Summary
La réponse immunitaire innée protège contre l'infection par des organismes pathogènes. Un élément essentiel de la réponse immunitaire innée, l'explosion respiratoire des phagocytes, génère des espèces réactives de l'oxygène qui tuent les micro-organismes envahisseurs. Nous décrivons un essai de stimulation du métabolisme oxydatif qui quantifie les espèces réactives de l'oxygène produites lors de la réponse immunitaire innée est chimiquement induite.
Abstract
La stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes fait partie de la réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes et implique la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). ROS sont toxiques et fonctionne pour tuer les microorganismes phagocytées. Dans quantification in vivo de phagocyte dérivés ROS fournit des informations sur la capacité de l'organisme à une réponse immunitaire innée robuste. Ici, nous décrivons un protocole pour quantifier et comparer ROS dans embryons de poissons zèbres entiers lors de l'induction chimique de l'explosion respiratoire phagocytaire. Ce procédé fait usage d'un composé non fluorescent qui devient fluorescent lors de l'oxydation par les ROS. Embryons de poisson zèbre individuels sont déposés à la pipette dans les puits d'une microplaque et on les incube dans ce substrat fluorogène avec ou sans un inducteur chimique de la stimulation du métabolisme oxydatif. La fluorescence dans chaque puits est quantifiée à des points temporels souhaités en utilisant un lecteur de microplaque. Des lectures de fluorescence sont ajustés pour éliminer la fluorescence de fond et compared l'aide d'un test t non apparié. Cette méthode permet de comparer le potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre à différents stades de développement et en réponse à des manipulations expérimentales telles que la protéine effet de choc, la surexpression, ou un traitement avec des agents pharmacologiques. Ce procédé peut également être utilisé pour surveiller la réponse de la stimulation du métabolisme oxydatif dans les reins disséqué entières ou des préparations de cellules de reins de poisson zèbre adulte et une autre espèce de poisson. Nous croyons que la relative simplicité et l'adaptabilité de ce protocole complètent les protocoles existants et seront d'intérêt pour les chercheurs qui cherchent à mieux comprendre la réponse immunitaire innée.
Introduction
Le système immunitaire comprend deux branches: l'immunité innée et adaptative. L'immunité innée est évolutif plus ancienne que l'immunité adaptative. Invertébrés sont actuellement pensé pour avoir seulement l'immunité innée, alors que les vertébrés possèdent deux branches innées et adaptatives. Alors que l'immunité adaptative confère une immunité spécifique et de longue durée à certains agents pathogènes, l'immunité innée est une réponse immédiate aux bactéries envahissantes, les virus et les champignons. Un aspect crucial de la réponse immunitaire innée implique la libération de cytokines et de chimiokines, ce qui entraîne l'inflammation et le recrutement des phagocytes (par exemple, les macrophages, les neutrophiles) d'engloutir et de détruire les envahisseurs étrangers.
Réponses immunitaires innées qui réussissent comprennent: (1) la reconnaissance des micro-organismes envahisseurs; (2) l'induction des cascades de signalisation appropriées (par exemple de libération de cytokines et de chimiokines), (3) le développement approprié / un nombre suffisant de cellules phagocytaires; (4) Migration des phagocytes vers les sites d'infection; (5) l'engloutissement des agents pathogènes, et (6) la destruction des micro-organismes englouti. Une carence dans l'une quelconque de ces étapes pourrait conduire à l'hôte d'être submergé par, et de succomber à, l'infection. Une réponse immunitaire innée robuste est essentiel à la santé des organismes, car elle est la première ligne de défense contre les agents pathogènes dans les plantes et les animaux. Chez les vertébrés, il potentialise également la réponse immunitaire adaptative 1. Par conséquent, il est essentiel que nous sommes en mesure d'évaluer tous les aspects de la réponse immunitaire innée afin de mieux comprendre et d'optimiser sa fonction.
