Summary
Способ STA-PUT позволяет для разделения различных популяций клеток сперматогенных в зависимости от размера и плотности.
Abstract
Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек. В настоящее время нет надежной системы культуры клеток позволяет сперматогенного дифференциации в пробирке, и большинство биологические исследования сперматогенных клеток требуют урожай тканей от животных моделях, таких как мыши и крысы. Потому что яичко содержит многочисленные типы клеток - как не-сперматогенеза (Лейдига, Сертоли, миелоидных и эпителиальные клетки) и сперматогенеза (сперматогенов сперматоциты, круглые сперматиды, конденсации сперматиды и сперматозоиды) - изучение биологических механизмов, участвующих в сперматогенеза требуют изоляции и обогащение этих различных типов клеток. Метод СТА-PUT позволяет для разделения гетерогенной популяции клеток - в данном случае, от яичек - через линейным градиентом BSA. Отдельные типы клеток осадок с разной скоростью осаждения в соответствии с серазмер LL, и фракции, обогащенные для различных типов клеток могут быть собраны и использованы в дальнейших анализов. Хотя способ STA-PUT не приводит к чрезвычайно чистых фракций из типов клеток, например, как могут быть получены с определенными методами сортировки клеток, он обеспечивает значительно более высокий выход общего числа клеток в каждой фракции
(~ 1 х 10 8 клеток / сперматогенеза тип клеток из исходного населения 7-8 х 10 8 клеток). Этот метод высокая доходность требует только специализированные изделия из стекла и может быть выполнена в любом холодном помещении или большой холодильник, что делает его идеальным методом для лабораторий, которые имеют ограниченный доступ к специализированным оборудованием вроде активацией флуоресценции сортировщика клеток (FACS) или элюент.
Introduction
Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек 1. Вкратце, стволовых как сперматогоний, что проживание вблизи эпителия семенных канальцев разделяй и дифференцироваться в сперматоцитах, которые затем подвергаются мейоза дивизий. После мейоза завершена, в результате гаплоидные клетки, или круглые сперматиды, пройти спермиогенеза, процесс дифференциации, которая включает пролитие цитоплазме и уплотнения ядра. Сперматид постепенно развивать жгутик и пройти удлинение и конденсацию ядра, производя удлинения, а затем конденсационных сперматиды соответственно. Конечные продукты являются сперматозоиды, которые выделяются в просвет семенных канальцев и в конечном счете в придатке яичка, где они созревают дальше.
Поскольку процесс сперматогенеза полагается на специальных гормональных и молекулярных условий вяички, надежная система культуры в пробирке в течение всего процесса сперматогенеза до сих пор не разработана 2,3. Культура методы были разработаны для создания "ячейки-подобные клетки примордиальных зародышевых" и гаплоидных, "круглые сперматид-подобные клетки" из стволовых клеток, но эти методы еще не в состоянии генерировать большое количество этих клеток и не дают позже сперматогенеза ячейку типы 4,5. К счастью, сперматогенного типы клеток существенно отличаются по размеру, что позволяет суспензии одноклеточных, полученной из цельного яичек быть разделены с жидким градиента. Метод СТА-PUT, продемонстрировали здесь, использует линейный градиент BSA и простой осаждение отделить сперматогенного клетки в зависимости от размера и массы 6-9.
