Summary
El modelo de transección del nervio tibial es un bien tolerado, validado, y reproducible modelo de atrofia del músculo esquelético. El modelo de protocolo quirúrgico se describe y se demuestra en C57Black6 ratones.
Abstract
El modelo de transección del nervio tibial es un bien tolerado, validado, y reproducible modelo de atrofia del músculo esquelético inducida por desnervación en roedores. Aunque originalmente desarrollado y utilizado ampliamente en la rata, debido a su tamaño más grande, el nervio tibial en ratones es lo suficientemente grande que pueda ser manipulado fácilmente, ya sea con aplastamiento o transección, dejando las ramas del nervio peroneal y sural del nervio ciático intacta y preservando así sus músculos en cuestión. Por lo tanto, este modelo ofrece las ventajas de la inducción de una menor morbilidad y impedimento de la deambulación que el modelo de transección del nervio ciático y también permite a los investigadores estudiar los mecanismos biológicos fisiológicos, celulares y moleculares que regulan el proceso de la atrofia muscular en ratones diseñados genéticamente. El nervio tibial suministra el gastrocnemio, sóleo y plantar los músculos, por lo que su corte transversal permite el estudio de los músculos esqueléticos desnervado compuesto por fibras de contracción rápida de tipo II y / o de tipo I de contracción lentafibras. Aquí se demuestra el modelo de transección del nervio tibial en el C57Black6 ratón. Evaluamos la atrofia del músculo gastrocnemio, como representante de un músculo, en 1, 2, y 4 semanas después de la denervación mediante la medición de los pesos musculares y del tipo de área de la sección transversal de la fibra específica en parafina secciones histológicas immunostained para la miosina rápida contracción.
Introduction
Denervación del músculo esquelético, debido a una lesión traumática de nervios periféricos, la enfermedad o la intervención farmacológica, resulta en la pérdida inmediata de la función contráctil muscular voluntario. Muscle concomitantemente comienza a atrofiarse y esta atrofia es reversible si reinervación oportuna y de buena calidad produce 1,2. En la ausencia de reinervación, atrofia miofibrilar progresa, y cambios biológicos irreversibles en el músculo se produce con la fibrosis muscular y muerte miofibras. Aquí se demuestra el modelo de transección del nervio tibial, un modelo de la denervación inducida por la atrofia muscular y la fibrosis en los ratones. Este modelo permite a los científicos estudiar los mecanismos biológicos fisiológicos, celulares y moleculares que subyacen a la atrofia muscular in vivo en los músculos gastrocnemio y sóleo. Aunque se han utilizado históricamente predominante en ratas, más reciente aplicación de este modelo a nocaut y las líneas de ratones transgénicos en concreto, permite a los investigadores para evaluar el papel de la, las proteínas (s) de interés en la inducción, el desarrollo y el mantenimiento, o, alternativamente, la resolución de, la atrofia muscular y la fibrosis in vivo.
El nervio tibial es un nervio periférico del motor-sensorial mixta en la extremidad posterior de roedores, y es una de las tres ramas terminales del nervio ciático. Transección del nervio tibial desnerva el gastrocnemio, sóleo y plantar (músculos y los tres músculos flexores profundos y pequeños de los pies, incluyendo tibial posterior, flexor largo de los dedos y flexor largo del dedo gordo hallicus), y es un modelo bien estandarizado y validado en ratas 3,4 . Los músculos gastrocnemio y sóleo pueden ser fácilmente diseccionados en puntos de tiempo de serie Publicación de transección del nervio tibial, fijaron y procesaron para la evaluación de la histología muscular y morfometría de la fibra muscular, o el flash congelado para la extracción de ARN y de proteínas musculares para el propósito de estudiar, por ejemplo, las redes de señalización celular que regulan la atrofia muscular. El gamuscular strocnemius es un tipo de fibra muscular mixta (de tipo I y de tipo II, aunque predominantemente de tipo II) y el músculo sóleo se compone de una gran proporción de fibras de tipo I, proporcionando de este modo contracción muscular a la vez rápido y lento para la evaluación de 5,6. El modelo de transección del nervio tibial es adecuado para estudiar el proceso de denervación inducida por la atrofia muscular, tanto a corto plazo (días) 7 y largo plazo (semanas a meses) 4,8.