De nombreux organismes modèles sont utilisés pour étudier l'immunité innée, allant de Arabadopsis à C. elegans à la drosophile à des souris à des cellules humaines en culture. Un avantage d'utiliser le poisson zèbre (Danio rerio) du système modèle pour étudier l'immunité innée, c'est que le poisson zèbre est un vertébré, avec im innée et acquisecommunauté, mais le développement de l'immunité innée et adaptative sont temporairement séparés. Poisson zèbre se fonder uniquement sur l'immunité innée pour la protection contre l'infection jusqu'à ce que l'immunité adaptative devient entièrement fonctionnel, qui se produit autour de 4-6 semaines après la fécondation 2. En plus des outils pour la manipulation génétique, la clarté optique et développement externe rapide, l'immunité innée comme le principal mode de défense dans embryons de poissons zèbres fournit un modèle simplifié dans lequel pour étudier la complexité de la réponse immunitaire innée in vivo.
Plusieurs protocoles ont été élaborés pour évaluer différentes facettes de la réponse immunitaire innée chez les embryons de poisson zèbre. Les puces à ADN ont validé RNAseq et que les profils de cytokines induites par la réponse immunitaire innée poisson zèbre sont similaires à celui des humains et ont également suggéré l'implication de gènes inattendus dans l'immunité innée 3,4. La transparence de l'embryon de poisson zèbre et fluorescent, transgenic souches d'agents pathogènes et de poisson zèbre pour permettre la visualisation des interactions hôte-pathogène dynamiques in vivo en temps réel. Embryons de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur spécifique de la myéloperoxydase des neutrophiles ou la 5,6-spécifique des macrophages MPEG1 promoteur 7 ont permis de visualiser et de quantifier la migration des phagocytes à des sites d'infections localisées 8 ainsi que de visualiser la phagocytose et la destruction de marqué par fluorescence pathogènes 8,9. Embryons de poisson zèbre sont également prêtent à la génération de tests à haut débit et les écrans chimiques. En conséquence, les méthodes d'analyse du transcriptome lors de l'infection 10 et migration des phagocytes à des sites de lésion induite chimiquement 11 à haut débit ont récemment été mis au point.
Des techniques énumérées ci-dessus, aucun d'évaluer quantitativement l'étape finale de destruction d'agents pathogènes par les phagocytes. Cette dernière étapeimplique une salve respiratoire (c.-à-production de ROS et d'autres composés toxiques), qui tuent les agents pathogènes englouti. L'enzyme oxydase NADPH est une source majeure de ROS dans les cellules phagocytaires. L'assemblage des sous-unités des résultats d'enzyme NADPH oxydase dans le transfert d'électrons de l'oxygène, générer des anions superoxydes. Par des réactions enzymatiques suivantes, superoxyde peut ensuite être converti en peroxyde d'hydrogène et l'acide hypochloreux (Figure 1A). Il s'agit de la stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes qui tue les pathogènes, et donc, la quantification du potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre est indicative de la santé globale immunitaire innée. Nous avons développé un test basé sur la fluorescence pour quantifier la salve respiratoire par groupes de 12 embryons de poisson zèbre individuels. Ce test utilise la forme non fluorescente, la réduction d'un colorant disponible dans le commerce, la cellule-perméable. Ce colorant, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceine diacétate (H2DCFDA), est converti en la fluorescencecomposé de cent, 2 ', 7'-fluorescéine (DCF), lors de l'oxydation. Les diverses ROS générés par l'éclatement respiratoire des phagocytes peuvent oxyder H2DCFDA et générer une fluorescence 24. L'apparition de fluorescence peut être utilisée pour quantifier et comparer la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes de poisson-zèbre. L'agoniste de l'acétate myristate de phorbol protéine kinase C (PMA) est utilisé pour induire chimiquement la NADPH oxydase pour produire des ROS et d'augmenter ainsi des lectures de fluorescence (Figure 1B). Ici, nous fournissons un protocole détaillé d'une version modifiée et optimisée de ce dosage embryon de poisson zèbre stimulation du métabolisme oxydatif. Ce dosage peut être utilisé pour comparer la stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes d'embryons de poisson zèbre individuels au cours du temps et / ou en réponse à des manipulations expérimentales (par exemple morpholino knockdown médié par la protéine). L'utilisation de cette méthode, en conjonction avec d'autres tests de l'immunité innée de poisson zèbre, fournira une image plus complète du complexe et critiqueréponse immunitaire innée.
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Protocol
Une. Soins poisson zèbre et d'entretien
- Élevage: poisson zèbre adulte d'apparition de masse comme décrit précédemment 13. Recueillir des embryons engendrés comme décrit précédemment 14.
