Summary
De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.
Abstract
Zoogdieren spermatogenese is een complex differentiatie proces dat plaatsvindt in verschillende stadia in de testes van de testes. Momenteel is er geen betrouwbare celkweeksysteem waardoor spermatogene differentiatie in vitro, en de meeste biologische studies van spermatogene cellen vereisen weefsel oogst uit dierlijke modellen zoals de muis en rat. Omdat de testis bevat een groot aantal celtypen - zowel niet-spermatogene (Leydig, Sertoli, myeloïde en epitheelcellen) en spermatogene (spermatogonia, spermatocyten, ronde spermatiden, condenseren spermatiden en spermatozoa) - studies van de biologische mechanismen die betrokken zijn bij de spermatogenese vereisen de isolatie en verrijking van deze verschillende celtypes. De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van een heterogene populatie van cellen - in dit geval, de testes - via een lineaire gradiënt BSA. Individuele celtypen sediment met verschillende sedimentatiesnelheid volgens cell grootte en fracties verrijkt verschillende celtypen kunnen worden verzameld en gebruikt in verdere analyses. Terwijl de STA-PUT methode niet leidt tot zeer zuivere fracties celtypes, bijvoorbeeld verkregen kunnen worden met bepaalde celsorteringsmethoden, verstrekt het een veel hogere opbrengst van de totale cellen in elke fractie
(~ 1 x 10 8 cellen / spermatogenese celtype uit een uitgangspopulatie van 7-8 x 10 8 cellen). Deze high yield methode vereist alleen gespecialiseerd glaswerk en kan worden uitgevoerd in een koude kamer of grote koelkast, waardoor het een ideale methode voor laboratoria die beperkte toegang tot gespecialiseerde apparatuur zoals een fluorescentie geactiveerde cel sorteerder (FACS) of afslibinrichting hebben.
Introduction
Zoogdieren spermatogenese is een complex proces dat differentiatie in verschillende stadia van de testes van de testes 1. In het kort, stam-achtige spermatogonia dat wonen in de buurt van het epitheel van de seminiferous verdeel en differentiëren in spermatocyten, die vervolgens ondergaan meiotische delingen. Nadat meiose is voltooid, de resulterende haploïde cellen of ronde spermatiden ondergaan spermiogenese een differentiatieproces dat het afstoten van cytoplasma en verdichting van de kern omvat. Spermatiden geleidelijk een flagellum en ondergaan rek en condensatie van de kern, het produceren verlengen en vervolgens condenseren spermatiden, respectievelijk. De eindproducten spermatozoa, die vrijkomen in het lumen van de seminiferous en uiteindelijk in de bijbal, waar ze verder rijpen.
Omdat het proces van spermatogenese steunt op speciale hormonale en moleculaire omstandigheden inde testes, een betrouwbare in vitro kweeksysteem voor het gehele proces van spermatogenese nog niet ontwikkeld 2,3. Cultuur methoden ontwikkeld voor het creëren "primordiale kiemcel-achtige cellen" en haploïde, "rond spermatide-achtige cellen" van stamcellen, maar deze methoden zijn nog niet in staat om grote aantallen van deze cellen te genereren en niet later spermatogenese cellen produceren types 4,5. Gelukkig is de spermatogenese celtypen sterk verschillen in omvang, waardoor voor een enkele-celsuspensie verkregen uit geheel testes met een gradiënt vloeistof te scheiden. De STA-PUT methode, hier aangetoond, maakt gebruik van een lineaire gradiënt BSA en eenvoudig sedimentatie te spermatogene cellen te scheiden op basis van grootte en massa 6-9.
