Summary
Räddning av rekombinanta arenaviruses från klonade cDNA, en metod kallad omvänd genetik, låter forskare undersöka vilken roll specifika virala genprodukter, liksom bidraget från de olika specifika domäner och rester, till många olika aspekter av biologi arenavirus . Likaså omvänd genetik i FDA-godkända cellinjer (Vero) för utveckling av vaccin ger nya möjligheter för generering av effektiva och säkra vacciner mot humana patogena arenaviruses.
Abstract
Utvecklingen och genomförandet av arenavirus reverse genetics representerar ett betydande genombrott i arenavirus fältet 4. Användningen av cell-baserade system arenavirus minigenome tillsammans med förmågan att generera rekombinanta infektiösa arenaviruses med förutbestämda mutationer i deras arvsmassa har underlättat utredningen av bidraget av virala bestämningsfaktorer för de olika stegen i arenavirus livscykel, liksom virus-värd interaktioner och mekanismer för arenavirus patogenes 1, 3, 11. Dessutom har utvecklingen av trisegmented arenaviruses tillåtit användning av arenavirus genomet för att uttrycka ytterligare främmande gener av intresse, vilket öppnar möjligheten till arenavirus-baserade program vaccinvektor 5. Likaså ger utvecklingen av singel-cykel smittsamma arenaviruses förmåga att uttrycka reportergener ett nytt experimentellt verktyg för att förbättra säkerheten av forskning som avser highly patogena humana arenaviruses 16. Den generation av rekombinanta arenaviruses med plasmid-baserad omvänd genetik har hittills förlitat sig på användningen av linjer gnagarcellinjer 7,19, vilket medför vissa hinder för utveckling av Food and Drug Administration (FDA)-licensierade vaccin eller vektorer vaccin. För att övervinna detta hinder, beskriver vi här en effektiv generering av rekombinanta arenaviruses i FDA-godkända Vero-celler.
Introduction
Arenaviruses är höljeförsedda virus med en bisegmented, negativ-strängat RNA-genom 3 som tillhör Arenaviridae familjen. Den arenavirus genomet kodar fyra proteiner i en ambisense mode från två separata virala segment 3. Den stora (L)-segmentet kodar RNA-beroende RNA-polymeras (L) och den lilla ringen (riktigt intressant ny gen) finger protein (Z) som fungerar som den viktigaste drivkraften för virus spirande. Den lilla (S)-segmentet kodar virala nukleoprotein (NP) och ytan glykoprotein (GP) (Figur 1).
Flera medlemmar av Arenaviridae familjen ansvarar för dödlig hemorragisk feber (HF) hos människor 3. Principiellt problem är Lassa virus (LASV) och Junín virus (JUNV), vilka är kända för att orsaka hög dödlighet hos inlagda patienter 8, 9. Även om dessa virus är endemisk till Västafrika och landsbygdens Argentina, respektive,Det finns ökande oro för import av LASV och JUNV till icke-endemiska områden på grund av ökat resande 10. Dessutom, även om inte normalt förknippas med svår sjukdom hos människor, är den prototypiska arenavirus lymfatisk koriomeningitvirus (LCMV) betraktas som en försummad patogen som det har funnits fall av dödlig infektion hos patienter med nedsatt immunförsvar 6, 15 och ansvarar för medfödda missbildningar och missfall hos gravida kvinnor 2, 13. För närvarande finns det inga amerikanska FDA-godkända vacciner mot arenaviruses och behandling är begränsad till nukleosidanalogen ribavirin, som är endast delvis effektiv och förknippas ofta med betydande biverkningar.
