Summary
Il metodo STA-PUT consente la separazione delle diverse popolazioni di cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e densità.
Abstract
Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli. Attualmente, non esiste un sistema di coltura cellulare affidabile consentendo differenziazione spermatogenesi in vitro, e la maggior parte degli studi biologici di cellule spermatogenesi richiedono raccolta dei tessuti da modelli animali come il topo e nel ratto. Poiché il testicolo contiene numerosi tipi di cellule - sia non spermatogenesi (Leydig, Sertoli, mieloidi e cellule epiteliali) e spermatogenesi (spermatogoni, spermatociti, spermatidi rotondi, a condensazione spermatidi e spermatozoi) - Studi dei meccanismi biologici coinvolti nella spermatogenesi richiedono l'isolamento e arricchimento di questi tipi di cellule differenti. Il metodo STA-PUT consente la separazione di una popolazione eterogenea di cellule - in questo caso, dai testicoli - attraverso un gradiente lineare BSA. Tipi di cellule individuali sedimentano con velocità di sedimentazione diversa a seconda cedimensioni ll, e le frazioni arricchito da diversi tipi di cellule possono essere raccolti e utilizzati in ulteriori analisi. Mentre il metodo STA-PUT non comporta frazioni altamente puri di tipi di cellule, ad esempio come possono essere ottenuti con determinati metodi di separazione delle cellule, esso fornisce un rendimento molto più elevato di cellule totali in ogni frazione
(~ 1 x 10 8 cellule / tipo di cellula spermatogenesi da una popolazione iniziale di 7-8 x 10 8 cellule). Questo metodo alto rendimento richiede solo vetreria specializzata e può essere eseguita in qualsiasi ambiente freddo o grande frigorifero, che lo rende un metodo ideale per i laboratori che hanno accesso limitato alle attrezzature specializzate come una fluorescenza attivato cell sorter (FACS) o elutriator.
Introduction
Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli 1. In breve, staminali come gli spermatogoni che risiedono vicino l'epitelio del tubulo seminifero divide e differenziarsi in spermatociti, che poi subiscono le divisioni meiotica. Dopo meiosi è completa, le cellule aploidi risultante o spermatidi rotondi, subiscono spermiogenesi, un processo di differenziazione che coinvolge lo spargimento del citoplasma e compattazione del nucleo. Spermatidi gradualmente sviluppano un flagello e subiscono l'allungamento e la condensazione del nucleo, producendo allungamento e poi a condensazione spermatidi, rispettivamente. I prodotti finali sono spermatozoi, che vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero e infine nella epididimo dove maturano ulteriormente.
Poiché il processo di spermatogenesi basa su condizioni ormonali e molecolari specialitesticoli, un sistema affidabile coltura in vitro per l'intero processo di spermatogenesi non è ancora stato sviluppato 2,3. Metodi di coltura sono stati sviluppati per la creazione di "cellule germinali primordiali come cellule" e, "le cellule spermatidi-come rotonde" aploidi da cellule staminali, ma questi metodi non sono ancora in grado di generare un gran numero di queste cellule e non riescono a produrre più tardi cellule spermatogenesi Tipi 4,5. Fortunatamente, i tipi cellulari spermatogenici differenze significative delle dimensioni, che consente una cella singola sospensione ottenuta da testicoli interi da separare con un gradiente liquido. Il metodo STA-PUT, ha dimostrato qui, usa un gradiente BSA lineare e semplice sedimentazione per separare le cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e massa 6-9.
Il metodo STA-PUT ha diversi vantaggi rispetto agli altri due metodi più utilizzati per separare i tipi di cellule spermatogenesi: FACS e elutriazione 10-13. L'apparato STA-PUT richiede only diversi pezzi di cristalleria specializzati riuniti in una stanza fredda o grande frigorifero. Pertanto, è meno costoso rispetto all'utilizzo di un cell sorter o un elutriator. Il metodo STA-PUT produce una maggiore quantità di cellule per tipo di cellula e testicolo che possono essere ordinati per FACS in un arco di tempo comparabile, sebbene la purezza di ciascuna popolazione cellulare non è così elevata come quelli ottenuti con FACS 11. Cell sorting utilizzando biglie magnetiche (magnetico cell sorting attivato, MACS) è stato recentemente impiegato con successo per l'arricchimento di spermatogoni da una popolazione di cellule testicolari mista, ma è attualmente inadatto per separare spermatociti e spermatidi a causa della mancanza di conoscenza della superficie adeguatamente i marcatori 14. Un ulteriore vantaggio del metodo STA-PUT su FACS o MACS è la capacità di isolare cellule vitali adatto a cultura successiva perché, contrariamente alla maggior parte dei protocolli FACS, non richiede alcun DNA o altri tipi di colorazione. Per gli studi che richiedono lrendimenti arge di spermatogenesi tipi di cellule al ~ 90% di purezza, la STA-PUT è un metodo ideale.