De STA-PUT methode heeft een aantal voordelen ten opzichte van de andere twee meest gebruikte methoden om spermatogene celtypes scheiden: FACS en elutriatie 10-13. De STA-PUT apparaat vereist only verschillende stukken van gespecialiseerde glaswerk geassembleerd in een koude kamer of grote koelkast. Zo is goedkoper dan het gebruik van een cel sorteerder of een afslibinrichting. De STA-PUT methode levert grotere hoeveelheden cellen per celtype en testis dan kan worden gesorteerd door FACS op een vergelijkbare tijdsspanne, hoewel de zuiverheid van elke celpopulatie is niet zo hoog als die verkregen met FACS 11. Celsortering gebruik magnetische korrels (magnetisch geactiveerde celsortering, MACS) is recent ook succesvol toegepast voor verrijking spermatogonia uit een gemengde testicular celpopulatie, maar het is nog niet geschikt voor het scheiden spermatocyten of spermatiden door gebrek aan kennis van geschikte oppervlakte-markers 14. Een bijkomend voordeel van de STA-PUT methode via FACS of MACS is de mogelijkheid om levende cellen voor verdere kweek isoleren omdat in tegenstelling tot de meeste FACS protocollen, het geen DNA of andere vormen van vlekken vereisen. Voor studies die ik nodigarge opbrengsten van spermatogene cellen vormen op ~ 90% zuiverheid, de STA-PUT is een ideale methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De STA-PUT protocol bestaat uit drie fasen: 2) Voorbereiding van de celsuspensie uit volle testes, en 3) Mobiele laden, sedimentatie, en fractieverzameling 1) Opzetten van de apparatuur en reagentia,. Wanneer deze wordt uitgevoerd door een team van twee onderzoekers, het protocol duurt gemiddeld acht uur.
1. Het opzetten van de STA-PUT Apparatuur (figuur 1)
*** STA-PUT apparaat worden geplaatst in een 4 ° C grote koelkast of een koude kamer die ook plaats biedt aan een fractie collector, indien deze wijze van inzameling heeft de voorkeur.
- De nacht voordat (of op zijn minst een paar uur voor) u de werkwijze uit te voeren, was alle apparatuur (met name het glaswerk en leidingen) en steriliseren met 70% ethanol. Laten drogen materiaal volledig voor de montage van de inrichting zoals weergegeven in figuur 1.
- Bevestig de twee 2 L flessen (figuren 1B en C) en de cellen laadkamer (
- Plaats een kleine roerstaaf in de cel laadruimte (figuur 1A) en een grotere roerstaaf in de meest linkse 2 L cilinder (figuur 1B) dat 2% BSA bevat.
- Plaats de 2 L bezinkkamer op het platform (figuur 1D). Plaats de metalen baffle (Figuur 1F) direct op de opening in de bodem van de bezinkkamer (figuur 1D). Dit is essentieel, omdat de geleideplaat voorkomt vortexen van de vloeistof en verstoring van de cel verloop tijdens fractieverzameling. Plaats het deksel op de top van de bezinkkamer.
- Na het aanbrengen van een zeer kleine hoeveelheid vacuüm vet aan de geslepen glas van de driewegkraan (figuur 1G), klemmen de kraan aan de bodem van de SEdimentation kamer, het aansluiten van de geslepen glas gewrichten van de kraan en de sedimentatie kamer.
- Verbind de mobiele laadkamer (figuur 1A) rechts uitlaat van de kraan met slang. Sluit de kraan.
- Bevestig de cel fractionering slang aan op de linker uitgang van de kraan. De fractionering buis bestaat uit een stuk slang met een glas Pasteur pipet verbonden met het open einde. Een stuk met een kleinere diameter wordt aan het smalle uiteinde van de glazen pipet bevestigd. De smalle pipet beperkt de stroom van de celsuspensie gedurende fractie verzamelen. Klem deze kleine buis op de bodem.
- Bereid 2 L Krebs (1x) buffer op de dag van het experiment (tabel 1). Vervolgens bereiden 550 ml 2% BSA in 1x Krebs, 550 ml 4% BSA in 1 x Krebs en 50 ml 0,5% BSA in 1x Krebs. Filter en deze oplossingen afkoelen tot 4 ° C.
- Giet de 4% BSA oplossing in de juiste 2 L cilinder (figuur 1C) en 2% BSAoplossing in de linker cilinder 2 L (Figuur 1B). Zorg ervoor dat er geen grote luchtbellen in de slang dat deze cilinders met elkaar verbindt.
- Giet Krebs buffer in de cel laadkamer en vul de slang deze kamer verbinden met de sedimentatie kamer, zorg ervoor dat er geen grote bellen, want deze kunnen het verloop verstoren. Knijpen of veegt de slang voorzichtig helpt om de bellen te verwijderen. Controleer alle Krebs buffer in de buis en niet in de celkamer.
- Laat een kleine hoeveelheid Krebs buffer te stromen in de bezinkkamer uitlekken bijna alle buffer in de cel fractionering buis om de buis te vullen en verwijder grote luchtbellen.
