל בכל שבריר
(~ 1 x 10 8 תאים / סוג spermatogenic תא מאוכלוסייה התחלתי של 7-8 x 10 8 תאים). שיטת תשואה גבוהה זה דורשת רק כלי זכוכית מתמחה ויכולה להתבצע בכל חדר קר או מקרר גדול, מה שהופך את שיטה אידיאלית למעבדות שיש להם גישה מוגבלת לציוד מיוחד כמו סדרן הקרינה הופעלה תאים (FACS) או elutriator.
Introduction
תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים 1. בקצרה, הגזע דמוי spermatogonia שמתגורר בסמוך לאפיתל של מתרס אבובית seminiferous ולהתמיין לspermatocytes, אשר לאחר מכן יעבור חטיבות meiotic. לאחר מיוזה היא מוחלטת, וכתוצאה מכך התאים הפלואידים, או spermatids העגול, עוברים spermiogenesis, תהליך בידול המערב את שפיכת הציטופלסמה והדחיסה של הגרעין. Spermatids לפתח בהדרגה השוטון ועובר התארכות והתעבות של הגרעין, הפקת spermatids מתארך ולאחר מכן עיבוי, בהתאמה. מוצרי הקצה הם תאי זרע, המשתחררים ללומן של אבובית seminiferous וסופו של דבר ליותרת האשך שבו הם בוגרים יותר.
בגלל התהליך של spermatogenesis מסתמך על תנאים הורמונליים ומולקולריים מיוחדים בהאשכים, מערכת תרבות אמינה במבחנה לכל התהליך של תאי זרע עדיין לא פותחו 2,3. שיטות תרבות פותחו ליצירה "תאי נבט קדמוני דמוי תא" ו "תאים עגולים כמו spermatid-" הפלואידים, מתאי גזע, אך שיטות אלה עדיין לא מסוגלים לייצר כמויות גדולות של תאים אלה ולא מצליחים לייצר תא spermatogenic מאוחר יותר סוגי 4,5. למרבה המזל, סוגי spermatogenic התא שונים באופן משמעותי בגודלם, המאפשר להשעית תא בודד המתקבלת מכל אשכים להיות מופרדים עם שיפוע נוזלי. שיטת STA-PUT, הפגין כאן, משתמשת בשיפוע BSA ליניארי ושקיעה פשוט להפריד תאי spermatogenic מבוסס על גודל והמסה 6-9.
יש שיטת STA-PUT מספר יתרונות על פני שתי שיטות נפוצות ביותר האחרות כדי להפריד בין סוגי spermatogenic תא: FACS וelutriation 10-13. מנגנון STA-PUT דורש onlכמה חתיכות y של כלי זכוכית מתמחה התאספו בחדר קר או מקרר גדול. לכן, זה פחות יקר מאשר באמצעות סדרן תא או elutriator. שיטת STA-PUT מניבה כמויות גדולות יותר של תאים לכל סוג תא ואשך מאשר ניתן למיין על ידי FACS במסגרת זמן דומה, אם כי טוהר של כל אוכלוסיית תא הוא לא גבוה כמו אלו שהושגו עם 11 FACS. מיון תא ניצול חרוזים מגנטיים (מיון מגנטי מופעל סלולרי, מחשבי מקינטוש) לאחרונה מועסק בהצלחה להעשרת spermatogonia מאוכלוסיית תאי אשכים מעורבת, אבל זה כרגע לא מתאים להפרדת spermatocytes או spermatids בשל חוסר ידע של שטח מתאים סמני 14. יתרון נוסף של שיטת STA-PUT על FACS או MACS הוא היכולת לבודד תאי קיימא מתאימים לתרבות שלאחר מכן, כי, בניגוד לרוב פרוטוקולי FACS, היא אינה דורשת כל ה-DNA או סוגים אחרים של מכתים. למחקרים שדורשים lתשואות arge של סוגי תאי spermatogenic ב ~ טוהר 90%, STA-PUT היא שיטה אידיאלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול STA-PUT כרוך בשלושה שלבים: 1) הגדרה של המנגנון וחומרים כימיים, 2) הכנה של השעיה תא מכל אשכים, ו3) טעינה סלולרי, שקיעה, ואיסוף שברים. כאשר היא מבוצעת על ידי צוות של שני חוקרים, הפרוטוקול לוקח שמונה שעות בממוצע.
