Summary
Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter bestrijding humane pathogene arenavirussen.
Abstract
De ontwikkeling en implementatie van arenavirus reverse genetics is een belangrijke doorbraak in het areanavirus veld 4. Het gebruik van cel-gebaseerde arenavirus minigenoom systemen samen met de mogelijkheid om recombinant infectueus arenavirussen met voorafbepaalde veranderingen in hun genomen te genereren is het onderzoek naar de bijdrage van virale determinanten van de verschillende stappen van de arenavirus levenscyclus, en virus-gastheer vergemakkelijkt interacties en mechanismen van pathogenese arenavirus 1, 3, 11. Bovendien is de ontwikkeling van trisegmented arenavirussen toegelaten gebruik van de arenavirus genoom aanvullende vreemde genen van interesse en aldus de mogelijkheid van arenavirus gebaseerd vaccin vector toepassingen 5 openen. Ook aan een enkele cyclus infectieuze arenavirussen kan uitdrukken reporter genen verschaft een nieuwe experimentele methode om de veiligheid van onderzoek met highl verbetereny pathogene menselijke arenaviruses 16. De generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken heeft tot nu toe vertrouwd op het gebruik van knaagdieren cellijnen 7,19, die enkele barrières voor de ontwikkeling van de Food and Drug Administration (FDA)-licentie vaccin of vaccinvectoren poses. Om dit obstakel te overwinnen, beschrijven we hier de efficiënte productie van recombinante arenaviruses in FDA-goedgekeurde Vero-cellen.
Introduction
Arenaviruses zijn omhulde virussen met een bisegmented, negatieve-stranded RNA genoom 3 die behoren tot de familie Arenaviridae. De arenavirus genoom codeert vier eiwitten in een ambisense mode uit twee afzonderlijke virale segmenten 3. De grote (L) segment codeert het RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L) en de kleine RING (Really Interesting New Gene) vinger eiwit (Z), dat fungeert als de belangrijkste drijvende kracht van het virus ontluikende. Het kleine (S) segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en het oppervlak glycoproteïne (GP) (figuur 1).
Verscheidene leden van de familie Arenaviridae verantwoordelijk voor dodelijke hemorrhagic fever (HF) bij mensen 3. Principiële zorgen zijn Lassa virus (LASV) en Junín virus (JUNV), waarvan bekend is dat hoge mortaliteit bij gehospitaliseerde patiënten 8, 9 veroorzaken. Hoewel deze virussen zijn endemisch in West-Afrika en landelijke Argentinië, respectievelijk,er zijn toenemende bezorgdheid van de invoer van LASV en JUNV naar niet-endemische gebieden als gevolg van verhoogde reizen 10. Bovendien, hoewel niet gewoonlijk geassocieerd met ernstige ziekten bij de mens, is het prototype arenavirus lymfatische choriomeningitisvirus (LCMV) beschouwd als een verwaarloosde pathogeen als er gevallen van dodelijke infecties zijn in immuungecompromitteerde patiënten 6, 15 en is verantwoordelijk voor aangeboren afwijkingen en spontane abortussen bij zwangere vrouwen 2, 13. Momenteel zijn er geen FDA-goedgekeurde vaccins tegen arenavirussen en behandeling is beperkt tot het nucleoside analoog ribavirine, die slechts gedeeltelijk effectief en vaak geassocieerd met significante bijwerkingen.
De introductie van plasmide-gebaseerde reverse genetics 4 en generatie van recombinant arenaviruses 7, 19 zijn sterk vooruitgegaan op het gebied van arenavirus onderzoek. Momenteel worden cellen van knaagdieren (zoals BHK-21) voor de algeatie van recombinant arenavirussen door de soortspecifieke murine RNA polymerase I (pol-I) promoter de transcriptie van de eerste S en L segmenten. Echter virus rescue in BHK-21 cellen geen goedgekeurde methode voor het genereren van recombinant arenavirussen als potentieel vaccin kandidaten zaad. Hier documenteren wij het gebruik van de menselijke pol-I promotor voor doeltreffende redding van de prototypische Oude Wereld (OW) LCMV en de Nieuwe Wereld (NW) JUNV Candid # 1 stam in Vero-cellen. Met behulp van een soortgelijke methodologie, we gegenereerd recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses dat twee extra vreemde genen gecodeerd in twee verschillende S-RNA-segmenten 5 bevatten. Dit nieuwe systeem volgt niet alleen een zeer reproduceerbare en eenvoudig protocol maar kunnen onmiddellijk worden toegepast bij de vorming van recombinante arenavirussen als potentiële vaccins of vaccin vector zaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arenavirus Rescue Transfection
Ons rescue was gebaseerd op het gebruik van zowel polymerase II eiwit expressieplasmiden die coderen voor de nucleoproteïne (NP) en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L), de virale trans-werkende factoren nodig zijn voor RNA-replicatie en genexpressie van de arenavirus genoom 7, 19 en plasmiden staat om directe intracellulaire synthese, via het cellulair RNA-polymerase I (pol-I), van de S en L antigenoom RNA species 7. In onze studies gebruiken we de pCAGGS eiwitexpressie plasmide, dat de kip β-actine promoter en polyadenylanation (pA) signaalsequenties gebruikt en de menselijke pol I-plasmide, dat het menselijke polymerase I promotor gebruikt en murine terminatorsequenties (figuur 2) . De S en L RNA segmenten worden gekloneerd in het plasmide HPOL-I in een antigenome oriëntatie om voor het genereren van genomische RNA segmenten bij transcriptie bij HPOL-I. Voor de redding van wild-type recombinant LCMV (rLCMV) en Candid # 1 (rCandid nr. 1) de pCAGGS NP en L van elk virus gecotransfecteerd met hun respectievelijke humane pol I-S en L RNA segmenten (Figuur 3). Generatie van recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid nr. 1) was dezelfde protocol maar de S segment werd opgesplitst in twee verschillende pol-I S plasmiden, coderen elk een onderscheidende reportergen: in een, de NP open reading frame (ORF) werd vervangen door het Green Fluorescent Protein (GFP) reporter gen (HPOL-I S GFP / GP) en, in de andere, de virale glycoproteïne precursor (GPC) ORF wordt vervangen Gaussia luciferase (Gluc) reportergen (HPOL-I S NP / Gluc). Een schematische weergave van het protocol is geïllustreerd in figuur 4. De volgende transfectie en infectie-protocol is vastgesteld voor 6-well-platen.
- OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mengsel: Bereid 250 ul OptiMEM media en, afhankelijkhet virus te redden, 10-12 ug LPF2000 (1 ug / ul) per transfectie (tabel 1). Een verhouding van 2,5 ug LPF2000 per ug DNA wordt aanbevolen. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen het plasmide transfectie mengsel in een aparte microcentrifugebuis (stap 1.2).
- Plasmide-DNA transfectie mengsel: Bereid de plasmide transfectie cocktail in een microcentrifugebuis met de aanbevolen hoeveelheden voor elk virus rescue (zie tabel 1). Breng het uiteindelijke volume tot 50 pi met OptiMEM.
- OptiMEM-LPF2000 plasmide-DNA mengsel Voeg 250 ul van de OptiMEM-LPF2000 mengsel (stap 1.1) in het plasmide DNA transfectie mengsel (stap 1.2). Incubeer het mengsel gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur. Ondertussen bereiden en tel 1 x 10 6 Vero-cellen per transfectie reactie. Vero-cellen worden getransfecteerd in suspensie.
- Bereiding van Vero cellen: Vero cells worden gekweekt in 100 mm gerechten. Breng alvorens te beginnen de 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS media, en trypsine-EDTA mengsel tot 37 ° C.
- Was de cellen tweemaal met 5 ml 1x PBS.
- Trypsinize cellen met 1 ml trypsine-EDTA en wacht tot cellen detach (ca. 5 min). Zacht tikken misschien nodig om volledig te verwijderen van de cellen van de gerechten.
- Voorzichtig resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 15 ml centrifugebuis.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 1000 rpm in een centrifuge.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM 10% FBS en 1% PS tellen van de cellen met een hemocytometer en concentratie passen aan 1 x 10 6 cellen / ml. Er werd waargenomen dat 0,5-1 x 10 6 cellen per transfectie Vero de beste resultaten.
- Meng LPF2000/DNA en cellen: Na 20 - 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur (stap 1.3), voeg 1 ml van Vero-cellen (1 x 10 6) (stap 1.4) naarde OptiMEM-LPF2000 plasmide-DNA mengsel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Seed LPF2000/DNA-cell mengsel in 6-well-platen: Voeg de DNA-LPF2000 Vero-mengsel (stap 1.5) in de putjes van de 6-well plaat. Schud de 6-well-plaat en laat de transfectie incubeer overnacht in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Wijzig transfectiemedium: Ongeveer 16-24 uur na transfectie, verwijder de transfectie media, voeg 2 ml van de infectie media en incubeer getransfecteerde cellen voor een extra 48 uur.
- Celpassage: Na 48 uur incubatie in infectie media, verwijder de weefselkweeksupernatant (TCS) en passeren de getransfecteerde cellen in een 100 mm schaal. De TCS bevat zelden besmettelijk virus, omdat de getransfecteerde cellen nodig aanvullende incubatie om virusdeeltjes te genereren. Voor de passage cel:
- Was de cellen tweemaal met 2 ml 1x PBS.
- Trypsinize cellen w ide 0,5 ml trypsine-EDTA en wacht tot cellen los.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 5000 rpm, 4 ° C in een microcentrifuge.
- Resuspendeer voorzichtig de cellen in 1 ml van infectie media en overbrengen van de cellen naar een 100 mm schaal. Breng het totale volume van de plaat, met besmettelijke media, 8 ml, voldoende volume om uitdroging te voorkomen van de cellen en voor het concentreren van het virus.
- Schud de 100 mm schaal en verder het incuberen van Vero-cellen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 72 uur.
- Collectie van TCS: Na 72 uur incubatie, het verzamelen van de TCS in een 15 ml centrifugebuis. Verwijder celresten door centrifugeren gedurende 5 min bij 2500 rpm in een centrifuge. Infectieuze arenavirus wordt gevonden in de TCS, zodat uit de celresten pellet en opslaan TCS bij -80 ° C.
Detectie van een succesvolle redding van rLCMV en rCandid # 1 geschiedt via een focus-vormende eenheid (FFU) immunofluorescentie assay (IFA). Voor wild-type virus rescue gebruiken we antilichamen specifiek voor de virale NP. De r3LCMV en r3Candid nr.1 coderen twee reportergenen (GFP en Gluc), waardoor virale detectie en titratie zonder de noodzaak van antilichamen door fluorescentiemicroscopie (GFP) en / of luminescentie (Gluc).
- Bevestig wild-type recombinante arenavirus rescue: De dag vóór titratie, wassen Vero-cellen tweemaal met PBS, trypsinize en bereiden 96-well platen tot 80 te bereiken - 90% samenvloeiing volgende dag (4 x 10 4 cellen / putje). Schud de platen met de hand om een geüniformeerde verdeling van de cellen te krijgen. Cultuur van de cellen een nacht in de 37 ° C incubator met 5% CO2. Controleer de cellen onder de microscoop om een monolaag te bevestigen, alvorens verder te gaan met de infectie:
- Serieel verdund (10 voudige verdunningen) de virus-bevattende TCS gewonnen uit de getransfecteerde cellen in de 100 mm schaal (stap 1.10) in OptiMEM.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de gezaaide Vero-cellen, wassen tweemaal met 50 pi 1x PBS, en infecteren cellen met 50 ul van de serieel verdund virus (stap 2.1). Infecteren cellen gedurende 1,5 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na infectie, verwijder de virusinoculum, voeg 100 ul van infectie media / putje en incubeer de cellen voor 16 - 18 uur. Virale re-infectie kan optreden na 18 uur incubatie, wat kan leiden tot overschatting van de virale titers.
- Bij 16 - 18 uur na infectie, verwijder de TCS van elk putje en zet de cellen met 4% formaldehyde opgelost in 1 x PBS, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Vervolgens verwijdert de fixeeroplossing en doorlaatbaar de cellen met 0,1% triton X-100 verdund in 1 x PBS, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het permeabilisatie oplossing, daarna wassen cellen 3 maal with 1x PBS.
- Blokkeer de cellen met 2,5% runderserum albumine (BSA) in 1x PBS (blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Als alternatief kunnen de cellen worden overnacht bij 4 ° C geblokkeerd en voortgezet met antilichaam incubatie de volgende dag.
- Maak ondertussen het primaire antilichaam. Verdun de LCMV-en Candid # 1-specifieke primaire antilichamen in blockingbuffer en centrifugeer de antilichaam / blokkerende oplossing gedurende 15 minuten bij 3.500 rpm. De monoklonale anti-LCMV NP antilichaam kloon 1.1.3 (1:30 verdunning) 16 en de monoklonale anti-JUNV NP antilichaam SA02-BG12 van BEI Resources (1:500 verdunning) kan worden gebruikt voor de detectie van rLCMV en rCandid nr.1 respectievelijk.
- Na 1 uur incubatie, zuigen de blockingbuffer en voeg 50 ul van het primaire antilichaam aan de cellen en incubeer 1 uur bij 37 ° C.
- Op dit moment Verdun het secundaire antilichaam in blockingbuffer en centrifugeer de antilichaam / blokkerende oplossing gedurende 15 minuten bij 3.500 rpm. De polyklonale konijn anti-muis IgG FITC tweede antilichaam voor de detectie van primaire monoklonale antilichamen werd gebruikt om beelden waargenomen in figuur 5 te verkrijgen.
- Na 1 uur incubatie zuig het primaire antilichaam, was 3 maal met 1 x PBS en voeg het secundaire antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Na 30 min incubatie, zuig het secundaire antilichaam en was 3 keer met 1x PBS. De cellen zijn nu klaar om te worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie aan beide bepalen het succes van virale redding en titratie door het tellen van de focus eenheden per ml (FFU / ml).
- r3LCMV en r3Candid # 1 viral rescue: Omdat deze virussen uiten twee reporter genen, hun reddingen kunnen worden gecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie om GFP expressie of Gluc expressie in TCS detecteren. Rescue kan ook worden bevestigd door expressie van Gluc in TCS. Om de trisegmented virussen titreren, volgen we de stappen 2.1 tot en met 2.1.4, echter cellen hoeven niet te be bevestigd aan een succesvolle virale redding door GFP-expressie te bepalen. De titratie van het virus wordt bepaald door het tellen van de FFU / ml. Om succesvolle virale redding bepalen door Gluc expressie Gluc expressie van TCS kunnen worden gemeten met een Gluc assay kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay kit, New England Biolabs). Daartoe:
- Pipet 100 ul van TCS in een 96-well witte plaat (Platbodem microtiterplaten, Fisher Scientific).
- Stel de lichtmeter (LumiCount, Packard Biosciences).
- Voeg 50-100 ul Gluc Assay oplossing (zoals aanbevolen door de fabrikant) aan elk monster en meet de Gluc reportergenexpressie met de luminometer. Als negatieve controle werd Gluc expressie van de TCS van de wildtype virussen geïnfecteerde cellen gemeten.
3. Passage van Tissue Culture Supematanten
Virale redding is afhankelijk van transfectie efficiëntie. Vero-cellen is aangetoondtot lagere transfectie efficiëntie dan andere cellijnen 14 hebben. Als virustiters in de TCS zijn laag, infecteren verse Vero-cellen bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01 (LCMV) of 0.1 (Spontaan # 1) voor 72 uur om het virus te versterken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle redding van een recombinant wildtype arenavirus wordt bevestigd door de aanwezigheid van virale antigenen met IFA (figuur 5). Bij recombinante trisegmented virussen kunnen succesvolle virale redding worden beoordeeld door het observeren GFP expressie door fluorescentie microscopie (figuur 6A). Succesvolle rescue zullen verder bevestigd door het beoordelen Gluc expressie (Figuur 6B). Representatieve resultaten illustreren de succesvolle redding van wild-type en trisegmented arenavirus werden verkregen volgens de hierboven aangegeven protocol.
Figuur 1. Arenavirus genoomorganisatie en virionstructuur. Arenavirussen zijn gehuld, negatief-sense RNA-virussen met bisegmented genomen 3. Elk segment gebruikt een ambisense coderingsstrategie aan de synthese van twee virale proteins in tegengestelde richting 3. De grote (L) segment (7.2 kb) codeert voor het RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L) en de kleine RING-vinger eiwit (Z) die matrix-achtige functies, waaronder de leiding van de ontluikende proces 3 heeft. De Small (S)-segment (3,5 kb) codeert voor het glycoproteïne precursor (GPC) en de nucleoproteïne (NP). GPC post-translationeel verwerkt tot GP-1 en GP-2, die associëren met het complex glycoproteïne (GP) de pieken op het oppervlak van de virion structuur die verantwoordelijk is voor receptorherkenning en celbinnendringing 17, 18 vormen te vormen produceren. NP encapsidates het virale RNA (vRNA) genoom en met de L-eiwit vormen de virale ribonucleoproteins (vRNPs) de minimale elementen voor virale replicatie en transcriptie 12 zijn. IGR: intergengebied.
Figuur 2. Arenavirus rescue plasmiden. Diagram van de plasmiden gebruikt voor het genereren van recombinant arenavirus in Vero-cellen. Eiwitexpressie pCAGGS plasmide gebruikt chicken β-actine promoter en het konijn β-globine polyadenylatie (pA) signaalsequenties voor de synthese van virale L en NP 4, 7. CMV-IE enhancer: cytomegalovirus directe vroege enhancer. Intron: kip β-actine intronsequentie. De HPOL-I plasmiden gebruikt de menselijke polymerase I promotor en murine polymerase terminator sequenties de synthese van virale RNA-segmenten. Zowel pCAGGS en HPOL-I plasmiden zijn ampicilline resistente (Ampr).
Figuur 3. . Wild-type en trisegmented arenavirus redding In de zwarte ovale de vereiste plasmiden voor de productie van recombinant wildtype arenavirus: pCAGGS NP en L en HPOL-I S en L. NP en L vereisend om virale replicatie en transcriptie te initiëren. De HPOL-I S en L directe intracellulaire synthese, via pol-I, S en L antigenomische RNA species. In de rood ovaal zijn de plasmiden die voor het genereren van trisegmented arenavirussen: pCAGGS NP en L, alsook de HPOL-iL plasmide, die dezelfde als die beschreven voor wildtype arenavirus rescue. De HPOL-I S wordt verdeeld in twee plasmiden: in een plasmide wordt vervangen door GFP NP (HPOL-I S GFP / GP) en in de andere plasmide, wordt het GP vervangen door Gluc gen (HPOL-I S NP / Gluc ).
Figuur 4. Areanavirus rescue protocol. Areanavirus rescue gebeurt in Vero cellen onder toepassing van een 6-well plaat formaat. In het kort worden Vero cellen die in suspensie op dag 1 met gebruik van Lipofectamine 2000. Op 24 uur na transfectie, wordt medium vervangen door vers medium infectieuze. Getransfecteerde cellen worden geïncubeerd een extra 48 uur en vervolgens opgeschaald naar een 100 mm gerechten (Dag 4). Vero cellen in 100 mm schalen worden gedurende een additionele 72 uur. Op dag 7 na transfectie TCS worden verzameld voor virale detectie door beide IFA (rLCMV en rCandid # 1) of fluorescentie microscopie (r3LCMV en r3Candid # 1) volgende infectie in vers Vero-cellen. Indien de virale titers lager dan verwacht, kan TCS worden gebruikt om verse Vero cellen te infecteren om het virus te amplificeren.
Figuur 5. Bevestiging van een succesvolle wildtype virale redding. TCS van cel passage (100 mm schalen) worden gebruikt om verse Vero cellen te infecteren in 96-well platen. Op 24 uur na infectie worden de cellen gefixeerd, gepermeabiliseerd en geblokkeerd vóór kleuring met LCMV-of Candid # 1-specifieke antilichamen. Aanwezigheid van virale antigenen waargenomen middels fluorescentiemicroscopie. Schaalbalken 100 urn.
Figuur 6. Succesvolle redding van trisegmented virussen. Recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid # 1) coderen zowel GFP en Gluc. Succesvolle virale redding kan eenvoudig worden bepaald door fluorescentiemicroscopie (A). Gluc reporter genexpressie kan worden als secundaire bevestiging van virale redding. Voudige inductie werd bepaald door normalisatie van Gluc luminescentie waarden wild-type virus infecties (B). Schaalbalken 100 urn.
Tabel 1. Lipofectamine / plasmide-DNA-concentratie voor arenavirus redding. Aanbevolen DNA en LPF2000 concentraties voor het genereren van recombinant Wild-type en trisegmented arenavirussen in Vero-cellen worden aangegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken is uitgegroeid tot een veel gebruikte aanpak voor het onderzoeken van vele verschillende facetten van arenavirus biologie. Hier documenteren we een cruciale verbetering van het huidige systeem door het uitvoeren arenavirus reddingen in Vero-cellen, waardoor de potentiële productie van FDA-goedgekeurde kandidaten vaccin tegen arenaviruses en vaccinvectoren tegen andere besmettelijke ziekten.
De experimentele procedures die betrokken zijn in het algemeen vast en mag geen belangrijke obstakels vormen. Er zijn echter verschillende factoren die zorgvuldig moet worden gecontroleerd om een consistente succes te garanderen. Goed onderhoud van Vero-cellen is cruciaal voor een succesvolle virale redden. Daarnaast is het noodzakelijk om een goede plasmidepreparaten moeten recombinant arenavirus (zie Protocol voor de juiste cel onderhoud en plasmide voorbereiding) genereren. Voor de redding van rLCMV en rCandid # 1 wild-type of de trisegmented versies wordt aanbevolen drie onafhankelijke transfecties van elke recombinant virus om de kans op een succesvolle redding verhogen, zoals Vero-cellen niet gemakkelijk getransfecteerd 14. Als meer dan een recombinant virus redding wordt geprobeerd, de schaal van de volgende stappen dienovereenkomstig aan om het aantal virussen worden gered. Als negatieve controle, nemen we een transfectie in afwezigheid van pCAGGS NP (pCAGGS-NP).
Sinds LCMV-en Candid # 1-geïnfecteerde cellen niet classic cytopathisch effect (CPE), succesvolle virale redding van wild-type rLCMV en rCandid weer # 1 virussen moet worden beoordeeld door de detectie van besmettelijke nageslacht, die kunnen worden gedaan met behulp van een klassieker plaque assay of via IFA. Wij raden het gebruik van de IFA over de klassieke plaque assay omdat de voormalige kan worden voltooid binnen 24 uur in plaats van de 5-6 dagen die nodig zijn voor de ontwikkeling van plaques. De r3LCMV of r3Candid # 1 wordt gered coderen twee reporter genen (GFP en Gluc), waardoor virale detectie en titratie mogelijk zonder van antilichamen door fluorescentiemicroscopie (GFP) en / of luminescentie (Gluc). Zoals in de redding van recombinant LCMV en Candid # 1 wildtype redding, zal een mislukte trisegmented virus redding resulteren in het gebrek aan fluorescerende Vero cellen na inoculatie met TCS van getransfecteerde cellen.
Aangezien de S en L segmenten worden aangedreven door de menselijke polyermase I promoter, kan dit rescue system worden toegepast in andere menselijke cellen. Inderdaad hebben we met succes geproduceerd zowel recombinant wild-type en trisegmented rLCMV en rCandid nr.1 virussen in 293T menselijke embryonale niercellen met een hoog rendement. Daarnaast transfectie in celmonolagen ook tot virus te redden, hoewel minder efficiënt bij transfectie Vero en 293T cellen in suspensie. Met betrekking tot de detectie van wild-type en LCMV Candid nr.1 virale redding kan primaire antilichamen tegen andere virale eiwitten worden gebruikt. In hetBij de r3 virussen konden we Gluc te detecteren door luminescentie plaats van GFP expressie. Alternatief kunnen andere reportergenen worden gebruikt in plaats van Gluc en GFP 5.
Onze virus rescue systeem heeft bewezen zeer efficiënt te zijn in onze handen, en hier bieden wij de beste transfectie voorwaarden. Het wordt sterk aanbevolen om de aangegeven hoeveelheden van plasmiden gebruiken. Als virus redding wordt uitgevoerd in andere humane cellijnen, de hoeveelheid cellen, DNA en / of LPF2000 worden getest.
De generatie van wild-type en trisegmented arenavirus met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics in Vero-cellen zal zorgen voor het bestuderen van meerdere aspecten van de biologie van arenavirus alsook voor de toekomstige ontwikkeling van de FDA goedgekeurde vaccins en vaccinvectoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken heden en verleden leden in JCT en LM-S laboratoria voor de ontwikkeling en verbetering van de arenavirus reverse genetics technieken en plasmiden. We danken ook Snezhana Dimitrova voor technische ondersteuning. Het monoklonaal antilichaam gericht om JUNV NP (SA02-BG12) werd verkregen van BEI Resources (NIAID Biodefense en opkomende infecties Research Resources Repository). BYHC werd ondersteund door Grant Number GM068411 van Institutionele Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R is een Fulbright-Conicyt (BIO 2008) en een Rochester Vaccin Fellowship (2012) ontvanger. EO-R huidige ondersteuning wordt geleverd door een postdoctorale Fellowship voor Diversiteit & Academic Excellence van het Bureau voor Faculty Development & Diversiteit aan de Universiteit van Rochester. Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gefinancierd door de NIH subsidie RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700008C), enDe Universiteit van Rochester Centrum voor Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).
Onderzoek bij JCT laboratorium werd ondersteund door subsidies RO1 AI047140, RO1 AI077719 en RO1 AI079665 van NIH.
Materials
| Material and methods | |||
| Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
References
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