En contraste con el modelo de transección del nervio ciático (un segundo modelo de la denervación inducida por la atrofia muscular comúnmente utilizado en roedores), la transección del nervio tibial induce una menor morbilidad en el animal, por lo que es un modelo más atractivo. Transección del nervio ciático desnerva todos los músculos de la pierna (debajo de la rodilla) y el pie, mermando la capacidad del animal para caminar 2, mientras que la transección del nervio tibial deja las ramas del nervio peroneo y sural del nervio ciático intacto, conservando asísus músculos en cuestión y territorios sensoriales. El ratón es incapaz de flexión plantar o invertir el pie, pero es capaz de deambular fácilmente y el peso lleva igualmente en ambas extremidades traseras, disminuyendo así significativamente la morbilidad del modelo. Estudios de análisis de la marcha que evalúan los patrones de caminar se han realizado en ratas después de lesiones del nervio tibial y ciático y demostrar que la huella y la carga de peso se conserva mejor con una lesión tibial 9,10. Además, en el modelo de transección del nervio tibial, el nervio peroneo puede ser movilizado en un punto de tiempo más tarde y se transfiere como una fuente de reinervación retardada, si el diseño del estudio requiere 3. En contraste, la reinervación retardada en el modelo de transección del nervio ciático hace necesario el uso de un injerto de nervio al déficit nervio ciático, muy significativamente el aumento de la dificultad técnica del modelo y la limitación de su uso para cirujanos expertos.
Mientras que el modelo de transección del nervio tibial requires familiaridad del operador con la técnica quirúrgica estéril en cirugía animal, tanto el nervio tibial y los músculos de la pantorrilla que inerva son fácilmente accesibles e identificables para la manipulación, de manera que las personas que no son cirujanos, o una amplia experiencia con la cirugía animal, pueden dominar fácilmente este modelo .
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Protocol
Antes de utilizar este modelo, los investigadores deben haber recibido la aprobación para el protocolo quirúrgico del uso de los animales de su institución órgano de gobierno. El modelo es aprobado por la Junta de Ética de la Investigación, Hamilton Health Sciences Corporation, la Universidad McMaster (AUP # 10/04/24) y se lleva a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones formuladas por el Consejo Canadiense de los Animales.
1. Ratón Preparación
- Pesar el ratón. Inducir la anestesia con isoflurano al 5% o 2% de halotano. El circuito utilizado debe garantizar compactación adecuada de la anestesia para proteger el cirujano. Después de 2-3 minutos la respiración del animal se ralentizará. Asegúrese de que el reflejo de parpadeo está ausente y pellizcar los espacios interdigitales de la pata para confirmar la anestesia quirúrgica (es decir, no hay respuesta por el ratón). Aplicar lubricante oftálmica al ojo, para evitar el secado de la córnea durante la cirugía.
- Shave la cara lateral del muslo y la nalga del ciáticoapuntarse a la rodilla y desinfectar con proviodine. Afeitar mantendrá el sitio de la incisión libre de pelo para asegurar una adecuada visualización del campo quirúrgico y para minimizar la interferencia con la disección del nervio y la transección. La escotadura ciática, que es superior y posterior en el fémur, se puede identificar mediante la palpación.
2. Procedimiento Operativo
- Reducir por inhalación isoflurano al 2% (halotano 1%) y colocar el ratón sobre un lado (el lado destinado a la cirugía hacia arriba), con un microscopio operativo o disección. Alternativamente, la cirugía se puede realizar con lupas quirúrgicas desde ampliación 3.5X es satisfactoria para un adulto (20-25 g) del ratón.
- Ponte los guantes estériles. Identificar la escotadura ciática por palpación. El uso de un escalpelo, incisión de la piel de la cara lateral del muslo de la escotadura ciática a la rodilla (aproximadamente 1 cm).