1. הקמת מנגנון STA-PUT (איור 1)
*** מנגנון STA-PUT צריך להיות ממוקם במקרר גדול 4 ° C או חדר קר שיכול גם להכיל אספן שבריר, אם שיטה זו של אוסף היא מועדפת.
- בלילה שלפני (או לפחות כמה שעות לפני) שתבצע את השיטה, לשטוף את כל הציוד (בעיקר כלי הזכוכית וצינורות) ולחטא עם 70% אתנול. בואו יבש ציוד לחלוטין לפני הרכבת המנגנון כפי שמודגם באיור 1.
- Secure שני צילינדרי 2 ליטר (איורים 1B ו-C) ותא העמסת תא (
- הנח בר קטן ומערבבים בתא טעינת תא (איור 1 א), ובר גדול ומערבבים בצילינדר L 2 השמאלי ביותר (איור 1) שיכיל BSA 2%.
- הנח את תא שקיעת 2 L על הפלטפורמה (1D איור). הנח לבלבל המתכת (איור 1F) ישירות על גבי הפתח בחלק התחתון של חדר השיקוע (1D איור). זה הוא קריטי, שכן לבלבל מונע vortexing של הנוזל ושיבוש של שיפוע התא במהלך איסוף שברים. מניחים את המכסה על החלק העליון של חדר שקיעה.
- לאחר מריחת כמות קטנה מאוד של שומן ואקום למפרק זכוכית קרקע של הסתום המשולש (איור 1G), מהדק את ברזלים לעומקו של seקאמרי dimentation, המחבר את מפרקי זכוכית קרקע של ברזלים וחדר שקיעה.
- חבר את התא לתא טעינה (איור 1 א) אל השקע הימני של ברזלים עם צינורות. סגור את ברזלים.
- צרף את צינורות חלוקה התא לשקע שמאל של ברזלים. צינורות חלוקה כוללים חתיכת הצינור עם זכוכית פיפטה פסטר מחוברת לסוף הפתוח. חתיכת צינור שעמם קטן יותר מחוברת לקצה הצר של פיפטה מזכוכית. פיפטה הצרה מגבילה את הזרימה של ההשעיה התא באיסוף שברים. הצמד הצינור הקטן הזה בתחתית מאוד.
- להכין 2 L קרבס (1x) חיץ היום של הניסוי (טבלת 1). לאחר מכן, להכין 550 BSA מיליליטר 2% ב1x קרבס, 550 מיליליטר BSA 4% ב1x קרבס, וארגון ה-BSA 50 מיליליטר 0.5% ב1x קרבס. לסנן ולצנן את הפתרונים הללו ל4 ° C.
- יוצקים את פתרון 4% BSA בצילינדר תקין 2 L (איור 1 ג) וBSA 2%פתרון בצילינדר L 2 שמאלה (איור 1). ודא שאין בועות גדולות בצינור שמחבר את הגלילים אלה.
- יוצקים חיץ קרבס לתוך תא טעינת תא ולמלא את צינורות המחברים חדר זה עם חדר שקיעה, כדי לוודא שאין בועות גדולות, כמו אלה יכולים להפריע לשיפוע. לוחץ או מצליף את הצינור בעדינות מסייע להסיר את הבועות. ודא שכל של חיץ קרבס הוא בצינור ולא בתא התא.
- לאפשר כמות קטנה של חיץ קרבס לזרום לתוך תא השיקוע ולאחר מכן לנקז כמעט את כל החיץ לתוך צינורות חלוקה תא כדי למלא את הצינור ולהסיר את כל בועות גדולות.
- הנח את אספן שבריר ישירות תחת קאמרי שקיעה. ודא שכל צינורות שבריר נמצאים במקום ומכוסה בניילון הנצמד, כדי למנוע זיהום.
2. בידוד תאי Spermatogenic מאשכים שלמים
3. טוען תא ושקיעה
- ודא כי ברזלים סגור, אבל במצב שיאפשר לי נוזל לזרום מהתא לתא (איור 1 א) לתוך תא השיקוע (1D איור).
- הפעל את שני צלחות בר ומערבב להגדרה נמוכה (כ 70 סל"ד) על מנת לאפשר לברים ומערבבים לנוע ברציפות, אבל לאט לאט.
- יוצקים את ההשעיה התא לתוך תא התא (איור 1 א) ולפתוח את ברזלים כך שהתאים לזרום באיטיות אל תוך חדר שקיעה בשיעור של 10 מיליליטר / דקה (1D איור). סגור את ברזלים. שיעור זרימה ניתן לקבוע על ידי סימון מרווחי נפח בתא השיקוע.
