Summary
Det medfødte immunforsvaret beskytter organismer mot patogen infeksjon. En kritisk komponent i det medfødte immunrespons, den phagocyte åndedretts briste, genererer reaktive oksygen arter som dreper invaderende mikroorganismer. Vi beskriver en luftveis burst analyse som kvantifiserer reaktive oksygen arter som produseres når det medfødte immunrespons er kjemisk indusert.
Abstract
Den phagocyte respiratorisk utbrudd er en del av den medfødte immunrespons mot patogene infeksjoner, og omfatter produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). ROS er giftige og funksjon for å drepe phagocytized mikroorganismer. In vivo kvantifisering av phagocyte-avledet ROS gir informasjon om en organismes evne til å montere en robust medfødte immunforsvaret. Her beskriver vi en protokoll for å kvantifisere og sammenligne ROS i hele sebrafisk embryo ved kjemisk induksjon av phagocyte åndedretts briste. Denne fremgangsmåte gjør bruk av en ikke-fluoriserende forbindelse som blir fluorescent ved oksydasjon av ROS. Individuell sebrafisk embryoer blir pipettert inn i brønnene i en mikroplate og inkubert i dette fluorogene substrat, med eller uten en kjemisk induser av respiratoriske utbrudd. Fluorescens i hver brønn er kvantifisert ved ønskede tidspunkter ved hjelp av en mikroplateleser. Fluorescens målinger er justert for å eliminere bakgrunnsfluorescens og deretter compared ved hjelp av en uparet t-test. Denne fremgangsmåte gir mulighet for sammenligning av de respiratoriske utbrudd potensialet av sebrafisk embryoer på forskjellige utviklingsstadier, og som reaksjon på eksperimentelle manipulasjoner slik som protein knockdown, overekspresjon eller behandling med farmakologiske midler. Denne metoden kan også benyttes for å overvåke luftveis burst respons i hele dissekert nyrer eller cellepreparater fra nyrer fra voksne sebrafisk og enkelte andre fiskearter. Vi tror at den relative enkelhet og tilpasning av denne protokollen vil utfylle eksisterende protokoller, og vil være av interesse for forskere som ønsker å bedre forstå det medfødte immunrespons.
Introduction
Immunsystemet består av to grener: medfødt og adaptiv immunitet. Medfødt immunitet er evolusjonært eldre enn adaptiv immunitet. Virvelløse dyr er i dag antatt å ha bare medfødt immunitet, mens virveldyr besitter både medfødte og ervervede grener. Selv om adaptiv immunitet confers spesifikk og langvarig immunitet mot visse patogener, er medfødt immunitet en umiddelbar respons på invasjon av bakterier, virus og sopp. En viktig del av det medfødte immunrespons innebærer frigjøring av cytokiner og chemokiner, noe som resulterer i betennelse og rekruttering av fagocytter (f.eks makrofager, nøytrofile) til å sluke og ødelegge fremmede inntrengere.
Vellykkede medfødte immunresponser omfatte: (1) anerkjennelse av invaderende mikroorganismer, (2) induksjon av de aktuelle signaleringskaskader (f.eks frigivelse av cytokiner og kjemokiner), (3) god utvikling / tilstrekkelig antall fagocytiske celler, (4) Migrasjon av fagocytter til nettsteder for infeksjon, (5) engulfment av patogener, og (6) ødeleggelse av oppslukt mikroorganismer. En mangel på ett av disse trinnene vil kunne føre til verten mottar altfor og bukke under for infeksjonen. En robust medfødte immunforsvaret er viktig for helsen til organismer fordi det er den første linjen i forsvaret mot patogener i alle planter og dyr. I virveldyr, forsterker det også det adaptive immunresponsen en. Derfor er det avgjørende at vi er i stand til å vurdere alle sider av det medfødte immunforsvaret for å bedre forstå det og å optimalisere sin funksjon.
