Tibial nerve transection - en standardisert modell for denervation-indusert skjelettmuskulatur Atrofi i Mus

Summary

Den tibial nerve transection modellen er et godt tolerert, validert, og reproduserbar modell av skjelettmuskulatur atrofi. Modellen kirurgisk protokollen er beskrevet og vist i C57Black6 mus.

Abstract

Den tibial nerve transection modellen er et godt tolerert, validert, og reproduserbar modell av denervation-indusert skjelettmuskulatur atrofi hos gnagere. Selv opprinnelig utviklet og brukt i stor utstrekning i rotte på grunn av sin større størrelse, er den tibial nerve hos mus stor nok til at det lett kan manipuleres med enten knuse eller transection, forlater peroneal og Sural nerve grener av isjiasnerven intakt og dermed bevare sine mål muskler. Dermed tilbyr denne modellen fordelene ved å indusere mindre sykelighet og hindring av førlighet enn isjiasnerven transection modell og også tillater etterforskere å studere fysiologiske, cellulært og molekylært biologiske mekanismene som regulerer prosessen med muskel atrofi i genmanipulerte mus. Den tibial nerve forsyner gastrocnemius, soleus og plantaris muskler, så det transection tillater studier av denerveres skjelettmuskulatur består av raske rykk type II fibre og / eller langsomme type Ifibre. Her kan vi demonstrere tibial nerve transection modell i C57Black6 mus. Vi vurdere atrofi av gastrocnemiusmuskelen, som en representant muskel, ved 1, 2 og 4 uker post-denervering ved å måle muskel vekter og fibertype spesifikk tverrsnittsareal på parafininnstøpte histologiske seksjoner immunostained for raske rykk myosin.

Introduction

Skjelettmuskulatur denervering, på grunn av traumatisk perifer nerveskade, sykdom eller farmakologisk intervensjon, resulterer i øyeblikkelig tap av muskel frivillig kontraktil funksjon. Muscle begynner samtidig å bli svekket og dette atrofi er reversibel hvis tidsriktig, god kvalitet reinnervation oppstår ^1,2. I fravær av reinnervation, utvikler myofiber atrofi, og irreversible biologiske endringer i muskel oppstå med muskel fibrose og myofiber død. Her har vi demonstrere den tibiale nerve transection-modellen, en modell av denervering-indusert skjelettmuskel atrofi og fibrose, i mus. Denne modellen gjør det mulig for forskere å studere fysiologiske, cellulært og molekylært biologiske mekanismene som ligger bak muskelatrofi in vivo i gastrocnemius og soleus muskler. Mens historisk brukt hovedsakelig i rotter, gir nyere anvendelse av denne modellen til knockout og transgene mus linjer spesielt, etterforskere for å vurdere rollen sinbestemt protein (er) av interesse i induksjon, utvikling og vedlikehold, eller alternativt oppløsningen av, muskelatrofi og fibrose in vivo.

Den tibial nerven er en blandet sensorisk-motorisk perifere nerve i gnager med bakbena, og er en av de tre terminale grener av isjiasnerven. Transection av tibial nerve denervates gastrocnemius, soleus og plantaris muskler (og de ​​tre små dype flexor musklene i foten, inkludert tibialis posterior, flexor digitorum longus og flexor hallicus longus), og er et godt standardisert og validert modell hos rotter ^3,4 . Gastrocnemius og soleus muskler kan lett dissekert på serielle tidspunkter legge tibial nerve transection, fast og behandlet for vurdering av muskel histologi og muskel fiber morphometrics, eller flash frosset for utvinning av muskel RNA og protein for å studere, for eksempel, mobilnettet signalering nettverk som regulerer muskelatrofi. Den gastrocnemius muskelen er en blandet fibertype muskel (type I og type II, selv om overveiende type II) og soleus muskel er sammensatt av en stor andel av type I-fibrene, og derved gir både hurtig og langsom rykk muskel for vurdering ^5,6. Den tibial nerve transection modellen er egnet for å studere prosessen med denervation-indusert muskelatrofi både på kort sikt (dager) ⁷ og lang sikt (uker til måneder) ^4,8.