- יוצקים 5 מיליליטר של .0.5% פתרון BSA לתוך תא התא ולנקז לתוך תא השיקוע בשיעור של 10 מיליליטר / דקה. סגור את ברזלים. צעד זה לשטוף את התאים מהתא לתא. חזור על 4x.
- הכן את השיפוע: פתח את מהדק בין התא לתא (איור 1 א) ושני צילינדרי 2 ליטר (איור 1B ו-C), ולהתחיל לרוקן את הנוזל לתוך תא השיקוע בשיעור של 40 מיליליטר / דקה (איור 1D) באופן מיידי. התאם את קצב הזרימה ולכן זה לוקח בערך 20-30 דקות כדי לטעון את שיפוע BSA לתוך תא השיקוע. שכבה דקה, ללא הפרעה של תאים מונחת על גבישיפוע BSA צריך להיות גלוי. ברגע שרוב BSA נטען, סגור את הברז ופונה לעמדה שתאפשר לניקוז נוזלים מתא שקיעה לתוך צינור חלוקתו.
- כבה את הצלחות ומערבבים.
- אפשר התאים למשקעים לשעה אחת ו45 דקות. לא להפריע למכשיר בתקופה זו. כל תסיסה מכאנית יכולה להפריע את השיפוע.
4. חלוקה וניתוח של שברים
*** כפי שאתה לבצע את השלבים הבאים, יש להיזהר שלא להפריע את השיפוע. אם שיפוע BSA מופרע, ההליך לא יעבוד!
- ברגע שתאי משקעים, לנקז לאט 50 מיליליטר מתא שקיעה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומניח בצד. חלק זה מכיל בדרך כלל גושים לא רצויים של תאים ופסולת.
- צרף את צינור החלק לאספן שבריר. *** אפשר גם לאסוף את השברים ביד אם Colle שברירctor אינו זמין.
- איסוף שברים: התאם את קצב הזרימה עם ברזלים כך ש10 מיליליטר (מילוי צינור איסוף אחד) נאסף כל שניות 45.
- מכסה את צינורות איסוף שבריר ספין 5 דקות ב450 RCF ב 4 ° C. יוצקים את supernatant בעדינות, resuspend תאים בנוזל שנותר, ולשמור את התאים על קרח.
- ברגע שכל השברים נאספים, מיקרוסקופי לנתח את השברים לאוכלוסיות תאים שונים. ניתן להבחין בין סוגי תאים שונים המבוססים על גודל תא ומורפולוגיה גרעינית 8,15. איור 2 מדגים "תוצאות נציג" לשלושת שברים ונקוו שמועשרים לתאים וspermatogonia () גופניים וmeiotic, (ב) spermatids העגול, ו (ג) מתארך ועיבוי spermatids.
- הקלד spermatogonia הם ca 12 14μm. קוטרו ויש לי גרעינים עגולים שהם הומוגני בהרכב הכרומטין.
- סוג B spermatogonia הוא ca 8-9μm. קוטרו ויש לי לפהגרעיני ד המראים heterochromatin צפוף יותר לאורך הפריפריה הגרעינית.
- spermatocytes טרום leptotene הוא ca 7.5-8.2μm. קוטרו, יש להם פחות מ ציטופלסמה סוג B spermatogonia, ויש להם גרעינים שנראים דומה לאלה בB spermatogonia סוג.
- spermatocytes העיקרי Leptotene הוא 8-10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes מראש leptotene, אבל נראה שכדי לזכות בהכרומטין צפוף יותר בקרום הגרעין.
- Zygotene spermatocytes העיקרי הוא 10-12 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes העיקרי leptotene.
- spermatocytes Pachytene הם בכל מקום בין 12-18 ca מיקרומטר. קוטר ומורכב של שפה דקה של ציטופלסמה סביב גרעין גדול. יותר גושים של הכרומטין צפוף ניתן לראות בגרעין.
- spermatids העגול 10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעין עגול עם chromocenter צפוף מכתים באמצע.
- שרידיםגופים הם ~ 6.5 מיקרומטר בקוטר, הם עגולים, וחסרי גרעין.
- spermatids מתארך והעיבוי דומה בגודלן לעגל spermatids, אבל יש גרעין ייחודי, בצורת מגל.
- התחל עם חלק 15 ולנתח כל חמישה שברים עד 85. בדרך כלל, שברים מתחת 15 יהיו מעורבים וגבשושיים מדי, ושברים מעל 85 יכילו כמה לתאים לא שמישים.