Införandet av plasmid-baserad reverse genetics 4 och generering av rekombinanta arenaviruses 7, 19 blivit mycket större inom arenavirus forskning. För närvarande är gnagarceller (såsom BHK-21) som används för geneation av rekombinanta arenaviruses grund av artspecifika murin RNA-polymeras I (pol-I) promotor som styr den initiala transkriptionen av S-och L segmenten. Emellertid virus räddning i BHK-21 celler inte är en godkänd metod för generering av rekombinanta arenaviruses som potentiella vaccinkandidater utsäde. Här kan vi dokumentera användningen av mänskliga Pol-I-promotorn för effektiv räddning av prototypic gamla världen (OW) LCMV och den nya världen (NW) JUNV Candid # 1 stam i Vero-celler. Med hjälp av en liknande metod, genererade vi rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) och Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses som innehåller ytterligare två främmande gener kodas i två olika S-RNA segment 5. Detta nya system inte bara följer en mycket reproducerbar och enkelt protokoll men kan omedelbart genomföras i framtagandet av rekombinanta arenaviruses som potentiella vaccin eller vaccin frön vektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Arenavirus Rescue Transfektion
Vår räddning systemet byggde på användningen av båda polymeras II plasmider proteinuttryck kodar nukleoproteinet (NP) och RNA-beroende-RNA-polymeras (L), de virala trans-verkande faktorer som krävs för RNA-replikation och genexpression av arenavirus genomet 7, 19, och plasmider med förmåga att styra intracellulär syntes, via den cellulära RNA-polymeras I (pol-I), för S-och L-antigenom RNA-species 7. I våra studier använder vi pCAGGS proteinuttryck plasmid, som använder kycklingen β-aktin promotor och polyadenylanation (pA) signalsekvenser, och den humana pol-I plasmid, som använder den humana polymeras I-promotorn och murina terminatorsekvenser (Figur 2) . S-och L-RNA-segment klonas in i HPOL-I plasmid i en antigenomisk orientering för att möjliggöra generering av genomiska RNA-segment vid transkription av HPOL-I. För att rädda vilda-TYpe rekombinant LCMV (rLCMV) och Candid # 1 (rCandid # 1) i pCAGGS NP och L från varje virus samtransfekterades tillsammans med sina respektive mänskliga Pol-I S och L-RNA segment (Figur 3). Generering av rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) och Candid # 1 (r3Candid # 1) följde ett liknande protokoll, men S-segmentet delades upp i två olika pol-I S plasmider, var och en kodar en distinkt reportergen: i en, NP öppna läs- (ORF) ersattes med det grönt fluorescerande proteinet (GFP) reportergen (HPOL-I S GFP / GP) och, i den andra, ORF den virala glykoprotein prekursorn (GPC) är ersatt med Gaussia luciferas (Gluc) reportergen (HPOL-I S NP / Gluc). En schematisk representation av det protokoll som illustreras i figur 4. Följande transfektion och infektion protokoll har fastställts för 6-well-plattor.
- OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) blandning: Förbered 250 il OptiMEM media och, beroendeom det virus räddning, 10-12 | ig av LPF2000 (1 pg / pl) per transfektion (Tabell 1). Ett förhållande av 2,5 pg LPF2000 per pg DNA rekommenderas. Inkubera i 5 - 10 min vid RT. Samtidigt förbereda plasmidtransfektion blandning i en separat mikrocentrifugrör (steg 1.2).
- Plasmid DNA-transfektion blandning: Förbered plasmidtransfektion cocktail i ett mikrocentrifugrör med hjälp av de rekommenderade mängderna för varje virus räddning (se tabell 1). Bringa den slutliga volymen till 50 | il med OptiMEM.
- OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmid blandning: Tillsätt 250 l av OptiMEM-LPF2000 blandning (steg 1,1) i plasmid-DNA transfektionsblandningen (steg 1,2). Inkubera denna blandning i 20 - 30 min vid RT. Samtidigt förbereder och räkna 1 x 10 6 Vero-celler per transfektion reaktion. Vero-celler kommer att transfekteras i suspension.
- Beredning av Vero-celler: Vero cells odlas i 100 mm skålar. Före start, föra 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS media, och trypsin-EDTA blandningen till 37 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med 5 ml 1 x PBS.
- Trypsinize celler med 1 ml trypsin-EDTA och vänta tills cellerna detach (ca 5 min). Försiktigt packas kanske krävs fullständigt lossa cellerna från disken.
- Försiktigt, resuspendera cellerna i 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS i ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera cellerna under 5 min vid 1000 rpm i en centrifug.
- Resuspendera cellerna i 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och justera koncentrationen till 1 x 10 6 celler / ml. Det observerades att 0,5 - 1 x 10 6 Vero-celler per transfektion gav de bästa resultaten.
- Blanda LPF2000/DNA och celler: Efter 20 - 30 minuter inkubation vid rumstemperatur (steg 1.3), tillsätt 1 ml av Vero-celler (1 x 10 6) (steg 1,4) tillden OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmid blandning och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Seed LPF2000/DNA-cell blandningen i 6-brunnars-plattor: Lägg DNA-LPF2000-Vero blandning (steg 1,5) i brunnarna i 6-brunnar. Skaka försiktigt 6-brunnars-plattan och låt transfektion inkubera över natt i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ändra transfektion medium: Ca 16 - 24 timmar efter transfektion, ta bort transfektion media, tillsätt 2 ml av infektion media och inkubera transfekterade celler under ytterligare 48 timmar.
- Cell passage: Efter 48 timmar av inkubation i infektion media, avlägsna supernatanten vävnadsodling (TCS) och passerar de transfekterade cellerna i en 100 mm skål. TCS innehåller sällan smittsamt virus eftersom de transfekterade cellerna behöver ytterligare inkubation att generera viruspartiklar. För cellpassage:
- Tvätta cellerna två gånger med 2 ml 1 x PBS.
- Trypsinize celler w ed 0,5 ml trypsin-EDTA och vänta tills cellerna lossnar.
- Resuspendera cellerna i 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera cellerna under 5 min vid 5000 rpm, 4 ° C i en mikrocentrifug.
- Försiktigt resuspendera cellerna i 1 ml av infektion media och överföra celler till en 100 mm skål. Ta upp den totala volymen i plattan, med infektiösa medier, till 8 ml, en tillräcklig volym för att förhindra torkning av cellerna såväl som för att koncentrera viruset.
- Skaka försiktigt 100 mm skål och fortsätta inkubering av Vero-celler i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 under 72 timmar.
- Insamling av TCS: Efter 72 timmars inkubation, samla TCS i ett 15 ml centrifugrör. Avlägsna cellrester genom centrifugering under 5 min vid 2500 rpm i en centrifug. Infectious arenavirus finns i TCS, så avlägsna från celldebris pelleten och lagra TCS vid -80 ° C.
Upptäckt av en lyckad räddning av rLCMV och rCandid # 1 uppnås genom en fokusering bildar enhet (FFU) immunofluorescensanalys (IFA). För vildtypvirus räddning vi använder antikroppar specifika för virala NP. Den r3LCMV och r3Candid # 1 koda två reportergener (GFP och Gluc), vilket möjliggör viral detektering och titrering utan behov av antikroppar genom fluorescensmikroskopi (GFP) och / eller luminiscens (Gluc).
- Bekräfta vildtyp rekombinant arenavirus räddning: Dagen före titreringen, tvätta Vero-celler två gånger med PBS, trypsinize och förbereda 96-brunnars plattor för att nå 80-90% konfluens nästa dag (4 x 10 4 celler / brunn). Skaka försiktigt plattorna för hand för att få en enhetlig fördelning av cellerna. Kultur cellerna, över natten, i 37 ° C inkubator med 5% CO2. Kontrollera att cellerna under mikroskop för att bekräfta ett monoskikt, innan du fortsätter med infektion:
- Seriellt späda (10 faldiga spädningar) virus-innehållande TCS återhämtat sig från de transfekterade cellerna i 100 mm skålen (steg 1.10) i OptiMEM.
- Ta ut mediet från de ympade Vero-celler, tvätta två gånger med 50 | il 1 x PBS, och infektera celler med 50 | il av serieutspätt virus (steg 2.1). Infect celler för 1,5 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter infektion, ta bort viruset ympen, tillsätt 100 l av infektion media / brunn och inkubera cellerna för 16 - 18 tim. Viral återinfektion kan inträffa efter 18 timmars inkubation, vilket kan leda till överskattning av virustitrar.
- Vid 16 - 18 h efter infektion, ta bort TCS från varje brunn och fixera cellerna med 4% formaldehyd utspädd i 1 x PBS, under 15 min vid RT.
- Ta sedan bort fixeringslösning och permeabilisera cellerna med 0,1% Triton X-100 utspätt i 1 x PBS, under 10 min vid rumstemperatur.
- Aspirera permeabilization lösningen, sedan tvätta cellerna 3 gånger with 1x PBS.
- Blockera cellerna med 2,5% albumin bovint serum (BSA) i 1 x PBS (blockeringslösning) under 1 h vid RT. Alternativt kan cellerna blockerades över natten vid 4 ° C och fortsatte med antikropp inkubation följande dag.
- Samtidigt förbereder den primära antikroppen. Späd LCMV-och Candid # 1-specifika primära antikroppar i blockerande lösningen, och sedan centrifugera antikropp / blockerande lösningen under 15 min vid 3500 rpm. Den monoklonala anti-LCMV NP antikropp klon 1.1.3 (1:30 utspädning) 16 och den monoklonala anti-JUNV NP antikropp SA02-BG12 från BEI Resources (1:500 utspädning) kan användas för detektion av rLCMV och rCandid # 1 , respektive.
- Efter en 1 h inkubation, aspirera den blockerande lösningen och tillsätt 50 | il av den primära antikroppen till cellerna och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Vid denna tidpunkt, späd sekundär antikropp i blockerande lösningen, och sedan centrifugera antikropp / blockerande lösningen under 15 min vid 3500 rpm. Polyklonal kanin-anti-mus-IgG-FITC sekundär antikropp för detektion av primära monoklonala antikroppar användes för att erhålla bilder som observerades i figur 5.
- Efter 1 h inkubation, aspirera den primära antikroppen, tvätta 3 gånger med 1 x PBS, och tillsätt den sekundära antikroppen under 30 min vid 37 ° C.
- Efter 30 minuters inkubation, aspirera sekundära antikroppen och tvätta 3 gånger med 1x PBS. Cellerna är nu redo att följas med hjälp av fluorescens mikroskopi både avgöra framgången för viral räddning och titrering genom att räkna fokus bildar enheter per ml (FFU / ml).
- r3LCMV och r3Candid # 1 viral räddning: Eftersom dessa virus uttrycka två reportergener, räddar deras kan övervakas genom fluorescensmikroskopi för att detektera GFP uttryck eller Gluc uttryck i TCS. Rescue kan också bekräftas genom uttryck av Gluc i TCS. Att titrera trisegmented virus, vi följer stegen 2.1 till 2.1.4, men cellerna behöver inte be fastställas för att bestämma en framgångsrik viral räddning på grund av GFP uttryck. Titreringen av viruset kommer att bestämmas genom att räkna FFU / ml. För att bestämma framgångsrik viral räddning genom Gluc uttryck, Gluc uttryck från TCS kan mätas med hjälp av en Gluc assay kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay kit, New England Biolabs). För detta ändamål:
- Pipettera 100 | il av TCS in i en 96-brunnars vit platta (plattbotten mikrotiterplattor, Fisher Scientific).
- Konfigurera luminometem (LumiCount, Packard Biosciences).
- Lägg 50-100 pl Gluk Assay lösning (som rekommenderas av tillverkaren) till varje prov och mäta Gluc uttryck reporter genen med luminometem. Som en negativ kontroll, var Gluc uttryck för TCS från vildtyp virus infekterade celler mäts.
Tre. Passage av vävnadskultursupernatanter
Viral räddning beror på transfektionseffektiviteter. Vero-celler har visatsatt ha lägre transfektionseffektiviteter än andra cellinjer 14. Om virustitrar i TCS är låga, infektera färska Vero-celler vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 0,01 (LCMV) eller 0,1 (Oförställd # 1) under 72 h för att amplifiera viruset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lyckad räddning av en rekombinant vildtyp arenavirus bekräftas av förekomsten av virala antigen med hjälp av IFA (Figur 5). I fallet med rekombinanta trisegmented virus, kan framgångsrik viral räddning bedömas genom att observera GFP uttryck genom fluorescensmikroskopi (figur 6A). Lyckad räddning kommer att bekräftas genom att bedöma Gluc uttryck (Figur 6B). Representativa resultat illustrerar lyckad räddning av vildtyp och trisegmented arenavirus erhölls med användning av ovan angivna protokoll.
Figur 1. Arenavirus genomorganisation och virus struktur. Arenaviruses är höljeförsedda, negativ-sense RNA virus med bisegmented genomen 3. Varje segment använder en ambisense kodning strategi för att styra syntesen av två virala proteins i motsatt riktning 3. Den stora (L) segment (7,2 kb) kodar för RNA-beroende-RNA-polymeras (L) och den lilla RING finger protein (Z) som har matrix-liknande funktioner, innefattande att rikta den spirande processen 3. The Small (S) segment (3,5 kb) kodar glykoprotein föregångaren (GPC) och nukleoproteinet (NP). GPC är posttranslationellt behandlas för framställning av GP-1 och GP-2, som associerar för att bilda glykoproteinkomplex (GP) som utgör de spikar på ytan av virionens struktur som ansvarar för receptorigenkänning och cellinträde 17, 18. NP encapsidates den virala RNA (vRNA) genom och tillsammans med L-proteinet bildar de virala ribonukleoproteiner (vRNPs) som är de minimala komponenter för viral replikation och transkription 12. IGR: intergenregionen.
Figur 2. Arenavirus Rescue plasmider. Diagram av plasmiderna som används för skapande av det rekombinanta arenavirus i Vero-celler. Protein Expression pCAGGS plasmid använder kyckling β-aktin promotor och kaninen β-globin polyadenylerings (PA) signalsekvenser att styra syntesen av viralt L och NP 4, 7. CMV-IE förstärkare: cytomegalovirus omedelbar tidig förstärkare. Intron: kyckling β-aktin intronsekvens. Den HPOL-I plasmider använder den humana polymeras I-promotorn och murina polymeras terminatorsekvenser att styra syntesen av de virala RNA-segment. Både pCAGGS och HPOL-I-plasmider ampicillinresistent (Ampr).
Figur 3. . Vildtyp och trisegmented arenavirus räddning i svart oval är de plasmider som krävs för skapande av det rekombinanta vildtyp arenavirus: pCAGGS NP och L, och HPOL-I S och L. NP och L kräverd att initiera viral transkription och replikation. Den HPOL-I S och L direkt intracellulär syntes, via pol-I, av S-och L-antigenomiska RNA-species. I den röda ovala är de plasmider som krävs för generering av trisegmented arenaviruses: pCAGGS NP och L, såväl som den HPOL-I L plasmiden, som är desamma som de som beskrivits för vildtyp arenavirus räddning. Den HPOL-I S är uppdelad i två plasmider: en i plasmiden, NP ersättas med GFP (HPOL-I S GFP / GP) och i den andra plasmiden, GP ersättas med Gluc genen (HPOL-I S NP / Gluc ).
Figur 4. Arenavirus rescue-protokollet. Arenavirus räddning sker i Vero-celler med användning av en 6-brunnars plattformat. Korthet Vero-celler transfekterades i suspension på dag 1 med användning av Lipofectamine 2000. Vid 24 h efter transfektion, är mediet ersattes med färskt infektiösa medier. Transfekterade celler inkuberas under ytterligare 48 timmar och sedan skalas upp till ett 100 mm skålar (dag 4). Vero-celler i 100 mm skålar inkuberas under ytterligare 72 timmar. På dag 7 efter transfektion TCS uppsamlas för viral detektering genom antingen IFA (rLCMV och rCandid # 1) eller fluorescensmikroskopi (r3LCMV och r3Candid # 1) efter infektion i färska Vero-celler. Om de virala titrarna är lägre än förväntat, kan TCS användas för att infektera färska Vero-celler för att amplifiera viruset.
Figur 5. Bekräftelse av en framgångsrik vildtyp viral räddning. TCS från cell passage (100 mm skålar) används för att infektera färska Vero-celler i 96-brunnsplattor. Vid 24 h efter infektion, celler fixeras, permeabiliserades, och blockeras innan färgning med LCMV-eller artiklar # 1-specifika antikroppar. Förekomst av virala antigener observeras använder fluorescensmikroskopi. Skala barer, 100 uM.
Figur 6. Lyckad räddning av trisegmented virus. Rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) och Candid # 1 (r3Candid # 1) koda både GFP och Gluc. Framgångsrik viral räddning kan snabbt bestämmas genom fluorescensmikroskopi (A). Gluc reportergenexpression kan användas som en sekundär bekräftelse av viral räddning. Fold induktion bestämdes genom normalisering av Gluc luminiscens värden till vildtyp virusinfektioner (B). Skala barer, 100 uM.
Tabell 1. Lipofectamine / plasmid DNA-koncentration för arenavirus räddning. Rekommenderad DNA och LPF2000 koncentrationer för generering av rekombinant tild-typ och trisegmented arenaviruses i Vero-celler indikeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generation av rekombinanta arenaviruses med plasmid-baserad omvänd genetik har blivit en allmänt använd metod för undersökning av många olika aspekter av arenavirus biologi. Här dokumenterar vi en avgörande förbättring av det nuvarande systemet genom att utföra arenavirus räddningar i Vero-celler, vilket möjliggör den potentiella generationen av FDA-godkända vaccinkandidater mot arenaviruses och vektorer vaccin mot andra infektionssjukdomar.
De experimentella inblandade förfaranden är i allmänhet väl etablerad och bör inte innebära några betydande hinder. Det finns dock flera faktorer som bör övervakas noggrant för att säkerställa en konsekvent framgång. Korrekt underhåll av Vero-celler är avgörande för en lyckad viral räddning. Dessutom är det viktigt att ha goda plasmidberedningar att generera rekombinanta arenavirus (se protokoll för korrekt cell underhåll och plasmidberedning). För att rädda rLCMV och rCandid # 1 vildtyp eller deras trisegmented versioner rekommenderas det tre oberoende transfektioner för varje rekombinant virus för att öka sannolikheten för en framgångsrik räddningsaktion, som Vero-celler är inte lätt transfekteras 14. Om mer än en rekombinant virus räddning är försök, skala följande åtgärder i enlighet med det antal virus som ska räddas. Som en negativ kontroll, inkluderar vi en transfektion i frånvaro av pCAGGS NP (-pCAGGS NP).
Eftersom LCMV-och Candid # 1-infekterade celler inte visar klassiska cytopatisk effekt (CPE), framgångsrik viral räddning av vildtyp rLCMV och rCandid nummer 1 virus måste bedömas genom detektering av infektiös avkomma, vilket kan göras med hjälp av en klassisk plackanalys eller via IFA. Vi rekommenderar användning av IFA över klassiska plackanalysen eftersom de förra kan slutföras inom 24 timmar i stället för 5 - 6 dagar krävs för utveckling av plack. Den r3LCMV eller r3Candid # 1 räddades koda två reportergener (GFP och Gluc), vilket således viral upptäckt och titrering utan behov av antikroppar genom fluorescensmikroskopi (GFP) och / eller luminiscens (Gluc). Som i räddningen av rekombinant LCMV och Candid # 1 vildtyp räddning, kommer ett misslyckat trisegmented virus räddning resultera i brist på fluorescerande veroceller efter ympning med TCS från transfekterade celler.
Med tanke på att S-och L-segmenten drivs av den humana polyermase I-promotorn, kan detta räddningssystem tillämpas på andra humana celler. I själva verket har vi också lyckats genererat både rekombinant vildtyp och trisegmented rLCMV och rCandid nummer 1 virus i 293T humana embryonala njur celler med hög verkningsgrad. Dessutom resulterade transfektion i cellmonoskikt också i virus räddning, om än inte lika effektivt som när transfektera Vero-och 293T-celler i suspension. I avseende på detektion av vildtyp LCMV och Candid # 1 viral räddning, kunde primära antikroppar mot andra virala proteiner också användas. IVid R3 virus, kunde vi upptäcka Gluc genom luminiscens istället för GFP uttryck. Alternativt kan andra reportergener användas i stället för Gluc och GFP 5.
Vårt virus räddningssystem har visat sig vara mycket effektiva i våra händer, och här ger vi de bästa transfektion villkor. Det rekommenderas att använda de angivna mängderna av plasmider. Om virus räddning utförs i andra humana cellinjer, mängden av celler, DNA och / eller LPF2000 bör testas.
Den generation av vildtyp och trisegmented arenavirus med plasmid-baserad omvänd genetik i Vero-celler kommer att möjliggöra att studera flera aspekter av biologi arenavirus liksom för den framtida utvecklingen av FDA-godkända vacciner och vektorer vaccin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar tidigare och nuvarande medlemmar i JCT och LM-S laboratorier för utveckling och förbättring av genetik arenavirus omvänd tekniker och plasmider. Vi tackar även Snezhana Dimitrova för teknisk support. Den monoklonala antikroppen riktad mot JUNV NP (SA02-BG12) erhölls från BEI Resources (NIAID Biodefense och Emerging Infektioner Research Resources Repository). BYHC stöddes av Grant Number GM068411 från Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R är en Fullbright-CONICYT (BIO 2008) och en Rochester Vaccine Fellowship (2012) mottagare. EO-R nuvarande stödet ges av en Postdoktorsstipendium för Mångfald & Academic Excellence från Byrån för fakultetens utveckling och mångfald vid University of Rochester. Forskning i LM-S laboratorium finansieras av NIH bidrag RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAIDEN Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning (HHSN266200700008C), ochUniversity of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).
Forskning vid JCT laboratorium har finansierats med bidrag RO1 AI047140, AI077719 RO1 och RO1 AI079665 från NIH.
Materials
| Material and methods | |||
| Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
References
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