- Plaats de fractie collector direct onder de bezinkkamer. Zorg ervoor dat alle de fractie buizen op hun plaats zitten en bedekt met plastic folie om besmetting te voorkomen.
2. Isoleren spermatogene Cellen van Whole Testikels
3. Cel laden en Sedimentatie
- Zorg ervoor dat de kraan gesloten is, maar in de positie die het mogelijk vloeistof te stromen uit de cel kamer (Figuur 1A) in de bezinkkamer (figuur 1D).
- Draai beide roerstaaf platen op een lage stand (ongeveer 70 min) zodat het roer bars continu bewegen, maar langzaam.
- Giet de celsuspensie in de celkamer (figuur 1A) en open de kraan zodat de cellen stroomt langzaam in de bezinkkamer met een snelheid van 10 ml / min (figuur 1D). Sluit de kraan. Stroomsnelheid kan worden bepaald vol intervallen op de bezinkkamer markering.
- Giet 5 ml 0,5% BSA oplossing in de celkamer en afwateren in de bezinkkamer met een snelheid van 10 ml / min. Sluit de kraan. Deze stap zal de cellen te wassen uit de cel kamer. 4x herhalen.
- Bereid de gradiënt: Open de klemmen tussen de celkamer (figuur 1A) en de twee 2 L flessen (fig. 1B en C), en beginnen de vloeibare afvoer in de bezinkkamer met een snelheid van 40 ml / min (figuur 1D) onmiddellijk. Stel het debiet dus het duurt ongeveer 20-30 minuten naar het BSA gradiënt te laden in de bezinkkamer. Een dunne, ongestoorde laag cellen die bovenop deBSA gradiënt moet zichtbaar zijn. Zodra de meeste van de BSA is geladen, sluit de kraan en draai naar de positie die het mogelijk vloeistof uit de bezinkkamer in de fractionering buis.
- Schakel het roer platen.
- Laat de cellen sedimenteren gedurende een uur en 45 minuten. STOOR NIET HET APPARAAT in deze tijd. Elke mechanische agitatie kon het verloop verstoren.
4. Fractionering en Analyse van de Fracties
*** Als je de volgende stappen uitvoeren, wees voorzichtig de helling niet te verstoren. Als de BSA gradiënt wordt verstoord, zal de procedure niet werken!
- Zodra de cellen gesedimenteerd, langzaam drain 50 ml van de sedimentatie kamer in een 50 ml conische buis en zet apart. Deze fractie bevat meestal ongewenste groepjes van cellen en puin.
- Bevestig de fractie buis om de fractie collector. *** Het is ook mogelijk om de fracties te verzamelen door de hand als een fractie collector is niet beschikbaar.
- Verzamel fracties: Stel het debiet met de kraan zodat 10 ml (vullen een collectie buis) wordt verzameld om de 45 sec.
- Cap de fractie verzamelbuizen en spin gedurende 5 min bij 450 RCF bij 4 ° C. Giet supernatant voorzichtig resuspendeer cellen in de resterende vloeistof, en houdt cellen op ijs.
- Als alle fracties worden verzameld, microscopisch analyseren de fracties van verschillende celpopulaties. Verschillende celtypen kunnen worden onderscheiden op basis van celgrootte en nucleaire morfologie 8,15. Figuur 2 illustreert "representatieve resultaten" voor de drie samengevoegde fracties die zijn verrijkt voor (a) somatische en cellen in de meiose en spermatogonia, (b) ronde spermatiden, en (c) het verlengen en condenseren spermatiden.
- Type A spermatogonia zijn 12-14μm ca. in diameter en hebben ronde kernen die homogeen chromatine samenstelling.
- Type B spermatogonia zijn 8-9μm ca. in diameter en hebben Round kernen die dichter heterochromatine langs de nucleaire periferie tonen.
- Pre-leptoteen spermatocyten zijn 7.5-8.2μm ca. diameter, minder dan cytoplasma Type B spermatogonia en kernen hebben die vergelijkbaar zijn met die van categorie B spermatogonia kijken.
- Leptoteen primaire spermatocyten zijn 8-10 um ca. in diameter en kernen hebben die lijken op die van pre-leptoteen spermatocyten uitzien, maar lijken dichter chromatine te doen aan de kernmembraan.