Метод СТА-PUT имеет ряд преимуществ перед другими двумя наиболее широко используемых методов для отделения сперматогенного типов клеток: FACS и отмучивание 10-13. СТА-PUT аппарат требует ОНЛу несколько частей специализированной посуды собраны в холодном помещении или большой холодильник. Таким образом, это дешевле, чем с использованием клеточного сортера или элюент. Способ STA-PUT дает более высокое количество клеток каждого типа клеток и семенниках, чем могут быть отсортированы по FACS в сопоставимой времени, хотя чистота каждой клеточной популяции не так высока, как полученные с FACS 11. Сотовый сортировки с использованием магнитных шариков (магнитный Активированный сортировки клеток, MACS) недавно был успешно применен для обогащения сперматогониев из смешанного яичек клеточной популяции, в настоящий момент неподходящим для разделения сперматоциты или сперматиды из-за незнания соответствующей поверхностных маркеров 14. Дополнительным преимуществом способа STA-PUT над FACS или MACS является возможность изолировать жизнеспособных клеток, подходящих для последующей культуры, потому что, в отличие от большинства протоколов FACS, он не требует никакого ДНК или другие типы окрашивания. Для исследований, требующих лArge выходы сперматогенных типов клеток при ~ 90%-ной чистоты, СТА-PUT является идеальным методом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол СТА-PUT состоит из трех этапов: 1) создание аппарата и реагентов, 2) Получение клеточной суспензии из цельных яичек, и 3) загрузка сотовый, осаждение и сбор фракции. Когда выполняется командой двух исследователей, протокол занимает восемь часов в среднем.
1. Настройка СТА-PUT Аппарат (рис. 1)
*** STA-PUT аппарат должен быть помещен в 4 ° C большим холодильником или холодной комнате, что также может вместить коллектор фракций, если это метод сбора является предпочтительным.
- В ночь перед (или по крайней мере за несколько часов до) выполнения метода, мыть все оборудование (особенно изделия из стекла и труб) и стерилизовать 70% этанолом. Пусть оборудования полностью высохнуть перед сборкой аппарата, как показано на рисунке 1.
- С помощью двух цилиндров 2 л (фиг.1В и С) и нагрузка сотовой ячейки в камере (
- Нанесите небольшое мешалкой в клетки загрузочной камеры (рис. 1А) и больший мешалкой в самый левый 2 л цилиндра (рис. 1В), который будет содержать 2% BSA.
- Поместите 2 л оседания камеру на платформе (рис. 1D). Поместите металлическую перегородку (рис. 1F) непосредственно на верхней части отверстие в нижней части камеры осаждения (рис. 1D). Это очень важно, так как перегородка предотвращает вихревание жидкости и нарушению клеточной градиента во время сбора фракции. Поместите крышку на верхней части отстойника камеры.
- После применения очень небольшое количество вакуумной смазки на притертой сустава трехходовым краном (рис. 1G), зажать кран на дно себеdimentation камера, соединяющая матового стекла суставы краном и оседания камеры.
- Подключите мобильный загрузкой камеру (рис. 1А) к правому выходе из крана с трубопровода. Закройте кран.
- Прикрепите трубку сотового фракционирования к левому гнезду краном. Трубка фракционирование включает в себя кусок трубы со стеклянной пипетки Пастера, подключенного к открытому концу. Кусок трубы меньшего отверстия прикреплен к узкому концу стеклянной пипетки. Узкий пипетка ограничивает поток суспензии клеток во фракции сбора. Зажмите эту маленькую трубку в самом низу.
- Подготовьте 2 L Krebs (1x) буфер день эксперимента (табл. 1). Затем готовят 550 мл 2% BSA в 1X Кребса, 550 мл 4% BSA в 1X Кребса и 50 мл 0,5% BSA в 1X Кребса. Фильтрует и охлаждает эти решения до 4 ° С
- Налейте 4% раствор BSA в правом 2 л цилиндра (рис. 1в) и 2% BSAраствор в левом L 2 цилиндра (фиг. 1В). Убедитесь, что нет никаких больших пузырьков в трубке, которая соединяет эти цилиндры.
- Налейте Кребса буфера в ячейки загрузочной камеры и заполнить трубопровод, соединяющий эту камеру с оседания камеры, убедившись, что нет никаких большие пузыри, так как они могут нарушить градиент. Сжатие или щелкая трубки мягко помогает удалить пузыри. Убедитесь, что все буфере Кребса в трубе, а не в клеточной камере.
- Разрешить небольшое количество буфера Кребса поступать в оседания камере, а затем слить почти все буфера в трубку сотового фракционирования в того, чтобы заполнить трубу и удалить любые большие пузыри.
- Поместите коллектор фракций непосредственно под оседания камеры. Убедитесь в том, что все фракции трубы находятся на месте и покрыты полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить загрязнение.
