Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zebrafish में सहज प्रतिरक्षा स्वास्थ्य का एक संकेतक के रूप में श्वसन फट रिस्पांस की मात्रा

Published: September 12, 2013 doi: 10.3791/50667
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine

Summary

सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोगज़नक़ संक्रमण के खिलाफ जीवों की रक्षा करता है. सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक है, भक्षककोशिकीय सांस फट, हमलावर सूक्ष्मजीवों को मारने कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों उत्पन्न करता है. हम सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रासायनिक प्रेरित है जब उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों quantifies कि एक सांस फट परख का वर्णन.

Abstract

भक्षककोशिकीय सांस फट रोगज़नक़ संक्रमण को सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का हिस्सा है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उत्पादन शामिल है. आरओएस विषाक्त कर रहे हैं और phagocytized सूक्ष्मजीवों को मारने के लिए कार्य करते हैं. भक्षककोशिकीय व्युत्पन्न आरओएस के vivo मात्रा का ठहराव एक मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट करने के लिए एक जीव की क्षमता के बारे में जानकारी प्रदान करता है. यहाँ हम भक्षककोशिकीय सांस फट का रासायनिक प्रेरण पर पूरे zebrafish भ्रूण में आरओएस यों और तुलना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस विधि आरओएस द्वारा ऑक्सीकरण पर फ्लोरोसेंट हो जाता है कि एक गैर फ्लोरोसेंट परिसर का उपयोग करता है. व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण एक microplate के कुओं में pipetted और सांस फट का एक रासायनिक inducer के साथ या बिना इस fluorogenic सब्सट्रेट में incubated हैं. प्रत्येक कुएं में प्रतिदीप्ति एक microplate रीडर का उपयोग कर वांछित समय बिंदुओं पर मात्रा निर्धारित है. प्रतिदीप्ति रीडिंग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को खत्म करने के लिए समायोजित और फिर सह रहे हैंएक unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर mpared. इस विधि विभिन्न विकासात्मक चरणों में और इस तरह के प्रोटीन पछाड़ना, overexpression, या औषधीय एजेंटों के साथ इलाज के रूप में प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के जवाब में zebrafish भ्रूण की सांस फट क्षमता की तुलना के लिए अनुमति देता है. यह विधि भी वयस्क zebrafish के गुर्दे और कुछ अन्य मछली प्रजातियों से पूरे dissected गुर्दे या सेल की तैयारी में सांस फट प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इस प्रोटोकॉल के रिश्तेदार सादगी और अनुकूलन क्षमता मौजूदा प्रोटोकॉल पूरक होगा और बेहतर सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए तलाश के शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की हो जाएगा.

Introduction

सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली: प्रतिरक्षा प्रणाली के दो शाखाओं के शामिल है. सहज रोगक्षमता evolutionarily प्रतिरक्षा अनुकूली से अधिक प्राचीन है. रीढ़ दोनों सहज और अनुकूली शाखाओं के अधिकारी जबकि अकशेरुकी वर्तमान में, केवल जन्मजात उन्मुक्ति है लगा रहे हैं. प्रतिरक्षा अनुकूली कुछ रोगजनकों के लिए विशिष्ट और लंबे समय से स्थायी उन्मुक्ति प्रदान करते हैं, जन्मजात उन्मुक्ति हमलावर बैक्टीरिया, वायरस और कवक के लिए एक तत्काल प्रतिक्रिया है. सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण पहलू विदेशी आक्रमणकारियों निगल और नष्ट करने के लिए फ़ैगोसाइट (जैसे मैक्रोफेज, neutrophils) की सूजन और भर्ती में जो परिणाम साइटोकिन्स और chemokines की रिहाई शामिल है.

सफल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को शामिल: हमलावर सूक्ष्मजीवों की (1) मान्यता; उचित cascades संकेत (साइटोकिन्स और chemokines के जैसे विज्ञप्ति) (2) के प्रेरण, phagocytic कोशिकाओं की (3) समुचित विकास / पर्याप्त संख्या, (4) संक्रमण की साइटों के लिए फ़ैगोसाइट के प्रवास; रोगजनकों के (5) घिराव; और घिरा सूक्ष्मजीवों की (6) विनाश. इन कदमों में से किसी एक में ए की कमी से अभिभूत किया जा रहा है मेजबान का कारण है, और संक्रमण, के सामने झुकने सकता है. यह सभी पौधों और पशुओं में रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है, क्योंकि एक मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जीवों के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है. रीढ़ में, यह भी अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 potentiates. इसलिए, यह हम इसे बेहतर समझने के लिए और अपने कार्य का अनुकूलन करने के क्रम में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सभी पहलुओं का मूल्यांकन करने में सक्षम हैं कि महत्वपूर्ण है.

कई मॉडल जीवों Arabadopsis से सी. को लेकर सहज प्रतिरक्षा अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं को चूहों को ड्रोसोफिला को एलिगेंस. जन्मजात उन्मुक्ति का अध्ययन करने के लिए zebrafish (Danio rerio) मॉडल प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक लाभ यह zebrafish सहज और अनुकूली दोनों आईएम के साथ, एक हड्डीवाला है कि हैसमुदाय, अभी तक सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली के विकास अस्थायी अलग कर रहे हैं. प्रतिरक्षा अनुकूली पूरी तरह कार्यात्मक हो जाता है जब तक Zebrafish के आसपास 4-6 सप्ताह के बाद निषेचन 2 तब होती है, जो पूरी तरह से संक्रमण के खिलाफ संरक्षण के लिए सहज प्रतिरक्षा पर भरोसा करते हैं. आनुवंशिक हेरफेर, ऑप्टिकल स्पष्टता और तेजी से, बाहरी विकास के लिए उपकरणों के अलावा, zebrafish भ्रूण में रक्षा के सिद्धांत विधा के रूप में सहज उन्मुक्ति विवो में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए एक सरल मॉडल प्रदान करता है.