- Zygotene primaire spermatocyten zijn 10-12 um ca. in diameter en kernen hebben die lijken op die van leptoteen primaire spermatocyten kijken.
- Pachytene spermatocyten ergens 12-18 um ca. diameter en bestaan uit een dunne rand van cytoplasma rond een grote kern. Meer klompen dichte chromatine te zien in de nucleus.
- Ronde spermatiden zijn 10 micrometer ca. in diameter en hebben een ronde kern met een dicht-kleuring chromocenter in het midden.
- Restlichamen zijn ~ 6,5 micrometer in doorsnede, zijn rond, en het gebrek aan een kern.
- Verlengen en condenserende spermatiden zijn vergelijkbaar in grootte met spermatiden ronden, maar hebben een unieke, sikkelvormige kern.
- Begin met fractie 15 en vijf fracties tot 85 analyseren. Meestal zal fracties onder 15 te worden gemengd en klonterig en fracties dan 85 zal weinig tot geen bruikbare cellen bevatten.
- Om een breuk analyseren rekening 5UL vloeistof uit de fractie verzamelbuis (nadat cellen werden geresuspendeerd na centrifugeren) en voeg aan 5UL van 8% formaldehyde in Krebs buffer. Laat de vaste cellen te zitten bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
- Voeg 5UL van 0,1% Triton en DAPI (5 μ / ml Krebs-buffer) aan de gefixeerde cellen. Laat de cellen op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Breng 10 pl van de verkregen oplossing op een glijbaan, bedek met een dekglaasje en geanalyseerd met een fluorescentie microscoop om de zuiverheid van elke fractie bepaald.
- Combineer fracties die vergelijkbaar in grootte en nucleaire morfologie zijn (zie "Representatieve resultaten") naar de volgende populaties van cellen te maken: de meiose en somatische diploïde cellen, ronde spermatiden en condenseren / verlengen spermatiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ideale resultaat van de STA-PUT procedure een vrij merkbaar scheiding van cellen van de testes basis van celgrootte en dichtheid. Terwijl cellen geisoleerd uit de testes sedimenteren via BSA gradiënt, kan een aantal verschillende groepen van cellen waargenomen. Eventuele klompen cellen neiging te zinken naar de bodem van de gradiënt en niet vervuilen de andere fracties. Een beetje verder op de helling zal de grote somatische en meiotische cellen. Verder de helling nog steeds kleiner ronde spermatiden. Op de top van de gradiënt wordt gecondenseerd spermatiden, sperma en verontreinigende rode bloedcellen (deze lijken kleine ronde cellen zonder kern).
Fracties kan snel worden geanalyseerd met een combinatie van licht en fluorescentie microscopie (figuur 2) 15. Meiotische, spermatogonial en somatische diploïde cellen zijn de grootste cellen in de testes en zal grote kernen die vlek relati bevattenvely homogeen met DAPI. Ronde spermatiden zijn kleinere cellen met kleinere ronde kernen, meestal met een helder kleuring chromocenter. Condenserende / verlengen spermatiden zijn kleine cellen die vaak kijken langwerpig, alsof er een kleine staart wordt gevormd. Deze cellen hebben kleinere, compacte kernen die helder kleuren met DAPI en hebben de vorm van een sikkel. Zodra cel fracties worden samengevoegd, kan de zuiverheid verder worden bepaald door Western blot analyse van cellysaten (Figuur 3). Gemeenschappelijke merkers van meiotische cellen zijn de synaptonemal complex 1 eiwitten SCP1 en Sycp2 16. Gemeenschappelijke markers van condenserende spermatiden zijn overgang eiwitten (bijv. TP1) of protamines 17.
Hoewel elk STA-PUT run verschillend kan zijn, zal meestal cellen in de meiose, spermatogonia en somatische diploïde cellen worden gevonden in fracties ca. 25-40, ronde spermatiden in fracties ca. 55-65, en condenseren / verlengen spermatiden in fracties ca.65-75 Door een kleiner verschil in grootte tussen somatische / meiotische cellen en rond spermatiden, fracties ca. 45-50 vaak nog percentage somatische / meiotische cellen en rond spermatiden. Kleuring met DAPI helpen deze twee populaties van cellen te onderscheiden. Er is minder overlap van de ronde spermatide en condensatie / verlengen spermatide fracties door het grotere verschil in grootte tussen de twee populaties van cellen. Meestal zal fracties onder 15 veel grote massa's van cellen en fracties boven de 85 bevatten, zullen weinig cellen en vele resterende lichamen, of membraan-gebonden cytoplasma dat wordt vergoten door spermatiden bevatten.
