Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

Published: August 1, 2013 doi: 10.3791/50662
* These authors contributed equally

Summary

복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.

Abstract

arenavirus 역 유전학의 개발 및 구현 arenavirus 필드 4에있는 중요한 돌파구를 나타냅니다. 자신의 게놈 소정의 돌연변이와 재조합 전염성 arenaviruses를 생성하는 기능과 함께 셀 기반 arenavirus의 minigenome 시스템의 사용은 arenavirus 라이프 사이클의 다른 단계 바이러스 성 결정 요인의 기여에 대한 조사뿐만 아니라, 바이러스 호스트를 촉진했다 상호 작용과 arenavirus 병인 1, 3, 11의 메커니즘. 또한, trisegmented arenaviruses의 개발은 따라서 arenavirus 기반의 백신 벡터 애플리케이션 5의 가능성을 열어, 그 밖의 외국 유전자를 표현하는 arenavirus 게놈의 사용을 허용하고있다. 마찬가지로, 표현 리포터 유전자 할 수있는 단일 사이클 전염성 arenaviruses의 개발 highl 관련된 연구의 안전을 개선하기 위해 새로운 실험 도구를 제공합니다Y 병원성 인간 arenaviruses 16. 플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 세대는 지금까지 식품 의약품 안전청의 개발 (FDA) 허가 백신 또는 백신 벡터에 대한 몇 가지 장벽을 포즈 7,19 설치류 세포주의 사용에 의존하고있다. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 FDA의 승인을 베로 세포에서 재조합 arenaviruses의 효율적인 세대는 여기에 대해 설명합니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Arenaviruses는 Arenaviridae 제품군에 속하는 bisegmented, 음의 가닥 RNA 게놈 3 싸여 바이러스입니다. arenavirus 게놈은 두 개의 분리 된 바이러스 세그먼트 3에서 ambisense 패션 개의 단백질을 인코딩합니다. 대형 (L) 부분은 RNA 의존 RNA 중합 효소 (L) 및 바이러스 신진의 주요 원동력 역할을하는 작은 링 (정말 흥미로운 새로운 유전자) 손가락 단백질 (Z) 인코딩합니다. 소 (S) 부분은 바이러스 핵 단백질 (NP)와 표면 당단백 (GP) (그림 1)를 인코딩합니다.

Arenaviridae 가족의 몇몇 일원은 인간 3 치명적인 출혈열 (HF)에 대한 책임이 있습니다. 원칙적으로 문제의 입원 환자 8, 9에서 높은 사망률을 일으키는 것으로 알려져 있습니다 라사 바이러스 (LASV)와 후닌 바이러스 (JUNV가) 있습니다. 이 바이러스는 각각 서부 아프리카와 농촌 아르헨티나에 발병하지만은,증가 여행 10에 의한 비 발병 지역에 LASV 및 JUNV의 수입 증가 우려가 있습니다. 일반적으로 인간의 심각한 질병과 관련이없는 있지만 또한, 프로토 타입 arenavirus 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV)는 면역 환자 6, 15 치명적인 감염 사례가되었습니다로 무시 병원균으로 간주하고 선천적 결함과 자연 유산에 대한 책임이 있습니다 임신 2, 십삼인치 현재이 없습니다 미국 arenaviruses 및 치료에 대한 백신은 부분적으로 만 효과가 종종 상당한 부작용과 관련된 클레오 아날로그 리바비린으로 제한됩니다 FDA 승인.에게