एकाधिक प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है. प्रोटीन और RNAseq zebrafish सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से हासिल साइटोकाइन प्रोफाइल के मनुष्यों के समान हैं और भी सहज उन्मुक्ति 3,4 में अप्रत्याशित जीन की भागीदारी का सुझाव दिया है कि पुष्टि की है. zebrafish भ्रूण और फ्लोरोसेंट, transgen की पारदर्शितारोगजनकों और zebrafish के आईसी उपभेदों वास्तविक समय में vivo में गतिशील मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं. न्युट्रोफिल विशेष myeloperoxidase प्रमोटर 5,6 या बृहतभक्षककोशिका विशेष MPEG1 प्रमोटर 7 के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण कल्पना और यों भक्षककोशिकीय प्रवास स्थानीयकृत संक्रमण 8 की साइटों के लिए और साथ ही phagocytosis और विनाश की कल्पना करने के लिए यह संभव बना दिया है fluorescently 8,9 रोगजनकों लेबल. Zebrafish भ्रूण भी उच्च throughput assays और रासायनिक स्क्रीन की पीढ़ी के लिए उत्तरदायी हैं. तदनुसार, संक्रमण 10 और रासायनिक प्रेरित चोट 11 की साइटों के लिए भक्षककोशिकीय प्रवास पर transcriptome विश्लेषण के उच्च तरीकों का हाल ही में विकसित किया गया है.

ऊपर सूचीबद्ध तकनीकों में से कोई मात्रात्मक फ़ैगोसाइट द्वारा रोगज़नक़ विनाश के अंतिम चरण का आकलन करें. इस अंतिम चरणघिरा रोगजनकों मार जो एक सांस फट (यानी आरओएस के उत्पादन और अन्य जहरीले यौगिकों), शामिल है. एंजाइम NADPH oxidase phagocytic कोशिकाओं में आरओएस का एक प्रमुख स्रोत है. ऑक्सीजन इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण में NADPH oxidase एंजाइम परिणामों के सब यूनिटों के विधानसभा, superoxide anions सृजन. बाद में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के माध्यम से, superoxide तो हाइड्रोजन पेरोक्साइड और हाइपोक्लोरस अम्ल (चित्रा 1 ए) में परिवर्तित किया जा सकता है. यह रोगजनकों को मारता है और इस प्रकार, zebrafish भ्रूण की सांस फट क्षमता की मात्रा का ठहराव समग्र सहज प्रतिरक्षा स्वास्थ्य का सूचक है कि फ़ैगोसाइट की सांस फट है. हम व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण 12 के समूह में सांस फट यों तो एक प्रतिदीप्ति आधारित परख विकसित की है. यह परख एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सेल पारगम्य डाई की गैर फ्लोरोसेंट, कम फार्म का इस्तेमाल करता. इस डाई, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein Diacetate (H2DCFDA), fluores में बदल जाता हैऑक्सीकरण पर प्रतिशत यौगिक, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (डीसीएफ),. भक्षककोशिकीय सांस फट से उत्पन्न विविध आरओएस H2DCFDA oxidize और प्रतिदीप्ति 24 उत्पन्न कर सकते हैं. प्रतिदीप्ति की उपस्थिति zebrafish के समूहों के बीच सांस फट प्रतिक्रिया यों और तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटीन kinase सी एगोनिस्ट phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) रासायनिक आरओएस के उत्पादन के लिए NADPH oxidase प्रेरित है और इस तरह प्रतिदीप्ति रीडिंग (चित्रा 1 बी) में वृद्धि करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस के साथ साथ, हम इस zebrafish भ्रूण सांस फट परख का एक संशोधित और अनुकूलित संस्करण की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह परख समय के साथ और / या प्रयोगात्मक जोड़तोड़ (जैसे morpholino की मध्यस्थता प्रोटीन पछाड़ना) के जवाब में व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण के समूहों के बीच सांस फट तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि का उपयोग, अन्य zebrafish जन्मजात उन्मुक्ति assays के साथ संयोजन के रूप में, जटिल और महत्वपूर्ण का एक और पूरी तस्वीर प्रदान करेगासहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Zebrafish की देखभाल और रखरखाव

  1. पशुपालन: मास अंडे वयस्क zebrafish के रूप में पहले 13 में वर्णित है. पहले 14 में वर्णित के रूप में पैदा की भ्रूण लीजिए.
  2. Microinjection (यदि वांछित): के रूप में जीन उत्पादों overexpress जीन उत्पादों या mRNA पछाड़ना के morpholino oligonucleotides के साथ microinject 1-4 सेल चरण zebrafish भ्रूण पहले 15 में वर्णित है.
    1. नकली की पर्याप्त पूल बनाए रखें नियंत्रण इंजेक्शन (कम से कम 48 जीवित, नकली प्रयोगात्मक चालाकी से मछली एक साथ 96 microplate भरने की जरूरत है, नियंत्रण मछली और 48 में रहने वाले इंजेक्शन).
  3. भ्रूण बनाए रखें: अंडा पानी में 28 डिग्री सेल्सियस पर गहरी पेट्री डिश में भ्रूण बढ़ो वांछित विकास मंच (एक सांस फट प्रतिक्रिया zebrafish भ्रूण में इस प्रोटोकॉल का उपयोग पता लगाने योग्य नहीं है जब तक (60 माइक्रोग्राम / एमएल त्वरित महासागर समुद्री नमक पानी autoclaved आसुत) छोटी से 2 दिन) निषेचन 12 पोस्ट. नोट: यह ओ किया गया है1-फिनाइल 2 Thiourea (पी टी यू) या golden/slc24a5 उत्परिवर्ती zebrafish का उपयोग माध्यम से या तो zebrafish भ्रूण में रंजकता को रोकने में काफी पीएमए (अप्रकाशित डेटा, 48, 72 में परीक्षण भ्रूण, और 96 से प्रतिदीप्ति के शामिल होने को बदल नहीं है कि bserved HPF).
    1. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ दैनिक मृत भ्रूण निकालें.
    2. ध्यान से पुराने अंडे पानी छानना और नयी अंडे पानी के साथ फिर से भरना.
  4. Dechorionate भ्रूण: प्रयोग के दिन के रूप में dechorionate भ्रूण (भ्रूण उनके chorions में अभी भी कर रहे हैं) पहले से दो ठीक संदंश 14 (यह श्वसन फट परख भी वयस्क zebrafish 12 और गुर्दे के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल से विच्छेदित गुर्दे पर प्रदर्शन किया जा सकता का उपयोग वर्णित वयस्क zebrafish से विच्छेदन पहले) 16,17 में वर्णित किया गया है.