- Suavemente separa la piel. Identificar el músculo bíceps femoral, que es el músculo superficial plana de la cara lateral del musloinmediatamente debajo de la piel. Con unas tijeras finas, dividir el músculo bíceps femoral a lo largo de las fibras musculares y mantenga abierto con un retractor de primavera para exponer el nervio ciático y sus ramas.
- Identificar el nervio ciático inmediatamente la profundidad del músculo bíceps femoral. Puede ser identificado por su color blanco brillante característico y es de aproximadamente 0,8 mm de diámetro. Se extiende desde la escotadura ciática a la rodilla, se ramifican en los nervios tibiales, peroneo y sural a nivel de la fosa poplítea.
- Separar suavemente el tibial de las ramas del nervio peroneo y sural con fórceps ultrafinas y primavera tijeras microdissecting. El nervio tibial es la rama más grande y suele ser central. Es importante no aplastar el nervio mientras que separa las ramas. Sosteniendo el nervio sólo en la capa adventicial exterior con las pinzas ultrafinas, y mantener la holgura del nervio (no enseñados), evitará aplastamiento del nervio y la lesión por tracción.
- Para obtener información completa y duradera denervatien, cortar el nervio tibial con microdissecting tijeras como distalmente como sea posible, evitando cuidadosamente los vasos poplíteos. Alternativamente, para la denervación temporal con reinervación completa esperada en 2-4 semanas, el nervio tibial puede simplemente ser aplastado con fórceps ultrafinas de 15 segundos en lugar de seccionado. (Nervios periféricos vuelven a crecer después de la lesión y se reinervar músculo deseado.)
- Si se requiere la denervación completa, suturar el extremo del nervio tibial cortado transversalmente a la superficie anterior del músculo bíceps femoral con nylon 10-0 y volver a aproximar el bíceps femoral con Vicryl 5-0 para evitar aberrante de re-inervación de los gastrocnemio y músculos sóleo.
- Cierre la piel con una sutura de Vicryl 5-0 correr.
3. Cuidado operativo del poste
- Apague la anestesia inhalatoria, pero mantener el flujo de oxígeno. Administrar buprinorphine (o sustituto) analgésico por vía subcutánea.
- Transferir el ratón a una jaula limpia sinropa de cama, mientras que despierta de la anestesia. Mantener en una manta de calentamiento dentro de la jaula y bajo observación directa hasta deambular.
- Transferencia y la casa en la jaula inferior suave (no cable) con amplia ropa de cama blanda.
- Inspeccionar la extremidad operativa diaria para la condición de la herida quirúrgica y el pie para el desarrollo de las úlceras por decúbito talón o las pruebas de la masticación. Los problemas menores pueden ser tratados con antibióticos o antisépticos tópicos como proviodine. Indicadores de punto final que requieren la eutanasia de animales son la pérdida de peso, la evidencia de autocuidado deficiente (piel rizada) y postura encorvada. Además, los animales con mayor apertura de la herida o úlceras que no se curan en 1-2 semanas con antibióticos tópicos o parece tener dolor deberán ser sacrificados.
4. Gastrocnemius Denervado y cosecha del músculo sóleo
- En el punto de tiempo después de la operación deseada, pesar el ratón y el sacrificio con sobredosis de CO 2.
- Shave el aspecto medial de tanto laoperativa y las piernas de control contralateral y limpio con alcohol. Coloque el ratón en un microscopio operativo o disección, o alternativamente usar lupas quirúrgicas para la ampliación de visualización.
- En la extremidad operativa, una incisión en la piel pierna medial con un bisturí desde el tobillo hasta la rodilla y circunferencialmente alrededor del tobillo. Tire suavemente la piel con pinzas fuera del músculo y proximalmente hacia el muslo. Esto expone a todos los músculos de la pierna. Identificar el músculo gastrocnemio, que es el músculo de la pantorrilla que se extiende desde la rodilla hasta el tobillo en la cara posterior de la pierna y se encuentra inmediatamente debajo de la piel. Identificar la inserción distal del músculo bíceps femoral, proximal al músculo gastrocnemio en la cara medial de la rodilla. En su inserción distal del bíceps femoral aparece delgada y transparente y se superpone a la porción más proximal del gastrocnemio. Con unas tijeras y disección extremo romo, separar suavemente la inserción distal del bíceps femoral del gasmúsculo gastrocnemio.
