Summary
Die angeborene Immunantwort gegen Krankheitserreger schützt Organismen Infektion. Eine kritische Komponente des angeborenen Immunantwort, die Phagozyten Atmungsstoß erzeugt reaktive Sauerstoffspezies, die eindringende Mikroorganismen zu töten. Wir beschreiben einen Assay, der Respiratory Burst reaktiven erzeugt, wenn der angeborenen Immunantwort chemisch induzierte Sauerstoffspezies quantifiziert.
Abstract
Phagozyten Respiratory Burst ist Teil der angeborenen Immunantwort gegen Pathogenbefall und umfasst die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ROS sind giftig und Funktion phagozytierten Mikroorganismen abzutöten. In vivo Quantifizierung von Phagozyten abgeleitete ROS gibt Auskunft über die Fähigkeit eines Organismus, um eine robuste angeborenen Immunantwort. Hier beschreiben wir ein Protokoll, im ganzen Zebrafischembryonen auf chemische Induktion des Phagozyten Respiratory Burst quantifizieren und vergleichen ROS. Dieses Verfahren ermöglicht die Verwendung eines nicht-fluoreszierende Verbindung, die bei der Oxidation von Fluoreszenz ROS wird. Einzelzebrafischembryos werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert und in diesem fluorogenen Substrat mit oder ohne einen chemischen Induktor des Respiratory Burst inkubiert. Fluoreszenz-in jede Vertiefung wird zu gewünschten Zeitpunkten mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader quantifiziert. Fluoreszenz-Messwerte werden angepasst, um die Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen und dann zusammenmpared mit einem ungepaarten t-Test. Dieses Verfahren ermöglicht einen Vergleich der Respiratory Burst Potential des Zebrafischembryos in verschiedenen Entwicklungsstadien und als Reaktion auf experimentelle Manipulationen wie Protein Zuschlagsüberexpression, oder die Behandlung mit pharmakologischen Mitteln. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um den respiratorischen Burst Reaktion vollständig seziert Nieren oder Zellpräparate aus Nieren von erwachsenen Zebrafisch und einige andere Fischarten zu überwachen. Wir glauben, dass die relative Einfachheit und Anpassungsfähigkeit dieses Protokoll wird die bestehenden Protokolle ergänzen und wird von Interesse für Forscher, die die angeborene Immunantwort besser zu verstehen suchen.
Introduction
Angeborenen und erworbenen Immunität: Das Immunsystem besteht aus zwei Zweigen besteht. Die angeborene Immunität ist evolutionär älter als adaptive Immunität. Wirbellose Tiere werden derzeit angenommen, dass nur der angeborenen Immunität haben, während Wirbeltieren sowohl die angeborenen und erworbenen Filialen besitzen. Während adaptiven Immunität verleiht spezifische und dauerhafte Immunität gegen bestimmte Erreger, ist die angeborene Immunität eine unmittelbare Reaktion auf eindringende Bakterien, Viren und Pilze. Ein entscheidender Aspekt der angeborenen Immunantwort beinhaltet die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen, die Entzündung und die Rekrutierung von Phagozyten (zB Makrophagen, Neutrophile) führt zu verschlingen und zerstören fremde Eindringlinge.
Erfolgreiche angeborenen Immunantwort beinhalten: (1) Anerkennung von eindringenden Mikroorganismen, (2) Induktion der entsprechenden Signalkaskaden (zB Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen), (3) die richtige Entwicklung / ausreichende Anzahl von Fresszellen, (4) Migration von Phagozyten auf Seiten der Infektion, (5) Einwirkung von Krankheitserregern, und (6) Zerstörung der Mikroorganismen verschlungen. Ein Mangel an einem dieser Schritte können an den Host durch überwältigt zu führen und zu erliegen, die Infektion. Eine robuste angeborenen Immunantwort entscheidend für die Gesundheit von Lebewesen, weil es die erste Verteidigungslinie gegen Pathogene in allen Pflanzen und Tieren. Bei Wirbeltieren, es potenziert auch die adaptive Immunantwort ein. Daher ist es wichtig, dass wir in der Lage, alle Aspekte der angeborenen Immunreaktion, um besser zu verstehen und um ihre Funktion zu optimieren auszuwerten.
Viele Modellorganismen werden zur angeborenen Immunität zu studieren, von Arabadopsis C. elegans, Drosophila, Mäuse zu kultivierten menschlichen Zellen. Ein Vorteil der Verwendung der Zebrafisch (Danio rerio) Modellsystem zur angeborenen Immunität zu studieren ist, dass der Zebrafisch ist ein Wirbeltier, sowohl mit angeborenen und adaptiven imGemeinschaft, noch die Entwicklung der angeborenen und erworbenen Immunität zeitlich getrennt. Zebrafisch verlassen sich ausschließlich auf die angeborene Immunität für den Schutz vor Infektion, bis die adaptive Immunität wird voll funktionsfähig, die um 4-6 Wochen nach der Befruchtung 2 auftritt. Zusätzlich zu den Werkzeugen zur genetischen Manipulation, optische Klarheit und eine schnelle, externe Entwicklung, angeborene Immunität als Prinzip Modus der Verteidigung in Zebrafischembryonen bietet ein vereinfachtes Modell, in dem die Komplexität der angeborenen Immunantwort in vivo zu untersuchen.