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Protocol
Il protocollo STA-PUT prevede tre fasi: 1) Messa a punto di apparecchi e reagenti, 2) Preparazione della sospensione di cellule dai testicoli intere, e 3) il carico delle cellule, la sedimentazione, e la raccolta di frazioni. Quando è eseguita da un team di due ricercatori, il protocollo vogliono otto ore in media.
1. Impostazione del Apparatus STA-PUT (Figura 1)
*** Apparecchi STA-PUT deve essere posto in un 4 ° C grande frigorifero o una cella che può ospitare anche un raccoglitore di frazioni, se si preferisce che metodo di raccolta.
- La sera prima (o almeno un paio d'ore prima) di eseguire il metodo, lavare tutte le attrezzature (in particolare il vetro e tubi) e sterilizzare con il 70% di etanolo. Lasciare apparecchiatura asciutto completamente prima di assemblare l'apparecchiatura come illustrato in Figura 1.
- Fissare i due cilindri 2 L (Figure 1B e C) e la camera di carico cella (
- Mettere una piccola ancoretta nella camera di caricamento cella (Figura 1A) e una ancoretta maggiore nel 2 L cilindro più a sinistra (Figura 1B) che conterrà il BSA 2%.
- Posizionare la camera di sedimentazione 2 L sulla piattaforma (Figura 1D). Posizionare il deflettore metallico (Figura 1F) direttamente sopra l'apertura nella parte inferiore della camera di sedimentazione (Figura 1D). Questo è fondamentale, come il deflettore evita vortex del liquido e la rottura del gradiente cella durante la raccolta delle frazioni. Mettere il coperchio sulla parte superiore della camera di sedimentazione.
- Dopo l'applicazione di una piccola quantità di grasso per vuoto a giunto smerigliato del rubinetto a tre vie (figura 1G), fissare il rubinetto sul fondo della SECamera dimentation, collegando i giunti a smeriglio del rubinetto e la camera di sedimentazione.
- Collegare la camera a cella di carico (Figura 1A) a destra all'uscita del rubinetto con la tubazione. Chiudere il rubinetto.
- Collegare il tubo frazionamento cellulare alla presa sinistra del rubinetto. Il tubo frazionamento comprende un pezzo di tubo con una pipetta Pasteur di vetro collegato all'estremità aperta. Un pezzo di tubo di diametro inferiore è attaccato alla estremità più stretta della pipetta di vetro. La pipetta stretta limita il flusso della sospensione cellulare durante frazione raccolta. Bloccare questo piccolo tubo nella parte inferiore.
- Preparare 2 L Krebs (1x) tamponare il giorno dell'esperimento (Tabella 1). Poi, preparare 550 ml 2% BSA in 1x Krebs, 550 ml 4% BSA in 1x Krebs, e 50 ml 0,5% BSA in 1x Krebs. Filtrare e raffreddare queste soluzioni a 4 ° C.
- Versare la soluzione BSA 4% nel cilindro L right 2 (Figura 1C) e il 2% BSAsoluzione in sinistra 2 L cilindro (Figura 1B). Assicurarsi che non ci sono grandi bolle nel tubo che collega questi cilindri.
- Versare tampone Krebs nella camera di caricamento delle cellule e riempire il tubo che collega questa camera con la camera di sedimentazione, assicurandosi che non ci siano grandi bolle, in quanto questi potrebbero disturbare il gradiente. Spremitura o sfogliando il tubo aiuta delicatamente per rimuovere le bolle. Assicurarsi che tutto il tampone Krebs è nel tubo e non nella camera di cella.
- Lasciare una piccola quantità di tampone Krebs di fluire nella camera di sedimentazione e poi drenare quasi tutto il tampone nel tubo frazionamento cellulare per riempire il tubo e rimuovere eventuali bolle grandi.