- La micro-injection (si désiré): micro-injection 1-4 poisson zèbre embryons au stade de cellules avec des oligonucléotides morpholino à knockdown produits géniques ou ARNm pour surexprimer produits géniques comme décrit précédemment 15.
- Maintenir un bassin suffisant de la maquette contrôles injectés (au moins 48 Résidant, maquette injecté poissons témoins et 48 vivant, poissons expérimentalement manipulé sont nécessaires pour remplir un puits de microplaques 96).
- Maintenir embryons: Cultiver embryons dans des boîtes de Pétri profondes à 28 ° C dans l'eau d'œuf (60 pg / ml Instant Ocean sel de mer dans distillée autoclave-eau) jusqu'à ce que le stade de développement souhaité (une réponse à l'éclatement respiratoire n'est pas détectable en utilisant ce protocole dans les embryons de poisson zèbre moins de 2 jours après la fécondation 12). Note: Il a été observed que la prévention de la pigmentation dans embryons de poissons zèbres, soit par l'utilisation de 1-phényl 2-thiourée (PTU) ou poisson zèbre mutant golden/slc24a5 ne modifie pas significativement l'induction de la fluorescence par le PMA (données non publiées, embryons testés à 48, 72 et 96 HPF).
- Retirer des embryons morts chaque jour avec une pipette de transfert en plastique.
- Décanter avec soin l'eau d'œuf vieux et reconstituer avec de l'eau nouvelle quotidienne d'oeufs.
- Embryons Dechorionate: Le jour de l'expérience, les embryons dechorionate (si les embryons sont encore dans leurs chorions) comme décrit précédemment à l'aide de deux pinces fines 14 (cet essai d'éclatement respiratoire peut également être effectuée sur les reins disséqués de poisson zèbre adulte 12 et protocoles détaillés pour les reins dissection de poisson zèbre adulte ont été décrits précédemment 16,17).
2. Préparation de la solution
- Préparer une solution stock de H2DCFDA: Peser 1 mg de H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg de H2DCFDA dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour faire un / ml solution mère à 1 mg.
- Faire 22 aliquotes de cette solution mère dans 1,7 ml microtubes.
- Envelopper les aliquotes de solution mère H2DCFDA dans une feuille d'aluminium et laisser dans l'ignorance autant que possible parce H2DCFDA est sensible à la lumière.
- Aliquotes magasin H2DCFDA à -20 ° C pour un maximum de 3 mois.
- ATTENTION - Préparer une solution mère d'acétate de phorbol myristate (PMA): Peser à 1 mg de PMA utilisant l'équipement adéquat de protection individuelle (c.-à-gants, lunettes et masque).
- Dissoudre PMA dans 1 ml de DMSO à faire un / ml solution mère à 1 mg.
- Faire 11 aliquotes de 1,7 ml dans des microtubes.
- aliquotes de magasins de solution stock PMA à -80 ° C pendant 3 mois.
- Préparer une solution de travail de H2DCFDA: Le jour de l'expérience, faire une solution de travail H2DCFDA en ajoutant une solution H2DCFDA de stock 1 partie 1partie du DMSO (500 ug / ml de concentration finale H2DCFDA). Par exemple, ajouter 20 ul de solution stock H2DCFDA et 20 ul de DMSO à une feuille enroulée 1,7 ml microtube.
- Préparer une solution de travail de PMA: Le jour de l'expérience, faire une solution de travail en ajoutant une solution PMA PMA de stock 1 partie à 49 parties nucléases eau libre (20 pg / ml de PMA de concentration finale). Par exemple, diluer 10 pi PMA solution stock dans 490 ul nucléase l'eau libre dans un tube de 1,7 ml à centrifuger.
- Préparer une solution de dosage de H2DCFDA: Le jour de l'expérience, préparer une solution de dosage H2DCFDA avec une concentration finale de 1 pg / ml dans de l'eau H2DCFDA d'oeuf. Les volumes préparé des solutions de dosage peuvent être modifiés comme on le souhaite, mais faire en sorte que les concentrations finales des réactifs sont maintenus. Pour les reins, au lieu de l'eau de l'oeuf, en utilisant le même volume de medium/F-12 modifié de Eagle de Dulbecco (DMEM 50%, 50% de F-12, sans rouge de phénol). Pour faire 5 ml de H2DCFDAsolution de dosage, utiliser une pipette sérologique de 5 ml pour transférer 5 ml d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) dans un tube de 15 ml à centrifuger conique enveloppée dans du papier et étiqueté «H».