Mehrere Protokolle entwickelt worden, um verschiedene Aspekte der angeborenen Immunantwort in Zebrafischembryos zu beurteilen. Microarrays und RNAseq haben bestätigt, dass die Cytokin-Profile von Zebrafisch angeborene Immunantwort hervorgerufen sind ähnlich wie die von Menschen und haben auch vorgeschlagen, die Beteiligung der Gene, die in unerwarteter angeborenen Immunität 3,4. Die Transparenz des Zebrafisch-Embryos und Leuchtstofflampen, transgenic Stämme von Krankheitserregern und Zebrafisch ermöglichen Visualisierung dynamischer Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo in Echtzeit. Transgene Zebrafischembryonen, die GFP unter der Kontrolle der Neutrophilen-spezifischen Promoter Myeloperoxidase 5,6 oder Makrophagen-spezifischen Promoter mpeg1 7 haben es möglich, zu den Orten der lokalisierten Infektionen 8 visualisieren und quantifizieren Phagozyten Migration sowie Phagozytose und Zerstörung sichtbar gemacht Fluoreszenz-markierten Krankheitserreger 8,9. Zebrafisch-Embryonen sind ebenfalls für die Erzeugung von Hochdurchsatz-Assays und chemischen Bildschirme. Dementsprechend haben Hochdurchsatz-Methoden der Transkriptom-Analyse bei der Infektion 10 und Phagozyten Migration auf Websites von chemisch induzierte Verletzung 11 vor kurzem entwickelt worden.
Von den oben aufgeführten Verfahren keine quantitativ beurteilen die letzte Stufe der Erreger Zerstörung durch Phagozyten. Diese letzte Stufebeinhaltet eine Respiratory Burst (dh Produktion von ROS und andere giftige Verbindungen), die die Krankheitserreger abzutöten verschlungen. Die NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle von ROS in phagozytischen Zellen. Zusammenbau der Untereinheiten der NADPH-Oxidase-Enzym führt Übertragung von Elektronen, Sauerstoff, Erzeugen Superoxidanionen. Durch nachfolgende enzymatische Reaktionen kann dann Superoxid zu Wasserstoffperoxid und hypochlorige Säure (1A) umgewandelt werden. Es ist der Respiratory Burst von Phagozyten, die Krankheitserreger abtötet, und somit ist die Quantifizierung des Respiratory Burst Potential des Zebrafischembryos anzeigt Gesamt angeborenen Immun Gesundheit. Wir entwickelten ein Fluoreszenz-basierten Assays, um den respiratorischen Burst in Gruppen einzelner Zebrafischembryonen 12 zu quantifizieren. Dieser Assay verwendet den nicht-fluoreszierenden, reduzierte Form eines im Handel erhältlichen zellgängigen Farbstoff. Dieser Farbstoff, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein Diacetat (H2DCFDA), ist in die Fluoreszenz umgewandeltCent-Verbindung, 2 ', 7'-Dichlorfluorescein (DCF), die bei der Oxidation. Die vielfältigen ROS durch die Phagozyten Respiratory Burst erzeugte H2DCFDA oxidieren und erzeugen Fluoreszenz 24. Das Aussehen der Fluoreszenz kann verwendet werden, um zu quantifizieren und vergleichen Sie die Atem Burst Reaktion zwischen Gruppen von Zebrafisch werden. Die Proteinkinase-C-Agonist Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) verwendet wird, um chemisch zu induzieren NADPH-Oxidase zu produzieren ROS und erhöhen somit Fluoreszenzmesswerte (Abbildung 1B). Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll einer modifizierten und optimierte Version dieses Zebrafischembryo Respiratory Burst Test. Dieser Test kann verwendet werden, um den Respiratory Burst von Gruppen einzelner Zebrafischembryonen im Laufe der Zeit und / oder in Reaktion auf experimentelle Manipulationen (z. B. Morpholino-vermittelte Protein Knockdown) zu vergleichen. Die Anwendung dieser Methode, in Verbindung mit anderen Zebrafisch-Assays angeborenen Immunität, wird ein vollständigeres Bild der komplexen und kritischen bietenangeborenen Immunantwort.
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Protocol
1. Zebrafisch-Pflege und Wartung
- Haltung: Massenlaich erwachsenen Zebrafisch wie zuvor beschrieben 13. Sammeln Embryonen hervorgebracht, wie zuvor beschrieben 14.