플라스미드 기반의 역 유전학 4 재조합 arenaviruses 7, 19 세대의 도입은 크게 arenavirus 연구 분야를 전진했다. 현재, 설치류 세포 (예 : BHK-21 등) GENER에 사용되는S와 L 세그먼트의 초기 전사를 지시 종의 특정 쥐 RNA 중합 효소 I (POL-I) 발기인에 의한 재조합 arenaviruses의 ATION. BHK-21 세포에서 그러나 바이러스 구조는 잠재적 인 백신 시드 후보로 재조합 arenaviruses의 생성에 대한 승인 방법 없습니다. 여기에서 우리는 프로토 타입 올드 월드 (OW) LCMV와 새로운 세계 (NW) 베로 세포에서 JUNV 몰래 # 1 균주의 효율적인 구조에 대한 인간의 POL-I 프로모터의 사용을 문서화합니다. 유사한 방법론을 사용하여, 우리는 재조합 trisegmented LCMV (r3LCMV)와 몰래 # 1 (r3Candid # 1) 두 개의 서로 다른 S RNA 세그먼트 5로 인코딩 된 두 개의 추가 외부 유전자를 포함 arenaviruses를 생성합니다. 이 새로운 시스템은 높은 재현성과 간단한 프로토콜을 따르고 있지만, 바로 잠재적 인 백신 또는 백신 벡터 씨와 같은 재조합 arenaviruses의 생성에 구현 될 수뿐만 아니라.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Arenavirus 구조 형질

우리의 구조 시스템은 핵 단백질 (NP)와 RNA 의존적-RNA 중합 효소 (L), RNA 복제 및 arenavirus 게놈의 유전자 발현에 필요한 바이러스 횡단 행동 요소를 인코딩 중합 효소 II의 단백질 발현 플라스미드 모두의 사용을 기반으로 한 7, 19, 및 세포 S의 RNA 중합 효소 I (POL-I) 및 L antigenome RNA 종 7을 통해 세포 내 합성을 지시 할 수있는 플라스미드. 우리의 연구에서 우리는 내가 발기인 및 쥐 종결 서열 (그림 2) 인간의 효소를 사용 pCAGGs 단백질 닭 β-액틴 프로모터 및 polyadenylanation (PA) 신호 시퀀스를 사용하여 플라스미드 표현하고, 인간의 폴-I 플라스미드를 사용 . S와 L RNA 세그먼트는 HPOL-I에 의한 전사에 따라 게놈 RNA 세그먼트의 생성을 허용 할 antigenomic 방향 HPOL-I 플라스미드에 복제됩니다. 야생 타이의 구조에 대한PE 재조합 LCMV (rLCMV)와 몰래 # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP 각 바이러스의 L은 각각의 인간의 폴-I S와 L RNA 세그먼트 (그림 3)와 함께 공동 형질 전환 하였다. 재조합 trisegmented LCMV (r3LCMV)와 # 1 (# 1 r3Candid) 몰래의 생성은 유​​사한 프로토콜을 따랐지만 S 세그먼트는 두 개의 서로 다른 폴-I S 플라스미드, 각 인코딩 특유의 리포터 유전자로 분할되었다 : 하나, NP 개방 판독 프레임 (ORF)은 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 유전자 (HPOL-I S GFP / GP)와, 다른에서, 바이러스 당 단백질 전구체 (GPC)를 ORF가 Gaussia 루시 페라 제 (Gluc) 리포터 유전자로 대체됩니다로 대체되었습니다 (HPOL-I S NP / Gluc). 프로토콜의 개략도는 그림 4에 나와 있습니다. 다음과 같은 형질 감염 프로토콜은 6 잘 플레이트 설립되었습니다.