Mange modellorganismer blir brukt til å studere medfødt immunitet, alt fra Arabadopsis til C. elegans til Drosophila til mus til dyrkede humane celler. En fordel ved å bruke sebrafisk (Danio rerio) modellsystem for å studere medfødt immunitet er at sebrafisk er et virveldyr, med både medfødte og adaptive imsamfunnet, men utviklingen av medfødte og adaptive immunitet er timelig segregert. Sebrafisk stole utelukkende på medfødt immunitet for beskyttelse mot infeksjon før adaptiv immunitet blir fullt funksjonell, noe som skjer rundt 4-6 uker etter befruktning to. I tillegg til verktøy for genetisk manipulasjon, optisk klarhet og rask, ekstern utvikling, medfødt immunitet som prinsippet modus i forsvaret i sebrafisk embryo gir en forenklet modell for å studere kompleksiteten i det medfødte immunrespons in vivo.
Flere protokoller har blitt utviklet for å vurdere ulike fasetter av det medfødte immunrespons hos sebrafisk embryo. Mikromatriser og RNAseq har validert at cytokinprofiler oppstår ved sebrafisk medfødte immunrespons er lik som mennesker og har også foreslått involvering av uventede gener i medfødt immunitet 3,4. Gjennomsiktigheten av sebrafisk embryo og fluorescerende, transgenic stammer av patogener og sebrafisk tillate visualisering av dynamiske verts-patogen interaksjoner in vivo i sanntid. Transgene sebrafisk embryoer som uttrykker GFP under styring av den nøytrofile spesifikke myeloperoksidase promoter 5,6 eller makrofag-spesifikk promoter MPEG1 7 har gjort det mulig å visualisere og kvantifisere phagocyte migrering til områder av lokale infeksjoner 8, så vel som for å visualisere fagocytose og ødeleggelse av fluorescensmerkede patogener 8,9. Sebrafisk embryo er også mottagelig for den generasjon av high-throughput analyser og kjemiske skjermer. Følgelig har høy gjennomstrømming metoder for transkriptom analyse ved infeksjon 10 og phagocyte migrasjon til områder av kjemisk indusert skade 11 nylig blitt utviklet.
Av de teknikkene som er nevnt ovenfor, ingen kvantitativt vurdere den siste fasen av patogen ødeleggelse av fagocytter. Denne siste etappeninnebærer en luftveis burst (dvs. produksjon av ROS og andre giftige forbindelser), som dreper de oppslukt patogener. Enzymet NADPH oksidase er en viktig kilde til ROS i fagocytterende celler. Montering av subenheter av NADPH oksidase enzym resulterer i overføring av elektroner til oksygen, genererer superoxide anioner. Gjennom etterfølgende enzymatiske reaksjoner, kan superoksid og deretter omdannes til hydrogenperoksid og hypoklorsyre (figur 1A). Det er den respiratoriske utbrudd av fagocytter som dreper patogener og er således en indikasjon på total medfødte immun helse kvantifisering av respiratoriske utbrudd potensialet av sebrafisk embryoer. Vi utviklet en fluorescens-basert analyse for å kvantifisere luft briste i grupper av individuelle sebrafisk embryo 12. Denne assay anvender den ikke-fluoriserende, reduserte form av en kommersielt tilgjengelig, cellepermeabel fargestoff. Dette fargestoff, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA), er konvertert inn i elektronisk fProsent forbindelse, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCF), ved oksydasjon. De ulike ROS generert av phagocyte åndedretts burst kan oksidere H2DCFDA og generere fluorescens 24.. Utseendet av fluorescens kan brukes til å kvantifisere og sammenligne den respiratoriske utbrudd reaksjon mellom grupper av sebrafisk. Den proteinkinase C agonist forbolmyristatacetat (PMA) blir brukt til å indusere kjemisk NADPH oksidase for å produsere ROS og dermed øke fluorescens opplesninger (figur 1B). Heri, gir vi en detaljert protokoll av en modifisert og optimalisert versjon av denne sebrafisk embryo åndedretts burst analysen. Denne analysen kan brukes til å sammenligne den respiratoriske utbrudd mellom grupper av individuelle sebrafisk embryoer over tid og / eller i respons på eksperimentelle manipulasjoner (f.eks morfolino-mediert protein knockdown). Bruken av denne metoden, i samarbeid med andre sebrafisk medfødt immunitet analyser, vil gi et mer fullstendig bilde av den komplekse og kritiskemedfødte immunforsvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Sebrafisk Stell og vedlikehold
- Husbandry: Mass spawn voksen sebrafisk som tidligere beskrevet 13. Samle gytt embryoer som tidligere beskrevet 14.