2. समाधान तैयार

  1. H2DCFDA के एक शेयर समाधान तैयार: H2DCFDA के 1 मिलीग्राम वजन.
    1. डिएक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 1 मिलीलीटर में H2DCFDA की ssolve 1 मिलीग्राम.
    2. 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में इस शेयर समाधान के 22 μl aliquots बनाओ.
    3. एल्यूमीनियम पन्नी में H2DCFDA शेयर समाधान के aliquots लपेटें और जब भी H2DCFDA प्रकाश के प्रति संवेदनशील है क्योंकि संभव अंधेरे में रहते हैं.
    4. अप करने के लिए 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर H2DCFDA aliquots.
  2. चेतावनी - phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) की एक शेयर समाधान तैयार: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (यानी दस्ताने, काले चश्मे और मुखौटा) का उपयोग पीएमए के 1 मिलीग्राम वजन.
    1. एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए DMSO के 1 मिलीलीटर में पीएमए भंग.
    2. 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 11 μl aliquots बनाओ.
    3. अप करने के लिए 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर पीएमए शेयर समाधान के स्टोर aliquots.
  3. H2DCFDA का एक काम कर समाधान तैयार: प्रयोग के दिन, 1 से 1 भाग H2DCFDA शेयर समाधान जोड़कर एक H2DCFDA काम कर समाधान करनाभाग DMSO (500 माइक्रोग्राम / एमएल H2DCFDA अंतिम एकाग्रता). उदाहरण के लिए, H2DCFDA शेयर समाधान के 20 μl जोड़ने और एक पन्नी के लिए 20 μl DMSO 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब लपेटा.
  4. पीएमए का एक काम कर समाधान तैयार: प्रयोग के दिन, नि: शुल्क पानी (20 माइक्रोग्राम / एमएल पीएमए अंतिम एकाग्रता) nuclease 49 भागों के लिए 1 भाग पीएमए शेयर समाधान जोड़कर एक पीएमए काम कर समाधान करें. उदाहरण के लिए, एक 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 490 μl nuclease मुफ्त पानी में 10 μl पीएमए शेयर समाधान पतला.
  5. H2DCFDA की एक खुराक के समाधान तैयार: प्रयोग के दिन, अंडा पानी में 1 ग्राम / एमएल H2DCFDA के अंतिम एकाग्रता के साथ एक H2DCFDA खुराक समाधान करें. खुराक समाधान की तैयार मात्रा में वांछित के रूप में संशोधित, लेकिन अभिकर्मकों के अंतिम सांद्रता बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित किया जा सकता है. गुर्दे के लिए, बजाय अंडा पानी की, (फिनोल लाल के बिना, 50% DMEM, 50% एफ 12) Dulbecco संशोधित ईगल medium/F-12 का एक ही मात्रा का उपयोग करें. H2DCFDA के 5 एमएल बनाने के लिएसमाधान खुराक, शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब पन्नी में लपेटा और 'एच' नामक एक 15 मिलीलीटर में 5 अंडे पानी की मिलीलीटर (या DMEM/F-12) स्थानांतरित करने के लिए एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करें.
    1. शंक्वाकार ट्यूब 'एच' लेबल और त्यागने 15 मिलीलीटर से अंडे पानी (या DMEM/F-12) के 10 μl निकालें.
    2. (यह मात्रा 48 भ्रूण या गुर्दे के नमूने (एक पूर्ण 96 microplate के आधे के लिए पर्याप्त है) मिश्रण करने के लिए 'एच' और भंवर लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में H2DCFDA काम कर समाधान के 10 μl जोड़ें और इन कुओं स्तर की माप प्रदान करेगा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की).
  6. H2DCFDA + पीएमए की एक खुराक के समाधान तैयार: प्रयोग के दिन के अंतिम सांद्रता के साथ एक H2DCFDA + पीएमए खुराक समाधान बनाने: H2DCFDA - 1 ग्राम / एमएल और पीएमए - 400 एनजी / एमएल. , H2DCFDA + पीएमए खुराक समाधान के 5 मिलीलीटर 'एच + पी' नामक एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 5 अंडे पानी की मिलीलीटर (या DMEM/F-12) स्थानांतरित करने के लिए एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करें.
    1. _ 110 निकालें6; शंक्वाकार ट्यूब 'एच + पी' लेबल और त्यागने 15 मिलीलीटर से अंडे पानी (या DMEM/F-12) के एल.
    2. H2DCFDA काम कर समाधान के 10 μl जोड़ें, तो लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 'एच + पी' और मिश्रण करने के भंवर (यह मात्रा 48 नमूने या एक पूर्ण 96 microplate के दूसरे आधे के लिए पर्याप्त है में पीएमए काम कर समाधान के 100 μl जोड़ने ).
  7. बर्फ पर खुराक समाधान रखें.