  1. OptiMEM-lipofectamine과 2000 (LPF2000) 혼합 : OptiMEM 매체 250 μl를 준비하고, 따라의 바이러스 구조, 10 - 형질 당 LPF2000 12 μg (1 ㎍ / ㎕의) (표 1). DNA의 μg 당 2.5 μg LPF2000의 비율이 권장됩니다. RT에서 10 분 - 5 알을 품다. 한편, 별도의 microcentrifuge 관 (단계 1.2)에서 플라스미드의 transfection 혼합물을 준비합니다.
  2. 플라스미드 DNA의 형질 전환 혼합물 : 각 바이러스 구조에 대한 권장 금액 (표 1 참조)를 사용 microcentrifuge 관에서 플라스미드 형질 칵테일을 준비합니다. OptiMEM 50 μL의 최종 볼륨을 가져와.
  3. OptiMEM-LPF2000-DNA 플라스미드 혼합물 : 플라스미드 DNA의 형질 혼합물 (단계 1.2)에 OptiMEM-LPF2000 혼합물 (단계 1.1) 250 μl를 추가합니다. RT에서 30 분 - 20이 혼합물을 품어. 한편 준비하고 형질 반응 당 1 × 10 6 베로 세포를 계산합니다. 베로 세포 현탁액에 형질 전환됩니다.
  4. 베로 세포의 준비 : 베로 CELLS 100 밀리미터 접시에서 배양된다. 시작하기 전에 37 ° C.에 1X PBS, DMEM 10 % FBS 1 % PS 미디어, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 혼합물을 가지고
    1. 1X PBS의 10 ML로 두 번 세포를 씻으십시오.
    2. 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML로 세포를 Trypsinize 세포 분리 (약 5 분) 때까지 기다립니다. 부드러운 어쩌면 완전히 요리에서 세포를 분리하는 데 필요한 탭핑.
    3. 조심스럽게 15 ML의 원심 분리기 튜브 DMEM 10 % FBS 1 % PS 10ml에 세포를 resuspend을.
    4. 원심 분리기에서 1,000 rpm으로 5 분 동안 세포를 원심 분리기.
    5. DMEM 10 % FBS 1 % PS 10ml에 세포를 resuspend을하고 혈구를 사용하여 셀을 계산 1 × 10 6 세포 / ㎖로 농도를 조정합니다. 1 × 10 형질 당 6 베로 세포가 최상의 결과를 생산 - 그것은 0.5 관찰되었다.
  5. LPF2000/DNA 세포를 혼합 : 20 후 - 30 분 실온 배양 (단계 1.3)로 베로 세포를 1 ㎖ (1 × 10 6) (단계 1.4)을 추가상온에서 5 분 OptiMEM-LPF2000-DNA 플라스미드 혼합물을 품어.
  6. 6 잘 접시에 씨앗 LPF2000/DNA-cell 믹스 : 6 잘 플레이트의 우물에 DNA-LPF2000 - 베로 혼합물 (단계 1.5)를 추가합니다. 부드럽게 6 잘 플레이트를 흔들 37 배양기에서 형질 부화 하룻밤하자 ° C와 5 % CO 2.
  7. 형질 매체 변경 : 약 16-24 시간의 포스트 형질을, 형질 미디어를 제거 감염 매체 2 ML을 추가하고 추가로 48 시간 동안 형질 전환 세포를 품어.
  8. 세포 통로 : 감염 미디어에서 배양 48 시간 후 조직 배양 상층 액 (TCS)를 제거하고 100mm 접시에 형질 전환 세포를 전달합니다. 형질 세포가 바이러스 입자를 생성하기 위해 추가 배양이 필요하기 때문에 TCS는 거의 전염성 바이러스를 포함하지 않습니다. 세포의 통과를 위해 :
    1. 1X PBS 2 ML로 두 번 세포를 씻으십시오.
    2. 세포에게 승 Trypsinize i 번째 0.5 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 ML과 세포가 분리 될 때까지 기다립니다.
    3. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 DMEM 10 % FBS 1 % PS 1 ML에있는 세포를 resuspend을.
    4. 5,000 rpm에서 5 분, 4 ° C의 microcentrifuge에 대한 세포를 원심 분리기.
    5. 조심스럽게 감염 미디어 1 ML에있는 세포를 resuspend을하고 100mm 접시에 세포를 전송합니다. 8 ml의 바이러스를 농축 세포의 건조 등을 방지하기 위해 충분한 볼륨으로, 전염성 미디어, 접시에 전체 볼륨을 가져와.
  9. 부드럽게 37 100 밀리미터 접시를 흔들어 인큐베이터 베로 세포 배양을 계속 ° C와 5 % 72 시간 동안 CO 2.
  10. TCS의 컬렉션을 : 72 시간 배양 후, 15 ML의 원심 분리기 튜브 TCS를 수집합니다. 원심 분리기에서 2,500 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 전염성 arenavirus는 TCS에서 발견되기 때문에 세포 파편 펠릿에서 제거하고 -80 TCS를 저장 ° C.
재조합 Arenavirus 구조 르 "> 2. 확인