- Mikroinjektion (wenn gewünscht): microinject 1-4 Zell-Stadium Zebrafischembryonen mit Morpholino Oligonukleotiden an Genprodukten oder mRNA-Knockdown, um Gen-Produkte als überexprimieren zuvor beschrieben 15.
- Sorgen Sie für ausreichende Pool von Mock injiziert Kontrollen (mindestens 48 Leben, Mock injiziert Kontrollfische und 48 Wohn-, experimentell manipuliert Fische werden benötigt, um eine 96-Well-Mikroplatte zu füllen).
- Pflegen Embryonen: Wachsen Embryonen in tiefe Petrischalen bei 28 ° C in Wasser-Ei (60 g / ml Instant Ocean Meersalz in destilliertem Wasser autoklaviert), bis die gewünschte Entwicklungsstadium (a respiratory burst Antwort ist nicht nachweisbar mit diesem Protokoll in Zebrafischembryonen jünger als 2 Tage nach der Befruchtung 12). Hinweis: Es ist o gewesenbserved, dass die Verhinderung der Pigmentierung in Zebrafischembryos durch entweder die Verwendung von 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) oder golden/slc24a5 mutierten Zebrafisch nicht signifikant die Induktion von Fluoreszenz, die durch PMA (unveröffentlichte Daten, Embryonen bei 48 und 72 getestet, und 96 zu verändern hpf).
- Entfernen Sie leere Embryonen täglich mit einer Kunststofftransferpipette.
- Dekantieren Sie vorsichtig altes Ei Wasser und füllt mit neuen Ei-Wasser täglich.
- Dechorionate Embryonen: Am Tag des Experiments unter Verwendung von zwei feinen Pinzette 14 (das Respiratory Burst Assay kann auch auf seziert Nieren von erwachsenen Zebrafisch 12 und ausführliche Protokolle für Nieren zuvor beschrieben durchgeführt werden dechorionate Embryonen (Embryonen, wenn noch in den Chorion), wie Präparation von erwachsenen Zebrafisch wurden bereits beschrieben 16,17) wurde.
2. Herstellung der Lösung
- Bereiten Sie eine Stammlösung von H2DCFDA: Wiegen Sie 1 mg H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg H2DCFDA in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), um eine 1 mg / ml Stammlösung zu machen.
- Machen Sie 22 ul Aliquots dieser Stammlösung in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Wickeln Sie die Portionen von H2DCFDA Stammlösung in Aluminiumfolie und in der Dunkelheit, wann immer möglich zu halten, weil H2DCFDA ist lichtempfindlich.
- Speicher H2DCFDA Aliquots bei -20 ° C für bis zu 3 Monate.
- ACHTUNG - Bereiten Sie eine Stammlösung von Phorbolmyristatacetat (PMA): Wiegen Sie 1 mg PMA über geeignete persönliche Schutzausrüstung (zB Handschuhe, Schutzbrille und Maske).
- Lösen PMA in 1 ml DMSO, um eine 1 mg / ml Stammlösung zu machen.
- Machen Sie 11 ul Aliquots in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Shop Aliquots von PMA-Stammlösung bei -80 ° C für bis zu 3 Monate.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung H2DCFDA: Am Tag des Versuchs, einen H2DCFDA Arbeitslösung durch Zugabe von 1 Teil H2DCFDA Stammlösung auf 1Teil DMSO (500 ug / ml H2DCFDA Endkonzentration). Fügen Sie beispielsweise 20 ul H2DCFDA Stammlösung und 20 ul DMSO auf eine Folie eingewickelt 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung von PMA: Am Tag des Experiments, machen Sie eine PMA Arbeitslösung durch Zugabe von 1 Teil PMA-Stammlösung zu 49 Teile Nuklease freiem Wasser (20 ug / ml PMA Endkonzentration). Zum Beispiel, verdünnte 10 ul PMA-Stammlösung in 490 ul Nuklease-freies Wasser in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Vorbereitung einer Dosierung von Lösung H2DCFDA: Am Tag des Experiments einen H2DCFDA Dosierungslösung mit einer Endkonzentration von 1 ug / ml in H2DCFDA Ei Wasser. Die hergestellten Volumen der Dosierungslösungen können nach Wunsch verändert werden, aber sicherzustellen, daß die Endkonzentrationen der Reagenzien gehalten. Für Nieren, anstelle von Ei-Wasser, das gleiche Volumen von Dulbecco modifiziertem Eagle-medium/F-12 (50% DMEM, 50% F-12, ohne Phenolrot). Zu 5 ml H2DCFDA machenDosierungslösung, verwenden Sie ein 5 ml serologische Pipette 5 ml Ei Wasser (oder DMEM/F-12) in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen in Folie eingewickelt und mit 'H' zu übertragen.
- Entfernen Sie 10 ul Ei Wasser (oder DMEM/F-12) aus den 15 ml konischen Röhrchen mit 'H' und entsorgen.