3. Microplate रीडर प्रोग्रामिंग

  1. Microplate रीडर पर पावर: साधन तैयार करें.
    1. प्रकाश स्रोत गर्म.
    2. जैसे उत्तेजना: प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए एक कार्यक्रम निर्धारित 485 एनएम, उत्सर्जन: 528 एनएम, प्रकाशिकी स्थिति: शीर्ष 510 एनएम, संवेदनशीलता: 65, पूर्व पढ़ने के लिए एक 5 सेकंड मिलाते कदम के साथ.

4. 96 खैर Microplate सेट अप (देखें चित्र 2)

  1. आपूर्ति को इकट्ठा: dechorionated भ्रूण, काला 96 microplate, P200 pipettor और साथ व्यंजन प्राप्तटिप्स, H2DCFDA और H2DCFDA + पीएमए खुराक समाधान के साथ बर्फ बाल्टी, मल्टीचैनल P200 pipettor, दो बाँझ जलाशयों, एल्यूमीनियम पन्नी, और कैंची.
  2. एक साथ 96 microplate के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरण एक भ्रूण: उपयोग कैंची एक विंदुक टिप कटौती करने के लिए कि इस तरह के उद्घाटन के माध्यम से फिट भ्रूण या गुर्दे.
    1. वांछित के रूप में (यह प्रत्येक अलग के लिए पिपेट टिप बदलने के लिए आवश्यक नहीं है 100 μl के लिए एक P200 pipettor सेट और एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से microplate के कुओं के रूप में कई में अंडे का पानी (या DMEM/F-12) के साथ एक भ्रूण स्थानांतरण भ्रूण एक प्रयोगात्मक हालत भीतर नमूना, लेकिन यह) प्रयोगात्मक शर्तों के बीच सुझावों को बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है. इन एकत्र आंकड़ों तिरछा करते हैं, अवशिष्ट chorions स्थानांतरित करने से बचने के लिए सुनिश्चित करें. गुर्दे के हस्तांतरण के लिए, (100 μl करने के लिए सेट) एक बड़ी मात्रा pipettor इस्तेमाल किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो पिपेट टिप्स, एक बड़ा बोर आकार प्राप्त करने के लिए काटा जा सकता है. यह भ्रूण या गुर्दे के नमूने बिना कुओं को शामिल करने के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन साथ हो सकता हैकुछ प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए नियंत्रित करने के लिए खुराक समाधान.
  3. खुराक समाधान करें: एक बाँझ 25 मिलीलीटर जलाशय में H2DCFDA खुराक समाधान डालो.
    1. एक साथ 96 microplate (H2DCFDA के 500 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता) पर एक स्तंभ में H2DCFDA खुराक समाधान के 100 μl विंदुक एक multichannel P200 pipettor और आठ युक्तियों का उपयोग करें.
    2. (आमतौर पर छह कॉलम या 48 कुओं एक पूरे 96 microplate भरने अगर) के रूप में वांछित के रूप में कई स्तंभों के लिए यह (सुझावों को बदलने के लिए आवश्यक नहीं है) दोहराएँ. नियंत्रण भ्रूण नमूने और प्रयोगात्मक चालाकी भ्रूण नमूनों में से आधे का आधा करने के लिए इस समाधान में जोड़ें (एक उदाहरण के साथ 96 microplate की स्थापना चित्रा 2 में दिखाया गया है, इन कुओं (रंग नारंगी) पीएमए के साथ प्रेरित नहीं नमूनों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति डेटा प्रदान करेगा) .
    3. एक नया, बाँझ 25 मिलीलीटर जलाशय में H2DCFDA + पीएमए खुराक समाधान डालो.
    4. एक multichannel P200 pipettor और simult को आठ युक्तियों का उपयोग करेंaneously (सुझावों को बदलने के लिए आवश्यक नहीं है, H2DCFDA-500 एनजी / एमएल और PMA-200 एनजी / एमएल के अंतिम सांद्रता) 96 microplate की (चित्रा 2 में रंग लाल) शेष कॉलम में H2DCFDA + पीएमए खुराक समाधान के 100 μl विंदुक .
  4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ microplate कवर.
  5. अच्छी तरह से प्रत्येक में समाधान homogenize के लिए 150 rpm पर लगभग 20 सेकंड के लिए microplate हिलाएँ.
  6. इसे पढ़ नहीं किया जा रहा है जब 28 डिग्री सेल्सियस पर microplate सेते हैं.

5. प्रतिदीप्ति मात्रा

  1. समय पर microplate पढ़ें = कदम 3.1.2 में वर्णित मापदंडों का उपयोग पीएमए के बाद इसके अलावा 0 घंटा.
    1. माप वांछित समय अंतराल के लिए हर कुछ मिनट ले जारी रखने या एक बाद में समय बिंदु तक 28 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी लिपटे microplate सेते हैं और फिर (जैसे 4 घंटा पीएमए के अलावा के बाद) एक वांछित समय में एक समापन बिंदु माप ले.
  2. एक प्लास्टिक का उपयोग टीकुओं से भ्रूण को पुनः प्राप्त करने ransfer पिपेट.
  3. अपने जानवरों की देखभाल और उपयोग प्रोटोकॉल, tricaine MS222 में जैसे विसर्जन के अनुसार भ्रूण euthanize.
  4. Biohazardous अपशिष्ट कंटेनर में microplate और अन्य डिस्पोजेबल सामग्री के निपटान के.