- Collocare il raccoglitore di frazioni direttamente sotto la camera di sedimentazione. Assicurarsi che tutti i tubi frazione sono a posto e coperti con pellicola trasparente per evitare la contaminazione.
2. Isolare le cellule della spermatogenesi da Testicoli interi
3. Cella di carico e sedimentazione
- Assicurarsi che il rubinetto è chiuso, ma nella posizione che permetterà liquido di fluire dalla camera di cella (Figura 1A) nella camera di sedimentazione (Figura 1D).
- Girare entrambe le piastre ancoretta a un livello basso (circa 70 giri) per consentire le barre stir di muoversi continuamente, ma lentamente.
- Versare la sospensione cellulare nella camera di cella (Figura 1A) e aprire il rubinetto in modo che le cellule fluire lentamente nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min (Figura 1D). Chiudere il rubinetto. Portata può essere determinata marcatura intervalli volume sulla camera di sedimentazione.
- Versare 5 ml di soluzione di BSA 0,5% nella camera di cella e di scarico nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min. Chiudere il rubinetto. Questo passaggio lavare le cellule dalla camera di cella. Ripetere 4x.
- Preparare il gradiente: Aprire i ganci tra la camera a cella (Figura 1A) e le due cilindri 2 L (Figura 1B e C), e cominciare a drenare il liquido nella camera di sedimentazione ad una velocità di 40 ml / min (Figura 1D) immediatamente. Regolare la portata in modo che richiede circa 20-30 min per caricare il gradiente BSA nella camera di sedimentazione. Un sottile strato di cellule indisturbato situata sulla cima delBSA gradiente dovrebbe essere visibile. Una volta caricata la maggior parte della BSA, chiudere il rubinetto e girarlo nella posizione che vi permetterà di drenare il liquido dalla camera di sedimentazione nel tubo di frazionamento.
- Spegnere le piastre mescolare.
- Permettono alle cellule di sedimentare per un'ora e 45 minuti. NON DISTURBARE 'APPARECCHIO durante questo tempo. Qualsiasi agitazione meccanica potrebbe disturbare il gradiente.
4. Frazionamento e analisi delle frazioni
*** Come si eseguono le seguenti operazioni, fare attenzione a non disturbare il gradiente. Se il gradiente BSA è disturbato, la procedura non funzionerà!
- Una volta che le cellule si sedimentano, drenare lentamente 50 ml dalla camera di sedimentazione in una provetta da 50 ml e mettere da parte. Questa frazione di solito contiene grumi indesiderati di cellule e detriti.
- Collegare il tubo frazione al collettore di frazioni. *** E 'anche possibile raccogliere frazioni da parte se un colle frazionector non è disponibile.
- Raccogliere frazioni: Regolare il flusso con il rubinetto in modo che 10 ml (riempimento un tubo di raccolta) sono raccolti ogni 45 sec.
- Tappare i tubi di raccolta frazione e girare per 5 minuti a 450 rcf a 4 ° C. Versare il surnatante delicatamente, risospendere le cellule in un liquido rimanente e mantenere le cellule in ghiaccio.
- Una volta che tutte le frazioni vengono raccolte, microscopicamente analizzare le frazioni di diverse popolazioni cellulari. Diversi tipi di cellule possono essere distinti in base alle dimensioni e la morfologia cellulare nucleare 8,15. Figura 2 illustra "risultati rappresentativi" per le tre frazioni raccolte che si arricchiscono per celle (a) e somatiche meiotiche e spermatogoni, (b) spermatidi rotondi, e (c) allungamento e condensazione spermatidi.
- Tipo A spermatogoni sono 12-14μm ca. di diametro e hanno nuclei rotondi che sono omogenea composizione cromatina.
- Tipo B spermatogoni sono 8-9μm ca. di diametro e hanno ROUNd nuclei che mostrano più denso eterocromatina lungo la periferia nucleare.
- Spermatociti Pre-leptotene sono 7.5-8.2μm ca. di diametro, hanno meno citoplasma di tipo B spermatogoni, e hanno nuclei che sembrano simili a quelle di tipo B spermatogoni.
- Spermatociti primari leptotene sono 8-10 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti pre-leptotene, ma sembrano avere più denso cromatina a livello della membrana nucleare.
- Zigotene spermatociti primari sono 10-12 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti primari leptotene.