- Mikroinjeksjon (hvis ønskelig): Microinject 1-4 celle scenen sebrafisk embryo med morfolino oligonukleotider til knockdown genprodukter eller mRNA til økt ekspresjon av genprodukter som tidligere beskrevet 15.
- Opprettholde en tilstrekkelig pool av mock injisert kontroller (minst 48 levende, mock injisert kontrollfisken og 48 levende, eksperimentelt manipulert fisk er nødvendig for å fylle en 96-brønns mikro).
- Oppretthold embryoer: Grow embryoer i dype petriskåler ved 28 ° C i egg vann (60 mikrogram / ml Instant Ocean Sea Salt i destillert vann-autoklaveres) til ønsket utviklingsstadiet (en luftveis burst respons ikke kan oppdages ved hjelp av denne protokollen i sebrafisk embryo yngre enn to dager etter befruktning 12). Merk: Det har vært observed at hindre pigmentering i sebrafisk embryoer gjennom enten ved bruk av 1-fenyl-2-tiourea (PTU) eller golden/slc24a5 mutant sebrafisk ikke signifikant påvirker induksjon av fluorescens ved PMA (upubliserte data, embryoer som ble testet ved 48, 72 og 96. HPF).
- Fjern døde embryoer daglig med en plast overføringspipetten.
- Dekanter nøye gamle egg vann og etterfylle med nye egg vann daglig.
- Dechorionate embryoer: På dagen for forsøket, dechorionate embryoer (hvis embryoer er fremdeles i deres chorions) som tidligere beskrevet ved hjelp av to fine tang 14 (dette åndedretts burst Analysen kan også utføres på dissekert nyrer fra voksen sebrafisk 12 og detaljerte protokoller for nyre disseksjon fra voksen sebrafisk, har tidligere blitt beskrevet 16,17).
2. Løsning Forberedelse
- Forbered en stamløsning av H2DCFDA: Vei opp 1 mg H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg H2DCFDA i 1 ml dimetyl-sulfoksyd (DMSO) for å gjøre en 1 mg / ml lagerløsning.
- Lag 22 ul delmengder av denne lageroppløsning i 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Pakk porsjoner av H2DCFDA stamløsning i aluminiumsfolie og holde i mørket når det er mulig fordi H2DCFDA er lysfølsom.
- Butikk H2DCFDA alikvoter ved -20 ° C i opptil tre måneder.
- FORSIKTIG - Forbered en stamløsning av forbolmyristatacetat (PMA): Vei opp 1 mg av PMA bruker riktig personlig verneutstyr (dvs. hansker, vernebriller og maske).
- Oppløs PMA i 1 ml DMSO for å lage en 1 mg / ml lagerløsning.
- Gjør 11 ul delprøver i 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Oppbevar alikvoter av PMA stamløsning ved -80 ° C i opp til 3 måneder.
- Tilbered en arbeidsløsning av H2DCFDA: På dagen for forsøket, foreta en H2DCFDA arbeidsløsning ved å tilsette en del H2DCFDA stamoppløsning til endel DMSO (500 ug / ml H2DCFDA sluttkonsentrasjon). For eksempel, tilsett 20 pl av H2DCFDA stamløsning og 20 ul DMSO til en folie viklet 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Tilbered en arbeidsløsning av PMA: På dagen for forsøket, foreta en PMA arbeidsløsning ved å tilsette en del PMA stamløsning til 49 deler nuclease-fritt vann (20 pg / ml PMA sluttkonsentrasjon). Eksempelvis fortynnes 10 mL PMA stamløsning i 490 ul nuklease fritt vann i et 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Tilbered en doseringsløsning av H2DCFDA: På dagen for forsøket, foreta en H2DCFDA doserings oppløsning med en endelig konsentrasjon på 1 pg / ml H2DCFDA i egg vann. De preparerte volumer av doserings løsninger kan bli modifisert som ønsket, men sikre at de endelige konsentrasjoner av reagensene opprettholdes. For nyrene, i stedet for egg vann, benytte det samme volumet av Dulbeccos modifiserte Eagle 's medium/F-12 (50% DMEM, 50% F-12, uten fenolrødt). For å gjøre 5 ml H2DCFDAdosering løsning, bruke en 5 ml serologisk pipette til å overføre 5 ml av egg vann (eller DMEM/F-12) i en 15 ml konisk sentrifugerør innpakket i folie og merket 'H'.