6. डेटा विश्लेषण

  1. आप प्रतिदीप्ति मूल्यों (पीएमए, 1 टेबल के अलावा के बाद जैसे 4 घंटा) की तुलना करना चाहते हैं, जिस पर समय बिंदु पर फैसला.
  2. व्यक्तिगत पीएमए प्रेरित नियंत्रण समूह के प्रतिदीप्ति मूल्यों से औसत संयुक्त राष्ट्र प्रेरित नियंत्रण समूह के प्रतिदीप्ति मूल्य घटाना.
  3. साथ और पीएमए बिना प्रायोगिक समूह के लिए इस दोहराएँ.
  4. दो कॉलम, नियंत्रण + पीएमए समूह और प्रयोगात्मक + पीएमए समूह (तालिका 2) में इन सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों की दुकान.
  5. नियंत्रण + पीएमए चल मैदान की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों के लिए साधन और मानक विचलन की गणनापी और प्रयोगात्मक + पीएमए समूह.
  6. (तालिका 2) सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए एक unpaired टी परीक्षण का उपयोग सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों की तुलना करें.
  7. ग्राफ़ नियंत्रण + पीएमए समूह और उचित मानक विचलन को दर्शाती त्रुटि सलाखों के साथ प्रयोगात्मक + पीएमए समूह का मतलब है.
  8. ग्राफ पर और चित्रा कथा में महत्व का स्तर (चित्रा 2) के रिकार्ड.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ, हम 48 पर zebrafish भ्रूण में सांस फट प्रतिक्रिया (जंगली प्रकार, एबी पृष्ठभूमि) की तुलना डेटा और 72 घंटे के बाद निषेचन (HPF) प्रदान करते हैं. हमारे समूह के नियंत्रण और हमारे प्रायोगिक समूह के रूप में 72 HPF भ्रूण के रूप में काम 48 HPF भ्रूण. इस्तेमाल किया नमूने का आकार 24 संयुक्त राष्ट्र प्रेरित भ्रूण और विकास मंच प्रति 24 पीएमए प्रेरित भ्रूण था. (रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) में) कच्चे प्रतिदीप्ति रीडिंग 4 घंटे पीएमए के बाद इसके अलावा microplate पढ़ने के द्वारा प्राप्त किया गया. कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों तालिका 1 में प्रदान की जाती हैं. कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों एक 72 HPF भ्रूण के अपवाद (48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU साधन) के साथ, 72 HPF संयुक्त राष्ट्र प्रेरित भ्रूण से 48 HPF संयुक्त राष्ट्र प्रेरित भ्रूण में लगातार उच्च स्तर पर थे. इन दो नमूनों के भीतर परिवर्तनशीलता (मानक विचलन: 48 HPF = 549 RFU ±, 72 HPF = 513 RFU ±) लगभग बराबर था, लेकिन 72 HPF समूह मतलब (मानक deviatio के संबंध में अधिक विविधn मतलब का एक प्रतिशत के रूप में: = 72% 48 HPF, = 223% 72 HPF). पीएमए प्रेरित समूहों में, कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों 72 HPF आबादी में (48 HPF पीएमए = 3798 RFU, 72 HPF पीएमए = 5825 RFU साधन) ज्यादातर उच्च थे. वहाँ 48 HPF पीएमए प्रेरित समूह (मानक विचलन: 48 HPF पीएमए = 831 RFU, 72 HPF पीएमए = 1365 RFU) की तुलना में 72 HPF पीएमए प्रेरित समूह में अधिक परिवर्तनशीलता था, लेकिन इसका मतलब के संबंध में परिवर्तनशीलता लगभग बराबर था (48 HPF पीएमए = 22%, 72 HPF पीएमए = 23%).

प्रतिदीप्ति की पृष्ठभूमि के स्तर में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में करने के लिए, सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों (पीएमए प्रेरित मूल्य शून्य से उपयुक्त विकास मंच के संयुक्त राष्ट्र प्रेरित मूल्यों का माध्य) की गणना की गई. ये सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों का अर्थ है, मानक विचलन, और 48 और 72 HPF समूहों के लिए पी मूल्य के साथ तालिका 2 में प्रदान की जाती हैं. इस डेटा का ग्राफ चित्रा 2 में प्रदान की जाती है. सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों लगातार हाय कर रहे हैं48 HPF समूह की तुलना में 72 HPF समूह में घेर (मतलब: 48 HPF = 3040 RFU, 72 HPF = 5596 RFU) और परिवर्तनशीलता मतलब के संबंध (48 HPF = 27%, 72 HPF = 24%) के साथ इसी तरह की है. यह श्वसन फट परख 72 HPF zebrafish भ्रूण अधिक आरओएस उत्पादन कर रहे हैं और इसलिए पीएमए साथ अधिष्ठापन के बाद 48 HPF भ्रूण की तुलना में एक अधिक मजबूत सांस फट प्रतिक्रिया माउंट कि पता चला. इस खोज के कारण 48 HPF भ्रूण की तुलना में 72 HPF भ्रूण में granulocytes 18 की संख्या में वृद्धि, सहित कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए हो सकता है. सांख्यिकीय आंकड़ों की तुलना करने के लिए एक unpaired टी परीक्षण सांस फट प्रतिक्रिया (* = पी 2 एक्स 10 -9) 48 HPF भ्रूण से 72 HPF भ्रूण में काफी अलग है कि पुष्टि की.