- In 10 ul H2DCFDA Arbeitslösung in die 15 ml konischen Röhrchen mit 'H' und Wirbel zu mischen (diese Menge reicht für 48 Embryo oder Nierenproben (die Hälfte einer vollen 96-Well-Mikroplatten), und diese Bohrungen werden Messungen der Ebene stellen der Hintergrundfluoreszenz).
- Bereiten Sie eine Dosier-Lösung von H2DCFDA + PMA: Am Tag des Versuchs, einen H2DCFDA + PMA Dosierungslösung mit Endkonzentrationen von: H2DCFDA - 1 ug / ml und PMA - 400 ng / ml. Zu 5 ml H2DCFDA + PMA Dosierungslösung zu machen, verwenden Sie ein 5 ml serologische Pipette 5 ml Ei Wasser (oder DMEM/F-12) in ein neues 15 ml konischen Röhrchen mit 'H + P' zu übertragen.
- Entfernen 110 _6; l Ei Wasser (oder DMEM/F-12) aus den 15 ml konischen Röhrchen mit 'H + P' und entsorgen.
- In 10 ul H2DCFDA Arbeitslösung, dann fügen Sie 100 ul PMA Arbeitslösung in die 15 ml konischen Röhrchen mit 'H + P' und Wirbel zu mischen (diese Menge reicht für 48 Proben oder der anderen Hälfte einer vollen 96-Well-Mikroplatten ).
- Halten Sie die Dosierungslösungen auf Eis.
3. Mikroplatten-Reader Programmierung
- Bereiten Instruments: Schalten Sie den Mikroplatten-Reader.
- Wärmen Sie die Lichtquelle.
- Stellen Sie ein Programm, um die Fluoreszenz zu lesen: zB Anregung: 485 nm, Emission: 528 nm; Optics Position: Top 510 nm, Empfindlichkeit: 65, mit einer 5 Sek. Schütteln Schritt vor dem Lese.
4. 96 Well Mikroplatten-Set Up (siehe Abbildung 2)
- Sammeln Sie liefert: Erhalten Gerichte mit dechorionated Embryonen, schwarz 96 Well-Mikroplatte, Pipette und p200Tipps, Eiskübel mit H2DCFDA und H2DCFDA + PMA Dosierungslösungen, Mehrkanal-p200-Pipette zwei sterilen Behältern, Alufolie, und Schere.
- Übertragung eines Embryos in jedes Well einer 96-Well-Mikroplatte: Verwenden Sie eine Schere, um eine Pipettenspitze geschnitten, daß Embryonen oder Nieren fit durch die Öffnung.
- Legen Sie ein p200-Pipette zu 100 ul und übertragen ein Embryo zusammen mit Ei Wasser (oder DMEM/F-12) in möglichst viele der Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Mikroplatten wie gewünscht (es ist nicht notwendig, die Pipettenspitze für jedes unterschiedliche ändern Embryo Probe innerhalb einer Versuchsanlage, aber es kann notwendig, um Tipps zwischen experimentellen Bedingungen zu ändern). Achten Sie darauf, die Übertragung zu vermeiden Rest Chorion, da diese dazu neigen, die gesammelten Daten zu verzerren. Für die Übertragung von Nieren, kann ein größeres Volumen Pipette (auf 100 ul eingestellt) verwendet werden und Pipettenspitzen geschnitten, um eine größere Bohrung erhalten werden, wenn nötig. Es kann notwendig sein, Vertiefungen ohne Embryo oder Nierenproben aufzunehmen, aber mitDie Dosierungslösungen für einige experimentelle Manipulationen zu steuern.
- In Dosierungslösungen: Gießen H2DCFDA Dosierungslösung in ein steriles 25 ml-Reservoir.
- Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette und p200 acht Tipps, um gleichzeitig pipettieren 100 ul H2DCFDA Dosierung Lösung in einer Spalte auf der 96-Well-Mikroplatten (500 ng / ml Endkonzentration von H2DCFDA).
- Wiederholen Sie diesen Vorgang (wechselnde Tipps ist nicht notwendig) für so viele Spalten wie gewünscht (in der Regel sechs Spalten oder 48 Brunnen füllt, wenn eine gesamte 96-Well-Mikroplatten). Diese Lösung wird auf die Hälfte der Steuer Embryo Proben und die Hälfte der experimentell manipuliert Embryo Proben (ein Beispiel 96-Well-Mikroplatten-Einrichtung ist in Abbildung 2 dargestellt, diese Brunnen (orange gefärbt) werden Hintergrundfluoreszenz Daten in Proben nicht mit PMA induzierte Verfügung stellen) .
- Gießen Sie die H2DCFDA + PMA Dosierungslösung in eine neue, sterile 25 ml-Reservoir.
- Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette und p200 acht Tipps, um SIMULTaneously pipettieren 100 ul H2DCFDA + PMA Dosierungslösung in die restlichen Spalten (rot in Abbildung 2) der 96-Well-Mikroplatte (wechselnde Tipps ist nicht notwendig, Endkonzentrationen von H2DCFDA-500 ng / ml und PMA-200 ng / ml) .
- Decken Sie die Mikrotiterplatte mit Aluminiumfolie.
- Schütteln Sie die Mikroplatte für ca. 20 Sekunden bei 150 Umdrehungen pro Minute, um die Lösungen in jedem gut homogenisieren.
- Die Mikrotiterplatte bei 28 ° C, wenn sie nicht gelesen wird.
5. Fluoreszenz Quantifizierung
- Lesen der Mikrotiterplatte zur Zeit = 0 Stunden nach der Zugabe von PMA mit den im Schritt 3.1.2 beschriebenen Parameter.
- Weiter Messungen alle paar Minuten für die gewünschte Zeitintervall oder inkubieren Sie die Folie eingewickelt Mikroplatten bei 28 ° C bis zu einem späteren Zeitpunkt, und dann nehmen Sie eine Endpunktmessung zu einer gewünschten Zeit (zB 4 Stunden nach der Zugabe von PMA).
- Mit einem Kunststoff transfer Pipette, um die Embryonen aus dem Brunnen holen.
- Euthanize die Embryonen nach Ihren Tierpflege-und Nutzungsprotokoll, zB Eintauchen in Tricaine MS222.
- Entsorgen Sie die Mikro und andere Einweg-Materialien in der biologische Abfälle zu entsorgen.
6. Datenanalyse
- Entscheiden Sie sich für den Zeitpunkt, an dem Sie gerne Fluoreszenzwerte (z. B. 4 Stunden nach der Zugabe von PMA, Tabelle 1) zu vergleichen.
- Subtrahieren Fluoreszenzwert des Durchschnitts un-induzierte Kontrollgruppe von Fluoreszenzwerte der einzelnen PMA-induzierte Kontrollgruppe.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Versuchsgruppe mit und ohne PMA.
- Bewahren Sie diese normierten Fluoreszenzwerte in zwei Spalten, die Steuer + PMA-Gruppe und der experimentellen + PMA-Gruppe (Tabelle 2).
- Berechnen Sie die Mittelwerte und Standardabweichungen für die normierten Fluoreszenzwerte des Steuer + PMA Group und die experimentelle + PMA-Gruppe.
- Vergleichen der normierten Fluoreszenzwerte unter Verwendung eines ungepaarten t-Test statistisch signifikant (Tabelle 2) zu bestimmen.
- Graph die Mittel des Steuer + PMA-Gruppe und der experimentellen + PMA Gruppe mit Fehlerbalken reflektieren die entsprechenden Standardabweichungen.
- Nehmen Sie das Signifikanzniveau auf der Grafik in der Abbildung und Legende (Abbildung 2).
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Representative Results
Hier bieten wir den Vergleich der Daten Respiratory Burst-Antwort in Zebrafischembryonen (Wildtyp-, AB-Hintergrund) bei 48 und 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf). Die 48 hpf Embryonen als unsere Kontrollgruppe und den 72 hpf Embryonen als unsere Versuchsgruppe handelte. Die Stichprobengröße betrug 24 un-induzierte Embryonen und 24 PMA-induzierte Embryonen pro Entwicklungsstadium. Roh Fluoreszenzmesswerte (in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU)) wurden durch Lesen der Mikroplatte 4 Stunden nach der Zugabe von PMA erhalten. Roh Fluoreszenzwerte sind in Tabelle 1 angegeben. Raw Fluoreszenzwerte waren durchweg höher in den 48 hpf un-induzierte Embryonen als die 72 hpf un-induzierte Embryonen, mit Ausnahme eines 72 hpf Embryos (Mittel: 48 hpf = 758 RFU, 72 hpf = 230 RFU). Die Variabilität innerhalb dieser zwei Proben war annähernd gleich (Standardabweichungen: 48 hpf = ± 549 RFU, 72 hpf = ± 513 RFU), aber die 72 hpf Gruppe variiert mehr, bezogen auf den Mittelwert (Standard deviation als Prozentsatz des Durchschnitts: 48 HPF = 72%, 72 HPF = 223%). In den PMA-induzierte Gruppen waren roh Fluoreszenzwerte meist höher in der 72 hpf Bevölkerung (Mittel: 48 hpf PMA = 3798 RFU, 72 hpf PMA = 5825 RFU). Es war mehr Variabilität in der 72 hpf PMA-induzierten Gruppe als der HPF 48 PMA-induzierte Gruppe (Standardabweichung: 48 HPF PMA = 831 RFU 72 HPF PMA = 1365 RFU), aber die Variabilität in bezug auf die mittlere in etwa gleich war (HPF 48 PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