- En su inserción distal en el calcáneo, el músculo gastrocnemio se estrecha en el tendón de Aquiles. Identificar el tendón de Aquiles, que aparece blanco y musculoso. Sostenga el tendón de Aquiles con unas pinzas, teniendo cuidado de no agarrar ni triture los músculos gemelos, y dividir el tendón de Aquiles de la inserción del calcáneo con unas tijeras.
- Sin soltar el tendón, levante suavemente el músculo gemelo (rojo claro) fuera el sóleo profundas (más rojo), a partir de la inserción distal a su origen en la rodilla (el sóleo se pueden cosechar por separado).
- Diseccionar el gastrocnemio de la pierna dividiendo el origen de los gastrocnemio de los chondyles fémur medial y lateral con unas tijeras. Tracción muy suave en el músculo facilita este proceso. Tenga cuidado de no aplastar el músculo.
- Los sóleo ahora serán claramente visibles, inmediatamente debajo del sitio de los gastrocnemio. Levante el sóleo de su inserción en el tendón de Aquiles de su oigin en la pantorrilla posterior. Si el sóleo se eleva inadvertidamente con el gastrocnemio, suavemente separarlo de la muestra cosechada. El gastrocnemio (rojo claro) y sóleo (rojo oscuro) siguen siendo fácilmente identificables en la muestra recolectada, debido a sus diferencias de color.
- Pesar los músculos por separado en una balanza de precisión.
- Dividir los músculos verticalmente, un medio para la congelación en nitrógeno líquido a presión (para su posterior proteínas y / o extracción de ARN), y un medio para la histología (es decir, evaluación morfométrica, inmunohistología) que se fijan ya sea en 10% de formalina, o la fijación congelados en isopentano enfriado con nitrógeno líquido , si lo deseas.
- Repita desde el paso 4.3 en el control, no operado, de lado a cosechar gemelo de control y los músculos sóleo.
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Representative Results
Transección del nervio tibial desnerva el gastrocnemio, sóleo y plantar los músculos de la pantorrilla. Aquí se evalúa el desarrollo de la atrofia en los músculos gemelos, como un músculo representativo. Músculo gastrocnemio fue cosechada de 2-3 meses de edad C57Black 6 ratones (Jackson Laboratories) denervado para 1, 2, o 4 semanas. Pesos musculares disminuyen progresivamente (Figura 1), al igual que el área de sección transversal de las fibras de tipo II musculares de contracción rápida (Figura 2), a través del tiempo. El gemelo es un tipo de fibra muscular mixta (tipo I y tipo II), pero denervación induce un detector de fibra de tipo I al tipo fibras II 11, y como resultado de un número suficiente de fibras tipo I puede no estar disponible para la medición y análisis estadístico robusto.
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Figura 1. Músculo gemelo Denervado demuestra atrofia progresiva. C57Black 6 ratones fueron sometidos a la transección del nervio tibial derecha. Músculo gastrocnemio se cosechó desde el control desnervado (derecha) y contralateral (izquierda) extremidades posteriores al 1, 2 ó 4 semanas después de la transección del nervio. Músculos gastrocnemio se pesaron, y el peso del músculo denervado se expresan como una proporción de la contralateral músculo inervado de control. La denervación induce una pérdida progresiva de masa muscular.