- Fjern 10 mL av egg vann (eller DMEM/F-12) fra de 15 ml konisk tube merket "H" og kaste.
- Tilsett 10 pl av H2DCFDA arbeidsløsning inn i 15 ml konisk rør som er merket "H", og vortex å blande (denne mengden er tilstrekkelig for 48 embryo eller nyreprøver (en halvdel av en full 96-brønns mikro), og disse brønner vil gi målinger av nivået av bakgrunnen fluorescens).
- Forbered en dosering løsning av H2DCFDA + PMA: På dagen for eksperimentet, gjøre en H2DCFDA + PMA doseringsløsning med endelige konsentrasjoner av: H2DCFDA - 1 mg / ml og PMA - 400 ng / ml. For å gjøre 5 ml H2DCFDA + PMA dosering løsning, bruker en 5 ml serologisk pipette til å overføre 5 ml av egg vann (eller DMEM/F-12) inn i en ny 15 ml konisk tube merket "H + P '.
- Fjern 110 _6, l av egg vann (eller DMEM/F-12) fra de 15 ml konisk tube merket "H + P" og kaste.
- Tilsett 10 pl av H2DCFDA arbeidsløsning, tilsett 100 ul av PMA arbeidsløsning inn i 15 ml konisk rør som er merket "H + P 'og vortex å blande (denne mengden er tilstrekkelig for 48 prøver eller den andre halvparten av en full 96-brønns mikro ).
- Hold doseringsløsninger på is.
Tre. Mikroplate Reader Programming
- Forbered instrument: Slå på mikroplateleser.
- Varm opp lyskilden.
- Sett opp et program for å lese fluorescens: f.eks magnetisering: 485 nm; Utslipp: 528 nm, Optikk Stilling: top 510 nm, Følsomhet: 65, med en 5 sek risting skritt før lese.
4. 96 Vel Mikro Set Up (se figur 2)
- Samle forsyninger: Skaffe retter med dechorionated embryoer, svart 96-brønns mikro, P200 pipettor ogtips, isen bøtte med H2DCFDA og H2DCFDA + PMA doseringsløsninger, flerkanals P200 pipette, to sterile reservoarer, aluminiumsfolie og sakser.
- Transfer ett embryo i hver brønn av en 96-brønns mikro: Bruk saks til å klippe en pipette tips slik at embryoer eller nyrer passer gjennom åpningen.
- Still et P200 pipette til 100 pl, og overfører en embryo sammen med egg vann (eller DMEM/F-12) i så mange av brønnene i en sort 96-brønners mikroplate som ønsket (det er ikke nødvendig å endre pipettespissen for hver forskjellig embryo prøven i løpet av en eksperimentell tilstand, men det kan være nødvendig å endre tips mellom eksperimentelle betingelser). Sørg for å unngå å overføre rest chorions, da disse har en tendens til å forskyve de innsamlede dataene. For overføring av nyrene, kan et større volum pipette (satt til 100 ul) bli brukt og pipettespisser kan kuttes for å oppnå en større innvendig diameter størrelse, hvis det er nødvendig. Det kan være nødvendig å innlemme brønner uten embryo eller nyreprøver, men meddoserings løsninger for å kontrollere for noen eksperimentelle manipulasjoner.
- Legg doseringsløsninger: Hell H2DCFDA dosering løsning i en steril 25 ml reservoar.
- Bruk en flerkanals P200 pipettor og åtte tips å samtidig pipette 100 mL av H2DCFDA dosering løsning i en kolonne på 96 brønns mikro (500 ng / ml sluttkonsentrasjon på H2DCFDA).
- Gjenta dette (skiftende tips er ikke nødvendig) for så mange kolonner som ønsket (vanligvis seks kolonner eller 48 brønner hvis fylle en hel 96-brønns mikro). Til denne oppløsningen til halvparten av kontrollembryoprøver og halvparten av de eksperimentelt manipulerte embryo prøver (eksempel 96-brønns mikro oppstilling er vist i figur 2, er disse brønner (farget orange) vil gi bakgrunnsfluorescens data i prøvene ikke indusert med PMA) .