In het algemeen, wanneer de cellen van ~ 22 testes worden gefractioneerd met de STA-PUT procedure, het levert ca. 10 8 cellen / spermatogene celtype (meiose / somatische diploïde cellen, ronde spermatiden en condenseren / verlengen spermatiden). Fracties die gezamenlijk de uiteindelijke populatie van cellen te creëren moet minstens80% zuiver was voor het type cel in kwestie. Als je niet ziet deze zuiverheidsgraad of hoger, is er mogelijk een probleem met de cel scheiding of de BSA gradiënt zijn. Ook als er weinig cellen in de eerste 20 fractie en een overvloed aan cellen in fracties 80 +, of als er een overvloed van cellen in de eerste 20 fracties en nauwelijks in fracties 70 +, de sedimentatie tijd moet verder worden geoptimaliseerd. Zie de discussie voor suggesties over hoe om problemen te schieten.
Figuur 1. Het opzetten van de STA-PUT Apparatuur: Een schematisch en werkelijke beeld van de STA-PUT apparaat worden weergegeven. Alle glaswerk is verbonden door kunststof buizen, zoals de buis die de inrichting verbindt met de fractiecollector. Pijlen geven de locatie van klemmen. A) Mobiele laadruimte, bevat een roerstaafje, B) 2 L cilinder voor 2% BSA, bevat een roerstaafje, C) 2 L cilinder voor 4% BSA; D) bezinkkamer; E) Stir platen; F) Baffle;. G) Stopcock Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Celpopulaties verkregen uit de STA-PUT: Fracties werden samengevoegd tot drie afzonderlijke populaties van cellen: de meiose en somatische cellen, ronde spermatiden en condenseren en verlengen spermatiden. Elke populatie is gekleurd met DAPI verschillen in grootte en nucleaire morfologie vertonen. Fasecontrast brengt verschillen in celgrootte en vorm. Witte balk geeft 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Markers van verschillende celpopulaties verkregen uit de sta-PUT: Gehele celextracten werden gemaakt van elke celpopulatie figuur 1 en Western blot analyse werd uitgevoerd om eiwitexpressie verschillen voor elke populatie vertonen.. Synaptonemal complex eiwit 1 (SCP1) is een eiwit dat uitsluitend tijdens de meiose uitgedrukt en is gevonden verrijkt in de meiotische fracties, terwijl de condensatie spermatide fractie verrijkt is voor de overgang eiwit 1 (TP1), een eiwit laat in spermiogenese uitgedrukt. Klik hier voor vergroting afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Degenen die spermatogenese studeren vertrouwen op dierlijke modellen voor spermatogene cel monsters, als een betrouwbare celcultuur systeem bestaat nog niet voor het genereren van alle spermatogene celtypen 3. Hoewel spermatogene cellen gemakkelijk worden verzameld uit heel testes, maar een gemengde bevolking leidt. Dit vormt een probleem voor degenen die wensen om specifieke subtypes van deze cellen, zoals cellen in de meiose, ronde spermatiden en condenseren spermatiden bestuderen. Drie verschillende methoden worden momenteel gebruikt om deze subtypes van spermatogene cellen scheiden: STA-PUT, FACS, en elutriatie 6-13. De laatste twee methoden toegang tot dure onderdelen van de uitrusting moeten worden: een cel sorteerder en een afslibinrichting, respectievelijk. Hoewel de FACS methode levert zeer zuivere populaties van de verschillende spermatogene celtypes, het proces duurt zes uur en levert slechts 0,5-2,0 x 10 6 cellen per celtype per 2-3 testes 11. Elutriatie, zoals de STA-PUT method, scheidt cellen op basis van grootte en dichtheid, maar vereist toegang tot een afslibinrichting, die duurder is dan de STA-PUT apparaat.