Figura 2. Músculo gastrocnemio Denervado demuestra disminución progresiva en el área de la sección transversal de miofibras músculos gastrocnemio (A) Denervado y de control fueron fijadas con formalina, corte en sección transversal en el musclsección media e y immunostained de la miosina del músculo anti-esquelético, de contracción rápida isoforma (Mi-32, Sigma, dilución 1:500) seguido de anticuerpo secundario biotinilado y como se describe streptavidin-HRP/DAB 7. Hematoxilina se utilizó como contratinción. Fast twitch fibras tipo II mancha marrón y tipo de contracción lenta las fibras I mancha púrpura claro. El área de sección transversal (CSA) de las fibras se midió usando el software ImageJ (Bethesda, NIH) como se describe 7,12. Las fibras de tipo II de contracción rápida demuestran atrofia progresiva. Muy pocas fibras tipo I están presentes en gastrocnemio denervados para permitir una evaluación estadísticamente válida de tamaño de la fibra. (N = 6-9 ratones / grupo de un mínimo de 200 fibras musculares se midieron por músculo por un revisor fue cegado respecto fenotipo operativo Los datos se presentan como la media + / -... Bar SD escala es igual a 100 micras). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
El modelo de transección del nervio tibial de la atrofia del músculo esquelético denervación inducida es un modelo comúnmente empleado y bien validado en ratas. Hemos adaptado este modelo para su uso en los ratones, lo que permite al investigador para tomar ventaja de la existencia de ratones modificados genéticamente y estudiar el proceso de la atrofia muscular in vivo en ausencia de proteínas cruciales para la regulación de la masa muscular 7,8. Los músculos gemelos y sóleo, tanto desnervar en este modelo, pueden ser fácil y rápidamente disecado con una mínima manipulación, lo que proporciona una excelente calidad de ARNm y proteínas para análisis moleculares posteriores. Del mismo modo, debido al tamaño de los músculos, que se pueden dividir, proporcionando tejido del mismo animal para los análisis histológicos y morfométricos concomitantes. Si se requiere una evaluación funcional de extremidades posteriores, caminando análisis pista se puede realizar en serie. Los pies son sumergidos en tinta y el ratón se camina a través de una caja con papel en elparte inferior. Características de las impresiones pueden ser medidos de forma fiable sin marca para indicar el grado de discapacidad neuromuscular y el compromiso de andar, ya que las características de la huella reflejan los grupos musculares funcionales 13,14. Mientras que originalmente desarrollado y validado en la rata 13, caminar análisis pista también puede llevarse a cabo en ratones 15.
Transección del nervio tibial es generalmente extremadamente bien tolerada por los ratones. Sólo una única dosis de analgésico es necesario en el postoperatorio inmediato. Con el uso de una técnica estéril adecuado, infección de tejidos blandos es rara. Mientras transección del nervio tibial no inducir parestesia sensorial en la cara plantar del pie, en nuestra experiencia y C57black6 nocaut o ratones transgénicos obtenidos en esta línea no tienden a auto-mutilarse. Sin embargo, los ratones deben ser inspeccionadas diariamente para detectar signos de auto-mutilación, úlceras de presión en el talón, así como de punto de cuidado de puntos finales. Si bien tenemos el ingenio mortalidad insignificanteh el modelo, encontramos que aproximadamente el 2-5% de los ratones debe ser sacrificado debido a la lesión mediada por auto-a, o en el desarrollo de las úlceras por presión, la extremidad posterior de accionamiento. El uso de ropa de cama blanda después de la operación es crucial para garantizar la comodidad del animal y ayuda a prevenir el desarrollo de úlceras por presión en el lado operado. Ligadura del nervio ciático, así como el modelo de SNI de ligadura (donde se ligan las ramas tibial y peroneo común de la ciática, pero la sural se deja intacta) sirven como modelos de dolor neuropático 16,17. Por lo tanto, la alodinia y la hiperalgesia térmica podrían ocurrir en el pie en nuestro modelo también, pero no hemos visto el comportamiento del dolor evidente en los ratones con la actividad diaria normal de ropa de cama blanda.
El nervio tibial de un solo miembro posterior se secciona y puesto que el peso de los ratones llevan casi por igual en ambos miembros posteriores, la musculatura de la extremidad no operado contralateral se puede utilizar como un control interno dentro de cada animal 7-10.Esto no es necesariamente el caso en el modelo de transección ciático, donde anomalías más significativas de la marcha pueden inducir una respuesta hipertrófica en el músculo del miembro contralateral. En el modelo de transección del nervio tibial, por lo general usamos los músculos gemelos y el sóleo de la pierna no operada como nuestro control muscular 7,8. Si el investigador decide utilizar animales separados de los que la cosecha control muscular, entonces se debe realizar una cirugía simulada. Cirugía simulada consistiría en la administración de la anestesia, la división de la piel para exponer el nervio tibial, pero sin transección. Piel simplemente se cerrará después de la exposición del nervio.