- Hell H2DCFDA + PMA dosering løsning inn i en ny, steril 25 ml reservoar.
- Bruk en flerkanals P200 pipettor og åtte tips for å simultaneously pipettere 100 ul H2DCFDA + PMA doseringsløsning inn i de gjenværende kolonnene (rødfarget i figur 2) i 96-brønns mikro (skiftende tips er ikke nødvendig, endelige konsentrasjoner av H2DCFDA-500 ng / ml og PMA-200 ng / ml) .
- Dekk mikro med aluminiumsfolie.
- Rist mikroplate i omtrent 20 sekunder ved 150 rpm for å homogenisere løsningene i hver brønn.
- Inkuber mikroplate ved 28 ° C når den ikke er lest.
5. Fluorescens Kvantifisering
- Les mikroplate på tidspunktet = 0 timer etter tilsetning av PMA ved hjelp av de parametre som er beskrevet i trinn 3.1.2.
- Fortsett å ta målinger med noen minutter for det ønskede tidsintervall, eller inkuberes folien pakket mikroplate ved 28 ° C inntil et senere tidspunkt, og deretter ta et endepunkt måling på et ønsket tidspunkt (for eksempel 4 timer etter tilsetning av PMA).
- Bruk en plast transfer pipette å hente embryoene fra brønnene.
- Avlive embryoene i henhold til ditt dyr omsorg og behandling protokollen, f.eks nedsenking i Tricaine MS222.
- Kast det mikro og andre engangsmateriell i biologisk risikoavfallsbeholder.
6. Data Analysis
- Bestem på tidspunktet hvor ønsker du å sammenligne fluorescens verdier (f.eks 4 hr etter tilsetting av PMA, Tabell 1).
- Trekk den gjennomsnittlige un-indusert kontroll konsernets fluorescens verdi fra den enkelte PMA-indusert kontroll konsernets fluorescens verdier.
- Gjenta dette for den eksperimentelle gruppen med og uten PMA.
- Lagre disse normaliserte fluorescens-verdier i to kolonner, kontroll + PMA gruppe og den eksperimentelle + PMA gruppe (tabell 2).
- Beregn middel og standardavvik for de normaliserte fluorescens verdier av kontroll + PMA Group og den eksperimentelle + PMA-gruppen.
- Sammenlign de normaliserte fluorescens-verdier ved hjelp av en uparet t-test for å bestemme statistisk signifikans (tabell 2).
- Graf hjelp av kontroll + PMA-gruppen og den eksperimentelle + PMA-gruppen med feilfelt som gjenspeiler de aktuelle standardavvik.
- Spill signifikansnivået på grafen og i figuren legende (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her gir vi data som sammenligner luft burst respons i sebrafisk embryo (villtype, AB bakgrunnen) på 48 og 72 timer etter befruktning (HPF). De 48 HPF embryoer fungerte som vår kontrollgruppe og de 72 HPF embryoer som vår eksperimentelle gruppen. Størrelsen på utvalget brukt var 24 un-indusert embryoer og 24 PMA-indusert embryoer per utviklingsstadiet. Rå fluorescens-målinger (i relative fluorescensenheter (RFU)) ble oppnådd ved å lese mikroplate 4 timer etter tilsetning av PMA. Rå fluorescens verdier er gitt i tabell 1. Rå fluorescens verdier var gjennomgående høyere i de 48 HPF un-indusert embryo enn de 72 HPF un-indusert embryoer, med unntak av en 72 HPF embryo (betyr: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU). Variasjonen innenfor disse to prøvene var omtrent lik (standardavvik: 48 HPF = ± 549 RFU, 72 HPF = ± 513 RFU), men 72 HPF gruppen variert mer med hensyn til gjennomsnittet (standard deviation i prosent av den midlere: 48 HPF = 72%, 72 HPF = 223%). I PMA-indusert grupper, rå fluorescens verdier var stort sett høyere i 72 HPF befolkningen (betyr: 48 HPF PMA = 3798 RFU, 72 HPF PMA = 5825 RFU). Det var mer variabilitet i 72 HPF PMA-induserte gruppe enn 48 HPF PMA-induserte gruppe (standardavvik: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1365 RFU), men variabiliteten med hensyn til middelverdi var omtrent lik (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