एक अधिक सामान्य अर्थ में, पीएमए के बाद इसके अलावा समय बिंदु = 0 टी घंटा में, कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों पीएमए प्रेरित है और संयुक्त राष्ट्र प्रेरित समूहों के बीच सांख्यिकीय अलग नहीं होना चाहिए. कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों बढ़ाने जाएगाएक बहुत बड़ा वृद्धि पीएमए प्रेरित भ्रूण 12 में होने वाली के साथ दोनों संयुक्त राष्ट्र प्रेरित और प्रेरित नमूनों में समय के साथ ई. संयुक्त राष्ट्र प्रेरित समूह की तुलना में पीएमए प्रेरित समूह में कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों में वृद्धि, पर लगभग 1-2 घंटे पुराने के साथ zebrafish भ्रूण के विकास के चरण पर निर्भर करता है पीएमए (, के अलावा के बाद सांख्यिकीय महत्वपूर्ण हो जाएगा भ्रूण) युवा भ्रूण से एक तेज सांस फट प्रतिक्रिया बढ़ते. सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों (प्रेरित शून्य से संयुक्त राष्ट्र प्रेरित) 48 और 72 घंटे के बाद निषेचन और 72 और 96 घंटे के बाद निषेचन के बीच होने वाली एक छोटे अंतर के बीच होने वाली सबसे बड़ी अंतर के साथ, zebrafish भ्रूण की बढ़ती विकास मंच के साथ वृद्धि करनी चाहिए. कच्चे प्रतिदीप्ति संख्या 5 से 60 गुना तक (48 और 96 घंटे के बाद निषेचन के बीच) zebrafish भ्रूण के विकास के चरण पर निर्भर करता है, संयुक्त राष्ट्र प्रेरित समूह में पीएमए प्रेरित समूह के सापेक्ष में अधिक होना चाहिए. परिवर्तनइस प्रकार व्यक्ति zebrafish भ्रूण के नमूने, के बीच हो जाएगा, यह इलाज के अनुसार लगभग 24 भ्रूण नमूनों का इस्तेमाल किया जा सिफारिश की है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक भक्षककोशिकीय भीतर सांस फट का रासायनिक प्रेरण का आरेख. (क) इस श्वसन फट परख में, पीएमए NADPH oxidase द्वारा superoxide anions के उत्पादन को प्रेरित किया जाता है. Superoxide superoxide dismutase से ऑक्सीजन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड में बदल जाती है. हाइड्रोजन पेरोक्साइड और क्लोराइड anions myeloperoxidase द्वारा हाइपोक्लोरस अम्ल में बदल जाता है. कई अलग अलग आरओएस द्वारा ऑक्सीकरण जब गैर फ्लोरोसेंट डाई, H2DCFDA, फ्लोरोसेंट परिसर, डीसीएफ, में बदल जाती है. प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव सांस फट प्रतिक्रिया के बाहर एक पढ़ा है कि कैसे (बी) आरेख.

लेफ्टिनेंट = "चित्रा 2" के लिए: सामग्री चौड़ाई = "4.5in" src = "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
चित्रा 2. श्वसन फट परख के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के योजनाबद्ध. व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण एक साथ 96 microplate के कुओं में स्थानांतरित कर रहे हैं dechorionated. सफेद में उल्लिखित कुओं नियंत्रण भ्रूण और प्रायोगिक समूह से भ्रूण काले रंग में होते हैं उल्लिखित कुओं होते हैं. H2DCFDA या H2DCFDA + पीएमए खुराक समाधान (क्रमशः, नारंगी या लाल रंग का) उपयुक्त वेल्स को जोड़ रहे हैं. प्रतिदीप्ति एक microplate रीडर का उपयोग मात्रा निर्धारित है. श्वसन फट परख डेटा तो, विश्लेषण किया तुलना में, और प्रस्तुत किया है. इस आंकड़े में तालिका तालिका 2 में प्रदर्शित सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों का एक सबसेट है. इस आंकड़े में ग्राफ का मतलब है, मानक विचलन और भी तालिका 2 में प्रदर्शित किया जाता है जो इस पांडुलिपि में प्रस्तुत पूरे डेटा सेट, के लिए पी मूल्य भी शामिल है. * पी = 2 x 10 - 9.

1 "> 48 HPF 72 HPF 3955 2821 2220 5432 3702 6822 3268 4618 2411 5553 2984 6535 2970 5448 1767 3042 2110 4638 4010 5914 2975 4199 3220 8259 4266 5391 2212 5786 2953 7408 3474 5893 4386 4650 1240 4405 2226 6442 2553 5924 2785 5274 3870 5728 3879 5601 3530 8505 मीन 3040 5596 Stdev 831 1365 पी मूल्य 2 ई -09

तालिका 1. संयुक्त राष्ट्र प्रेरित से कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों (नारंगी पृष्ठभूमि) और प्रेरित (लाल पृष्ठभूमि) 48 या 72 घंटे के बाद निषेचन (HPF) पीएमए के अलावा के बाद 4 घंटे में क्रमशः zebrafish भ्रूण (सफेद या काले रंग की संख्या,). मतलब संयुक्त राष्ट्र प्रेरित नमूने के लिए गणना की है.