- Retirer 10 pi d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) de 15 ml tube conique étiqueté «H» et le jeter.
- Ajouter 10 ul de la solution de travail H2DCFDA dans le tube de 15 ml conique marqué «H» et vortex pour mélanger (ce volume est suffisant pour 48 embryon ou échantillons de reins (la moitié d'un plein bien microplaque 96) et ces puits seront de fournir des mesures du niveau fluorescence de fond).
- Préparer une solution de dosage de H2DCFDA + PMA: Le jour de l'expérience, préparer une solution H2DCFDA + PMA de dosage avec des concentrations finales de: H2DCFDA - 1 pg / ml de PMA et de - 400 ng / ml. Pour faire 5 ml de solution de dosage H2DCFDA + PMA, utiliser une pipette sérologique de 5 ml pour transférer 5 ml d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) dans un nouveau tube de 15 ml conique marqué «H + P '.
- Retirer 110 _6; l d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) de 15 ml tube conique étiqueté «H + P 'et le jeter.
- Ajouter 10 ul de la solution de travail H2DCFDA, puis ajouter 100 ul de solution de travail PMA dans le tube de 15 ml conique étiqueté «H + P 'et vortex pour mélanger (ce volume est suffisant pour 48 échantillons ou l'autre moitié d'une pleine et microplaques 96 ).
- Conserver les solutions de dosage sur la glace.
3. Programmation microplaque Reader
- Préparer l'appareil: alimentation sur le lecteur de microplaques.
- Réchauffez la source de lumière.
- Mettre en place un programme de lecture de fluorescence: par exemple excitation: 485 nm; émission: 528 nm; Optique Position: top 510 nm; Sensibilité: 65, avec une étape en secouant 5 sec avant la lecture.
4. 96 Eh bien microplaques Set Up (voir la figure 2)
- Rassembler les fournitures: Obtenir des plats avec des embryons dechorionated, noir 96 puits de microplaques, p200 pipette etconseils, seau à glace avec H2DCFDA et solutions de dosage H2DCFDA + PMA, multicanal p200 pipette, deux réservoirs stériles, une feuille d'aluminium, et des ciseaux.
- Transfert d'un embryon dans chaque puits d'une microplaque à 96 puits: Utilisez des ciseaux pour couper une pointe de pipette tels que les embryons ou les reins ajustement à travers l'ouverture.
- Définir une pipette p200 à 100 pi et de transférer un embryon avec l'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) en autant de puits d'une microplaque de 96 puits noire comme vous le souhaitez (il n'est pas nécessaire de changer l'embout de pipette pour chaque différente échantillon de l'embryon dans une condition expérimentale, mais il peut être nécessaire de changer de conseils entre les conditions expérimentales). Soyez sûr d'éviter le transfert chorions résiduelles, que ceux-ci ont tendance à fausser les données recueillies. Pour le transfert de reins, un volume plus grand pipette (fixée à 100 pi) peut être utilisé et embouts de pipette peut être coupé pour obtenir une taille de plus gros calibre, si nécessaire. Il peut être nécessaire d'incorporer des puits sans échantillons d'embryons ou des reins, mais avecles solutions de dosage pour contrôler quelques manipulations expérimentales.
- Ajouter solutions de dosage: Verser la solution de dosage H2DCFDA dans une aiguille stérile de 25 ml réservoir.
- Utilisez un p200 pipette multicanaux et huit conseils pour pipette simultanément 100 pi de solution de dosage H2DCFDA dans une colonne sur le bien microplaque 96 (500 concentration finale ng / ml de H2DCFDA).
- Répétez cette (changement de conseils n'est pas nécessaire) pour autant de colonnes que désiré (généralement six colonnes ou 48 puits si le remplissage toute une microplaque à 96 puits). Ajouter cette solution à la moitié des échantillons d'embryons de commande et la moitié des échantillons d'embryons expérimentalement manipulés (par exemple, 96 puits de microplaque mis en place est représenté sur la figure 2, ces puits (couleur orange) fournira des données de fluorescence d'arrière-plan dans les échantillons non induites par le PMA) .