- כדי לנתח כל חלק, לקחת 5ul של נוזל מצינור איסוף שבריר (פעם תאים כבר resuspended לאחר צנטריפוגה) ולהוסיף ל5ul של פורמלדהיד 8% בחיץ קרבס. אפשר התאים הקבועים לשבת בטמפרטורת חדר למשך חמש דקות.
- הוספת 5ul של .0.1% טריטון וDAPI (5 μ / מיליליטר חיץ קרבס) לתאים הקבועים. אפשר התאים לשבת בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- הנח 10 μl של הפתרון שהתקבל לשקופית, מכסה בלהחליק את מכסה, ולנתח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את טוהר של כל חלק.
- שלב את השברים הדומים בגודלם ומורפולוגיה גרעינית (ראו "נציג תוצאות") כדי ליצור האוכלוסיות של תאים הבאים: תאי דיפלואידי meiotic וסומטיים, spermatids העגול, וspermatids עיבוי / מתארך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה האידיאלית מהליך STA-PUT היא הפרדה די בולטת של תאים מהאשכים המבוססים על גודל תא וצפיפות. בעוד התאים מבודדים מאשכי סדימנטציה דרך שיפוע BSA, כמה להקות שונות של תאים יכולות להיות שנצפו. כל גושים של תאים נוטים לשקוע בתחתית של השיפוע ולא לזהם את השברים האחרים. עוד קצת במעלה השיפוע יהיה גופני הגדול ותאי meiotic. במעלה השיפוע עדיין יהיה spermatids העגול קטן יותר. בחלק העליון של השיפוע יהיה מרוכז spermatids, זרע, ומזהם תאי דם אדומים (מופיעים אלה להיות תאים עגולים קטנים ללא גרעין).
ניתן לנתח שברים במהירות באמצעות שילוב של אור ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2) 15. Meiotic, spermatogonial, ותאים סומטיים דיפלואידי הם התאים הגדולים ביותר שנמצאו באשכים ויכיל גרעינים גדולים שrelati הכתםvely הומוגנית עם DAPI. spermatids העגול הם תאים קטנים עם גרעינים עגולים קטנים יותר, בדרך כלל עם chromocenter מכתים במאור פנים. spermatids עיבוי / מתארך הם תאים קטנים שלעתים קרובות נראים מלבני, כאילו זנב קטן ויוצר. תאים אלה גרעינים קטנים יותר, קומפקטיים שכתם בהיר עם DAPI והם בצורת מגל. ברגע שברי תאים משולבים, טוהר ניתן לקבוע עוד יותר על ידי ניתוח כתם המערבי של lysates התא (איור 3). סמנים נפוצים של תאי meiotic הם 1 החלבונים המורכבים synaptonemal Scp1 וSycp2 16. סמנים נפוצים של עיבוי spermatids הם חלבוני מעבר (למשל TP1) או protamines 17.
למרות כל ריצה PUT-STA יכולה להיות שונה, תאים בדרך כלל meiotic, spermatogonia ותאים סומטיים דיפלואידי יהיו למצוא בברים ca. 25-40, spermatids סיבוב בברי ca. 55-65, ועיבוי / מתארכים spermatids בשברי ca.65-75 בשל הבדל קטן בגודל בין תאים סומטיים / meiotic וspermatids העגול, ca. לעתים קרובות יש שברי 45-50 אפילו אחוז התאים סומטיים / meiotic וspermatids העגול. צביעה עם DAPI תעזור להבחין בין שתי אוכלוסיות של תאים אלה. יש פחות חפיפה של spermatid העגול ועיבוי / מתארך שברים spermatid בשל ההבדל הגדול בגודל בין שתי אוכלוסיות של תאים אלה. בדרך כלל, שברים מתחת 15 יכילו הרבה גושים גדולים של תאים ושברים מעל 85 יכיל מספר תאים וגופים רבים שיורי, או ציטופלסמה קרום הנכנס שנשפכה על ידי spermatids.
בדרך כלל, כאשר תאים מ~ 22 אשכים הם מופרדים עם הליך STA-PUT, זה מניב CA. 10 8 תאים / סוג spermatogenic תאים (תאים סומטיים דיפלואידי / meiotic, spermatids העגול, וspermatids עיבוי / מתארך). שברים שמשולבים ליצור האוכלוסייה הסופית של תאים צריכים להיות לפחות80% טהורים לסוג של תא בשאלה. אם אתה לא רואה את התואר הזה של טוהר או גבוה יותר, ייתכן שיש בעיה עם הפרדת תא או שיפוע BSA. כמו כן, אם יש מעט תאים ב20 השברים הראשונים ושפע של תאים שבברים 80 +, או אם יש שפע של תאים ב20 השברים הראשונים וכמעט ולא בשברים 70 +, זמן שקיעה צריך להיות עוד יותר אופטימיזציה. אנא ראה את הדיון להצעות כיצד לירות צרה.