2. Изоляция сперматогенного клеток из цельной семенников
3. Сотовый Погрузка и Седиментация
- Убедитесь, что запорный кран закрыт, но в положении, которое позволит жидкость течь из клеточной камере (рис. 1А) в камере осаждения (рис. 1D).
- Поверните оба мешалкой пластины на низком уровне (около 70 оборотов в минуту), чтобы позволить размешивать бары двигаться непрерывно, но медленно.
- Налейте клеточной суспензии в клеточной камере (рис. 1А) и открыть кран, так что клетки протекать медленно в камере осаждения со скоростью 10 мл / мин (рис. 1D). Закройте кран. Расход может быть определена путем маркировки интервалы громкости на оседания камеры.
- Налейте 5 мл 0,5% раствора БСА в клеточной камере и стекать в камере осаждения со скоростью 10 мл / мин. Закройте кран. Этот шаг будет промыть клетки из клеток камеры. Повторите 4 раза.
- Подготовка градиент: Открыть зажимы между клеткой камеры (рис. 1А) и двух цилиндров 2 L (фиг. 1B и С), и начать вытекать жидкость в камере осаждения со скоростью 40 мл / мин (рис. 1D) немедленно. Отрегулируйте расход таким образом, занимает приблизительно 20-30 минут, чтобы загрузить градиент BSA в оседания камеры. Тонкий, спокойно слой клеток, лежащих на верхней частиBSA градиент должен быть виден. После того, как большая часть BSA загружается, закройте кран и включите его в положение, которое позволит жидкости вытечь из отстойника камеры в фракционирования трубки.
- Выключите ажиотаж пластины.
- Разрешить клетки осадок в течение одного часа и 45 минут. НЕ БЕСПОКОИТЬ аппарат в это время. Любое механическое перемешивание может нарушить градиент.
4. Фракционирование и анализ фракций
*** Как вы выполните следующие действия, будьте осторожны, чтобы не нарушить градиент. Если градиент БСА нарушается, процедура не будет работать!
- Как только клетки осаждали медленно сливать 50 мл от оседания камеры в 50 мл коническую трубку и отложите в сторону. Эта фракция, как правило, содержит нежелательные скопления клеток и мусора.
- Прикрепите фракции трубку к коллектор фракций. *** Можно также собрать фракции вручную, если доля Коллет е р не доступен.
- Сбор фракций: Отрегулируйте расход с краном так, чтобы 10 мл (заполнение одной коллекции трубку) собирают в 45 сек.
- Трубки закрывают крышками Сбор фракций и спин в течение 5 мин при 450 RCF при 4 ° С. Слейте супернатант осторожно, ресуспендирования клеток в оставшейся жидкости, и сохранить клетки на льду.
- После того как все фракции собирают, микроскопически анализ фракций на различных клеточных популяций. Различные типы клеток можно отличить на основе размера клеток и ядерной морфологии 8,15. Рисунок 2 иллюстрирует репрезентативные результаты "" для трех объединенных фракций, обогащенных для (а) и соматических клеток и мейоза сперматогониев, (б) круглых сперматидах и (в) удлинения и конденсации сперматиды.
- Тип A сперматогоний являются 12-14 мкм ок. в диаметре и имеют круглые ядра, которые являются однородными в хроматина композиции.
- Тип B сперматогониев являются 8-9μm ок. в диаметре и Rounг ядер, которые показывают более плотную гетерохроматина вдоль периферии ядра.
- Предварительно leptotene сперматоциты являются 7,5-8.2μm ок. в диаметре, имеют меньше цитоплазму, чем типа B сперматогониев, и имеют ядра, которые выглядят аналогичны типа B сперматогониев.
- Leptotene сперматоциты 8-10 мкм ок. в диаметре и имеют ядра, которые выглядят аналогичны предварительно leptotene сперматоцитах, но, кажется, чтобы получить больше плотный хроматин на ядерной мембране.