- Verser la solution de dosage H2DCFDA + PMA en un nouveau réservoir de 25 ml, stérile.
- Utilisez un p200 pipette multicanaux et huit conseils pour SIMULTpipeter aneously 100 ul de solution de dosage H2DCFDA + PMA dans les colonnes restantes (de couleur rouge sur la figure 2) du puits de microplaque 96 (changement de conseil n'est pas nécessaire, des concentrations finales de H2DCFDA-500 ng / ml et PMA-200 ng / ml) .
- Recouvrir la plaque avec une feuille d'aluminium.
- Agiter la microplaque pendant environ 20 secondes à 150 tours par minute pour homogénéiser les solutions dans chaque puits.
- Incuber la microplaque à 28 ° C quand il n'est pas en cours de lecture.
5. Fluorescence Quantification
- Lire la microplaque au temps = 0 h après l'addition de PMA en utilisant les paramètres décrits dans l'étape 3.1.2.
- Continuer à prendre des mesures toutes les quelques minutes pour l'intervalle de temps désiré ou incuber la microplaque feuille enroulée à 28 ° C jusqu'à un point de temps plus tard, puis prendre une mesure de point final à une heure (par exemple 4 heures après l'addition de PMA).
- Utilisez un plastique transfert pipette pour récupérer les embryons à partir des puits.
- Euthanasier les embryons en fonction de votre soin des animaux et le protocole d'utilisation, par exemple immersion dans tricaine MS222.
- Disposer de la microplaque et autres matériaux jetables dans le conteneur de déchets biologiques.
6. Analyse des données
- Décider sur le point d'heure à laquelle vous souhaitez comparer les valeurs de fluorescence (par exemple 4 h après l'addition de PMA, tableau 1).
- Soustraire la valeur de fluorescence de la moyenne non induite par le groupe de contrôle à partir des valeurs de fluorescence de l'individu induite par le PMA contrôle groupe.
- Répétez cette opération pour le groupe expérimental avec et sans PMA.
- Conserver les valeurs de fluorescence normalisés en deux colonnes, le contrôle + groupe PMA et le groupe expérimental + PMA (tableau 2).
- Calculer les moyens et les écarts types pour les valeurs de fluorescence normalisés de la commande + PMA group et le groupe + de PMA expérimental.
- Comparez les valeurs de fluorescence normalisés en utilisant un test t apparié pour déterminer la signification statistique (tableau 2).
- Graphique des moyens de contrôle + groupe PMA et le groupe expérimental PMA + avec des barres d'erreur reflétant les écarts-types appropriées.
- Noter le niveau d'importance sur le graphique et dans la légende de la figure (Figure 2).
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Representative Results
Ici, nous fournissons des données comparant la réponse à l'éclatement respiratoire dans embryons de poissons zèbres (de type sauvage, AB fond) à 48 et 72 heures après la fécondation (HPF). Les 48 embryons de HPF agi comme notre groupe de contrôle et les 72 HPF embryons que notre groupe expérimental. La taille de l'échantillon utilisé était de 24 embryons induite Nations unies et les 24 embryons PMA-induites par stade de développement. Lectures de fluorescence brutes (en unités relatives de fluorescence (RFU)) ont été obtenues par la lecture de la microplaque 4 heures après l'addition de PMA. Les valeurs de fluorescence brutes sont fournis dans le Tableau 1. Valeurs de fluorescence premières étaient toujours plus élevés dans les 48 HPF embryons induit un-que les 72 embryons induite ONU-HPF, à l'exception d'un embryon de 72 HPF (moyen: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU). La variabilité au sein de ces deux échantillons a été à peu près égale (écarts-types: 48 HPF = ± 549 RFU, 72 HPF = ± 513 RFU), mais le groupe de 72 HPF varie plus par rapport à la moyenne (deviatio normen en tant que pourcentage de la moyenne: 48 hpf = 72%, 72 hpf = 223%). Dans les groupes PMA-induites, les valeurs de fluorescence premières étaient pour la plupart plus élevé dans la population de 72 HPF (moyen: 48 HPF PMA = 3798 RFU, 72 HPF PMA = 5825 RFU). Il y avait une plus grande variabilité dans le groupe induite par le PMA 72 hpf que le groupe 48 hpf induite par le PMA (écarts-types: 48 hpf PMA = 831 RFU, 72 hpf PMA = RFU 1365), mais la variabilité par rapport à la moyenne était approximativement égale (48 hpf PMA = 22%, 72 hpf PMA = 23%).