rLCMV 및 rCandid # 1의 성공적인 구조의 발견은 초점을 형성 단위 (FFU) 면역 분석 (IFA)를 통해 얻을 수 있습니다. 야생 형 바이러스 구조를 위해 우리는 바이러스 NP에 대한 특정 항체를 사용합니다. r3LCMV 및 r3Candid 중 1 따라서 형광 현미경 (GFP) 및 / 또는 발광 (Gluc)에 의한 항체의 필요없이 바이러스 탐지 및 적정 수 있도록 두 기자 유전자 (GFP 및 Gluc) 인코딩합니다.

  1. 야생형 재조합 arenavirus 구조 확인 : 적정 전날, PBS로 두 번 베로 세포를 씻어 trypsinize 80에 도달하는 96 - 웰 플레이트를 준비 - 90 % 합류 다음날 (4 × 10 4 세포 /도). 부드럽게 세포의 균일 한 분포를 얻기 위해 손으로 판을 흔들어. 문화 세포 하룻밤, 37 ° C 배양기 5 % CO 2. 감염을 진행하기 전에, 단층을 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인
    1. 순차적으로 희석 (10 배 희석) 바이러스가 포함 TCS는 OptiMEM에서 100 밀리미터 접시 (단계 1.10)에 형질 전환 세포에서 발견.
    2. 시드 베로 세포에서 용지를 제거 1X PBS의 50 μL로 두 번 세척하고, 순차적으로 희석 바이러스 (단계 2.1) 50 μL와 세포를 감염. 37 1.5 시간 동안 세포를 감염 ° C와 5 % CO 2.
    3. 감염 후, 바이러스 접종을 제거 100 감염 미디어 μL / 잘을 추가하고 16를위한 세포를 배양 - 18 시간. 바이러스 다시 감염 바이러스 역가의 과다 추정 될 수있는, 18 시간 배양 한 후 발생할 수 있습니다.
    4. 16시 - 18 시간 게시물 감염, 각 우물에서 TCS를 제거하고 RT에서 15 분, 1X PBS에 희석 4 % 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
    5. 다음으로, 고정 용액을 제거하고 세포를 permeabilize로 0.1 % 트리톤 X-100 실내 온도에서 10 분 동안, 1X PBS에 희석.
    6. permeabilization 솔루션을 대기음 후, 세포에게 3 회 위스콘신 세척일 1X PBS.
    7. RT에서 1 시간 1X PBS (차단 솔루션)에서 2.5 % 알부민 소 혈청 (BSA)로 세포를 차단합니다. 또한, 세포는 4 ° C에서 하룻밤 차단 항체 배양 다음날을 계속 할 수 있습니다.
    8. 한편 일차 항체를 준비합니다. 솔루션을 차단에 LCMV와 몰래 # 1 특정 기본 항체를 희석 한 후 3,500 rpm에서 15 분 동안 / 차단 솔루션 항체를 원심 분리기. BEI 자원 (1:500 희석)에서 단클론 항-LCMV NP 항체 클론 1.1.3 (1시 반 희석) 16 단클론 항-JUNV NP 항체 SA02-BG12는 rLCMV의 탐지 및 rCandid # 1 사용할 수 있습니다 각각.