Um Schwankungen der Hintergrundwerte der Fluoreszenz-Konto wurden normalisierte Fluoreszenzwerte berechnet (PMA-induzierte Wert minus den Mittelwert der un-induzierten Werte der entsprechenden Entwicklungsstufe). Diese normierten Fluoreszenzwerte sind in Tabelle 2 angegeben, zusammen mit dem Mittel, Standardabweichungen und p-Wert für die 48 und 72 hpf-Gruppen. Ein Diagramm dieser Daten ist in Fig. 2 vorgesehen. Die normierten Fluoreszenzwerte sind durchweg hallogher in der Gruppe 72 hpf als der 48 hpf Gruppe (bedeutet: 48 = 3040 RFU hpf, 72 hpf = 5596 RFU) und die Variabilität ist ähnlich in Bezug auf die mittlere (48 hpf = 27%, 72 hpf = 24%). Diese Respiratory Burst-Test ergab, dass 72 hpf Zebrafisch-Embryonen sind in der Lage, mehr ROS produzieren und somit eine robustere Respiratory Burst Reaktion als 48 hpf Embryonen nach Induktion mit PMA zu montieren. Diese Feststellung kann durch eine erhöhte Anzahl von Zellen, einschließlich einer erhöhten Anzahl von Granulozyten 18, 72 HPF Embryonen im Vergleich zu 48 HPF Embryonen. Ein ungepaarten t-Test statistisch vergleichen die Daten bestätigt, dass die Atmungsstoß Antwort ist in 72 hpf Embryonen deutlich anders als 48 hpf Embryonen (* p = 2 x 10 -9).
In einem allgemeineren Sinn, zu dem Zeitpunkt t = 0 h nach der Zugabe von PMA, die rohen Fluoreszenz-Werte statistisch nicht unterschiedlich zwischen der PMA-induzierten und nicht-induzierten Gruppen sein. Die rohen Fluoreszenzwerte wird zunehe über die Zeit sowohl in der nicht-induzierten und induzierten Proben, mit einem viel größeren Zunahme der PMA-induzierten Embryos 12 auftritt. Der Anstieg der Roh-Fluoreszenz-Werte in der PMA-induzierten Gruppe, im Vergleich zu dem nicht-induzierten Gruppe wird auf etwa 1-2 Stunden nach der Zugabe von PMA (je nach Entwicklungsstadium der Zebrafisch-Embryonen, mit älteren statistisch signifikant werden Embryonen eine schnellere Montage Respiratory Burst Antwort als jüngere Embryonen). Normierte Fluoreszenzwerte (induzierte minus un-induziert) sollte mit der zunehmenden Entwicklungsstadium der Zebrafisch-Embryonen zu erhöhen, mit dem größten auftretenden Unterschied zwischen 48 und 72 Stunden nach der Befruchtung und eine kleinere Differenz zwischen 72 und 96 Stunden nach der Befruchtung auftritt. Raw Fluoreszenz Zahlen sollten 5 bis 60-fach höher in der PMA-induzierten Gruppe in Bezug auf die un-induzierte Gruppe, je nach dem Entwicklungsstadium der Zebrafisch-Embryonen (zwischen 48 und 96 Stunden nach der Befruchtung) sein. Variationzwischen einzelnen Proben Zebrafischembryo, so kommen, wird empfohlen, etwa 24 Embryo Proben pro Behandlung verwendet werden.
Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der chemischen Induktion des Respiratory Burst innerhalb einer Fresszelle. (A) In diesem Assay Respiratory Burst, PMA verwendet wird, um die Produktion von Superoxid-Anionen durch NADPH-Oxidase bewirken. Superoxid wird durch Superoxid-Dismutase zu Sauerstoff und Wasserstoffperoxid umgewandelt wird. Wasserstoffperoxid-und Chlorid-Anionen werden von Myeloperoxidase in hypochlorige Säure umgewandelt. Die nicht-fluoreszierenden Farbstoff, H2DCFDA wird, wenn sie durch viele verschiedene ROS oxidiert in der fluoreszierenden Verbindung DCF, umgewandelt. (B) Schematische Darstellung, wie die Quantifizierung der Fluoreszenz ist ein Auslesen der Respiratory Burst Antwort.
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2. Schematische Darstellung der Versuchsanordnung für den Respiratory Burst Test. Einzel dechorionated Zebrafischembryos werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Die in weiß umrandet Brunnen enthalten Steuer Embryonen und die schwarz umrandet enthalten Embryonen aus der Versuchsgruppe Brunnen. H2DCFDA oder H2DCFDA + PMA Dosierungslösungen werden in die entsprechenden Vertiefungen (farbige orange oder rot, beziehungsweise) aufgenommen. Die Fluoreszenz wird mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader quantifiziert. Respiratory Burst-Test-Daten werden dann analysiert, verglichen und dargestellt. Die Tabelle in dieser Figur ist eine Teilmenge der normierten Fluoreszenzwerte in Tabelle 2 dargestellt. Die Grafik in diesem enthalten sind die Mittelwerte, Standardabweichungen und p-Wert für den gesamten Datensatz in dieser Handschrift vorgestellt, die ebenfalls in der Tabelle 2 wird angezeigt. * P = 2 X 10-9.
Tabelle 1. Raw Fluoreszenzwerte von nicht-induzierten (orange Hintergrund) und induzierte (roter Hintergrund) 48 oder 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) Zebrafisch-Embryonen (weiße oder schwarze Zahlen, beziehungsweise) bei 4 Stunden nach der Zugabe von PMA. Der Mittelwert für den nicht-induzierten Proben berechnet.
| 48 hpf Embryonen | 72 hpf Embryonen | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Bedeuten | 758 | 230 | |||
| 48 hpf embroys + PMA | 72 hpf Embryonen + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tabelle 2. Normalisierung und statistische Vergleich der Daten. Normalisierten Fluoreszenzwerte zu erhalten, die Berechnung der Differenz zwischen jedem PMA-induzierte Fluoreszenzwert und der entsprechenden nichtinduzierten Mittelwert. Statistisch zu vergleichen, diese beiden Sätze von Daten unter Verwendung eines ungepaarten t-Test. Berechnen Sie die Mittelwerte und Standardabweichungen. Anzeige der Mittelwerte, Standardabweichungen und p-Wert (e) in grafischer Form (wie in Abbildung 2).
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Discussion
Die primäre Funktion der Fresszellen ist zu erkennen, zu verschlingen und zerstören Krankheitserreger. Die Fähigkeit der Phagozyten, um eine ausreichende Atem Burst zu erzeugen ist kritisch für diese Funktion. Somit ist die Quantifizierung des Respiratory Burst Reaktion ein Verfahren zum Vergleich der allgemeinen Gesundheit und der angeborenen Immunfunktion zwischen Gruppen von Individuen und / oder in Reaktion auf experimentelle Manipulationen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu induzieren, zu quantifizieren und vergleichen Sie den Respiratory Burst Reaktion zwischen den Gruppen der einzelnen Zebrafischembryonen. Kurz gesagt, führt PMA in der Produktion von ROS durch das Enzym NADPH-Oxidase. Diese ROS wirken auf ein nicht-fluoreszierenden Farbstoff und oxidieren, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden. Ein Mikroplatten-Lesegerät verwendet, um die relative Fluoreszenz in jeder Vertiefung zu erfassen. Fluoreszenz nach PMA-Induktion erzeugt wird, das den Atmungsausbruch Potential und die allgemeine Gesundheit der angeborenen Immunzebrafischembryonen. Vergleich der normalisierten Niveau der FluoreszenzFluoreszenz zwischen PMA induzierten Gruppen unter Verwendung eines ungepaarten t-Test kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob es einen signifikanten Unterschied in der Respiratory Burst Potential zwischen Gruppen von Zebrafisch ist. Experimentelle Manipulationen was erhebliche Unterschiede in der Respiratory Burst Reaktion Einblicke in Mechanismen der angeborenen Immunität, zB Genprodukte für die Phagozyten Respiratory Burst erforderlich, Medikamente, die eine Verstärkung oder antagonisieren die respiratory burst-Antwort bereitzustellen.
Protokolle zu verschiedenen Facetten der angeborenen Immunantwort in der Zebrafisch-Modell zu testen entwickelt (siehe Einleitung). Relativ wenige dieser Techniken messen die Produktion von ROS. Die Technik in diesem Artikel beschrieben quantifiziert Produktion von ROS in Zebrafischembryonen nach Stimulation eines angeborenen Immunantwort mit PMA. Diese Technik ist ähnlich der Respiratory Burst-Assays an isolierten Vollblutproben, wobei PMA wird auch verwendet, durchgeführt induce einen respiratorischen Burst-Antwort, und dann wird der ROS erzeugt werden unter Verwendung eines fluorogenen Substrats (z. Phagoburst, Orpegen Pharma) gemessen. Das hier beschriebene Verfahren kann mit ganzen Zebrabärbling-Embryonen, sowie seziert Nieren von erwachsenen Zebrafisch 13 verwendet werden, wie der Zebrafisch Vorderniere ist analog zu humanem Knochenmark, das der Ort der erwachsenen Hämatopoese 19 ist. Das hier beschriebene Verfahren ist auch flexibel genug, um mit anderen Fischarten und Zellsystemen, wie z. B. Zellpräparate Dickkopfelritze Nieren 20 verwendet werden.
Eine alternative Methode zu der ROS ganz Zebrafischembryos zu detektieren Verwendung eines in vivo-Wasserstoffperoxid-Sensor. Messenger-RNA für eine Redox-sensitive fluoreszierende Protein wird in Zebrafischembryonen injiziert und die Fluoreszenzverhältnis wird über die Zeit nach der Verwundung Schwanzflosse 21 überwacht. Diese genetisch codierten Redox-Sensor ermöglicht die Visualisierung der zeitlichen undräumliche Dynamik von Wasserstoffperoxid-Produktion in vivo. Anwendung des Verfahrens offenbart die überraschende Ergebnis, daß die anfänglich erzeugte voran Ankunft der ersten angeborenen Immunzellen, was darauf hindeutet, dass Wasserstoffperoxid durch verwundeten Epithelzellen freigesetzt Wasserstoffperoxid als Signal an Phagozyten 21 rekrutieren wirkt. Diese Technik, während kraftvoll und informativ, geht zeitaufwendig und technisch schwierig und Mikroskopie embryologischen Verfahren. Diese Redox-Sensor ist auch spezifisch für Wasserstoffperoxid, das nur eine der vielen ROS funktioniert bei der angeborenen Immunantwort.
Im Vergleich zu der oben diskutierten Ansatz misst unsere Methode auch in vivo ROS und doch technisch weniger anspruchsvoll und verwendet eine chemische, eine angeborene Immunantwort statt eines physischen Wunde induzieren. Im Gegensatz zu dem obigen Verfahren, die speziell misst die Herstellung von Wasserstoffperoxid, misst unser Verfahren dasGesamthöhe der ROS. Ein Vorteil der Erkennung eines einzelnen ROS ist, dass die Rollen für diese Verbindung allein in der angeborenen Immunität kann aufgeklärt werden. Ähnlich zu dem oben diskutierten Verfahren, teilt unser Ansatz auch die inhärenten Vorteile und Nachteile der in der ganzen Tier durchgeführt. Die Interaktionen zwischen Fresszellen und ihrer Umgebung, die eliminiert werden, wenn Respiratory Burst-Tests werden auf isolierten Blutproben durchgeführt werden, sind in diesen ganzen Tier Tests erhalten. Die Verwendung des gesamten Tieres zu erwartenden Ergebnisse beim Nachweis von ROS aus nicht Phagozyten Quellen (z. B. Mitochondrien stamm ROS nonphagocyte NADPH-Oxidase). In einem Versuch, die Spezifizität unseres Verfahrens zum Erfassen Phagozyten abgeleitete ROS Adresse bezeichnet wir eine Studie, in der dieser respiratorischen Burst-Assay wurde in Zebrafischembryonen durchgeführt fehlt Phagozyten spezifischen NADPH-Oxidase-9. Phagozyten spezifische NADPH-Oxidase wurde über Morpholino-vermittelten knock down von p47phox oder p91p gehemmtHox-Protein. Im Zebrafisch-Embryonen, in der Entwicklungsphase getestet, die Expression dieser NADPH-Oxidase-Untereinheiten auf eine Teilmenge von Blutzellen beschränkt, wahrscheinlich Makrophagen 22,23. Die Atem Burst-Potential von Embryonen fehlt Phagozyten-spezifische NADPH-Oxidase war, dass etwa ein Drittel der Kontrollen 9 (persönliche Mitteilung, Dr. Robert Wheeler). Dieses Ergebnis legt nahe, dass, während unsere respiratory burst Assay macht erfassen ROS aus anderen Quellen als Phagozyten, kann die Mehrzahl der detektierten Fluoreszenz, um den respiratorischen Burst über Phagozyten NADPH-Oxidase zurückzuführen. Weitere Spezifität dieses Assays wurde unter Verwendung von Bisindolylmaleimid I (BiSi), eine pharmakologische Inhibitor der Proteinkinase C gezeigt, um die Wirkung von PMA, einem Proteinkinase-C-Agonist, NADPH-Oxidase zu verhindern. Vorbehandlung der PMA-induzierten Zebrafisch-Embryos mit Nieren oder Bisi führte Fluoreszenzwerte ähnlich un-induzierten Kontrollen 12. Eine ideale AtemBurst-Assay würde ein in vivo-Assay mit hohem Durchsatz, wo Phagocyten-spezifische ROS könnte sowohl quantitativ und über die Zeit dargestellt werden können. Bis dies möglich ist, die schnelle Natur und der technischen Einfachheit der hier beschriebenen Verfahren liefert eine nützliche Alternative.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Vergangenheit und Gegenwart die Mitglieder des Kim Labor, Mark Nilan für Zebrafisch-Pflege und Wartung, Dr. Robert Wheeler für hilfreiche Diskussionen und gemeinsame Nutzung von Daten zu bestätigen, und NIH Zuschüsse 3RO1GM087308-02S1 und 1P20RR024475-01A2 und die Maine Agrar-und Forst Experiment Station (Veröffentlichungsnummer 3303) für die Finanzierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
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