- Зиготены сперматоциты 10-12 мкм ок. в диаметре и имеют ядра, которые выглядят аналогичны leptotene первичных сперматоцитах.
- Пахитенных сперматоциты где-нибудь от 12-18 мкм ок. в диаметре и состоит из тонкого ободка цитоплазмы, окружающей большое ядро. Еще сгустки плотной хроматина можно увидеть в ядре.
- Круглые сперматиды являются 10 мкм ок. в диаметре и имеют круглую ядро с плотно-окрашивания хромоцентр в середине.
- Остаточныйтела ~ 6,5 мкм в диаметре, круглые, и не имеют ядро.
- Удлинения и конденсации сперматиды близки по размерам к круглой сперматиды, но имеют уникальную, серповидные ядро.
- Начните с фракцией 15 и анализировать каждые пять фракций до 85. Как правило, фракции ниже 15 будет слишком смешивают и массивный, и фракции, выше 85 будет содержать некоторые, чтобы не пригодных к использованию клеток.
- Для анализа фракцию, принимать 5UL жидкости из коллекции фракция трубки (один раз клетки были повторно суспендируют после центрифугирования) и добавить к 5UL 8% формальдегида в буфера Кребса. Разрешить фиксированные клетки сидеть при комнатной температуре в течение пяти минут.
- Добавить 5UL 0,1% Тритон и DAPI (5 μ / мл буфера Кребса) с фиксированными клетками. Разрешить клетки сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Поместите 10 мкл полученного раствора на слайд, накрыть покровным и анализировать с флуоресцентным микроскопом, чтобы определить чистоту каждой фракции.
- Объедините фракции, которые похожи по размеру и морфологии ядра (см. "Представитель результаты"), чтобы создать следующие популяции клеток: мейотические и соматические диплоидных клеток, круглые сперматиды и конденсационных / удлинения сперматиды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Идеальным результатом от процедуры СТА-PUT довольно заметно разделение клеток из яичек в зависимости от размера ячейки и плотности. В то время как клетки, выделенные из семенников которые седиментации через градиента BSA, несколько различных групп клеток можно наблюдать. Любые скопления клеток, как правило, опускаются на дно градиента и не будет загрязнять других фракций. Чуть дальше градиента будет большой соматические и мейоза клетки. Дальше до градиента по-прежнему будет более мелкие круглые сперматиды. В верхней части градиента будет конденсируется сперматиды, сперму и загрязняя эритроциты (это, кажется, маленькие круглые клетки без ядра).
Фракции могут быть проанализированы быстро, используя комбинацию света и флуоресцентной микроскопии (рис. 2) 15. Мейоза, сперматогонную, и соматические диплоидные клетки являются крупнейшими клетки, находящиеся в яичках и будет содержать большие ядра, что пятно отношений ТипыVely однородно с DAPI. Круглые сперматиды небольшие клетки с меньшими круглых ядер, вообще с ярко окрашивания хромоцентр. Конденсаторные / удлинения сперматиды небольшие клетки, которые часто выглядят продолговатые, как если бы маленький хвост формирования. Эти клетки имеют меньшие по площади компактные ядра, которые пятно ярко с DAPI и имеют форму серпа. После того, как клеточные фракции объединяют, чистота может быть дополнительно определен с помощью вестерн-блоттинга клеточных лизатов (рис. 3). Обычные маркеры мейоза клеток синаптонемного сложные белки 1 и SCP1 Sycp2 16. Общие маркеры конденсации сперматиды являются переходные белки (например ТР1) или протамины 17.
Хотя каждый СТА-PUT выполнения могут быть разными, как правило, мейотические клетки, сперматогониев и соматические диплоидные клетки будут найдены в долях CA. 25-40, круглые сперматиды в фракций ок. 55-65, и конденсации / удлинения сперматиды в долях CA.65-75 Ввиду меньшей разницы в размерах между соматическими / мейотических клеток и круглых сперматид, фракции ок. 45-50 часто имеют даже процент соматических / мейотических клеток и круглых сперматид. Окрашивание DAPI поможет отличить эти две популяции клеток. Существует меньше перекрытие круглого сперматиды и конденсации / удлинения сперматид фракции в связи с большим различием в размере между этими двумя популяциями клеток. Как правило, фракции ниже 15 будет содержать многие крупные скопления клеток и фракций выше 85 будет содержать несколько клеток и многие остаточные тела, или мембраносвязанное цитоплазму, которая пролитую сперматид.