I motsetning til den isjiasnerven transection modell (en andre modell av denervering-indusert muskelatrofi vanligvis brukes i gnagere), induserer tibial nerve transection mindre sykelighet i dyret, noe som gjør det til en mer attraktiv modell. Transection av isjiasnerven denervates alle musklene i bena (under kneet) og foten, svekke dyrets evne til å ambulate ^2, mens transection av tibial nerve forlater peroneal og Sural nerve grener av isjiasnerven intakt, og dermed bevaresine mål muskler og sensoriske territorier. I mus er ute av stand til plantar bøye eller invertsukker foten, men er i stand til å ambulate lett og bærer vekten likt på begge bakben derved vesentlig å forringe sykelighet av modellen. Ganglag analyse studier som evaluerte gåmønstre er utført i rotter etter tibial og isjiasnerven skader og vise at fotavtrykk og vektbærende er bedre bevart med tibial skade ^9,10. I tillegg, i den tibiale nerve transection modellen, kan peroneal nerve blir mobilisert på et senere tidspunkt og overføres som en kilde til forsinket reinnervation, hvis studiedesignet krever ^tre. I kontrast, nødvendiggjør forsinket reinnervation i hoftenervene transection modell ved bruk av en nerve pode på isjiasnerven underskudd, meget kraftig opp på tekniske problemer av modellen og å begrense bruken til dyktige kirurger.

Mens tibial nerve transection modell requires kjennskap til operatøren med steril operative teknikk i dyr kirurgi, både tibial nerve og kalv muskler den Innerverer er lett tilgjengelige og identifiserbare for manipulasjon, slik at personer som ikke er kirurger, eller lang erfaring med dyr kirurgi, kan lett mestre denne modellen .

Protocol

Før du bruker denne modellen, må etterforskere har fått godkjent den kirurgiske protokoll fra sine institusjonens dyr bruk styrende organ. Modellen er godkjent av Forskningsetisk Board, Hamilton Health Sciences Corporation, McMaster University (AUP # 10-04-24) og er utført i henhold til anbefalingene fra den kanadiske Council on Animal Care.

En. Mus Forberedelse

1. Vei musen. Indusere anestesi med 5% isofluran eller 2% halothane. Kretsen som brukes bør sikre tilstrekkelig fjernere av anestesien for å beskytte kirurgen. Etter 2-3 min dyrets åndedrett vil avta. Sikre blunkerefleksen er fraværende og klemme interdigitale mellomrom i labben for å bekrefte kirurgisk anestesi (dvs. ingen reaksjon fra mus). Påfør oftalmisk smøremiddel for øyet, for å hindre uttørking av hornhinnen i løpet av operasjonen.
2. Barbere lateral lår og rumpeballe fra sciatichakk til kneet og desinfisere med proviodine. Barbering vil holde stedet av snittet hårfri å sikre tilstrekkelig visualisering av operasjonsområdet og minimere interferens med nerve disseksjon og transection. Den isjiasnerven hakk, som er overlegen og posterior til femur, kan identifiseres ved palpasjon.

2. Operativ Prosedyre

1. Reduser inhalasjon isofluran til 2% (halothane 1%) og plasserer musen på sin side (side ment for kirurgi vendt opp), under en drift eller dissekere mikroskop. Alternativt kirurgi kan utføres med kirurgiske luper siden 3.5x forstørrelse er tilfredsstillende for en voksen (20-25 g) mus.
2. Don sterile hansker. Identifiser sciatic hakk ved palpasjon. Ved hjelp av en skalpell, incise huden av lateral lår fra sciatic hakk til kneet (ca. 1 cm).
3. Forsiktig spre huden. Identifiser biceps femoris muskelen, som er den flat overfladisk muskel av lateral lårumiddelbart under huden. Ved hjelp av gode saks, splitte biceps femoris muskelen langs muskelfibre og holder åpent med en fjær retractor å avsløre isjiasnerven og dets grener.
4. Identifiser isjiasnerven umiddelbart dypt til biceps femoris muskelen. Den kan bli identifisert ved sin karakteristiske skinnende hvit farge og er omtrent 0,8 mm i diameter. Det går fra sciatic hakk til kneet, forgrening inn i tibial, peroneal og Sural nerver på nivå med popliteal fossa.
5. Forsiktig skille tibial fra peroneal og Sural nerve grener med ultrafine tang og våren microdissecting saks. Den tibial nerve er den største gren og er vanligvis sentral. Det er viktig ikke å knuse nerve mens skille grenene. Holder nerve bare på ytre adventicial lag med ultrafine tang, og holde nerve slakk (ikke undervist), vil unngå nerve knuse og trekkraft skade.
6. For komplett og varig denervatipå, kutt tibial nerve med microdissecting saks som distalt som mulig, nøye unngå knehasecyste fartøy. Alternativt, for midlertidig denervation med forventet komplett reinnervation i 2-4 uker, kan den tibial nerve rett og slett bli knust med ultrafine tang for 15 sek i stedet for transektert. (Perifere nerver gjenvekst etter skade og vil reinnervate målet muskel.)
7. Dersom fullstendig denervering er nødvendig, sutur enden av transektert nerve til tibiale den fremre overflate av biceps femoris muskelen med 10-0 nylon og re-omtrentlig biceps femoris med 5-0 Vicryl å forhindre avvikende re-innervasjon av gastrocnemius og soleus muskler.
8. Lukk huden med en løpende 5-0 Vicryl sutur.