Pour tenir compte de la variabilité des niveaux de fluorescence de fond, les valeurs de fluorescence normalisés ont été calculés (valeur induite par le PMA, moins la moyenne des valeurs non-induits de l'étape de développement approprié). Ces valeurs de fluorescence normalisés sont fournis dans le tableau 2, ainsi que les moyennes, les écarts-types et p-valeur pour les 48 et 72 HPF groupes. Un graphique de ces données est fourni sur la figure 2. Les valeurs de fluorescence normalisés sont toujours salutgher dans le groupe de 72 hpf que le groupe de filtre passe-haut 48 (signifie: 48 hpf = 3040 RFU, 72 hpf = 5596 RFU) et la variabilité est similaire en ce qui concerne la moyenne (48 hpf = 27%, 72 hpf = 24%). Ce dosage de la stimulation du métabolisme oxydatif révélé que les embryons de poisson zèbre 72 hpf sont capables de produire plus de ROS et donc monter une réponse de stimulation du métabolisme oxydatif plus robuste que 48 hpf embryons après l'induction par le PMA. Cette constatation peut être due à une augmentation du nombre de cellules, y compris une augmentation du nombre de granulocytes 18, dans 72 embryons de HPF comparativement à 48 embryons de HPF. Un test t non apparié pour comparer statistiquement les données ont confirmé que la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif est significativement différente dans les 72 embryons de HPF de 48 hpf embryons (* p = 2 X 10 -9).
Dans un sens plus général, au point de temps t = 0 h après l'addition de PMA, les valeurs de fluorescence premières ne devraient pas être statistiquement différente entre les groupes induite ONU-PMA-induite et. Les valeurs de fluorescence brutes seront de pluse au cours du temps dans les deux échantillons non induits et induits, avec une augmentation beaucoup plus importante survenant dans les embryons PMA-induites 12. L'augmentation des valeurs de fluorescence premières du groupe induite par le PMA, par rapport au groupe non-induite, deviendra statistiquement significative à environ 1-2 heures après l'addition de PMA (en fonction du stade de développement des embryons de poisson zèbre, avec les anciens embryons montage d'une réponse à l'éclatement rapide des voies respiratoires que les jeunes embryons). Valeurs de fluorescence normalisés (moins induite non induite) devraient augmenter avec le stade de développement de plus en plus d'embryons de poisson zèbre, avec la plus grande différence se produisant entre 48 et 72 h fécondation de poste et une plus petite différence se produit entre 72 et 96 heures après la fécondation. Numéros de fluorescence premières devraient être 5 à 60 fois plus élevée dans le groupe induite par le PMA par rapport au groupe non-induite, selon le stade de développement des embryons de poisson zèbre (entre 48 et 96 heures après la fécondation). Variationva se produire entre les échantillons d'embryons de poisson zèbre individuels, par conséquent, il est recommandé d'environ 24 échantillons par traitement de l'embryon être utilisés.
Figure 1. Schéma d'induction chimique de la stimulation du métabolisme oxydatif à l'intérieur d'un phagocyte. (A) Dans ce test de stimulation du métabolisme oxydatif, PMA est utilisé pour induire la production d'anions superoxydes par la NADPH oxydase. Le superoxyde est converti en oxygène et en peroxyde d'hydrogène par la superoxyde dismutase. Le peroxyde d'hydrogène et chlorure anions sont convertis en acide hypochloreux par la myéloperoxydase. Le colorant non-fluorescent, H2DCFDA, est converti en le composé fluorescent, DCF, lorsqu'il est oxydé par de nombreux différents ROS. (B) Schéma de la façon dont la quantification de la fluorescence est une lecture de la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif.