Вообще, когда клетки из ~ 22 яичек фракционируют с процедурой СТА-PUT, он дает ок. 10 8 клеток / сперматогенеза типа клеток (мейоза / соматические диплоидные клетки, круглые сперматид, и конденсации / удлинения сперматид). Фракции, которые объединяются, чтобы создать окончательный популяцию клеток должна быть не менее80% чистоты для типа клетки идет речь. Если вы не видите эту степень чистоты или выше, может быть проблема с разделением клеток или градиента BSA. Кроме того, если есть несколько клеток в первые 20 фракций и обилие клеток в долях 80 +, или если есть обилие клеток в первые 20 фракций и вряд ли в долях 70 +, время оседания нуждается в дальнейшем оптимизированы. Пожалуйста, см. обсуждение для предложений о том, как снимать проблемы.
Рисунок 1. Настройка СТА-PUT Аппарат: схемы и фактической образ СТА-PUT аппарата показаны. Все изделия из стекла связано с тем, пластиковых труб, в том числе трубы, которая соединяет аппарат с коллектора фракций. Стрелки указывают расположение зажимов. А) Сотовый загрузочная камера, содержит мешалку, B) 2 л цилиндр для 2% BSA, содержит мешалку, С) 2 л цилиндр для 4% BSA, D) Седиментация камера; E) Stir пластины, F) перегородка;. G) Кран Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Клеточные популяции, полученные из STA-PUT: фракции объединяют в три отдельных популяций клеток: мейотические и соматических клеток, круглых сперматид и конденсации и удлинения сперматиды. Каждая популяция окрашивали DAPI, чтобы показать различия в ядерной размера и морфологии. Контрастность изображения Фаза передает различия в размерах клеток и формы. Белый бар составляет 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Маркеры различных клеточных популяций, полученных из STA-PUT: Весь клеточные экстракты были сделаны из каждой клеточной популяции, показанного на фиг.1 и вестерн-блот анализ проводили, чтобы показать различия экспрессии белка для каждой группы населения.. Синаптонемных сложный белок 1 (SCP1) представляет собой белок экспрессируется исключительно во время мейоза и находится обогащенный мейотических фракций, в то время как конденсации сперматиды фракция обогащена для перехода белка 1 (ТР1), белок, выразил в конце спермиогенеза. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Те, кто изучает сперматогенез полагаться на животных моделях для образцов сперматогенных клеток, как надежная система культуры клеток еще не существует для генерации всех типов сперматогенного клеток 3. Хотя сперматогенного клетки легко собраны из цельных яичек, приводит только смешанное население. Это создает проблему для тех, кто желает изучать конкретные подтипы этих клеток, такие как мейотических клеток, круглых сперматид и конденсационных сперматид. Три различные методы в настоящее время используются для разделения этих подтипов сперматогенных клеток: STA-PUT, FACS, и отмучивание 6-13. Последние два метода требуют доступа к дорогим единиц оборудования: сотовый сортировщик и элюент соответственно. Хотя метод СУИМ дает очень чистые населенности различных сперматогенных типов клеток, процесс занимает шесть часов и дает лишь 0,5-2,0 × 10 6 клеток на тип клеток на 2:58 яичек 11. Отмучиванием, как СТА-PUT метод, отделяет элементы на основе размера и плотности, но требует доступа к элюент, что дороже, чем СТА-PUT аппарата.