For å veie opp for variasjon i bakgrunnsnivåene av fluorescens, ble normalisert fluorescens verdier beregnet (PMA-indusert verdi minus gjennomsnittet av de un-induserte verdier av det aktuelle utviklingsstadiet). Disse normalisert fluorescens-verdier er gitt i tabell 2, sammen med de midler, standard avvik, og p-verdier for de 48 og 72 HPF grupper. En graf av disse data er gitt i figur 2.. De normaliserte fluorescens verdier er konsekvent hiGher i 72 HPF gruppe enn 48 HPF gruppen (betyr: 48 HPF = 3040 RFU, 72 HPF = 5596 RFU), og variasjonen er lik med hensyn til den gjennomsnittlige (48 HPF = 27%, 72 HPF = 24%). Dette luft burst analysen avdekket at 72 HPF sebrafisk embryo er i stand til å produsere mer ROS og derfor montere en mer robust luft burst respons enn 48 HPF embryoer etter induksjon med PMA. Dette funnet kan skyldes et økt antall celler, inkludert et økt antall granulocytter 18, i 72 HPF embryo i forhold til 48 HPF embryoer. En uparet t-test for å statistisk sammenligne dataene bekreftet at luft burst responsen er vesentlig forskjellig i 72 HPF embryoer enn 48 HPF embryoer (* p = 2 X 10 -9).
I en mer generell forstand, på tidspunktet t = 0 timer etter tilsetning av PMA, den rå fluorescens-verdier bør ikke være statistisk forskjellig mellom PMA-induserte og ikke-induserte grupper. Den rå fluorescens verdier i økendee over tid i begge un-induserte og induserte prøver, med en langt større økning oppstår i PMA-induserte 12 embryoer. Økningen i den rå fluorescens-verdier i PMA-induserte gruppe, sammenlignet med den un-indusert gruppe, blir statistisk signifikant på omtrent 1-2 timer etter tilsetning av PMA (avhengig av utviklingsstadiet av sebrafisk embryoer, med eldre embryoer montere en raskere luft burst respons enn yngre embryoer). Normalisert fluorescens verdier (indusert minus un-indusert) skal øke med økende utviklingsstadiet av sebrafisk embryo, med den største forskjellen oppstår mellom 48 og 72 timer etter befruktning, og en mindre forskjell oppstår mellom 72 og 96 timer etter befruktning. Rå fluorescens tall bør være 5 til 60 ganger høyere i PMA-induserte gruppe i forhold til un-indusert gruppe, avhengig av utviklingsstadiet av sebrafisk embryoer (mellom 48 og 96 timer etter befruktning). Variasjonvil oppstå mellom individuelle sebrafisk embryo prøver, således er det anbefalt at omtrent 24 embryo prøver per behandling anvendes.
Figur 1. Diagram av kjemisk induksjon av luft burst innenfor en phagocyte. (A) I denne respiratorisk utbrudd-analysen, er PMA brukes til å indusere produksjonen av superoxide anioner av NADPH oksidase. Superoxide omdannes til oksygen og hydrogenperoksyd ved superoksid dismutase. Hydrogenperoksid og kloridanioner omdannes til hypoklorsyre etter myeloperoxidase. Den ikke-fluoriserende fargestoff, H2DCFDA, omdannes til den fluorescerende forbindelse, DCF, når oksydert av mange forskjellige ROS. (B) Diagram av hvordan kvantifisering av fluorescens er en lese ut av respiratorisk utbrudd respons.
lt = "Figur 2" fo: content-width = "4.5in" src = "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
Figur 2. Skjematisk av den eksperimentelle design for respiratorisk utbrudd-analysen. Individuell sebrafisk dechorionated embryo overføres til brønnene i en 96 brønns mikroplate. Brønnene er skissert i white inneholde kontrollembryoer og brønnene som beskrevet i sort inneholde embryoer fra forsøksgruppen. H2DCFDA eller H2DCFDA + PMA doseringsløsninger er lagt til de aktuelle brønnene (farget oransje eller rød, henholdsvis). Fluorescens kvantifiseres ved hjelp av en mikroplateleser. Åndedretts burst assay data blir deretter analysert, sammenlignes, og presentert. Tabellen i denne figuren er en undergruppe av de normaliserte fluorescens-verdiene som vises i tabell 2. Grafen i dette tallet inkluderer midler, standardavvik og p-verdi for hele datasettet presentert i dette manuskriptet, som også er vist i Tabell 2. * P = 2 X 10-9.