En algunos modelos de transección del nervio periférico, reinervación errante del muñón proximal del músculo de la blanco contamina la denervación planificada. En este modelo, asegurar el extremo proximal del nervio tibial cortado transversalmente a la superficie superficial del músculo bíceps femoral, cerrando de esta manera la interfaz de músculo, la inhibiciónts la reinervación errante. Como tal, es un paso fundamental y esencial en el modelo. Reinervación Errante es raro en este modelo.
Del mismo modo, un manejo cuidadoso del nervio durante la cirugía es esencial. Las ramas del nervio sural y peroneo deben separarse suavemente del nervio tibial antes de la transección tibial, y no aplastados o estirados en el proceso. Los manejos bruscos de estos nervios comprometerá su función, denervación parcial otra musculatura patas traseras. Si esto ocurre el modo de andar del animal será influenciada diferencialmente en comparación con los ratones sometidos única transección del nervio tibial, y la carga muscular variable puede contaminar los resultados experimentales. Del mismo modo, se debe tener cuidado cuando la disección de la musculatura desnervado. Muscle debe ser manejado por el tendón, y no comprendió directamente para evitar artefactos enamoramiento que afectará a la histología, los análisis morfométricos de fibras musculares y, posiblemente, la expresión génica.
Nos typically emplear este modelo en ratones de 20-24 g (2-3 meses de edad), ya que el animal es maduro y los nervios ciático y tibial son tanto de tamaño adecuado para ser fácilmente manejado. La cirugía se puede realizar en los animales más pequeños, más pequeños, si se desea, pero el factor limitante aquí será la destreza del cirujano. Esto puede ser un problema si el investigador está interesado en el estudio de la respuesta de las células satélite en el músculo denervado. El potencial regenerador de células satélite disminuye en mayor, en comparación con los animales más jóvenes, 18 y por lo tanto los animales más jóvenes pueden ser necesarios en el diseño experimental, presentando un desafío técnico para un operador con menos experiencia.
El modelo de transección del nervio tibial se puede adaptar simplemente a partir de un modelo de atrofia muscular inducida por denervación, a uno de reinervación muscular retardada (> 4 semanas), si se desea y si los operadores experimentados quirúrgicos están disponibles 1,3. Después de un período de denervación especificado por la investigator, el ratón puede ser reintervenido y el nervio peroneal movilizó a reinervar la musculatura desnervado. Se identifica el muñón distal del nervio tibial seccionado, recortado y el nervio peroneo se movilizó en su extremo distal y microcirugía reparado al muñón del nervio tibial. El nervio peroneo crecerá a un ritmo de aproximadamente 1 mm / día en el muñón del nervio tibial a reinervar los músculos gemelos y sóleo. El modelo de transección del nervio tibial proporciona una ventaja sobre el modelo de transección del nervio ciático en la que un injerto de nervio no es necesario en el procedimiento de reinervación 2 debido a la disponibilidad del nervio peroneo. Sin embargo, cabe señalar que reanastomoses nerviosas requiere la precisión de un operador cualificado y experimentado.
En resumen, aquí se demuestra el modelo de transección del nervio tibial en ratones, según un modelo sencillo, robusto, bien validados y reproducibles de la atrofia del músculo esquelético inducida por denervación.
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Disclosures
No hay conflictos de interés se declaran.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de Investigación Neuromuscular CIHR (JNM - 90959, para Jaeb).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| 10-0 Nylon suture | Ethicon | 2850G | |
| 5-0 Vicryl suture | Ethicon | J553G | |
| Equipment | |||
| Spring microdissecting scissors | Fine Surgical Tools | 15021-15 | |
| Ultra fine forceps | Fine Surgical Tools | 11370-40 | |
| Non locking micro needle holder (driver) | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Spring retractor | Fine Surgical Tools | 17000-02 | |
References
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