Процедура СТА-PUT использует простой градиент BSA отделить сперматогенного клетки разных размеров с достаточно высоким выходом (~ 10 8 клеток / населения на ~ 22 яичек). Относительно методов FACS, процедура СТА-PUT дает больше клеток / яичко и занимает гораздо меньше времени, чтобы отделить типы клеток. По сравнению с СУИМ и отмучиванием, процедура СТА-PUT является относительно простым и недорогим. СТА-PUT требует только холодный номер или большой холодильник и набор специализированных посуды, что делает его идеальным методом для лабораторий, не имеющих доступа к сортировщика клеток или элюент. Когда выполняется должным образом, СТА-PUT может обеспечить около 90% чистого население круглых сперматид или конденсации сперматид.
Метод СТА-PUT очень полезно, но требует оптимизации в несколько различных этапов, особенно секedimentation. Суб-оптимальное разделение типов клеток может быть вызвано несколькими различными проблемами, наиболее связанных с градиентом BSA. Чтобы сделать правильный градиент, включите перемешать баров в клетки загрузочной камеры и 2 л цилиндра держа 2% BSA в то время как вы создаете градиент. Также очистить все трубки пузырьков и поставить перегородку в месте в оседания камеры перед загрузкой клетки. Снижение скорости потока BSA в или из седиментационной камеры может помочь. Самое главное, что СТА-PUT Прибор не должен быть нарушен при создании градиента, седиментации, или сбора фракций.
Неоптимальная доходность клеток могут быть результатом недостаточного числа / размера яичек, недостаточное разделение клеток во время лечения коллагеназы / трипсин, и клеточной слипания. Если один не может получить необходимое количество клеток для этого протокола STA-PUT в связи с использованием новорожденных мышей или генотипов, которые производят небольшое количество сперматогенного челLs, это может быть необходимо использовать больше животных на STA-PUT или заказать СТА-PUT изделия из стекла комплект оптимизированный для небольших объемов и количества клеток (приобретается в ProScience) 18. Для получения оптимального количества клеток (700-800 млн.), использовать по крайней мере 11 самцов мышей репродуктивного возраста, в идеале, по крайней мере 8-9 недель. Тем не менее, не более 800 миллионов клеток должны быть загружены в один STA-PUT. Если клетки не диссоциируют в суспензии отдельных клеток после обработки трипсином, концентрация ДНКазы может быть увеличена до 1 мкг / 5 мл раствора. ДНКазы чувствителен повторить циклов замораживания / оттаивания, и с использованием свежих ДНКазы каждый раз приведет к более эффективной дисперсии канальцев в суспензии отдельных клеток. Можно использовать широким отверстием пипетку, чтобы помочь развалится клеточные скопления перед фильтрацией через сетку.
Один аспект способа STA-положить, что потребует оптимизации является количество времени клетки осесть через градиента BSA. Один часи 45 мин, как правило, работает хорошо, но на этот раз могут отличаться от лаборатории к лаборатории. Как правило, различные слои клеток можно увидеть визуально по всему градиенту BSA. Если есть несколько клеток в первые 20 фракций, собранных и обилие клеток в долях 80 +, время оседания возможно, должны быть расширены. Если слишком много клеток в первые 20 фракций, собранных и недостаточно разделение типов клеток, время осаждения возможно, должны быть снижены.
Клетки, полученные с процедурой STA-PUT может использоваться для многих различных типов экспериментов. СТА-PUT предоставляет обширный материал для Вестерн-блоттинга, иммунофлюоресценции и анализа РНК, хотя масштабные биохимия эксперименты могут потребовать объединения материал из нескольких различных трасс СТА-PUT. Когда отделены от других типов клеток, гаплоидные сперматиды можно культивировать и подвергали в лабораторных молекулярной манипуляции на срок до трех дней, что может быть проще, чем
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы. Этот протокол, демонстрируется предполагает использование лабораторных мышей и был казнен в соответствии со всеми соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Животные, используемые в настоящем протоколе ведутся под руководством и утверждения университета институционального комитета уходу и использованию животных Пенсильвании (IACUC протокол № 804284).
Acknowledgments
Это исследование было поддержано NIH гранты GM055360 к SLB и U54HD068157 к агр. JMB была поддержана T32 генетики подготовки Грант в Университете Пенсильвании (GM008216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