- Spermatociti pachitene sono ovunque 12-18 micron ca. di diametro e sono costituiti da un sottile bordo di citoplasma che circonda un nucleo di grandi dimensioni. Altre macchie di denso cromatina può essere visto nel nucleo.
- Spermatidi rotondi sono 10 micron ca. di diametro e hanno un nucleo rotondo con chromocenter densamente colorazione nel mezzo.
- Residuocorpi sono ~ 6.5 micron di diametro, sono rotondi, e mancano di un nucleo.
- Allungamento e condensazione spermatidi sono simili per dimensioni a arrotondare spermatidi, ma hanno un unico nucleo a forma di falce.
- Inizia con frazione di 15, e analizzare ogni cinque frazioni fino a 85. Di solito, le frazioni inferiori a 15 saranno troppo misto e disomogeneo, e le frazioni superiori a 85 conterranno pochi a nessun cellule utilizzabili.
- Per analizzare una frazione, prendere 5UL di liquido dal tubo di raccolta delle frazioni (volta che le cellule sono state risospese dopo centrifugazione) e aggiungere 5UL dell'8% formaldeide in tampone Krebs. Lasciare le cellule fissate a riposare a temperatura ambiente per cinque minuti.
- Aggiungere 5UL del 0,1% Triton e DAPI (5 μ / ml tampone Krebs) alle cellule fisse. Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per 5 min.
- Trasferire 10 microlitri della soluzione risultante su un vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto e analizzare con un microscopio a fluorescenza per determinare la purezza di ciascuna frazione.
- Unire le frazioni che sono simili per dimensioni e morfologia nucleare (vedi "Rappresentante dei risultati") per creare le seguenti popolazioni di cellule: cellule diploidi meiotiche e somatiche, spermatidi rotondi e condensazione / allungamento spermatidi.
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Representative Results
Il risultato ideale dalla procedura STA-PUT è abbastanza evidente separazione di cellule dai testicoli in base alle dimensioni e la densità delle cellule. Mentre le cellule isolate da testicoli sono sedimenta attraverso il gradiente BSA, si possono osservare diverse bande distinte di cellule. Eventuali grumi di cellule tendono a depositarsi sul fondo del gradiente e non contaminare le altre frazioni. Un po 'più in alto il gradiente sarà il grande somatiche e le cellule meiotico. Più in alto il gradiente sarà ancora spermatidi rotondi più piccoli. Nella parte superiore del gradiente verrà condensato spermatidi, spermatozoi e contaminando globuli rossi (questi sembrano essere cellule rotonde piccole senza nucleo).
Le frazioni possono essere analizzati rapidamente usando una combinazione di luce e microscopia a fluorescenza (Figura 2) 15. Meiotica, spermatogoni, e le cellule somatiche diploidi sono le più grandi cellule trovate nei testicoli e conterrà le grandi nuclei quella macchia relazionvamente omogeneo con DAPI. Spermatidi rotondi sono cellule più piccole con nuclei rotondi più piccoli, in genere con una colorazione chromocenter brillantemente. Di condensazione / allungamento spermatidi sono piccole cellule che spesso sembrano oblunga, come se una piccola coda si sta formando. Queste cellule hanno più piccoli, nuclei compatti che macchiano brillantemente con DAPI e sono a forma di una falce. Una volta frazioni cellulari sono combinati, la purezza può essere ulteriormente determinato mediante analisi Western blot di lisati cellulari (Figura 3). Marcatori comuni di cellule meiotiche sono i complessi 1 synaptonemal proteine SCP1 e Sycp2 16. Indicatori comuni di condensazione spermatidi sono proteine di transizione (ad esempio TP1) o protamine 17.
Anche se ogni run STA-PUT può essere diverso, le cellule di solito meiotiche, spermatogoni e cellule somatiche diploidi saranno trovati in frazioni ca. 25-40, spermatidi rotondi in frazioni di ca. 55-65, e condensazione / allungamento spermatidi in frazioni ca.65-75 A causa di una minore differenza di dimensioni tra le cellule meiotiche / somatiche e spermatidi rotondi, frazioni ca. 45-50 hanno spesso ancor percentuale di cellule meiotiche / somatiche e spermatidi rotondi. Colorazione con DAPI aiuterà a distinguere queste due popolazioni di cellule. C'è meno sovrapposizione della spermatidi rotondi e condensazione / allungamento frazioni spermatidi a causa della differenza di dimensioni tra queste due popolazioni di cellule. Di solito, le frazioni inferiori a 15 contengono molte grandi grumi di cellule e delle frazioni sopra 85 contiene poche cellule e molti corpi residui, o citoplasma di membrana che è sparso da spermatidi.