De STA-PUT procedure maakt gebruik van een eenvoudige BSA verloop op spermatogene cellen van verschillende grootte te scheiden met een vrij hoge opbrengst (~ 10 8 cellen / bevolking per ~ 22 testes). Ten opzichte van FACS methoden, de STA-PUT procedure levert meer cellen / testis en neemt veel minder tijd om celtypen te scheiden. Vergeleken met FACS en elutriatie, de STA-PUT procedure is relatief eenvoudig en goedkoop. De STA-PUT vereist slechts een koude kamer of een grote koelkast en een set gespecialiseerde glaswerk, waardoor het een ideale methode voor laboratoria zonder toegang tot een celsorteerder of afslibinrichting. Wanneer goed uitgevoerd, kan de STA-PUT een ongeveer 90% zuivere populatie van rond spermatiden of condenserende spermatiden bieden.
De STA-PUT methode is zeer nuttig, maar vereist optimalisatie op verschillende stappen, vooral sedimentation. Sub-optimale scheiding van celtypen kan worden veroorzaakt door verschillende problemen meeste betreffende de BSA verloop. Om een goed verloop te maken, zet de roerstaafjes in de cel laadruimte en de 2 L cilinder die de 2% BSA tijdens het maken van de gradiënt. Ook verwijder alle slangen van bellen en zet het schot op zijn plaats in de bezinkkamer voordat de cellen. Het verminderen van de stroomsnelheid van het BSA in of uit de bezinkkamer kan helpen. Het belangrijkste is dat de STA-PUT apparaat niet gestoord worden tijdens het maken van de helling, sedimentatie, of gedeelte collectie.
Sub-optimale cel opbrengsten kunnen het gevolg zijn van onvoldoende aantal / grootte van de testikels, onvoldoende celscheiding tijdens collagenase / trypsine behandeling, en cel klonteren zijn. Als men niet het juiste aantal cellen voor deze sta-PUT protocol verkrijgen door het gebruik van neonatale muizen of genotypen die kleine aantallen spermatogenese cel producerenls, kan het nodig zijn om meer dieren per STA-PUT gebruikt of een STA-PUT glaswerk kit geoptimaliseerd voor kleinere volumes en aantal cellen (verkrijgbaar van ProScience) 18 bestellen. Om een optimaal aantal cellen (700-800.000.000) te verkrijgen, minstens 11 mannelijke muizen vruchtbare leeftijd, idealiter ten minste 8-9 weken oud. Echter, mag niet meer dan 800 miljoen cellen in een STA-PUT worden geladen. Indien cellen niet gedissocieerd in een enkele celsuspensie na trypsine behandeling, kan de DNAse concentratie worden verhoogd tot 1 ug / 5 ml oplossing. DNAse is gevoelig voor cycli van bevriezen / ontdooien en met verse DNAse telkens zal resulteren in een efficiëntere dispersie van tubules in een enkele celsuspensie te herhalen. Men kan een wijde boring pipet gebruiken om uit elkaar te breken celklonten voordat filteren door middel van mesh.
Een aspect van de STA-PUT methode optimalisering vereist is het tijd de cellen bezinken door de BSA gradiënt. Een uuren 45 min werkt meestal goed, maar dit keer kan verschillen van laboratorium tot laboratorium. Meestal kan verschillende lagen cellen visueel gezien in de BSA gradiënt. Als er weinig cellen in de eerste 20 fracties verzameld en een overvloed aan cellen in fracties 80 +, moet de sedimentatie tijd worden verlengd. Als er te veel cellen in de eerste 20 fracties verzameld en onvoldoende scheiding van celtypen, moet de bezinktijd worden verlaagd.
De verworven met de STA-PUT procedure cellen kunnen worden gebruikt voor vele verschillende soorten experimenten. De STA-PUT biedt voldoende materiaal voor western blot analyse, immunofluorescentie, en RNA-analyse, hoewel grootschalige biochemie experimenten kan eisen combineren materiaal uit verschillende STA-PUT runs. Afgescheiden andere celtypen kunnen haploïde spermatiden worden gekweekt en onderworpen aan moleculaire manipulatie in vitro tot drie dagen, die eenvoudiger dan kan
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. Dit protocol wordt aangetoond impliceert het gebruik van laboratorium muizen en werd uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties. Dieren die in dit protocol worden onderhouden onder begeleiding en goedkeuring van de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC protocol # 804284).
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door NIH subsidie GM055360 aan SLB en U54HD068157 te RGM. JMB werd gesteund door de T32 Genetics Training Grant aan de Universiteit van Pennsylvania (GM008216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