איור 1. הקמת מנגנון STA-PUT: תמונה סכמטית ובפועל של מנגנון STA-PUT מוצג. כל הזכוכית מחוברת על ידי צינורות פלסטיק, כוללים הצינור שמחבר את המכשיר לאספן שבריר. חצים מצביעים על מיקומו של מהדק. א) חדר טעינה סלולרי, מכיל בר ומערבב; B) צילינדר 2 ליטר לBSA 2%, מכיל בר ומערבב; גליל C) 2 L לBSA 4%; ד ') קאמרי שקיעה; E צלחות מערבבים); F) הטיות;. G) ברזלים לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. אוכלוסיות תאים המתקבלות מSTA-PUT: שברים אוחדו לשלוש אוכלוסיות נפרדות של תאים: תאי meiotic וסומטיים, spermatids עגול, ועיבוי ומתארך spermatids. כל אוכלוסייה מוכתמת עם DAPI להראות הבדלים בגודל גרעיני ומורפולוגיה. הדמיה בניגוד שלב מעבירה הבדלים בגודל תא וצורה. בר לבן מייצג 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. סמנים של אוכלוסיות תאים שונות המתקבלות מSTA-PUT: תמציות תא כולו היו עשויים מאוכלוסיית תא שמוצגת באיור 1 וניתוח כתם מערבי בוצע כדי להראות הבדלי ביטוי חלבון לכל אוכלוסייה.. חלבון Synaptonemal המורכב 1 (Scp1) הוא חלבון מתבטא באופן בלעדי במהלך המיוזה, והוא נמצא מועשר שבברי meiotic, תוך שבריר spermatid עיבוי מועשר לחלבון מעבר 1 (TP1), חלבון לידי ביטוי בשלב מאוחר בspermiogenesis. לחץ כאן לצפייה גדולה יותר תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אלה שלומדים spermatogenesis להסתמך על מודלים של בעלי חיים לדגימות תאי spermatogenic, כמערכת תרבית תאים אמינה עדיין לא קיימת ליצירה כל סוגי תאי spermatogenic 3. למרות שתאי spermatogenic נאספים בקלות מכל אשכים, רק אוכלוסיית תוצאות מעורבת. זה מהווה בעיה למי שרוצה ללמוד תתי סוגים מסוימים של תאים אלה, כגון תאי meiotic, spermatids העגול, וspermatids עיבוי. שלוש שיטות שונות משמשות כיום להפריד בין תתי סוגים של תאי spermatogenic הבאים: STA-PUT, FACS, וelutriation 6-13. שתי השיטות האחרונות דורשות גישה לחלקים יקרים של ציוד: סדרן תא וelutriator, בהתאמה. למרות ששיטת FACS תשואות אוכלוסיות טהורות ביותר של סוגי תאי spermatogenic השונים, התהליך לוקח שש שעות ומניב רק 0.5-2.0 x 10 6 תאים לכל סוג תא ל02:58 אשכים 11. Elutriation, כמו ספיד PUT-STAOD, מפריד את התאים בהתבסס על גודל וצפיפות, אבל דורש גישה לelutriator, שהוא יקר יותר ממנגנוני STA-PUT.
הליך STA-PUT משתמש בשיפוע BSA פשוט להפריד תאי spermatogenic בגדלים שונים עם תשואה גבוהה למדי (~ 10 8 תאים / אוכלוסייה ל~ 22 אשכים). יחסית לשיטות FACS, הליך STA-PUT מניב יותר תאים / אשך ולוקח הרבה פחות זמן להפריד בין סוגי תאים. בהשוואה לFACS וelutriation, הליך STA-PUT הוא יחסית פשוט וזול. STA-PUT דורש רק חדר קר או מקרר גדול וסט של כלי זכוכית מיוחדים, מה שהופך את שיטה אידיאלית למעבדות ללא גישה לסדרן תא או elutriator. כאשר מבוצע כראוי, STA-PUT יכול לספק כ 90% מאוכלוסייה טהורה של spermatids העגול או spermatids עיבוי.