    9. 1 시간 배양 한 후, 차단 솔루션을 기음과 세포 일차 항체의 50 μl를 추가하고 37 1 시간 동안 품어 ° C.
    10. 이 시간에 솔루션을 차단에 차 항체를 희석 한 후 3,500 rpm에서 15 분 동안 항체 / 차단 솔루션을 원심 분리기. 폴리기본 단클론 항체의 검출을위한 클론 토끼 항 마우스 IgG의 FITC 차 항체는 그림 5에서 관찰 된 이미지를 얻기 위해 사용되었다.
    11. 1 시간 배양 한 후, 일차 항체를 대기음 1X PBS로 3 회 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 차 항체를 추가 ° C.
    12. 30 분 부화 후, 차 항체를 대기음하고 1X PBS로 3 회 세척한다. 세포는 두 ML (FFU / ㎖) 당 단위를 형성 초점을 계산하여 바이러스 구조 및 적정의 성공을 결정하는 형광 현미경을 사용하여 현재 관찰 할 준비가 된 것입니다.
  2. r3LCMV 및 # 1 r3Candid 바이러스의 구조 :이 바이러스는 두 기자 유전자를 표현하기 때문에, 그들의 GFP 식 또는 TCS의 Gluc 표현을 감지하는 형광 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다 구출. 구조는 TCS의 Gluc의 발현에 의해 확인 할 수 있습니다. trisegmented 바이러스를 적정하기 위해, 우리는 2.1.4 단계 2.1를 수행하지만 세포가 B 할 필요가 없습니다전자 때문에 GFP 발현을 성공적으로 바이러스 구조를 결정하는 고정. 바이러스의 적정은 FFU / ㎖를 계산하여 결정됩니다. Gluc 표현, TCS에서 Gluc 식으로 성공적인 바이러스 성 구조를 확인하려면 Gluc 분석 키트 (Biolux Gaussia 루시 페라 제 분석 키트, 뉴 잉글랜드 Biolabs 사)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 이를 위해 :
    1. 96 - 웰 하얀 접시 (평면 바닥의 microtiter 접시, 피셔 과학)에 피펫 TCS의 100 μl를.
    2. luminometer (LumiCount, 팩커드 생명 과학)을 설정합니다.
    3. 각 샘플에 100 μL Gluc 분석 실험 용액 (제조업체가 권장)와 luminometer로 Gluc 리포터 유전자 발현을 측정 - 50를 추가합니다. 대조군으로, 야생형 바이러스에 감염된 세포에서 TCS의 Gluc 발현을 측정 하였다.