3. Postoperativ Care

1. Slå av inhalasjonsanestetikumet men opprettholde flyten av oksygen. Administrer buprinorphine (eller erstatning) smertestillende subkutant.
2. Overfør musen til et rent bur med ingensengetøy mens oppvåkning fra anestesi. Hold på en varmende teppe i buret og under direkte observasjon inntil ambulating.
3. Overføring og hus i bløt bunn bur (ikke ledning) med rikelig myk sengetøy.
4. Inspiser opererte kneet daglig for tilstanden til operasjonssåret og foten for utvikling av liggesår hæl sår eller tegn på å tygge. Mindre problemer kan behandles med aktuelle antibiotika eller antiseptika som proviodine. Endpoint indikatorer som krever dyr dødshjelp er vekttap, bevis på dårlig egenomsorg (ruffled pels), og krum holdning. I tillegg bør dyr med store sår avbrudd eller sår som ikke leges 1-2 uker med aktuelle antibiotika eller synes å ha smerte ofres.

4. Denerveres Gastrocnemius og Soleus Muscle Harvests

1. På den postoperative tidspunkt ønsket, veie musen og offer med CO ₂ overdose.
2. Barbere den mediale aspekt av bådeoperativt og kontralaterale kontroll beina og ren med alkohol. Plasser musen under en drift eller dissekere mikroskop, eller alternativt bruke kirurgisk visning luper for forstørrelse.
3. På den opererte kneet, incise den mediale kalveskinn med en skalpell fra ankelen til kneet og omkretsen rundt ankelen. Trekk forsiktig huden med tang utenfor muskel og proximally mot låret. Dette utsetter alle musklene i leggen. Identifiser gastrocnemiusmuskelen, som er den Leggmuskelen som går fra kneet til ankelen på bakre del av leggen og ligger umiddelbart under huden. Identifiser distale innsetting av biceps femoris muskelen, proksimal til den gastrocnemiusmuskelen på den mediale aspektet av kneet. På sitt distale innsetting av biceps femoris vises tynn og filmy og ligger over den mest proksimale delen av gastrocnemius. Ved hjelp av saks og butte enden disseksjon, forsiktig skille distale innsetting av biceps femoris fra gassentrocnemius muskel.
4. På sitt distale innsetting i calcaneous, smalner gastrocnemius muskel i akillessenen. Identifiser akillessene, som er hvit og senete. Hold akillessene med tang, tar seg ikke å holde eller knuse gastrocnemius muskelen, og dele akillessenen fra calcaneus innsetting ved hjelp av saks.
5. Fremdeles holder senen, forsiktig løfte gastrocnemius muskelen (blek rød) av de dype soleus (dypere rød), fra den distale innsetting mot sin opprinnelse i kneet (soleus kan høstes separat).
6. Dissekere gastrocnemius utenfor beinet ved å dele opprinnelsen til gastrocnemius fra den mediale og laterale femur chondyles med saks. Svært skånsom trekkraft på muskel forenkler denne prosessen. Vær forsiktig med å knuse muskelen.
7. De soleus vil nå være tydelig synlig, rett under stedet av gastrocnemius. Løft soleus fra sin innsetting på akillessenen til sin ellerigin på bakre kalv. Hvis soleus er utilsiktet tatt opp med gastrocnemius, forsiktig skille den fra høstet prøven. Gastrocnemius (lys rød) og soleus (mørk rød) er fortsatt lett identifiserbare i høstet prøven på grunn av deres fargeforskjeller.
8. Vei musklene separat på en presisjon skala.
9. Split musklene vertikalt, halvparten for snap frysing i flytende nitrogen (for etterfølgende protein og / eller RNA ekstraksjon), og halvparten for histologi (dvs. morfometrisk vurdering, immunohistology) feste enten i 10% formalin eller frosset fiksering i isopentan kjøles med flytende nitrogen , som ønsket.
10. Gjenta fra trinn 4.3 ovenfor om kontroll, ikke-operert, siden å høste kontroll gastrocnemius og soleus muskler.