</ Tr>
48 HPF भ्रूण 72 HPF भ्रूण
408 326 358 92 83 208
276 381 1124 473 106 86
518 180 1085 110 93 109
1196 232 380 143 152 81
1416 339 735 123 85 81
489 390 347 98 118
2139 1183 1015 95 97 2609
1660 385 1630 111 115 136
मीन 758 230
48 HPF embroys + पीएमए 72 HPF भ्रूण + पीएमए
4713 2868 5144 3051 4868 4880
2978 4768 1998 5662 6144 4635
4460 3733 2984 7052 4429 6672
4026 3978 3311 4848 8489 6154
3169 5024 3543 5783 5621 5504
3742 2970 4628 6765 6016 5958
3728 3711 4637 5678 7638 5831
2525 4232 4288 3272 6123 8735

तालिका 2. सामान्य और डेटा का सांख्यिकीय तुलना. सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक पीएमए प्रेरित प्रतिदीप्ति मूल्य और उचित संयुक्त राष्ट्र प्रेरित मतलब मूल्य के बीच अंतर की गणना. सांख्यिकीय एक unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर डेटा के इन दो सेट की तुलना करें. इसका मतलब है और मानक विचलन की गणना. (चित्रा 2 के रूप में) ग्राफिकल रूप में मतलब है, मानक विचलन, और पी मूल्य (ओं) प्रदर्शित करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

फ़ैगोसाइट का प्राथमिक कार्य रोगजनकों, का पता लगाने चपेट में ले, और नष्ट कर रहा है. एक पर्याप्त श्वसन फट निर्माण करने के लिए फ़ैगोसाइट की क्षमता इस समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, श्वसन फट प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव व्यक्तियों और / या प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के जवाब में के समूहों के बीच सामान्य सहज प्रतिरक्षा स्वास्थ्य और कार्य करने की अनुमति तुलना एक विधि है. यहाँ, हम प्रेरित यों, और व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण के समूहों के बीच सांस फट प्रतिक्रिया तुलना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. संक्षेप में, पीएमए एंजाइम NADPH oxidase द्वारा आरओएस के उत्पादन में यह परिणाम है. ये आरओएस एक गैर फ्लोरोसेंट डाई पर कार्रवाई और एक फ्लोरोसेंट मिश्रित रूप से oxidize. एक microplate पाठक अच्छी तरह से प्रत्येक में रिश्तेदार प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है. पीएमए प्रेरण पर उत्पन्न प्रतिदीप्ति सांस फट क्षमता और zebrafish भ्रूण की सामान्य सहज प्रतिरक्षा स्वास्थ्य का सूचक है. Fluores की सामान्यीकृत स्तर की तुलना करेंएक unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर पीएमए प्रेरित समूहों के बीच cence zebrafish के समूहों के बीच सांस फट क्षमता में एक महत्वपूर्ण अंतर है कि यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. श्वसन फट प्रतिक्रिया में काफी अंतर में जिसके परिणामस्वरूप प्रायोगिक जोड़तोड़ सहज प्रतिरक्षा तंत्र, भक्षककोशिकीय सांस फट के लिए आवश्यक जैसे जीन उत्पादों, श्वसन फट प्रतिक्रिया को शक्ति या नाराज है कि दवाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा.

Zebrafish मॉडल में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं परख प्रोटोकॉल (परिचय देखें) विकसित किया गया है. इन तकनीकों के अपेक्षाकृत कुछ आरओएस के उत्पादन को मापने. इस लेख में विस्तृत तकनीक पीएमए के साथ एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की उत्तेजना पर zebrafish भ्रूण में आरओएस के उत्पादन quantifies. इस तकनीक पीएमए भी इंदु के लिए प्रयोग किया जाता है, जिनमें पृथक पूरे रक्त के नमूने, पर प्रदर्शन श्वसन फट assays के लिए इसी तरह की हैएक सांस फट प्रतिक्रिया CE, और उसके बाद उत्पन्न आरओएस एक fluorogenic सब्सट्रेट (जैसे Phagoburst, Orpegen फार्मा) का उपयोग कर मापा जाता है. zebrafish पूर्वकाल गुर्दा वयस्क hematopoiesis 19 की साइट है जो मानव अस्थि मज्जा, के अनुरूप है यहाँ के रूप में वर्णित विधि, वयस्क zebrafish 13 से पूरे zebrafish भ्रूण है, साथ ही विच्छेदित गुर्दे के साथ प्रयोग किया जा सकता है. यहाँ वर्णित विधि भी अन्य मछली प्रजातियों और ऐसे मूर्ख मनुष्य छोटी मछली गुर्दे 20 से सेल की तैयारी के रूप में सेल प्रणाली, के साथ प्रयोग किया जा करने के लिए पर्याप्त बहुमुखी है.

पूरे zebrafish भ्रूण में आरओएस पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक Vivo में हाइड्रोजन पेरोक्साइड सेंसर का उपयोग करता है. एक redox के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए मैसेंजर आरएनए zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है और प्रतिदीप्ति अनुपात 21 लोग घायल हो गए पूंछ पंख निम्नलिखित समय पर नजर रखी जाती है. यह आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग redox सेंसर लौकिक के दृश्य परमिट औरविवो में हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पादन के स्थानिक गतिशीलता. इस विधि के आवेदन घायल उपकला कोशिकाओं द्वारा जारी कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड सुझाव पहला सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के शुरू में पहले आगमन, उत्पादन हाइड्रोजन पेरोक्साइड फ़ैगोसाइट 21 भर्ती करने के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करता है कि आश्चर्यजनक परिणाम का पता चला. इस तकनीक, शक्तिशाली और जानकारीपूर्ण, समय लेने वाली और तकनीकी रूप से कठिन embryological और माइक्रोस्कोपी प्रक्रियाओं शामिल है. इस redox सेंसर भी केवल एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान कार्य कर कई आरओएस का है जो हाइड्रोजन पेरोक्साइड, के लिए विशिष्ट है.