In genere, quando le cellule da ~ 22 testicoli sono frazionati con la procedura di STA-PUT, produce ca. 8 10 cellule / tipo spermatogenesi cellule (cellule meiotiche / somatiche diploidi, spermatidi rotondi, e condensazione / allungamento spermatidi). Le frazioni che vengono combinati per creare la popolazione totale di cellule devono essere almeno80% puro per il tipo di cellula in questione. Se non vedi questo grado di purezza o superiore, potrebbe esserci un problema con la separazione delle cellule o la sfumatura BSA. Inoltre, se ci sono poche cellule nei primi 20 frazioni e un'abbondanza di cellule in frazioni 80 +, o se vi è un'abbondanza di cellule nelle prime 20 frazioni e pochissima in frazioni 70 +, il tempo di sedimentazione deve essere ulteriormente ottimizzato. Si prega di consultare la discussione per suggerimenti su come disturbare il tiro.
Figura 1. Impostazione del Apparatus STA-PUT: Un'immagine schematica ed effettiva dell'apparato STA-PUT sono presenti. Tutta la vetreria è collegato con un tubo in plastica, compreso il tubo che collega l'apparecchio al collettore di frazioni. Le frecce indicano la posizione dei morsetti. A) camera di cella di carico, contiene una ancoretta, B) cilindro 2 L per il 2% BSA, contiene una ancoretta, C) 2 cilindro L per il 4% BSA, D) camera di sedimentazione, E) piatti saltati, F) deflettore,. G) Rubinetto Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Popolazioni cellulari ottenute dalla STA-PUT: Frazioni sono stati combinati in tre popolazioni separate di cellule: cellule meiotiche e somatiche, spermatidi rotondi e condensazione e allungando spermatidi. Ogni popolazione è macchiato con DAPI per mostrare le differenze in termini di dimensioni e morfologia nucleare. Fase di imaging contrasto trasmette differenze nelle dimensioni delle cellule e forma. Barra bianca rappresenta il 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Marcatori di diverse popolazioni cellulari ottenute dalla STA-PUT: estratti cellulari totali sono stati fatti da ciascuna popolazione cellulare mostrato in Figura 1 e western blot è stata eseguita per mostrare le differenze di espressione proteica per ogni popolazione.. Synaptonemal complesso proteina 1 (SCP1) è una proteina espressa esclusivamente durante la meiosi e si trova arricchito nelle frazioni meiotiche, mentre la frazione spermatide condensazione è arricchito di proteine di transizione 1 (TP1), una proteina espressa nel tardo spermiogenesi. Clicca qui per ingrandire immagine .
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Discussion
Coloro che studiano la spermatogenesi si basano su modelli animali per i campioni di cellule spermatogenesi, come un sistema di coltura cellulare affidabile non esiste ancora per generare tutti i tipi cellulari spermatogeniche 3. Anche se le cellule spermatogenesi sono prontamente raccolti dai testicoli intere, solo una popolazione mista risultati. Questo pone un problema per coloro che desiderano studiare specifici sottotipi di queste cellule, come le cellule meiotiche, spermatidi rotondi e spermatidi condensazione. Tre diversi metodi attualmente utilizzati per separare questi sottotipi di cellule spermatogenesi: STA-PUT, FACS, e elutriation 6-13. Gli ultimi due metodi richiedono l'accesso a costosi pezzi di attrezzature: un cell sorter e elutriator, rispettivamente. Sebbene il metodo FACS produce popolazioni altamente puri dei diversi tipi di cellule spermatogenesi, il processo richiede sei ore e produce solo 0,5-2,0 x 10 6 cellule per tipo cellulare per 2-3 testicoli 11. Elutriazione, come il meth STA-PUTod, separa le cellule in base alle dimensioni e densità, ma richiede l'accesso a un elutriator, che è più costoso l'apparato STA-PUT.