Tabell 1. Rå fluorescens verdier fra un-indusert (orange bakgrunn) og induserte (rød bakgrunn) 48 eller 72 timer etter befruktning (HPF) sebrafisk embryoer (hvite eller svarte tall, henholdsvis) i 4 timer etter tilsetning av PMA. Gjennomsnittet er beregnet for de un-induserte prøver.
| 48 HPF embryoer | 72 HPF embryoer | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Mean | 758 | 230 | |||
| 48 HPF embroys + PMA | 72 HPF embryoer + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tabell 2. Normalisering og statistisk sammenligning av dataene. For å oppnå normaliserte fluorescens-verdier, beregning av forskjellen mellom hver PMA-induserte fluorescens verdi og den aktuelle un-indusert middelverdi. Statistisk sammenligne disse to sett av data ved hjelp av en uparet t-test. Beregn middel og standardavvik. Vise midler, standardavvik, og p-verdi (er) i grafisk form (som i figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den primære funksjon av fagocytter er å oppdage, sluker, og ødelegge patogener. Muligheten av fagocytter til å produsere en tilstrekkelig respiratorisk utbrudd er kritisk for denne funksjonen. Således er kvantifisering av respiratoriske utbrudd respons en metode for å tillate sammenligning av generell medfødte immun helse og funksjon mellom grupper av individer og / eller som reaksjon på eksperimentelle manipulasjoner. Her beskriver vi en protokoll for å indusere, kvantifisere og sammenligne luft burst respons mellom grupper av individuelle sebrafisk embryo. Kort sagt, PMA resulterer i produksjon av ROS av enzymet NADPH oksidase. Disse ROS virker på en ikke-fluoriserende fargestoff og oksidere det til dannelse av en fluorescerende forbindelse. En mikroplateleser brukes til å detektere den relative fluorescens i hver brønn. Fluorescens generert på PMA induksjon er et tegn på luft burst potensial og generell medfødte immun helse av sebrafisk embryo. Sammenligning av det normaliserte nivå av elektronisk fCence mellom PMA induserte grupper som bruker en uparet t-test kan brukes til å avgjøre om det er en betydelig forskjell i luft burst potensialet mellom grupper av sebrafisk. Eksperimentelle manipulasjoner som fører til signifikante forskjeller i den respiratoriske utbrudd reaksjon vil gi innsikt i mekanismer av medfødt immunitet, f.eks genproduktene som er nødvendige for phagocyte respiratorisk utbrudd, medikamenter som potensierer eller antagonisere respiratorisk utbrudd respons.
Protokoller til analysen forskjellige fasetter av det medfødte immunrespons hos sebrafisk-modellen har blitt utviklet (se innledningen). Relativt få av disse teknikkene måle produksjonen av ROS. Teknikken er beskrevet i denne artikkelen kvantifiserer produksjon av ROS i sebrafisk embryo ved stimulering av en medfødt immunrespons med PMA. Denne teknikken er lik luft burst-analyser utført på isolerte fullblodprøver, hvor PMA blir også brukt for å induce en luftveis burst svar, og deretter ROS generert måles ved hjelp av en fluorogene substrat (f.eks Phagoburst, Orpegen Pharma). Metoden som beskrives her kan brukes til hele sebrafisk embryo, samt dissekert nyrer fra voksen sebrafisk 13, som sebrafisk anterior nyre er analogt til menneskelig benmarg, som er åsted for voksen hematopoiesen 19. Metoden som beskrives her er også allsidig nok til å brukes med andre fiskearter og cellesystemer, som for eksempel cellepreparater fra Hodet ørekyte nyrer 20.