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Figure 2. Schéma du modèle expérimental pour l'essai d'éclatement respiratoire. Individuel dechorionated embryons de poisson zèbre sont transférés dans les puits d'une microplaque à 96. Les puits décrites dans le blanc contiennent des embryons de contrôle et les puits décrits dans le noir contiennent des embryons du groupe expérimental. Solutions de dosage H2DCFDA ou H2DCFDA PMA + sont ajoutés dans les puits appropriés (de couleur orange ou rouge, respectivement). La fluorescence est quantifiée en utilisant un lecteur de microplaque. Données d'essai d'éclatement respiratoire est ensuite analysé, comparé, et présenté. Le tableau de cette figure est un sous-ensemble des valeurs de fluorescence normalisés affichés dans le tableau 2. Le graphique de ce chiffre inclut les moyennes, les écarts types et p-valeur pour l'ensemble des données présentées dans ce manuscrit, qui est également affiché dans le tableau 2. * P = 2 X 10-9.
Tableau 1. Valeurs de fluorescence brutes de non-induite (fond orange) et induits (fond rouge) 48 ou 72 heures après la fécondation (HPF) embryons de poisson zèbre (numéros blancs ou noirs, respectivement) à 4 h après l'addition de PMA. La moyenne est calculée pour les échantillons non induits.
| 48 embryons HPF | 72 embryons HPF | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Signifier | 758 | 230 | |||
| 48 embroys de HPF + PMA | 72 embryons de HPF + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tableau 2. La normalisation et la comparaison statistique des données. Pour obtenir des valeurs de fluorescence normalisés, calculer la différence entre chaque valeur de fluorescence induite par le PMA et la valeur moyenne induite non approprié. Comparer statistiquement ces deux ensembles de données à l'aide d'un test t non apparié. Calculer les moyens et les écarts-types. Afficher les moyennes, les écarts-types et p-valeur (s) sous forme graphique (voir Figure 2).
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Discussion
La fonction principale des phagocytes est de détecter, engloutir, et détruire les agents pathogènes. La capacité des phagocytes pour produire une explosion respiratoire adéquate est essentielle pour cette fonction. Ainsi, la quantification de la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif est une méthode pour permettre la comparaison de la santé générale immunitaire innée et la fonction entre des groupes d'individus et / ou en réponse à des manipulations expérimentales. Ici, nous décrivons un protocole pour induire, quantifier et comparer la réponse de salve respiratoire entre les groupes de différents embryons de poisson zèbre. En bref, PMA se traduit par la production de ROS par l'enzyme oxydase NADPH. Ces ROS agissent sur un colorant non-fluorescent et s'oxydent pour former un composé fluorescent. Un lecteur de microplaque est utilisé pour détecter la fluorescence relative dans chaque puits. Fluorescence générée lors de la PMA induction est une indication du potentiel d'éclatement santé respiratoire et immunitaire innée général de embryons de poisson zèbre. Comparaison du niveau normalisé de fluorescencecence entre les groupes à l'aide de PMA induit un test t non apparié peut être utilisé pour déterminer s'il existe une différence significative dans le risque de stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes de poisson-zèbre. Les manipulations expérimentales résultant des différences importantes dans la réponse à l'éclatement respiratoire permettront de mieux comprendre les mécanismes de l'immunité innée, par exemple les produits de gènes nécessaires à la stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes, des médicaments qui potentialisent ou antagonistes de la réponse à l'éclatement respiratoire.
Protocoles de test différentes facettes de la réponse immunitaire innée dans le modèle de poisson zèbre ont été développés (voir Introduction). Relativement peu de ces techniques mesurent la production de ROS. La technique décrite dans le présent article quantifie la production de ROS dans les embryons de poisson zèbre à la stimulation d'une réponse immunitaire innée par le PMA. Cette technique est semblable à des essais de stimulation du métabolisme oxydatif isolées effectuées sur des échantillons de sang entier, dans lequel le PMA est également utilisé pour INDUCE une réponse à l'éclatement respiratoire, puis le ROS générés sont mesurés en utilisant un substrat fluorogène (par exemple Phagoburst, Orpegen Pharma). Le procédé décrit ici peut être utilisé avec des embryons de poisson zèbre entiers, ainsi que des reins disséqués à partir du poisson zèbre adulte 13, comme le rein antérieur poisson zèbre est analogue à la moelle osseuse humaine, qui est le site de l'hématopoïèse adulte 19. La méthode décrite ici est également assez souple pour être utilisé avec d'autres espèces de poissons et des systèmes cellulaires, comme les préparations de cellules de reins Vairon à grosse tête 20.