La procedura STA-PUT utilizza un semplice gradiente BSA per separare le cellule spermatogenesi di diverse dimensioni con una resa piuttosto elevata (~ 10 8 cellule / popolazione per ~ 22 testicoli). Relativa ai metodi FACS, la procedura STA-PUT produce più cellule / testicolo e richiede molto meno tempo per separare tipi cellulari. Rispetto al FACS e elutriazione, la procedura STA-PUT è relativamente semplice e poco costoso. La STA-PUT richiede solo una stanza fredda o grande frigorifero e un set di vetreria specializzata, che lo rende un metodo ideale per laboratori senza accesso a un cell sorter o elutriator. Se eseguita correttamente, la STA-PUT in grado di fornire una popolazione di circa il 90% pura spermatidi rotondi o spermatidi condensazione.
Il metodo STA-PUT è molto utile, ma richiede l'ottimizzazione in diversi passaggi differenti, specialmente sedimentation. Separazione subottimale di tipi di cellule può essere causato da diversi problemi diversi, più relative al gradiente BSA. Per effettuare una corretta sfumatura, attivare le barre scalpore nella camera di caricamento cellulare e il cilindro 2 L tiene la BSA 2%, mentre si sta creando il gradiente. Cancellare anche tutti i tubi di bolle e mettere il deflettore posto nella camera di sedimentazione prima di caricare le cellule. Riducendo la portata della BSA o in uscita dalla camera di sedimentazione può aiutare. Soprattutto, l'apparato STA-PUT non deve essere disturbato durante la creazione del gradiente, sedimentazione, o raccolta di frazioni.
Sub-ottimale rendimento cellulari possono essere il risultato di un insufficiente numero / dimensione dei testicoli, la separazione delle cellule inadeguata durante il trattamento collagenasi / tripsina e aggregazione delle cellule. Se uno è in grado di ottenere un numero adeguato di cellule per questo protocollo STA-PUT a causa dell'uso di topi neonati o genotipi che producono un piccolo numero di cel spermatogenesils, può essere necessario utilizzare più animali per STA-PUT o per ordinare un kit STA-PUT vetreria ottimizzato per minori volumi e il numero di cellule (disponibile da ProScience) 18. Per ottenere un numero ottimale di cellule (700-800,000,000), utilizzare almeno 11 topi maschi in età riproduttiva, idealmente almeno 8-9 settimane. Tuttavia, non più di 800 milioni di cellule devono essere caricati in una STA-PUT. Se le cellule non sono dissociate in una sospensione di cellule singole dopo trattamento con tripsina, la concentrazione DNAsi può essere aumentata fino a 1 mg / 5 ml di soluzione. DNAsi è sensibile ripetere cicli di congelamento / scongelamento, e utilizzando DNAsi fresco ogni volta si tradurrà in una dispersione più efficace di tubuli in una sospensione di cellule singole. Si può utilizzare una vasta pipetta foro per aiutare spezzare grumi di cellule prima di filtrare attraverso la rete.
Un aspetto del metodo STA-PUT che richiederà ottimizzazione è la quantità di tempo le cellule possono sedimentare tramite il gradiente BSA. Un'orae 45 min di solito funziona bene, ma questo tempo può variare da laboratorio a laboratorio. Solitamente, diversi strati di cellule può essere visto visivamente tutto il gradiente BSA. Se ci sono poche cellule nei primi 20 frazioni raccolte e l'abbondanza di cellule in frazioni di 80 +, il tempo di sedimentazione può avere bisogno di essere esteso. Se ci sono troppe cellule nelle prime 20 frazioni raccolte e vi sia una sufficiente separazione di tipi cellulari, il tempo di sedimentazione può essere necessario abbassare.
Le cellule acquisiti con la procedura STA-PUT possono essere utilizzati per diversi tipi di esperimenti. La STA-PUT fornisce ampio materiale per l'analisi Western Blot, immunofluorescenza e analisi di RNA, anche se gli esperimenti biochimici su larga scala possono richiedere la combinazione di materiale da diverse diverse piste STA-PUT. Quando separato da altri tipi di cellule, spermatidi aploidi possono essere coltivate e sottoposte a manipolazione molecolare in vitro fino a tre giorni, che può essere più facile che
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo protocollo essendo dimostrato prevede l'utilizzo di topi di laboratorio ed è stata eseguita in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Animali utilizzati in questo protocollo sono mantenuti sotto la guida e l'approvazione della University of Pennsylvania Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (protocollo IACUC # 804284).
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH GM055360 per SLB e U54HD068157 di RGM. JMB è stata sostenuta dal T32 Genetica formazione di Grant presso l'Università della Pennsylvania (GM008216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
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