שיטת STA-PUT היא מאוד שימושית, אבל דורשת אופטימיזציה במספר שלבים שונים, במיוחד שלedimentation. הפרדה תת אופטימלית של סוגי תאים יכולה להיגרם על ידי מספר נושאים שונים, רוב הנוגעים לשיפוע BSA. כדי להפוך את שיפוע נכון, להפעיל את הברים ומערבבים בתא טעינת תא וצילינדר 2 ליטר מחזיק BSA 2% בזמן שאתה יוצר את השיפוע. גם לנקות את כל צינורות של בועות ולשים לבלבל במקום בתא השיקוע לפני טעינת התאים. הפחתת קצב הזרימה של BSA לתוך או מחוץ לתא השיקוע עשויה לעזור. והכי חשוב, מנגנון STA-PUT לא צריך להיות מופרע במהלך יצירת השיפוע, שקיעה, או אוסף שבריר.
תת אופטימלית תשואות תא יכולות להיות התוצאה של מספר / גודל מספק של אשכים, הפרדת תאים לקויה במהלך טיפול collagenase / טריפסין, ויצירת גושים של תאים. אם אחד הוא לא מצליח להשיג את המספר המתאים של תאים לפרוטוקול STA-PUT וזאת בשל השימוש בעכברים או גנוטיפים יילודים שמייצרים מספר קטן של cel spermatogenicls, ייתכן שיהיה צורך להשתמש יותר חיות לכל STA-PUT או להזמין ערכת PUT-STA זכוכית מותאמת לכמויות ומספרי תא קטנות יותר (זמינה מProScience) 18. כדי להשיג מספר אופטימלי של תאים (700-800 מ'), השתמש לפחות 11 עכברי זכרים בגיל פריון, באופן אידיאלי לפחות 8-9 שבועות. עם זאת, צריכים להיות טעונים לא יותר מ 800 מיליון תאים לתוך אחד STA-PUT. אם תאים לא ניתקו לתוך השעיה תא בודדת לאחר טריפסין טיפול, ריכוז DNAse ניתן להגדיל עד לפתרון 1 מיקרוגרם / 5 מיליליטר. DNAse הוא רגיש לחזור על מחזורים של הקפאה / הפשרה, ובאמצעות DNAse הטרי בכל פעם תגרום לפיזור יעיל יותר של צינוריות לתוך השעיה תא בודדת. אפשר להשתמש פיפטה שעמם רחבה כדי לעזור להתפרק גושי תא לפני הסינון דרך רשת.
היבט אחד של שיטת STA-PUT שתדרוש אופטימיזציה הוא כמות הזמן שהתאים מותר משקעים דרך שיפוע BSA. שעה אחתו45 דקות בדרך כלל עובדת היטב, אבל הפעם יכול להיות שונות ממעבדה למעבדה. בדרך כלל, שכבות שונות של תאים שניתן לראות מבחינה ויזואלית לאורך שיפוע BSA. אם יש כמה תאים ב20 השברים הראשונים נאספו ושפע של תאים שבברים 80 +, זמן שקיעה ייתכן שיהיה הצורך להאריך. אם יש יותר מדי תאים ב20 השברים הראשונים נאספו ויש הפרדה מספיקה של סוגי תאים, זמן שקיעה ייתכן שיצטרך להיות מושפל.
התאים שנרכשו בהליך STA-PUT יכולים לשמש לסוגים רבים ושונים של ניסויים. STA-PUT מספק חומר רב לניתוח כתם מערבי, immunofluorescence, וניתוח RNA, למרות שניסויים ביוכימיה בקנה מידה גדולה עשויים לדרוש שילוב של חומרים מכמה ריצות STA-PUT שונים. כשנפרד מסוגי תאים אחרים, יכול להיות מתורבת spermatids הפלואידים ונתון במבחנה המניפולציה מולקולרית לתקופה של עד שלושה ימים, אשר יכול להיות קלה יותר מאשר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. פרוטוקול זה שמפגינים כרוך בשימוש בעכברי מעבדה ובוצע בהתאם לכל הנחיות הרלוונטיות, תקנות ורשויות רגולטוריות. בעלי חיים המשמשים בפרוטוקול זה נשמרים תחת הדרכתו ואישור מאוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי פנסילבניה (פרוטוקול # IACUC 804,284).
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי GM055360 NIH מענקים לSLB וU54HD068157 לRGM. JMB נתמכה על ידי T32 הגנטיקה הדרכה גרנט באוניברסיטת פנסילבניה (GM008216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