ऊपर चर्चा दृष्टिकोण की तुलना में, हमारे विधि भी विवो आरओएस में उपाय है, और अभी तक तकनीकी रूप से कम मांग है और नहीं बल्कि एक शारीरिक घाव से एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए एक रसायन का उपयोग करता है. विशेष रूप से हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पादन उपाय जो उपरोक्त विधि के विपरीत, हमारे प्रक्रिया के उपायआरओएस का कुल स्तर. एक एकल आरओएस का पता लगाने के लिए एक लाभ सहज प्रतिरक्षा में अकेले कि परिसर के लिए भूमिकाओं को स्पष्ट किया जा सकता है. ऊपर चर्चा की विधि के समान, हमारे दृष्टिकोण भी पूरे जानवर में प्रदर्शन किया जा रहा है के निहित फायदे और नुकसान के शेयरों. फ़ैगोसाइट और सांस फट assays अलग रक्त के नमूने पर प्रदर्शन कर रहे हैं जब समाप्त हो जाते हैं, जो अपने वातावरण के बीच बातचीत, इन सारी पशु assays में संरक्षित कर रहे हैं. हालांकि, पूरे जानवरों के उपयोग की संभावना (जैसे आरओएस, nonphagocyte NADPH oxidase mitochondrially व्युत्पन्न) गैर भक्षककोशिकीय स्रोतों से आरओएस का पता लगाने में यह परिणाम है. भक्षककोशिकीय व्युत्पन्न आरओएस का पता लगाने के लिए हमारे विधि की विशिष्टता को संबोधित करने के प्रयास में, हम इस श्वसन फट परख भक्षककोशिकीय विशेष NADPH oxidase 9 कमी zebrafish भ्रूण में प्रदर्शन किया गया था जिसमें एक अध्ययन करने के लिए भेजा. भक्षककोशिकीय विशेष NADPH oxidase p47phox या p91p के नीचे morpholino की मध्यस्थता दस्तक के माध्यम से हिचकते थाHox प्रोटीन. Zebrafish भ्रूण में, assayed विकास के चरण में, इन NADPH oxidase सब यूनिटों की अभिव्यक्ति रक्त कोशिकाओं का एक सबसेट तक ही सीमित है, संभावना 22,23 मैक्रोफेज. भक्षककोशिकीय विशेष NADPH oxidase कमी भ्रूण की सांस फट क्षमता लगभग एक तिहाई नियंत्रण 9 (निजी संचार, डॉ. रॉबर्ट व्हीलर) की थी. यह परिणाम हमारे श्वसन फट परख फ़ैगोसाइट के अलावा अन्य स्रोतों से आरओएस पता लगाता है, जबकि पता चला प्रतिदीप्ति के बहुमत भक्षककोशिकीय NADPH oxidase के माध्यम से श्वसन फट करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इस परख के आगे विशिष्टता NADPH oxidase पर पीएमए, एक प्रोटीन kinase सी एगोनिस्ट, की कार्रवाई को रोकने के लिए, बीआईएस indolylmaleimide मैं (bisi), प्रोटीन kinase सी के एक औषधीय अवरोध करनेवाला का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. Bisi साथ पीएमए प्रेरित zebrafish गुर्दे या भ्रूण की पूर्व उपचार संयुक्त राष्ट्र प्रेरित नियंत्रण 12 के लिए इसी तरह प्रतिदीप्ति स्तर में हुई. एक आदर्श सांसफट परख भक्षककोशिकीय विशेष आरओएस मात्रा निर्धारित है और समय के साथ देखे जा सकता है दोनों जहां एक Vivo में उच्च throughput परख होगी. यह संभव है, जब तक यहां वर्णित विधि का तेजी से प्रकृति और तकनीकी आसानी एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों किम प्रयोगशाला, उपयोगी विचार विमर्श और डेटा साझा करने के लिए zebrafish देखभाल और रखरखाव, डॉ. रॉबर्ट व्हीलर के लिए मार्क Nilan के अतीत और वर्तमान सदस्यों को स्वीकार करना, और एनआईएच अनुदान 3RO1GM087308-02S1 और 1P20RR024475-01A2 और मेन कृषि और वन होगा वित्त पोषण के लिए स्टेशन (प्रकाशन संख्या 3303) प्रयोग.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
H2DCFDA Sigma Aldrich 35845-1G
PMA Fisher BP6851
DMSO Sigma Aldrich D2438-5X10ML
Tricaine S MS222 Western Chemical 100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red Life Technologies 11039-021
Deep Petri Dishes VWR 89107-632
Plastic Transfer Pipettes Fisher 13-711-7M
#5 Dumont Forceps Electron Microscopy Sciences 72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes Axygen 10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes VWR 21008-918
5 ml Serological Pipettes Greiner Bio One 606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader BioTek Contact BioTek
Black 96 Well Microplate VWR 82050-728
25 ml Sterile Reservoirs VistaLab 3054-2003
P200 Pipettor Gilson F123601
Multichannel Pipettor VWR 89079-948
Pipette Tips VWR 89079-478

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
  2. Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
  3. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
  4. Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
  5. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
  6. Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
  7. Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
  8. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
  9. Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
  10. Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
  11. d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
  12. Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
  13. Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
  14. Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  16. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
  17. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
  18. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  19. Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
  20. Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
  21. Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
  22. Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
  23. Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
  24. Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 79 फ़ैगोसाइट प्रतिरक्षा प्रणाली zebrafish प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों इम्यून सिस्टम प्रक्रियाओं मेजबान रोगज़नक़ बातचीत श्वसन फट इम्यून सिस्टम घटना सहज प्रतिरक्षा बैक्टीरिया वायरस संक्रमण]
Zebrafish में सहज प्रतिरक्षा स्वास्थ्य का एक संकेतक के रूप में श्वसन फट रिस्पांस की मात्रा
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goody, M. F., Peterman, E.,… More

Goody, M. F., Peterman, E., Sullivan, C., Kim, C. H. Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50667, doi:10.3791/50667 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter