Summary
Врожденная иммунная реакция защищает организмы от патогенной инфекции. Одним из важнейших компонентов врожденного иммунного ответа, респираторный взрыв фагоцитов, генерирует активные формы кислорода, которые убивают вторгшиеся микроорганизмы. Мы описываем респираторный взрыв анализа, который количественно активные формы кислорода, произведенные при врожденной иммунной реакции химически индуцированных.
Abstract
Респираторный взрыв фагоцитов является частью врожденного иммунного ответа к патогенной инфекции и включает в себя производство активных форм кислорода (АФК). АФК являются токсичными и функционировать убить фагоцитируются микроорганизмы. В естественных условиях количественное фагоцитов полученных АФК предоставляет информацию о способности организма поддержать активную врожденную иммунную реакцию. Здесь мы опишем протокол для количественной и сравнить ROS в целых эмбрионов данио на химической индукции дыхательного взрыва фагоцитов. Этот метод использует не-флуоресцентным соединением, которое становится люминесцентные от окисления АФК. Отдельные данио эмбрионов пипеткой в лунки микропланшета и инкубировали в этом флюорогенного субстрата с или без химического индуктора дыхательного взрыва. Флуоресценции в каждой лунке количественно в нужных точках времени с помощью микропланшет-ридера. Показания флуоресценции корректируются для устранения фоновой флуоресценции, а затем совместноmpared помощью непарного т-тест. Этот метод позволяет для сравнения респираторный взрыв потенциала эмбрионов данио рерио на разных стадиях развития и в ответ на экспериментальных манипуляций, таких как белка нокдаун, избыточная экспрессия или лечения фармакологических агентов. Этот метод также может быть использован для мониторинга ответа респираторный взрыв в целых расчлененный почек или клеточных препаратов из почек взрослых данио и некоторых других видов рыб. Мы считаем, что относительная простота и технологичность этого протокола будет дополнять существующие протоколы и будет представлять интерес для исследователей, которые стремятся лучше понять врожденную иммунную реакцию.
Introduction
Иммунная система состоит из двух ветвей: врожденного и адаптивного иммунитета. Врожденный иммунитет является эволюционно более древняя, чем адаптивного иммунитета. Беспозвоночные в настоящее время полагают, только врожденный иммунитет, тогда как позвоночные обладают как врожденные и адаптивные ветви. В то время как адаптивный иммунитет дает конкретные и длительный иммунитет к определенным патогенов, врожденный иммунитет является непосредственным ответом на вторжение бактерий, вирусов и грибков. Одним из важнейших аспектов врожденного иммунного ответа связан с высвобождением цитокинов и хемокинов, что приводит к воспалению и найма фагоцитов (например макрофаги, нейтрофилы), чтобы поглотить и уничтожить иноземных захватчиков.
Успешные врожденные иммунные реакции включают: (1) признание вторжения микроорганизмов; (2) индукция соответствующих сигнальных каскадов (например высвобождение цитокинов и хемокинов); (3) надлежащее развитие / необходимого числа фагоцитов; (4) Миграция фагоцитов в местах инфекции; (5) охвате патогенов, и (6) уничтожение охвативших микроорганизмов. Дефицит в любом из этих шагов может привести к хосту быть раздавленными, а поддавшись, инфекции. Надежная врожденного иммунного ответа является жизненно важным для здоровья организмов, потому что это первая линия обороны против патогенов во всех растений и животных. У позвоночных, он также усиливает адаптивный иммунный ответ 1. Поэтому очень важно, чтобы мы в состоянии оценить все аспекты врожденного иммунного ответа, с тем, чтобы лучше понять его и оптимизации его функции.
Многие модельные организмы используются для изучения врожденного иммунитета, начиная от Arabadopsis к С. Элеганс в дрозофилы до мышей к культуре клеток человека. Преимущество использования данио (Danio рерио) модель системы для изучения врожденного иммунитета является то, что данио является позвоночным, как с врожденного и адаптивного имсообщества, но развитие врожденного и адаптивного иммунитета временно отделены. Данио рерио полагаться исключительно на врожденного иммунитета для защиты от инфекций, пока адаптивный иммунитет не станет полностью функциональной, которое происходит вокруг 4-6 недель после оплодотворения 2. Кроме инструментов для генетических манипуляций, оптической прозрачности и быстрого, внешнего развития, врожденный иммунитет как принцип режиме обороны у эмбрионов рыбок данио обеспечивает упрощенную модель, в которой для изучения сложности врожденного иммунного ответа в естественных условиях.
Несколько протоколы были разработаны для оценки различных аспектов врожденного иммунного ответа у эмбрионов рыбок данио. Microarrays и RNAseq быть подтверждено, что цитокин профили вызываемые данио врожденного иммунного ответа аналогичны у людей и также показали участие неожиданных генов в врожденного иммунитета 3,4. Прозрачность эмбрионов рыбок данио и люминесцентные, трансгеннойштаммы ИЦ патогенов и рыбок данио позволяют для визуализации динамических взаимодействий хозяин-патоген в естественных условиях в режиме реального времени. Трансгенные эмбрионы рыбок данио, выражающие GFP под контролем нейтрофилов конкретных миелопероксидазы промоутер 5,6 или макрофагов конкретных mpeg1 промоутер 7 сделали возможным визуализировать и количественно фагоцитов миграцию к местам локализованных инфекций 8, а также визуализировать фагоцитоз и разрушение флуоресцентно меченных патогены 8,9. Эмбрионы рыбок данио также поддаются генерации высокой пропускной анализов и химических экранов. Соответственно, недавно были разработаны методы высокой пропускной из транскриптома анализа при инфекции 10 и фагоцитов миграции к местам химически индуцированного повреждения 11.
Из методов, перечисленных выше, ни один количественно не оценить заключительный этап уничтожения возбудителя фагоцитами. Это заключительный этапвключает в себя респираторный взрыв (то есть производства АФК и других токсичных соединений), убивающих охвативших патогенов. Фермент НАДФН оксидазы является основным источником АФК в фагоцитирующих клеток. Ассамблея субъединиц НАДФН энзима приводит к переносу электронов к кислороду, генерации супероксид-анионы. Через последующих ферментативных реакций, супероксид затем могут быть преобразованы в перекиси водорода и хлорноватистой кислоты (фигура 1А). Это респираторный взрыв фагоцитов, который убивает болезнетворные микроорганизмы и, таким образом, количественное определение респираторный взрыв потенциала эмбрионов данио рерио является показателем общей врожденной иммунной здоровья. Мы разработали флуоресценции основе анализа для количественной оценки респираторный взрыв в группах отдельных эмбрионов рыбок данио 12. Этот анализ использует не-флуоресцентный, восстановленную форму коммерчески доступной, проникающий в клетку краситель. Этот краситель, 2 ',7-диацетат dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA), преобразуется в флуоресценциицент соединение, 2 ',7-дихлорфлуоресцеина (DCF), при окислении. Различные ROS, генерируемые дыхательного взрыва фагоцитов может окислять H2DCFDA и генерировать флуоресценции 24. Появление флуоресценции могут быть использованы для количественного определения и сравнить ответ респираторный взрыв между группами данио. Протеинкиназы С ацетат агонист форбол-миристат (PMA) используется для химически индуцировать НАДФН-оксидазы, чтобы произвести ROS и тем самым увеличить показания флуоресценции (рис. 1b). При этом мы предоставляем подробный протокол модифицированной и оптимизированной версии этого данио эмбрионов респираторный взрыв анализа. Этот анализ может быть использован для сравнения респираторный взрыв между группами отдельных эмбрионов данио рерио с течением времени и / или в ответ на экспериментальных манипуляций (например, морфолино-опосредованного белком нокдаун). Использование этого метода, в сочетании с другими данио врожденных анализов иммунитета, обеспечит более полное представление о сложной и критическойврожденного иммунного ответа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Данио рерио Уход и техническое обслуживание
- Животноводство: Масса икру взрослых данио, как описано выше 13. Сбор порожденные эмбрионов, как описано выше 14.
- Микроинъекция (при желании): Microinject 1-4 клеточной стадии эмбрионов данио с морфолино-олигонуклеотидов в нокдаун генных продуктов или мРНК для сверхэкспрессии генных продуктов, как описано выше 15.
- Для обеспечения надлежащей пул макет вводят управления (по крайней мере 48 проживает, макет вводят рыбы управления и 48 жизнь, экспериментально манипулировать рыбы необходимы, чтобы заполнить также планшет 96).
- Поддержание эмбрионов: Grow эмбрионов в глубоких чашках Петри при 28 ° С в яичном воде (60 мкг / мл мгновенных Ocean морской соли в не дистиллированная вода-в автоклаве) до желаемой стадии развития (ответ респираторный взрыв не обнаруживается с использованием этого протокола в эмбрионов данио рерио в возрасте до 2 дней после оплодотворения 12). Примечание: Это было оbserved, что предотвращение пигментации эмбрионов данио рерио либо через использование 1-фенил-2 тиомочевины (PTU) или golden/slc24a5 мутанта данио существенно не изменяет индукцию флуоресценции PMA (неопубликованные данные, эмбрионов испытаны на 48, 72 и 96 HPF).
- Удалить мертвых эмбрионов ежедневно с пластиковой пипетки.
- Тщательно слейте старую яйцо воду и пополняться новой яйца воды ежедневно.
- Dechorionate эмбрионы: В день эксперимента, dechorionate эмбрионы (если эмбрионы все еще находятся на хорионов), как описано выше, используя два тонких щипцов 14 (это респираторный взрыв анализ также может быть выполнена на расчлененных почек от взрослых данио 12 и подробных протоколов для почек рассечение от взрослых данио были ранее описаны 16,17).
2. Подготовка решения
- Подготовка исходного раствора H2DCFDA: Взвесить 1 мг H2DCFDA.
- Диssolve 1 мг H2DCFDA в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО), чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора.
- Сделать 22 мкл аликвоты этого раствора в 1,7 мл микропробирок.
- Оберните аликвоты H2DCFDA маточного раствора в алюминиевую фольгу и держать в темноте, когда это возможно, потому что H2DCFDA является светочувствительным.
- Магазин H2DCFDA аликвоты при -20 ° С в течение до 3 месяцев.
- ВНИМАНИЕ - Подготовка исходного раствора форболмиристатацетата (PMA): Взвесить 1 мг PMA используя соответствующие средства индивидуальной защиты (т.е. перчатки, очки и маску).
- Растворить PMA в 1 мл ДМСО, чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора.
- Сделать 11 мкл аликвоты в 1,7 мл микропробирок.
- Храните аликвоты PMA маточного раствора при температуре -80 ° С в течение до 3 месяцев.
- Подготовьте рабочего раствора H2DCFDA: В день эксперимента, сделать рабочий раствор H2DCFDA, добавив 1 часть H2DCFDA маточного раствора до 1часть ДМСО (500 мкг / мл H2DCFDA конечная концентрация). Например, можно добавить 20 мкл исходного раствора H2DCFDA и 20 мкл ДМСО для фольги обернуты 1,7 мл микроцентрифужную пробирку.
- Подготовить рабочий раствор PMA: В день эксперимента сделать рабочий раствор PMA добавлением 1 часть PMA маточного раствора до 49 частей нуклеазному свободную воду (20 мкг / мл РМА конечная концентрация). Например, разбавить 10 мкл PMA исходного раствора в 490 мкл нуклеазы свободной воды в 1,7 мл трубки микроцентрифужных.
- Подготовка дозирования раствора H2DCFDA: В день эксперимента сделать дозирующую решение H2DCFDA с конечной концентрации 1 мкг / мл H2DCFDA в яйце воды. Подготовленные объемы растворов дозирования могут быть изменены по желанию, но гарантировать, что конечные концентрации реагентов сохраняются. Для почек, вместо яиц водой, используют тот же объем модифицированной Дульбекко medium/F-12 Игла (DMEM 50%, 50% F-12, без фенолового красного). Чтобы 5 мл H2DCFDAдозирования решение, использовать 5 мл серологические пипетки для передачи 5 мл яичного воды (или DMEM/F-12) в 15 мл коническую трубку центрифуги, завернутые в фольгу и меченых 'H'.
- Удалить 10 мкл яйца водой (или DMEM/F-12) от 15 мл коническую пробирку 'H' и выбросить.
- Добавить 10 мкл H2DCFDA рабочего раствора в 15 мл коническую пробирку 'H' и вихревые перемешать (этот объем достаточно для 48 эмбриона или образцов почек (половина полного 96 лунок микропланшет) и эти скважины обеспечит измерения уровня из фоновой флуоресценции).
- Подготовьте дозирования раствора H2DCFDA + PMA: В день эксперимента, сделать дозирования раствора H2DCFDA + PMA с конечных концентраций: H2DCFDA - 1 мкг / мл и PMA - 400 нг / мл. Чтобы 5 мл раствора дозирования H2DCFDA + PMA, используйте 5 мл серологические пипетки для передачи 5 мл яичного воды (или DMEM/F-12) в новый 15 мл коническую пробирку 'Н + Р'.
- Удалить 110 _6; л яичного воды (или DMEM/F-12) от 15 мл коническую пробирку 'Н + Р' и выбросить.
- Добавить 10 мкл H2DCFDA рабочего раствора, затем добавить 100 мкл PMA рабочего раствора в 15 мл коническую пробирку 'Н + Р' и вихревой смешивать (этот объем достаточно для 48 образцов или другой половине полного 96 лунок микропланшет ).
- Держите дозирования решения на льду.
3. Считыватель микропланшетов Программирование
- Подготовить инструмент: Сила на микропланшетного.
- Разминка источник света.
- Настройте программу для чтения флуоресценции: например возбуждает: 485 нм; Излучение: 528 нм; Оптика: Top 510 нм; Чувствительность: 65, с 5 сек дрожащим шагом до начала чтения.
4. 96 Ну Микропланшетный Настройка (см. рисунок 2)
- Соберите поставок: Получить блюда с dechorionated эмбрионов, черный 96-луночный микропланшет, P200 пипетки исоветы, ведро льда с H2DCFDA и дозирования растворов H2DCFDA + PMA, многоканальный p200 пипетка, две стерильные резервуары, алюминиевая фольга, и ножницы.
- Передача одного эмбриона в каждую лунку микропланшета 96 а: Ножницами отрезать пипетки таким образом, что эмбрионы или почки подходят через отверстие.
- Установите P200 пипетки до 100 мкл и передать один эмбрион вместе с яйцом воды (или DMEM/F-12) в, как многие из лунки черного 96-луночного микропланшета по желанию (не надо менять пипетки для каждого разные Образец эмбрион в пределах экспериментальной состоянии, но это может быть необходимо изменить подсказки между экспериментальных условиях). Будьте уверены, чтобы избежать переноса остаточные хорионов, так как они, как правило, искажают данные, собранные. Для передачи почек, больший объем пипетки (устанавливается на 100 мкл) могут быть использованы и наконечники могут быть сокращены, чтобы получить больший размер отверстия, если это необходимо. Это может быть необходимо, чтобы включить скважин без образцов эмбриона или в почках, но срешения дозирования для управления для некоторых экспериментальных манипуляций.
- Добавить решения дозирования: Налейте раствор дозирования H2DCFDA в стерильный 25 мл водохранилища.
- С помощью многоканального P200 пипетки и восемь подсказки, чтобы одновременно пипетки 100 мкл раствора дозирования H2DCFDA в одном столбце на луночного микропланшета 96 (500 нг / мл конечна концентраци H2DCFDA).
- Повторите это (изменение советы не надо) на столько столбцов, как хотелось бы (обычно шесть столбцов или 48 скважин, если заполнение весь планшет 96 а). Добавить это решение до половины образцов эмбриональных управления и половины экспериментально манипулировать образцов эмбриона (пример 96 луночный микропланшет настроить показано на рисунке 2, эти скважины (окрашены в оранжевый цвет) представит справочные флуоресценции данных в образцах не индуцированных с PMA) .
- Залейте раствор дозирования H2DCFDA + PMA в новую, стерильную резервуара 25 мл.
- Используйте многоканальную P200 пипетки и восемь советов, которые одноврaneously пипетки 100 мкл раствора дозирования H2DCFDA + PMA в остальных колонках (красного цвета на рисунке 2) из а микропланшет 96 (изменение советы не надо, конечные концентрации H2DCFDA-500 нг / мл и PMA-200 нг / мл) .
- Накройте планшет с алюминиевой фольгой.
- Встряхнуть планшет в течение примерно 20 сек при 150 оборотах в минуту для гомогенизации решения в каждую лунку.
- Выдержите планшет при 28 ° С, когда он не читается.
5. Флуоресценции Количественное
- Read микропланшет в момент времени = 0 ч после добавления ФМА с использованием параметров, описанных в пункте 3.1.2.
- Продолжать принимать измерений каждые несколько минут для нужного интервала времени или не инкубировать фольги завернутые планшет при 28 ° С до более позднем этапе, а затем принять измерение конечной точки в заданное время (например, 4 ч после добавления PMA).
- С помощью пластиковой тransfer пипетки для получения эмбрионов из скважин.
- Усыпить эмбрионов в соответствии с вашим ухода за животными и протокола использования, например, погружения в Tricaine MS222.
- Утилизировать микроплиты и других расходных материалов в биологически опасных контейнер для отходов.
6. Анализ данных
- Принятие решения о времени, в который вы хотели бы сравнить значения флуоресценции (например, 4 ч после добавления PMA, таблица 1).
- Вычтите значение флуоресценции среднего ООН-индуцированной контрольной группы из значений флуоресценции индивидуальных PMA-индуцированной контрольной группы.
- Повторите эту процедуру для экспериментальной группы с и без PMA.
- Храните эти нормированные значения флуоресценции в двух колонках, управления + группы PMA и экспериментальной + группы PMA (табл. 2).
- Рассчитать средние и стандартные отклонения для нормированных значений флуоресценции контролем + PMA Гроур и экспериментальная + PMA группа.
- Сравнение нормированные значения флуоресценции помощью непарного т-тест для определения статистической значимости (табл. 2).
- График средства контроля + группы PMA и экспериментальной + группы PMA с барами об ошибках, отражающих соответствующие стандартные отклонения.
- Запишите уровень значимости на графике и в фигурном легенде (рис. 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы предоставляем данные, сравнивающие ответ респираторный взрыв в эмбрионов рыбок данио (дикого типа, А. Б. фон) на 48 и 72 часа после оплодотворения (ФВЧ). Эмбрионы 48 HPF действовал как наш контрольной группе и эмбрионов 72 оплодотворения как нашей экспериментальной группы. Размер выборки использовали 24 ООН-индуцированной эмбрионы и 24 PMA-индуцированные эмбрионы в стадии развития. Сырье Измерение флюоресценции (в относительных единицах флуоресценции (RFU)) были получены путем считывания микропланшетов 4 часа после добавления ФМА. Сырье значения флуоресценции приведены в таблице 1. Сырье значения флуоресценции была выше в 48 HPF не-индуцированной эмбрионов в чем HPF не-индуцированной эмбрионов 72, за исключением одного 72 HPF эмбриона (означает: 48 оплодотворения = 758 РФС, 72 HPF = 230 РФС). Изменчивость в пределах этих двух образцов был приблизительно равен (стандартные отклонения: 48 HPF = ± 549 РФС, 72 HPF = ± 513 РФС), но 72 HPF группа варьировать более по отношению к средней (стандарт deviatioн в процентах от среднего: 48 HPF = 72%, 72 HPF = 223%). В PMA-индуцированных групп, сырые значения флуоресценции были в основном выше в ФВЧ населения 72 (средства: 48 оплодотворения PMA = 3798 РФС, 72 оплодотворения PMA = 5825 РФС). Был более изменчивость в 72 HPF PMA-индуцированную группы чем 48 HPF PMA-индуцированную группы (стандартных отклонений: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1365 РФС), но изменчивость по отношению к среднему была приблизительно равна (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
Для учета изменчивости фоновых уровней флуоресценции, были рассчитаны нормированные значения флуоресценции (PMA-индуцированной значение минус среднее значение не-индуцированных значений соответствующей стадии развития). Эти нормализованные значения флуоресценции приведены в таблице 2 вместе с помощью стандартных отклонений, и п-значение для групп 48 и 72 HPF. График этой данных обеспечивается на рисунке 2. Приведенные значения флуоресценции последовательно приветGher в 72 HPF группе, чем в группе HPF 48 (означает: 48 HPF = 3040 РФС, 72 HPF = 5596 RFU) и изменчивость аналогично по отношению к среднему (48 HPF = 27%, 72 HPF = 24%). Это респираторный взрыв анализ показал, что эмбрионы 72 оплодотворения данио в состоянии производить больше ROS и поэтому смонтировать более надежный ответ респираторный взрыв, чем 48 часов после оплодотворения эмбрионов после индукции с PMA. Этот вывод может быть связано с увеличением числа клеток, в том числе к увеличению числа гранулоцитов 18, в 72 HPF эмбрионов по сравнению с 48 эмбрионов HPF. Непарный т-тест, чтобы статистически сравнить данные подтвердили, что ответ респираторный взрыв значительно отличается в 72 HPF эмбрионов, чем за 48 часов после оплодотворения эмбрионов (* р = 2 х 10 -9).
В более общем смысле, в момент времени T = 0 ч после добавления PMA, значения сырья флуоресценции не должно быть статистически отличаются между РМА-индуцированной и ООН-индуцированной групп. Исходные значения флуоресценции будет повышее с течением времени как в не-индуцированных и индуцированных образцов, с гораздо большее увеличение происходит в PMA-индуцированных эмбрионов 12. Увеличение сырьевых значений флуоресценции в PMA-индуцированной группы, по сравнению с не-индуцированной группы, станет статистически значимы на примерно 1-2 часов после добавления PMA (в зависимости от стадии развития из эмбрионов данио рерио, с старше эмбрионы монтажа ответа быстрее респираторный взрыв, чем молодые эмбрионов). Нормированные значения флуоресценции (индуцированной минус не-индуцированной) должна возрастать с увеличением стадии развития эмбрионов данио рерио, с самой большой разницей, произошедшим между 48 и 72 ч после оплодотворения и меньшей разницей, произошедшим между 72 и 96 часов после оплодотворения. Сырье цифры флуоресценции должно быть от 5 до 60 раз выше, в PMA-индуцированной группы относительно не-индуцированной группы, в зависимости от стадии развития из эмбрионов рыбок данио (между 48 и 96 часов после оплодотворения). Изменениебудет происходить между отдельными образцами данио эмбриона Таким образом, рекомендуется, чтобы примерно 24 образцов эмбрионов в лечении быть использованы.
Рисунок 1. Схема химической индукции дыхательного взрыва внутри фагоцитов. (A) В этом анализе респираторный взрыв, PMA используется, чтобы вызвать производство супероксидных анионов НАДФН-оксидазы. Супероксид преобразуется в кислорода и перекиси водорода на супероксиддисмутазы. Перекиси водорода и хлорид-анионы преобразуются в хлорноватистой кислоты по миелопероксидазы. Не-флуоресцентный краситель, H2DCFDA, преобразуется в флуоресцентным соединением, DCF, при окислении многими различными АФК. (B) Схема как количественное определение флуоресценции для чтения из ответ респираторный взрыв.
л = "Рисунок 2" FO: содержание-шир = "4.5in" Первоначально "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
Рисунок 2. Схема экспериментальной конструкции для серийной анализа дыхания. Индивидуальный dechorionated эмбрионы рыбок данио переносятся в лунки а микропланшет 96. Скважины, изложенные в белом содержат эмбрионы управления и колодцы, изложенные в черном содержат эмбрионы из экспериментальной группы. Дозирования решения H2DCFDA или H2DCFDA + PMA добавляются в соответствующие лунки (цветные оранжевый или красный, соответственно). Флуоресценции количественно с помощью микропланшет-ридера. Данные анализа дыхательного взрыва затем анализируется, по сравнению, и представлены. В таблице на этой фигуре является подмножеством нормированных значений флуоресценции, отображаемых в таблице 2. График на рисунке включает в себя средства, стандартные отклонения и р-значение для всего набора данных, представленных в этой рукописи, которая также отображается в таблице 2. * Р = 2 X 10 - 9.
Таблица 1. Сырье значения флуоресценции от не-индуцированной (оранжевый фон) и индуцированной (красный фон) 48 или 72 часа после оплодотворения (ФВЧ) эмбрионы рыбок данио (белый или черный числа, соответственно) на 4 ч после добавления PMA. Среднее рассчитывается для не-индуцированных образцов.
| 48 HPF эмбрионы | 72 HPF эмбрионы | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Означать | 758 | 230 | |||
| 48 HPF embroys + РМА | 72 HPF эмбрионы + РМА | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ TR>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Таблица 2. Нормализация и статистическое сравнение данных. Чтобы получить нормированные значения флуоресценции, вычислить разницу между каждой PMA-индуцированной флуоресценции значения и соответствующего среднего значения не-индуцированной. Статистически сравнить эти два набора данных помощью непарного т-теста. Рассчитать средние и стандартные отклонения. Дисплей средства, стандартные отклонения и п-значение (я) в графическом виде (как показано на рисунке 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основная функция фагоцитов является выявление, поглотить, а уничтожить болезнетворные микроорганизмы. Способность фагоцитов производить адекватную респираторный взрыв имеет решающее значение для этой функции. Таким образом, количественная оценка ответ респираторный взрыв является одним из методов, чтобы позволить сравнение общей врожденной иммунной здоровья и функции между группами лиц и / или в ответ на экспериментальных манипуляций. Здесь мы опишем протокол индуцировать, количественно и сравнить реакцию дыхательного взрыва между группами отдельных эмбрионов рыбок данио. Короче говоря, PMA приводит к получению АФК с помощью фермента NADPH-оксидаза. Эти ROS действовать на не-флуоресцентным красителем и окислять его, чтобы сформировать флуоресцентное соединение. Микропланшет-ридера используется для обнаружения относительную флуоресценцию в каждую лунку. Флуоресценции генерируется при индукции PMA свидетельствует о дыхательных потенциала на разрыв и общего врожденной иммунной здоровья эмбрионов данио рерио. Сравнение нормализованного уровня флуоресценциилюминесценции между PMA индуцированных групп, использующих непарный т-тест может быть использован для определения, есть ли существенная разница в пакетном потенциала дыхательных между группами рыбок данио. Экспериментальные манипуляции, приводящие к существенным различиям в ответ респираторный взрыв помогут прояснить механизмы врожденного иммунитета, например генных продуктов, необходимых для дыхательного взрыва фагоцитов, препаратов, которые потенцируют или антагонистами ответ респираторный взрыв.
Протоколы для анализа различных аспектов врожденной иммунной реакции в модели данио были разработаны (см. введение). Относительно немногие из этих методов измерения производство АФК. Методика подробно в этой статье количественно производство АФК у эмбрионов данио рерио после стимуляции врожденного иммунного ответа с PMA. Эта методика аналогична респираторных анализах пакетных выполненных на изолированных образцах цельной крови, в которых PMA также используется для промсе ответа респираторный взрыв, а затем ROS генерируются оцениваются при помощи флюорогенного субстрата (например, Phagoburst, ORPEGEN Pharma). Описанный здесь метод может быть использован с целых эмбрионов данио рерио, а также рассеченных почек от взрослых данио 13, как данио рерио переднего почки аналогичен костного мозга человека, которая является участком взрослого гемопоэза 19. Метод, описанный здесь также достаточно универсален для использования с другими видами рыб и клеточных системах, таких как сотовые препаратов из толстоголов почек 20.
Альтернативный метод для обнаружения ROS в целых эмбрионов данио использует в естественных условиях датчика перекиси водорода в. РНК для окислительно-восстановительного чувствительных флуоресцентного белка инжектируют в эмбрионов данио рерио и отношение флуоресценции контролируют с течением времени после поражающего киле 21. Это генетически закодированы датчик окислительно-восстановительный позволяет визуализацию временного иПространственная динамика производства перекиси водорода в естественных условиях. Применение этого метода показало удивительный результат, что перекись водорода производится первоначально предшествует прибытие первых врожденных иммунных клеток, предполагая, что перекись водорода, выпущенный раненых эпителиальных клеток выступает в качестве сигнала набирать фагоциты 21. Этот метод, в то время как мощный и информативный, включает в себя много времени и технически сложные эмбриологические и микроскопии процедуры. Этот датчик окислительно-восстановительного также специфичны для перекиси водорода, который является только одним из многих ROS, функционирующих в течение врожденной иммунной реакции.
По сравнению с подходом, описанного выше, наш метод также измеряет в естественных ROS, и все же технически менее требовательны и использует химические чтобы вызвать врожденную иммунную реакцию, а не физическим раны. В отличие от указанного выше способа, который специфически измеряет производства перекиси водорода, наша процедура измеряетОбщий уровень АФК. Преимущество обнаружения одного ROS в том, что роли для только этого соединения в врожденного иммунитета может быть выяснены. По аналогии с методом говорилось выше, наш подход также разделяет свои преимущества и недостатки выполняется на животное в целом. Взаимодействия между фагоцитов и их окружения, которые устранены, когда респираторный взрыв анализы выполняются на отдельных образцах крови, сохранились в этих целых анализов животных. Тем не менее, использование целого животного, вероятно, приводит к обнаружению АФК от источников, не связанных фагоцитов (например, митохондрии, полученных АФК, nonphagocyte NADPH оксидазы). В попытке решить специфику нашего метода для обнаружения фагоцитов, полученных АФК, мы ссылались на исследования, в котором это респираторный взрыв был выполнен анализ у эмбрионов данио рерио хватает фагоцитов конкретных NADPH оксидазы 9. Фагоцитоза конкретных НАДФН оксидазы ингибировалось через морфолинозамещенной опосредованной сбить из p47phox или p91pHox белка. В эмбрионов данио рерио, на стадии развития анализируемой, выражение этих НАДФН оксидазы субъединиц ограничивается подмножества клеток крови, вероятно, макрофагов 22,23. Респираторный взрыв потенциал эмбрионов, лишенных фагоцитов конкретных NADPH оксидазы был примерно треть, что из управления 9 (личное общение, доктор Роберт Уилер). Данный результат показывает, что в то время как наша респираторный взрыв анализ делает обнаружить ROS из других источников, чем фагоцитов, большинство флуоресценции обнаруженного можно отнести к дыхательной взрыв через фагоцитарной NADPH-оксидаза. Далее специфичность этого анализа была продемонстрирована с использованием бис-indolylmaleimide я (BisI), фармакологическая ингибитор протеинкиназы С, чтобы предотвратить действие PMA, агониста протеинкиназы С, на НАДФН-оксидазы. Предварительная обработка PMA-индуцированных данио почек или эмбрионов с BisI привело уровней флуоресценции, подобных ООН-индуцированных управления 12. Идеальный дыханияворвался анализ будет в естественных условиях высокой пропускной анализ, где фагоцитов конкретных АФК может быть как количественно и визуализированы с течением времени. Пока это не возможно, быстрое природы и технических простота способа, описанного здесь обеспечивает полезную альтернативу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность прошлые и нынешние члены лаборатории Ким, Марк Нилан для рыбок данио ухода и обслуживания, д-р Роберт Уилер за полезные обсуждения и обмена данными, и NIH гранты 3RO1GM087308-02S1 и 1P20RR024475-01A2 и Мэн сельскохозяйственных и лесных опытная станция (номер публикации 3303) для финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.