Representative Results

Tibial nerve transection denervates gastrocnemius, soleus og plantaris musklene i leggen. Her kan vi vurdere utviklingen av atrofi i gastrocnemius muskelen, som representant muskel. Gastrocnemius muskelen ble slaktet 2-3 måneder gamle C57Black 6 mus (Jackson Laboratories) denerveres for en, to eller fire uker. Muskelen vekter progressivt synkende (figur 1), som gjør det tverrsnittsarealet av type II raske muskelfibrene (figur 2), over tid. Gastrocnemius er en blandet fibertype muskel (type I og type II), men denervering induserer en fibertype bryter fra type I til type II fibre ^11, og som et resultat et tilstrekkelig antall av type I fibrene ikke kan være tilgjengelig for måling og robust statistisk analyse.

50657fig1.jpg "/>
Figur 1. Denerveres gastrocnemius muskel demonstrerer progressive atrofi. C57Black 6 mus gjennomgikk transection av retten tibial nerve. Gastrocnemius muskelen ble høstet fra denerveres (th) og kontralaterale kontrollen (venstre) bakben på en, to, eller fire uker etter nerve transection. Gastrocnemius muskler ble veiet, og vekten av denervert muskelen er uttrykt som et forhold mellom den kontralaterale kontroll innervert muskel. Denervation induserer en progressiv tap av muskelmasse.

Figur 2. Denerveres gastrocnemius muskel demonstrerer progressive nedgang i myofiber tverrsnitt (A) denerveres og kontroll gastrocnemius muskler var formalin fast, kutte på tverrsnitt på muscle midtseksjon og immunostained for anti-skjelettmuskulatur myosin, raske rykk isoform (My-32, Sigma, 1:500 fortynning) etterfulgt av biotinylated sekundært antistoff og streptavidin-HRP/DAB som beskrevet ^syv. Hematoxylin ble brukt som en counterstain. Raske rykk type II fibre flekken brun og langsomme type I fibre flekken lys lilla. Den tverrsnittsareal (CSA) av fibrene ble målt ved anvendelse ImageJ programvare (Bethesda, NIH), som beskrevet ^7,12. Den raske rykk type II fibre demonstrere progressive atrofi. For få type I fibre er til stede i denervert gastrocnemius for å tillate en statistisk evaluering av fiberstørrelse. (N = 6-9 mus / gruppe Minst 200 myofibers ble målt per muskel av en korrekturleser blindet for operativ fenotype data presenteres som gjennomsnitt + / -... SD Skalalinje tilsvarer 100 mikrometer). Klikk her for å se større versjon regne .

Discussion

Den tibial nerve transection modell av denervation-indusert skjelettmuskulatur atrofi er en vanlig ansatt og godt validert modell hos rotter. Vi har tilpasset denne modell for bruk i mus, noe som gjør det mulig for undersøkeren å dra fordel av eksistensen av genetisk modifiserte mus og studere prosessen med muskelatrofi in vivo i fravær av proteiner er viktige for regulering av muskelmasse ^7,8. Gastrocnemius og soleus muskler, både denerveres i denne modellen, kan enkelt og raskt dissekert med minimal håndtering, og dermed gi utmerket kvalitet mRNA og protein for påfølgende molekylære analyser. På samme måte, på grunn av størrelsen av musklene, kan de bli spaltet, og gir vev fra det samme dyr ved samtidig histologisk og morfometrisk analyse. Hvis bakben funksjonell vurdering er nødvendig, kan tursti analyse være serielt utført. Føttene er dyppet i blekk og musen gikk gjennom en innhegning med papir påbunnen. Kjennetegn på trykkene kan måles pålitelig og scoret for å indikere omfanget av nevromuskulær funksjonshemming og ganglag kompromiss, siden fotavtrykk karakteristikkene gjenspeiler funksjonelle muskelgrupper ^13,14. Mens opprinnelig utviklet og validert i rotte ^13, kan gå spor analyse også utføres i mus ^15.

Tibial nerve transection er generelt svært godt tolerert av musene. Bare en enkelt dose av analgetikum som er nødvendig i den umiddelbare postoperative periode. Med bruk av passende steril teknikk, er mykt vev infeksjon sjeldne. Mens tibial nerve transection gjør indusere sensorisk parestesier på plantar aspektet av foten, i vår erfaring C57black6 og knockout eller transgene mus avledet på denne linjen ikke pleier å auto-lemleste. Imidlertid må musene inspiseres daglig for tegn på auto-lemlestelse, hæl trykksår, samt punkt omsorg endepunkter. Mens vi har ubetydelig dødelighet viddh modellen, finner vi at ca 2-5% av mus må avlives på grunn av selv-mediert skade, eller det kan oppstå trykksår på, det opererte hind lem. Bruken av myke senger postoperativt er avgjørende for å sikre dyrets komfort og bidrar til å hindre utvikling av trykksår på opererte side. Isjiasnerven ligation samt SNI modell av ligation (der tibial og felles peroneal grener av sciatic ligeres, men Sural er igjen intakt) tjene som modeller for nevropatisk smerte ^16,17. Dermed kunne allodynia og termisk hyperalgesi oppstå i foten i vår modell også, men vi har ikke sett åpenlys smerte oppførsel i mus med normal daglig aktivitet på myke senger.

Den tibial nerve av bare ett bakben er transektert og siden mus vekt bærer nesten likt på begge bakbena, kan muskulaturen fra den kontralaterale ikke-operert lem brukes som en intern kontroll i hvert dyr ^7-10.Dette er ikke nødvendigvis tilfelle i sciatic transection modell, der flere betydelige forandringer av gangart kan indusere en hypertrofisk respons i kontralaterale lem muskler. I tibial nerve transection modell, vi bruker vanligvis gastrocnemius og soleus muskelen fra en ikke-operert lem som vår kontroll muskel ^7,8. Hvis etterforskeren velger å bruke separate dyr for å høste kontroll muskel, så humbug kirurgi bør utføres. Sham operasjon ville bestå av administrasjon av anestesi, splitting av huden for å avsløre tibial nerve, men ingen transection. Huden vil rett og slett bli stengt følgende nerve eksponering.

I noen perifere nerve transection modeller, forurenser villfaren reinnervation fra den nære stubbe til målet muskel den planlagte denervation. I denne modellen, som sikrer den proksimale enden av den tibiale transektert nerve til den overfladiske overflaten av biceps femoris muskelen, og dermed lukke muskel-grensesnittet, hemmendets villfaren reinnervation. Som sådan, er det en kritisk og vesentlig trinn i modellen. Villfaren reinnervation er sjelden i denne modellen.

Tilsvarende er en skånsom behandling av nerve under operasjonen vesentlig. Sural og peroneal nerve grenene må være forsiktig separert fra tibial nerve før tibial transection, og ikke knuses eller strukket i prosessen. Røff håndtering av disse nervene vil svekke deres funksjon, delvis denervating andre bakben muskulatur. Hvis dette skjer dyrets gangart vil bli ulikt påvirket i forhold til de musene som gjennomgår eneste tibial nerve transection, og den variable muskel belastning kan forurense de eksperimentelle resultatene. Likeledes må det utvises forsiktighet når dissekere denerveres muskulaturen. Muscle bør håndteres av senen, og ikke gripes direkte for å unngå knuse gjenstand som vil påvirke histologi, muskel fiber morfometriske analyser og muligens genuttrykk.

Vi typically bruke denne modellen i mus 20-24 g (2-3 måneders alder), som dyret er moden og sciatic og tibial nerver er både av tilstrekkelig størrelse til å være lett håndteres. Operasjonen kan utføres på yngre, mindre dyr hvis ønskelig, men den begrensende faktor her vil være dyktighet av drifts-kirurg. Dette kan være et problem hvis etterforskeren er interessert i å studere satellitt celle respons i denerveres muskel. Satellitten celle regenererende potensial avtar hos eldre sammenlignet med yngre, dyr ¹⁸ og derfor yngre dyr kan være nødvendig i eksperimentell design, presentere en teknisk utfordring for en mindre erfaren operatør.

Den tibial nerve transection modell kan tilpasses fra bare en modell av denervering-indusert muskelatrofi, til en av forsinket muskel reinnervation (> 4 uker), om ønsket og om erfarne operatører er tilgjengelige kirurgiske ^1,3. Etter en periode med denervering spesifisert av investigator, kan du bruke musen bli reoperert og peroneal nerve mobilisert til reinnervate den denerveres muskulaturen. Den distale stubben av transektert tibial nerve er identifisert, trimmet og peroneal nerve er mobilisert på sitt ytre ende og microsurgically reparert til tibial nerve stubben. Peroneal nerve vil vokse med en hastighet på ca 1 mm / dag i tibial nerve stubben til reinnervate gastrocnemius og soleus muskler. Den tibial nerve transection modellen gir en fordel over isjiasnerven transection modellen ved at en nerve pode er ikke nødvendig i reinnervation prosedyre ² på grunn av tilgjengeligheten av peroneal nerve. Imidlertid bør det bemerkes at nerve reanastomoses krever presisjon i en dyktige og erfarne operatør.

I sammendraget, her kan vi demonstrere tibial nerve transection modell i mus, som en enkel, robust, godt validert og reproduserbar modell av denervation-indusert skjelettmuskulatur atrofi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02