3. 조직 배양 상층 액의 통과

바이러스 구조가 형질 전환 효율에 따라 달라집니다. 베로 세포가 표시되어다른 세포 라인 14보다 낮은 형질 전환 효율을 가지고 있습니다. TCS의 바이러스 역가가 낮은 경우, 바이러스를 증폭하는 72 시간 동안 0.01 (LCMV) 또는 0.1 (# 1 몰래)의 감염의 다중성 (MOI)에서 신선한 베로 세포를 감염.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

재조합 야생형 arenavirus의 성공적인 구조는 IFA (그림 5)를 사용하여 바이러스 항원의 존재에 의해 확인됩니다. 재조합 trisegmented 바이러스의 경우, 성공적인 바이러스 성 구조는 형광 현미경 (그림 6A)에서 GFP 발현을 관찰하여 평가 될 수있다. 성공적인 구조는 더욱 Gluc 표현 (그림 6B)를 평가하여 확인됩니다. 야생 유형과 trisegmented arenavirus의 성공적인 구조를 보여주는 대표적인 결과는 위에 표시된 프로토콜을 사용 하였다.

그림 1
그림 1. Arenavirus 게놈 조직과 virion의 구조. Arenaviruses는 bisegmented 게놈 3 싸여 부정적인 센스 RNA 바이러스이다. 각 세그먼트는 ambisense 코딩 전략은 두 가지 바이러스 PROTEI의 합성을 지시하는 데 사용반대 방향으로 3 NS. 대형 (L) 세그먼트 (7.2 KB)는 RNA 의존 RNA-중합 효소 (L) 및 신진 과정 3을 지시 등의 매트릭스와 같은 기능을 가지고 작은 RING 손가락 단백질 (Z) 인코딩합니다. 소 (S) 세그먼트 (3.5 KB)은 당 단백질 전구체 (GPC)와 핵 단백질 (NP)를 인코딩합니다. GPC는 포스트 translationally 수용체의 인식 및 셀 항목 17, 18에 대한 책임 virion의 구조의 표면에 스파이크를 구성하는 당 단백질 복합체 (GP)를 형성하기 위해 연결 GP-1 GP-2를 생성하는 처리입니다. 순이익은 바이러스 성 RNA (vRNA와) 게놈 encapsidates 함께 L 단백질 양식을 바이러스 복제와 전사 12 최소한의 구성 요소 바이러스 ribonucleoproteins (vRNPs). IGR : intergenic 지역.

그림 2
그림 2. Arenavirus rescu전자 플라스미드. 베로 세포에서 재조합 arenavirus의 생성에 사용되는 플라스미드의 다이어그램. 플라스미드 단백질 발현 pCAGGs는 바이러스 L과 순이익 4, 7의 합성을 지시하는 닭 β-액틴 프로모터와 토끼 β-글로빈 폴리아 데 닐화 (PA) 신호 시퀀스를 사용합니다. CMV-IE 증강 : 사이토 메갈로 바이러스 즉시 초기 확장기. 인트론 : 닭 β-액틴 인트론 서열. HPOL-I 플라스미드는 바이러스 성 RNA 세그먼트의 합성을 지시하는 인간의 중합 효소에게 I 프로모터와 쥐 중합 종료 시퀀스를 사용합니다. pCAGGs 및 HPOL-I 플라스미드 모두 암피실린 내성 (Ampr)입니다.

그림 3
그림 3. . pCAGGs NP와 L, 그리고 HPOL-I S와 L. NP와 L 요구된다 야생형과 trisegmented arenavirus 구조 검은 색 타원형에서 재조합 야생형 arenavirus의 생성에 필요한 플라스미드 있습니다바이러스 전사 및 복제를 시작할 라. HPOL-I S와 S와 L antigenomic RNA 종의 폴-I를 통해 L 직접 세포 합성. pCAGGs NP와 L뿐만 아니라 HPOL-I 야생 형 arenavirus 구조에 대해 설명한 것과 동일있는 플라스미드 L :. 빨간색 타원을 trisegmented arenaviruses의 생성에 필요한 플라스미드는 HPOL-I S는 두 개의 플라스미드로 구분됩니다 : 플라스미드 하나, 순이익은 GFP (HPOL-I S GFP / GP)로 대체하고 다른 플라스미드에, GP는 Gluc 유전자 (HPOL-I S NP / Gluc로 대체됩니다 ).

그림 4
그림 4. Arenavirus 구조 프로토콜. Arenavirus 구조는 6 잘 플레이트 형식을 사용하여 베로 세포에서 수행됩니다. 간단히, 베로 세포 lipofectamine과 2000을 사용하여 1 일에 정지에 형질 전환됩니다. 24 시간 후 형질에서 미디어 신선한 전염성 미디어로 대체됩니다. 형질 전환 세포에 대한 배양하는 추가로 48 시간 후 스케일 업 100mm 요리 (4 일)에. 100 밀리미터 요리 베로 세포는 추가로 72 시간 동안 배양한다. 7 일 후 형질 TCS에서 IFA (rLCMV 및 rCandid # 1) 또는 형광 현미경 (r3LCMV 및 r3Candid # 1) 신선한 베로 세포에서 다음과 같은 감염 중 하나에 의해 바이러스 탐지를 위해 수집됩니다. 바이러스 역가가 예상보다 낮은 경우, TCS는 바이러스를 증폭하는 신선한 베로 세포를 감염 할 수 있습니다.

그림 5
그림 5. 세포 통로 (100mm 요리)에서 성공적으로 야생형 바이러스 구조. TCS의 확인은 96 - 웰 플레이트에 신선한 베로 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 24 시간 후 감염에서 세포를 고정 투과 및 LCMV 또는 몰래 # 1 특정 항체로 염색하기 전에 차단됩니다. 바이러스 항원의 존재는 형광 현미경을 사용하여 관찰된다. 스케일 바, 100 μm의.

십t "FO : 유지 - together.within 페이지 ="항상 "> 그림 6
그림 6. trisegmented 바이러스의 성공적인 구조. 재조합 trisegmented LCMV (r3LCMV)와 중 1 위 솔직한는 (r3Candid # 1) GFP 및 Gluc를 모두 인코딩합니다. 성공적인 바이러스 구조가 빠르게 형광 현미경 (A)에 의해 결정될 수있다. Gluc 리포터 유전자 발현은 바이러스 구조의 차 확인으로 사용할 수 있습니다. 배 유도는 야생형 바이러스 감염 (B)에 Gluc 발광 값의 정상화에 의해 결정되었다. 스케일 바, 100 μm의.

표 1
표 1. arenavirus 구조에 대한 플라스미드 / lipofectamine과 DNA 농도. 재조합 줘야의 생성에 대한 권장 DNA와 LPF2000 농도베로 세포의 D-타입과 trisegmented arenaviruses가 표시됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 생성은 arenavirus 생물학의 여러 가지 측면의 조사를 위해 널리 사용되는 방법이되고있다. 여기에 우리가 arenavirus를 수행하여 현재 시스템에 중요한 개선을 문서화하는 것은 다른 전염성 질병에 대한 arenaviruses 백신 벡터에 대한 FDA의 승인 백신 후보의 잠재적 인 발생을 허용, 베로 세포에서 구출.

관련 실험 절차는 잘 설립 된 일반에 상당한 장애물을 제기하지 않아야합니다. 신중하게 일관된 성공을 보장하기 위해 모니터링해야 여러 가지 요인이, 그러나있다. 베로 세포의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 성 구조 매우 중요합니다. 또한, 재조합 arenavirus를 (적절한 세포 유지 보수 및 플라스미드 준비를위한 프로토콜 참조)를 생성하는 좋은 플라스미드 준비가 필수적이다. rLCMV 및 rCandi의 구조에 대한D # 1 야생형이나 베로 세포가 쉽게 14 형질하지 않기 때문에 그것은, 성공적인 구조의 가능성을 높이기 위해 각각의 재조합 바이러스에 대한 세 가지 독립적 인 transfections에 추천합니다 그들의 trisegmented 버전. 하나 이상의 재조합 바이러스의 구조를 시도하면, 구출되는 바이러스의 수에 따라 다음 단계를 확장 할 수 있습니다. 음성 대조군으로, 우리는 pCAGGs NP (- pCAGGs NP)의 부재 형질 있습니다.

LCMV와 몰래 # 1에 감염된 세포 클래식 세포 변성 효과 (CPE), 야생 형 rLCMV 성공적으로 바이러스 구조 및 rCandid를 표시하지 않기 때문에 # 1 바이러스 클래식을 사용하여 수행 할 수있는 전염성 자손의 검출을 통해 평가되어야합니다 플라크 분석 또는 IFA를 통해. 전자는 대신 5 24 시간 이내에 완료 할 수 있기 때문에 우리는 고전 상패 분석​​을 통해 IFA의 사용을 권장 - 5 일 패의 개발에 필요한. r3LCMV 또는 r3Candid # 1 (G 두 기자의 유전자를 인코딩 구출FP와 Gluc)는, 따라서 형광 현미경 (GFP) 및 / 또는 발광 (Gluc)에 의한 항체의 필요없이 바이러스 탐지 및 적정 수 있도록합니다. 재조합 LCMV와 몰래 # 1 야생형 구조의 구조에서와 마찬가지로, 실패 trisegmented 바이러스 구조가 형질 전환 된 세포에서 TCS와 접종시 형광 베로 세포의 부족에서 발생합니다.

S와 L의 세그먼트가 인간 polyermase 내가 프로모터에 의해 구동되는 것을 감안할 때,이 구조 시스템은 다른 인간의 세포에 적용 할 수 있습니다. 실제로 우리는 또한 성공적으로 재조합 야생 유형과 trisegmented rLCMV과 높은 효율 293T 인간 배아 신장 세포에서 rCandid # 1 바이러스를 모두 생성 한. 또한, 세포 단층의 형질은 정학 베로와 293T 세포를 형질 때만큼 효율적이지이기는하지만, 바이러스 구조로 만들었습니다. 야생형 LCMV와 중 1 위 솔직한 바이러스 구조의 검출에 관해서는, 다른 바이러스 단백질에 대한 기본 항체도 사용할 수 있습니다. 에서R3 바이러스의 경우, 우리는 발광 대신 GFP 식으로 Gluc을 감지 할 수 있습니다. 또는 다른 리포터 유전자가 Gluc 및 GFP 5의 장소에서 사용할 수 있습니다.

우리의 바이러스 구조 시스템은 우리 손에 매우 효율적인 것으로 입증되었습니다, 그리고 여기 우리는 최고의 형질 조건을 제공합니다. 그것은 매우 플라스미드의 지정된 금액을 사용하는 것이 좋습니다. 바이러스 구조가 다른 인간의 세포 라인, 세포의 양, DNA 및 / 또는 LPF2000에서 수행하는 경우 테스트해야합니다.

베로 세포에 플라스미드 기반의 역 유전학을 사용하여 야생 유형과 trisegmented arenavirus의 세대 arenavirus의 생물학의 여러 측면을 공부뿐만 아니라 FDA의 승인을 백신과 백신 벡터의 미래 발전을위한 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 arenavirus 역 유전학 기술과 플라스미드의 개발 및 개선을위한 JCT 및 LM-S 실험실에서 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. 우리는 또한 기술 지원 Snezhana Dimitrova 감사합니다. JUNV NP (SA02-BG12)로 지정 단클론 항체는 BEI 자원 (NIAID의 바이오 디펜스 및 신흥 감염증 연구 자료 저장소)로부터 얻은 것입니다. BYHC는 기관 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상에서 허가 번호 GM068411에 의해 지원되었다. EO-R은 Fullbright-Conicyt (BIO 2008)와 로체스터 백신 원정대 (2012)받는 사람이다. EO-R 현재 지원은 로체스터 대학의 교수 개발 및 다양성 사무실에서 다양성과 학문적 우수성에 대한 박사 원정대에 의해 제공됩니다. LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 센터 (HHSN266200700008C)에 의해 재정 지원, 그리고바이오 디펜스 면역 모델링 (HHSN272201000055C)를위한 로체스터 센터의 대학.

JCT 실험실에서 연구 보조금 RO1 AI047140, NIH에서 RO1 AI077719, 및 RO1 AI079665에 의해 지원되었다.

Materials

Material and methods
Cell lines
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586).

Plasmids
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis.

Viruses
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed.

Tissue culture media and solutions
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells.

Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections.

10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
  2. Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
  3. Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827 (2007).
  4. Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
  5. Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
  6. Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
  7. Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
  8. Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
  9. Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
  10. Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
  11. Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
  12. Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
  13. Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
  14. Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
  15. Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
  16. Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
  17. Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
  18. Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
  19. Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. J. Vis. Exp. (78), e50662, doi:10.3791/50662 (2013).More

Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. J. Vis. Exp. (78), e50662, doi:10.3791/50662 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter