Summary
Спасение рекомбинантных аренавирусы из клонированных кДНК, подход называют обратной генетики, позволяет исследователям исследовать роль специфических вирусных генных продуктов, а также вклад их различных конкретных областях и остатки, ко многим различным аспектам биологии ареновирус . Кроме того, методы обратной генетики в FDA утвержденных клеточных линий (Vero) для разработки вакцины обеспечивает новые возможности для создания эффективных и безопасных вакцин для борьбы человека аренавирусы патогенными.
Abstract
Разработка и реализация ареновирус обратной генетики представляет собой значительный прорыв в 4 поля ареновирус. Использование клеточных ареновирус минигеном систем вместе с способность генерировать рекомбинантного инфекционного аренавирусы с заданными мутациями в их геномах способствовал исследованию вклада вирусных детерминант в различных этапах жизненного цикла ареновирус, а также вирус-хозяин взаимодействий и механизмов ареновирус патогенез 1, 3, 11. Кроме того, развитие trisegmented аренавирусы разрешил использование ареновирус генома выразить дополнительную интерес чужеродных генов, тем самым открывая возможность ареновирус вакцины на основе вектора приложения 5. Кроме того, развитие однотактную инфекционных аренавирусы способны выразить гены репортер обеспечивает новый экспериментальный инструмент для повышения безопасности исследований с участием Highlу человека патогенных аренавирусы 16. Поколение рекомбинантных аренавирусы использованием плазмиды на основе обратной генетики до сих пор полагались на использование линий грызунов клетки 7,19, что создает некоторые препятствия для развития пищевых продуктов и медикаментов (FDA)-лицензированной вакцины или вакцины векторов. Чтобы преодолеть это препятствие, мы описываем здесь эффективное производство рекомбинантных аренавирусы в FDA утвержденных Vero клеток.
Introduction
Аренавирусы окутаны вирусов с bisegmented, отрицательная РНК генома 3, которые принадлежат к семейству Arenaviridae. Ареновирус генома кодирует белки в четыре ambisense моды из двух отдельных вирусных сегментов 3. Большой (L) сегмент кодирует РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) и малое кольцо (действительно интересный новый ген) палец белка (Z), которая служит главной движущей силой вируса почкованием. Маленький (S) сегмент кодирует вирусный нуклеопротеина (NP), а поверхность гликопротеина (GP) (рис. 1).
Несколько членов семьи Arenaviridae ответственны за смертельные геморрагические лихорадки (HF) в организме человека 3. Из принципа опасения вируса Ласса (LASV) и вирус Хунин (JUNV), который как известно, вызывают высокую смертность у больных, госпитализированных 8, 9. Хотя эти вирусы являются эндемичными для Западной Африки и сельских Аргентине, соответственно,Есть растущую озабоченность ввоза LASV и JUNV чтобы не эндемичных районах в связи с увеличением числа поездок 10. Кроме того, хотя обычно не связаны с тяжелыми заболеваниями у людей, прототип ареновирус лимфоцитарные хориоменингита (LCMV) считается возбудителем пренебречь, поскольку были случаи смертельных инфекций у пациентов с иммунодефицитом 6, 15 и отвечает за врожденные аномалии и спонтанные аборты у беременных женщин, 2, 13. Пока ни один американский FDA-разрешенных вакцин против аренавирусы и лечение ограничивается аналог нуклеозидов рибавирином, которая лишь частично эффективны и часто связано со значительными побочными эффектами.