Une autre méthode pour détecter les ROS dans les embryons de poisson zèbre entiers fait usage d'un capteur in vivo dans de peroxyde d'hydrogène. L'ARN messager pour une protéine fluorescente redox sensible est injecté dans des embryons de dard-perche, et le rapport de la fluorescence est surveillée au cours du temps suite à la nageoire caudale blessant 21. Ce capteur redox génétiquement codé permet la visualisation du temporel etdynamique spatiale de la production de peroxyde d'hydrogène in vivo. L'application de ce procédé a révélé le résultat surprenant que le peroxyde d'hydrogène produit à l'arrivée d'abord précédée des premières cellules immunitaires innées, ce qui suggère que le peroxyde d'hydrogène libéré par les cellules épithéliales blessés agit comme un signal pour recruter des phagocytes 21. Cette technique, tout puissant et informative, implique du temps et des procédures de embryologiques et microscopie techniquement difficiles. Ce capteur redox est également spécifique pour le peroxyde d'hydrogène, qui est seulement l'une des nombreuses ROS fonctionnant au cours de la réponse immunitaire innée.
En comparaison à l'approche décrite ci-dessus, notre procédé mesure également in vivo ROS, et encore est techniquement moins exigeant et utilise un produit chimique pour induire une réponse immunitaire innée plutôt qu'une blessure physique. Contrairement à la méthode ci-dessus, qui mesure précisément la production de peroxyde d'hydrogène, notre procédure mesure laniveau total de ROS. Un avantage de la détection d'un seul ROS est que les rôles pour que composé seul dans l'immunité innée peuvent être élucidés. Similaire à la méthode décrite ci-dessus, notre approche partage également les avantages et des inconvénients d'être réalisée chez l'animal entier. Les interactions entre les phagocytes et de leur environnement, qui sont éliminés lors des essais d'éclatement respiratoires sont effectuées sur des échantillons de sang isolé, sont conservées dans ces essais sur les animaux entiers. Cependant, l'utilisation de l'animal entier est probablement attribuable à la détection de ROS à partir de sources non-phagocytaires (par exemple, les mitochondries dérivés ROS, nonphagocyte la NADPH oxydase). Dans une tentative de répondre à la spécificité de notre méthode pour détecter phagocyte dérivés ROS, nous nous sommes référés à une étude dans laquelle cet essai d'éclatement respiratoire a été réalisée dans embryons de poissons zèbres manque spécifiques phagocyte la NADPH oxydase 9. Spécifique à la NADPH oxydase phagocytaire a été inhibée par l'intermédiaire d'knock morpholino médiée vers le bas de p47phox ou p91pprotéine de hox. Dans les embryons de poisson zèbre, au stade du développement dosé, l'expression de ces sous-unités de la NADPH oxydase est limitée à un sous-ensemble des cellules du sang, des macrophages susceptibles 22,23. Le potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons qui n'ont pas spécifique-phagocyte la NADPH oxydase a été d'environ un tiers de celle des contrôles 9 (communication personnelle, le Dr Robert Wheeler). Ce résultat suggère que, bien que notre test de stimulation du métabolisme oxydatif détecte ROS à partir de sources autres que les phagocytes, la majorité de la fluorescence détectée peut être attribuée à la stimulation du métabolisme oxydatif par l'intermédiaire de la NADPH oxydase phagocytaire. De plus la spécificité de ce dosage a été démontrée en utilisant le bis-indolylmaléimide I (BISI), un inhibiteur pharmacologique de la protéine kinase C, pour empêcher l'action de PMA, un agoniste de la protéine kinase C, de la NADPH oxydase. Pré-traitement des reins poisson zèbre PMA-induites ou des embryons avec Bisi a donné lieu à des niveaux de fluorescence similaires à des contrôles non-induites 12. Une respiratoire idéaldosage éclatement serait un dosage à haut débit in vivo spécifique au phagocyte où ROS peut être quantifiée et visualisée à la fois au cours du temps. Jusqu'à ce que ce soit possible, la nature rapide et la facilité technique de la méthode décrite ici fournit une alternative utile.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents du laboratoire Kim, Mark Nilan pour les soins du poisson zèbre et l'entretien, le Dr Robert Wheeler pour des discussions utiles et le partage de données, et des subventions des NIH 3RO1GM087308-02S1 et 1P20RR024475-01A2 et le Maine agricoles et forestiers expérimenter la station (numéro de publication 3303) pour le financement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
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