En alternativ metode for å detektere ROS i hele sebrafisk embryoer gjør bruk av en in vivo hydrogenperoksyd sensor. Messenger RNA for en redoks-følsom fluorescerende protein injiseres i sebrafisk embryoer og fluorescens-forhold overvåkes over tid etter halefinnen såret 21.. Dette genetisk kodet redoks sensoren tillater visualisering av det temporale ogromlige dynamikk hydrogenperoksyd produksjon in vivo. Anvendelse av denne fremgangsmåte viste det overraskende resultat at det hydrogenperoxyd produsert først innledes ankomsten av de første medfødte immunceller, tyder på at hydrogenperoxyd frigjøres ved sårede epitelceller virker som et signal til å rekruttere fagocytter 21. Denne teknikken, mens kraftig og informativ, innebærer tidkrevende og teknisk vanskelig embryologiske og mikros prosedyrer. Denne redoks sensoren er også spesifikk for hydrogenperoksyd, som bare er en av de mange ROS fungerer under medfødte immunrespons.
I forhold til de tilnærming omtalt ovenfor, måler vår metode også in vivo ROS, og likevel er teknisk mindre krevende og bruker en kjemisk for å indusere en medfødte immunrespons i stedet for en fysisk såret. I motsetning til den ovennevnte fremgangsmåte, som spesifikt måler hydrogenperoksyd produksjon, måler vår prosedyrentotale nivået av ROS. En fordel ved å detektere et enkelt ROS er at rollene for at forbindelsen alene medfødt immunitet kan belyses. I likhet med fremgangsmåten omtalt ovenfor, vår tilnærming deler også de iboende fordeler og ulemper ved å bli utført på hele dyret. Samspillet mellom fagocytter og deres miljø, som elimineres når luftveisserie analysene er utført på isolerte blodprøver, er bevart i disse hele dyre analyser. Men sannsynligvis resulterer bruk av hele dyret i påvisning av ros fra ikke-phagocyte kilder (f.eks mitochondrially-avledet ROS, nonphagocyte NADPH oksidase). I et forsøk på å ta opp spesifisitet av vår metode for å påvise phagocyte-avledet ROS, referert vi til en studie hvor denne luft burst analysen ble utført i sebrafisk embryo mangler phagocyte spesifikke NADPH oksidase ni. Phagocyte spesifikke NADPH oksidase ble hemmet via morpholino-mediert knock down av p47phox eller p91phox protein. I sebrafisk embryoer i det utviklingsmessige stadiet analysert, er ekspresjonen av disse NADPH oksidase subenheter begrenset til en undergruppe av blodceller, makrofager sannsynlig 22,23. Den respiratoriske briste potensialet i embryoer mangler phagocyte spesifikke NADPH oksidase var omtrent en tredjedel som av kontrollene 9 (personlig kommunikasjon, Dr. Robert Wheeler). Dette resultatet tyder på at mens våre luft burst analysen gjenkjenner ROS av andre enn fagocytter kilder, kan de fleste av de oppdaget fluorescens tilskrives luft burst via phagocyte NADPH oksidase. Ytterligere spesifisiteten av denne analysen ble demonstrert ved anvendelse av bis-indolylmaleimide I (bisi), et farmakologisk hemmer av proteinkinase C, for å hindre virkningen av PMA, en proteinkinase C-agonist, i NADPH oksidase. Forbehandling av PMA-indusert sebrafisk nyrer eller embryoer med Bisi resulterte i fluorescens nivåer tilsvarende un-induserte kontroller 12. En ideell luftbriste assay ville være en in vivo high-throughput assay hvor phagocyte spesifikke ROS kan både kvantifiseres og visualisert med tiden. Inntil denne er det mulig, gir hurtig natur og teknisk enklere metoden beskrevet her for et nyttig alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke tidligere og nåværende medlemmer av Kim laboratoriet, Mark Nilan for sebrafisk stell og vedlikehold, Dr. Robert Wheeler for nyttige diskusjoner og deling av data, og NIH tilskudd 3RO1GM087308-02S1 og 1P20RR024475-01A2 og Maine Agricultural and Forest Experiment Station (publikasjonsnummer 3303) for finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.