Внедрение на основе плазмиды обратной генетики и 4 поколение рекомбинантных аренавирусы 7, 19 в значительной степени продвинули области ареновирус исследований. В настоящее время клетки грызунов (например, ВНК-21) используются для вообще говоряAtion рекомбинантных аренавирусов из-за видоспецифических мышиной РНК-полимеразы I (поли-I) промотор, направляющий начальной транскрипции S и L сегментов. Однако вирус спасения в клетках ВНК-21 не утвержденного метода получения рекомбинантных аренавирусы в качестве потенциальных кандидатов семян вакцины. Здесь мы документировать использование человеческих POL-я промоутер для эффективного спасения прототипом Старого Света (OW) LCMV и Новый Свет (NW) JUNV Откровенный № 1 напряжения в клетках Vero. Использование аналогичной методологии, мы получили рекомбинантный trisegmented LCMV (r3LCMV) и откровенной № 1 (r3Candid # 1) аренавирусы, которые содержат два дополнительных чужеродные гены закодированы в двух различных сегментов РНК S 5. Эта новая система не только следует высокой воспроизводимостью и простой протокол, но могут быть непосредственно реализованы в получения рекомбинантных аренавирусов как потенциальные вакцины или семена вакцинного вектора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансфекцию ареновирус спасения
Наши спасательных система основана на использовании как полимеразой II экспрессии белка плазмидами, кодирующими нуклеопротеина (NP) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (L), вирусный транс-действующие факторы, необходимые для репликации РНК и экспрессии генов в геноме ареновирус 7, 19 и плазмиды, способные направлять внутриклеточный синтез, через сотовую РНК-полимеразы I (поли-I) из S и L антигеном виды РНК 7. В наших исследованиях мы используем pCAGGs плазмиды экспрессии белка, который использует куриный β-актин промотора и polyadenylanation (PA) сигнальные последовательности, и человеческий POL-я плазмиды, которая использует человеческие полимеразы промотор и терминатор мышиных последовательностей (рис. 2) . S и L сегментов РНК клонируют в HPOL-I плазмиды в антигеномную ориентации для обеспечения генерации геномных сегментов РНК после транскрипции HPOL-I. По спасению диких-воPE рекомбинантных LCMV (rLCMV) и откровенной № 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP и L друг от вируса котрансфицировали вместе с их соответствующими человека POL-I S и L сегментов РНК (рис. 3). Генерация рекомбинантного trisegmented LCMV (r3LCMV) и откровенной № 1 (r3Candid № 1), а затем аналогичный протокол, но сегмент S была разделена на две различные плазмиды POL-I S, каждый из которых кодирует ген-репортер отличительных: в одном, NP открытые чтения рамка (ORF) был заменен на зеленый флуоресцентный белок (GFP) ген-репортер (HPOL-I S GFP / GP) и, с другой стороны, вирусный предшественник гликопротеина (ГПХ) ORF заменяется Gaussia люциферазы (Gluc) ген-репортер (HPOL-I S NP / Gluc). Схематическое представление протокола показано на рисунке 4. После трансфекции и инфекции протокол был установлен на 6-луночные планшеты.
- OptiMEM Lipofectamine-2000 (LPF2000) смеси: Подготовьте 250 мкл среды OptiMEM и, в зависимостина вирус спасательных, 10 - 12 мкг LPF2000 (1 мкг / мкл) в трансфекции (таблица 1). Отношение 2,5 мкг LPF2000 на мкг ДНК рекомендуется. Инкубировать в течение 5 - 10 мин при комнатной температуре. Между тем, готовить смесь трансфекции плазмидой в отдельную пробирку микроцентрифужных (шаг 1.2).
- Плазмиду смесь трансфекции ДНК: Подготовка трансфекции плазмидой коктейль в микроцентрифуге трубки с помощью рекомендуемое количество для каждого вируса спасательных работ (см. таблицу 1). Принесите конечный объем до 50 мкл с OptiMEM.
- OptiMEM-LPF2000-ДНК плазмиды смеси: Добавить 250 мкл OptiMEM-LPF2000 смеси (шаг 1.1) в смеси трансфекции плазмиды ДНК (шаг 1.2). Инкубируют в эту смесь в течение 20 - 30 мин при комнатной температуре. В то же время подготовить и считать 1 х 10 6 клеток на Vero трансфекции реакции. Vero клетки будут трансфицированных в суспензии.
- Подготовка клетки Веро: Vero челлс культивируют в 100 мм чашек. Перед началом приведения 1х PBS, DMEM 10% FBS, 1% PS информации и трипсин-ЭДТА смесь до 37 ° C.
- Мытье клетки дважды с 5 мл 1x PBS.
- Trypsinize клеток с 1 мл трипсина-EDTA и подождите, пока клетки отделяются (около 5 мин). Нежный нарезание возможно, необходимые для полного открепления клеток от блюд.
- Осторожно ресуспендирования клеток в 10 мл среды DMEM 10% FBS, 1% PS в 15 мл центрифужную пробирку.
- Центрифуга клетки в течение 5 минут при 1000 оборотов в минуту в центрифуге.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл среды DMEM 10% FBS, 1% PS и подсчета клеток с использованием гемоцитометра и регулировать концентрации 1 × 10 6 клеток / мл. Было отмечено, что 0,5 - 1 х 10 6 клеток на Vero трансфекции показали наилучшие результаты.
- Смешайте LPF2000/DNA и клеток: через 20 - 30 мин комнатной температуры инкубации (шаг 1.3), добавить 1 мл клеток Веро (1 х 10 6) (шаг 1.4) кOptiMEM-LPF2000-ДНК плазмиды смеси и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
- Семенной LPF2000/DNA-cell смесь в 6-луночные планшеты: Добавить ДНК-LPF2000-Веро смеси (шаг 1,5) в лунки 6-луночного планшета. Аккуратно встряхните 6-и-тарелку и потом трансфекции инкубировать в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Изменить трансфекционную среду: около 16 - 24 часов после трансфекции, удалите трансфекции СМИ, добавляют 2 мл инфекции СМИ и инкубировать трансфекции клеток в течение 48 часов.
- Сотовые пассаж: После 48 часов инкубации инфекции в средствах массовой информации, удалить супернатанта клеточной культуры (TCS) и передать трансфицированным клеток в 100 мм блюдо. TCS редко содержит инфекционный вирус, потому что Трансфицированные клетки нуждаются в дополнительной инкубации для создания вирусных частиц. Для ячейки пассаж:
- Мытье клетки дважды по 2 мл 1x PBS.
- Trypsinize клетки W го 0,5 мл трипсина-EDTA и ждать, пока клетки отсоединить.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл среды DMEM 10% FBS, 1% PS в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга клетки в течение 5 минут при 5000 оборотов в минуту, 4 ° С в микроцентрифуге.
- Осторожно ресуспендирования клеток в 1 мл среды инфекции и передачи клеткам 100 мм чашку. Поднимают общего объема в пластине с инфекционными информации, в 8 мл, достаточный объем, чтобы предотвратить высыхание клеток, а также для концентрации вируса.
- Осторожно встряхнуть 100 мм чашку и продолжают инкубацию Vero клеток в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 72 час.
- Коллекция TCS: После 72 часов инкубации, собирать TCS в 15 мл центрифужные пробирки. Удалить клеточного дебриса центрифугированием в течение 5 мин при 2500 оборотах в минуту в центрифуге. Инфекционные ареновирус находится в TCS, так что удалить из клетки мусора гранул и хранить TCS при -80 ° С.
Обнаружение успешное спасение rLCMV и rCandid № 1 осуществляется через блок формирования фокуса (ФФУ) иммунофлюоресценции (РИФ). Для вируса дикого типа спасательных мы используем антитела, специфичные к вирусным NP. R3LCMV и r3Candid # 1 кодируют два репортерных генов (GFP и Gluc), что позволяет вирусной обнаружения и титрование без необходимости антител с помощью флуоресцентной микроскопии (GFP) и / или люминесценции (Gluc).
- Подтвердите дикого типа рекомбинантных спасательных ареновирус: За день до титрования, мыть клетки Веро дважды PBS, Trypsinize и подготовить 96-луночных планшетов достигнет 80 - 90% слияния следующий день (4 х 10 4 клеток / лунку). Осторожно встряхнуть пластин вручную, чтобы получить равномерное распределение клеток. Культуры клеток, в одночасье, в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. Проверьте клеток под микроскопом, чтобы подтвердить монослой, прежде чем приступить к инфекции:
- Серийно разбавленных (10 кратное разбавление), содержащих вирус TCS извлечены из трансфицированных клеток в 100 мм чашке (шаг 1,10) в OptiMEM.
- Удалите носитель из посеянных клетки Vero, мыть два раза с 50 мкл 1x PBS, и инфицировать клетки с 50 мкл серийно разводили вируса (шаг 2.1). Infect клетки в течение 1,5 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- После заражения, удалить вирус посевной, добавьте 100 мкл инфекции СМИ / лунку и инкубировать клетки в течение 16 - 18 час. Вирусные повторное инфицирование может произойти после 18 ч инкубации, что может привести к переоценке вирусные титры.
- В 16 - 18 ч после инфицирования удалить TCS из каждой лунки и фиксации клеток с 4% формальдегидом разведенного в 1 × PBS, в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Затем удалите фиксирующем растворе и клетки проницаемыми с 0,1% тритона Х-100 разбавляют в 1 × PBS, в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте пермеабилизации решение, то мыть клетки 3 раза Wiй 1x PBS.
- Блок клеток с 2,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в 1х PBS (блокирующий раствор) в течение 1 часа при комнатной температуре. Альтернативно клетки можно блокировать в течение ночи при 4 ° С и продолжали инкубацию с антителом на следующий день.
- Тем временем подготовки первичного антитела. Развести LCMV и Candid # 1-специфический первичными антителами в блокирующем растворе, а затем центрифугируют антитело / блокирующий раствор в течение 15 мин при 3500 оборотах в минуту. Моноклональное анти-LCMV NP антител клона 1.1.3 (1:30 разбавление) 16 и моноклональных анти-NP JUNV антитело SA02-BG12 от BEI ресурсов (разведение 1:500) может быть использован для обнаружения rLCMV и rCandid # 1 соответственно.
- После 1 часа инкубации, аспирации блокирующего раствора и добавляют 50 мкл первичного антитела к клеткам и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
- В это время, разбавленные вторичные антитела в блокирующем растворе, а затем центрифугируют антитело / блокирующий раствор в течение 15 мин при 3500 оборотах в минуту. Поликлональной кроличьего антитела против мышиного IgG FITC вторичными антителами для обнаружения первичных моноклональные антитела были использованы для получения изображения наблюдались на рисунке 5.
- После 1 часа инкубации, аспирации первичных антител, промыть 3 раза 1 × PBS и добавьте вторичным антителом в течение 30 мин при 37 ° С.
- После 30 мин инкубации, аспирации вторичные антитела и промыть 3 раза с 1x PBS. Клетки теперь готовы наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии как определять успех вирусной спасательных и титрование путем подсчета фокус единиц на мл (ФФУ / мл).
- r3LCMV и r3Candid # 1 вирусные помощь: Поскольку эти вирусы передачи двух репортерных генов, их спасает можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии для обнаружения GFP выражение или Gluc выражение в ТКС. Спасение может быть также подтверждается выражением Gluc в ТКС. На титрование trisegmented вирусы, мы следуем шаги 2.1 до 2.1.4, однако клетки не нужно Bэлектронной фиксируется для определения успешной вирусной спасательных из-за GFP выражения. Титрования вируса будет определен путем подсчета ФФУ / мл. Для определения успешный вирусный спасение Gluc выражение, Gluc выражение из TCS может быть измерена с использованием набора для анализа Gluc (Biolux Gaussia набора для анализа люциферазы, New England Biolabs). С этой целью:
- Внесите 100 мкл TCS в 96-а белая пластина (плоское дно микротитрационные планшеты, Fisher Scientific).
- Настройка люминометра (LumiCount, Packard Biosciences).
- Добавить 50 - 100 мкл Assay Gluc раствора (в соответствии с рекомендациями производителя) к каждому образцу и измерить Gluc экспрессии гена репортера в фотометр. В качестве отрицательного контроля, Gluc выражение TCS с вирусами дикого типа инфицированных клеток была измерена.
3. Прохождение Супернатанты тканевой культуры
Вирусные спасательных зависит от эффективности трансфекции. Vero клетки, как было показано, имеют более низкую эффективность трансфекции по сравнению с другими клеточными линиями 14. Если титры вируса в TCS низки, инфицировать свежий Vero клеток при множественности инфекции (MOI), 0,01 (LCMV) или 0,1 (Candid # 1) в течение 72 ч, чтобы усилить вируса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное спасение рекомбинантного дикого типа ареновирус будет подтверждено присутствие вирусных антигенов использованием IFA (рис. 5). В случае trisegmented рекомбинантных вирусов, успешной вирусной спасательных можно оценить путем наблюдения GFP выражение с помощью флуоресцентной микроскопии (фиг. 6А). Успешное спасение будет дополнительно подтверждена путем оценки Gluc выражение (фиг.6В). Типичные результаты, иллюстрирующие успешное спасение дикого типа и trisegmented ареновирус были получены с использованием указанных выше протокола.
Рисунок 1. Ареновирус организации генома и структуре вириона. Аренавирусы окутаны, отрицательной смысловой РНК-вирусы с геномами bisegmented 3. Каждый сегмент использует ambisense стратегии кодирования, чтобы направить синтез двух вирусных Proteiнс в противоположной ориентации 3. Большой (L) сегмента (7,2 Kb) кодирует РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) и небольшой белок палец кольцо (Z), которая имеет матрицу-подобные функции, в том числе направляя начинающим процесс 3. Маленький (S) сегмента (3,5 Кб) кодирует гликопротеин предшественника (GPC) и нуклеопротеидов (NP). GPC является посттрансляционно обрабатывают для получения GP-1 и GP-2, который ассоциируется с образованием комплекса гликопротеина (GP), которые представляют собой шипами на поверхности вириона структуры, отвечающей за распознавание рецептора и проникновение в клетку 17, 18. NP encapsidates вирусной РНК (вРНК) генома и вместе с формой белка L вирусный рибонуклеопротеинов (vRNPs), которые являются минимальными компонентов для репликации и транскрипции 12. IGR: межгенной области.
Рисунок 2. Ареновирус Rescuэлектронной плазмид. Схема плазмиды, используемые для получения рекомбинантных ареновирус в клетках Веро. Экспрессию белка pCAGGs плазмиды использует куриного β-актин промотора и кролик β-глобина полиаденилирования (PA) сигнальные последовательности, чтобы направить синтез вирусной L и 4 NP, 7. CMV-IE усилитель: цитомегаловируса рано усилитель. Интрон: курица β-актина интрон последовательности. HPOL-I плазмиды используют человеческий полимеразы мышиный промотор и терминатор полимеразной последовательности направлять синтез вирусной РНК-сегментов. Оба pCAGGs и HPOL-I плазмиды, устойчивые к ампициллину (Ampr).
Рисунок 3. . Дикого типа и trisegmented ареновирус спасательного В черном овальный являются плазмиды, необходимые для получения рекомбинантных дикого типа ареновирус: pCAGGs NP и L, и HPOL-I S и Л. П. и L которые требуютD инициировать вирусной транскрипции и репликации. HPOL-I и S L прямой внутриклеточный синтез, через пол-я, S и L антигеномную видов РНК. В красный овал являются плазмиды необходимых для генерации trisegmented аренавирусов: pCAGGs NP и L, а также HPOL-I L плазмиды, которые являются такими же, как описано для дикого типа ареновирус спасения. HPOL-I S разделяется на две плазмиды: плазмида в одном НП заменяется GFP (HPOL-I S GFP / GP), а в другой плазмиды, GP заменен Gluc гена (HPOL-I S NP / Gluc ).
Рисунок 4. Ареновирус протокол спасения. Ареновирус спасательных делается в Vero клеток с использованием 6-луночный планшет формата. Вкратце, Vero клетки трансфицируют в виде суспензии в 1 день с использованием Липофектамина 2000. Через 24 часа после трансфекции носителя заменяли свежей инфекционных сред. Трансфицированные клетки инкубировали в течение еще 48 часов, а затем в увеличенном масштабе в 100 мм чашки (День 4). Vero клеток в 100 мм чашек инкубировали в течение дополнительных 72 часов. На 7 день после трансфекции TCS собираются для обнаружения вирусного либо IFA (rLCMV и rCandid # 1) или флуоресцентной микроскопии (r3LCMV и r3Candid # 1) после инфекции в свежем Vero клетках. Если вирусные титры ниже, чем ожидалось, TCS может быть использован для заражения свежих клетках Веро для амплификации вируса.
Рисунок 5. Подтверждение успешного дикого типа вирусного спасения. TCS от клетки проход (100 блюд мм) использовали для инфицирования свежей Vero клеток в 96-луночных планшетах. Через 24 часа после инфицирования клетки фиксируют, проницаемыми и блокировали перед окрашиванием LCMV или Candid № 1-специфических антител. Присутствие вирусных антигенов наблюдается с помощью флуоресцентной микроскопии. Шкала баров, 100 мкм.
Рисунок 6. Успешное спасение trisegmented вирусов. Рекомбинантных trisegmented LCMV (r3LCMV) и откровенной № 1 (r3Candid # 1) кодируют как GFP и Gluc. Успешная вирусная спасательных легко определяется с помощью флуоресцентной микроскопии (А). Gluc выражение гена-репортера может быть использован в качестве вторичного подтверждения вирусной спасения. Кратность индукции определяется нормализацией Gluc значения люминесценции с диким типом вирусных инфекций (B). Шкала баров, 100 мкм.
Таблица 1. Lipofectamine / ДНК плазмиды концентрации для ареновирус спасения. Рекомендуем ДНК и LPF2000 концентраций для получения рекомбинантных ВильD-типа и trisegmented аренавирусы в клетках Веро указаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генерация рекомбинантного аренавирусы использованием плазмиды на основе обратной генетики стала широко используемый подход для исследования различных аспектов ареновирус биологии. Здесь мы документе решающую совершенствования нынешней системы, выполняя ареновирус спасает в Веро-клетки, что позволяет потенциальным поколение FDA утвержденных кандидатов вакцины против аренавирусы и вакцины против векторов других инфекционных заболеваний.
Экспериментальные процедуры, связанные в целом хорошо известны и не должны создавать значительные препятствия. Есть, однако, ряд факторов, которые должны быть тщательно проверены, чтобы гарантировать постоянный успех. Правильное обслуживание клетки Веро имеет решающее значение для успешной вирусной спасения. Кроме того, крайне важно иметь хорошие препараты плазмид для получения рекомбинантных ареновирус (см. Протокол для надлежащего содержания клеток и плазмиды подготовки). Для спасения rLCMV и rCandiг # 1 дикого типа или их trisegmented версий рекомендуется трех независимых трансфекции для каждого рекомбинантного вируса, чтобы увеличить вероятность успешного спасения, как Vero клетки не легко соединяются 14. Если более чем один рекомбинантный вирус спасательной попытке, масштабировать следующие шаги, соответственно, количество вирусов спасти. В качестве отрицательного контроля, мы включаем трансфекции в отсутствии pCAGGs NP (NP-pCAGGs).
Поскольку LCMV и Candid № 1-инфицированные клетки не отображают классический цитопатического эффекта (CPE), успешной вирусной спасении дикого типа rLCMV и rCandid # 1 вирусы должны быть оценены путем выявления инфекционное потомство, которое может быть сделано с помощью классических методом бляшек, или с помощью ИФА. Мы рекомендуем использовать ИФА по сравнению с классическим методом бляшек, поскольку первые могут быть завершены в течение 24 часов, а не 5 - 6 дней, необходимых для развития бляшек. R3LCMV или r3Candid № 1 спасают два гена кодируют репортер (GFP и Gluc), что позволяет вирусной обнаружения и титрование без необходимости антител с помощью флуоресцентной микроскопии (GFP) и / или люминесценции (Gluc). Как и в спасательных рекомбинантных LCMV и откровенной № 1 дикого типа спасения, trisegmented неудачной спасательной вирус приведет отсутствие флуоресцентного Vero клеток при заражении TCS из трансфицированных клеток.
Учитывая, что S и L сегментов приводятся в действие человека polyermase Я промоутер, эта спасательная система может быть применена в других клетках человека. В действительности, мы также успешно, образующихся как рекомбинантный дикого типа и trisegmented rLCMV и rCandid № 1 293Т вирусов в человеческие эмбриональные клетки почки при высокой эффективности. Кроме того, трансфекции монослоев клеток также привело к вирусу спасения, хотя и не так эффективно, как при трансфекции и Vero клеток 293Т в суспензии. В отношении обнаружения дикого типа LCMV и Candid # 1 вирусные спасения, первичные антитела против других вирусных белков также может быть использован. Вслучае R3 вирусы, мы могли обнаружить Gluc по свечению вместо GFP выражения. Альтернативно, другие гены-репортеры могут быть использованы вместо Gluc и GFP 5.
Наш вирус спасательная система доказала свою высокую эффективность в наших руках, и вот мы предоставляем лучшие условия трансфекции. Настоятельно рекомендуется использовать указанными количествами плазмид. Если вирус спасательных выполняется в других линий клеток человека, количество клеток, ДНК и / или LPF2000 должны быть проверены.
Поколение дикого типа и trisegmented ареновирус использованием плазмиды на основе обратной генетики в клетках Веро позволит для изучения множества аспектов биологии ареновирус, а также для дальнейшего развития FDA-разрешенных вакцин и вакцинных векторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Material and methods | |||
| Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
References
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
