Summary
Doğuştan gelen bağışıklık tepkisi patojen enfeksiyonuna karşı koruma sağlar organizmalar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin önemli bir bileşeni, fagosit solunum patlaması, istila eden mikroorganizmaları öldürmek reaktif oksijen türleri oluşturur. Biz, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi kimyasal uyarılmaktadır zaman üretilen reaktif oksijen türleri rakamlarla bir solunum patlaması tahlili tarif eder.
Abstract
Fagosit solunum patlaması patojen enfeksiyonuna karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir parçası olan ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini içerir. ROS zehirlidir ve fagosite mikroorganizmaları öldürmek için işlev görürler. Fagosit türevi ROS in vivo miktar güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi için bir organizmanın yeteneği ile ilgili bilgi sağlar. Burada fagosit solunum patlaması kimyasal indüksiyon üzerine tüm Zebra balığı embriyolarının ROS ölçmek ve karşılaştırmak için bir protokol açıklar. Bu yöntem, ROS tarafından oksidasyonu ve onu takiben floresan haline olmayan bir floresan bileşik kullanır. Bireysel embriyolar, zebra balığı, bir mikroplaka oyuklarına pipetle ve solunum patlaması bir kimyasal uyarıcı ile ya da olmadan, bu flüorojenik alt-tabaka içinde inkübe edilir. Her çukurdaki floresans bir mikro levha okuyucusu kullanarak arzu edilen zaman noktalarında ölçülür. Floresans okumaları floresan arka plan ortadan kaldırmak için ayarlandı ve daha sonra işbirliği vardıreşleştirilmemiş t-testi kullanılarak mpared. Bu yöntem, farklı gelişim aşamalarında ve bu protein demonte, aşırı ekspresyonuna veya farmakolojik maddeler ile tedavi olarak deneysel manipülasyonlar tepki olarak zebrafish embriyoların solunum patlama potansiyelinin karşılaştırma sağlar. Bu yöntem aynı zamanda yetişkin zebrafish böbrekler ve diğer bazı balık türleri ikinci bütün Dissected böbrek veya hücre preparasyonlarda solunum patlaması yanıtını izlemek için kullanılabilir. Biz bu protokolün göreceli basitlik ve uyum mevcut protokolleri tamamlayacak ve daha doğuştan gelen bağışıklık tepkisini anlamaya çalışırlar araştırmacıların ilgi olacağına inanıyoruz.
Introduction
Doğal ve adaptif bağışıklık: Bağışıklık sistemi iki koldan oluşur. Doğuştan bağışıklık evrimsel adaptif bağışıklık daha eskidir. Omurgalılar hem doğal ve adaptif şubeleri sahip iken Omurgasız anda, sadece doğuştan bağışıklığı olması düşünülmektedir. Adaptif bağışıklık belirli patojenlere karşı özel ve uzun süreli bağışıklık sağlamasına rağmen, doğuştan gelen bağışıklık istilacı bakteri, virüs ve mantarlar için hemen bir yanıttır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir önemli yönü yabancı istilacıları yutmak ve yok etmek fagositlerce (örneğin makrofajlar, nötrofiller) iltihabı ve işe sonuçlanan sitokin ve kemokin salınımını içerir.
Başarılı doğuştan gelen bağışıklık tepkileri içerir: mikroorganizmalara (1) tanıma, uygun sinyalizasyon kaskadlar (sitokinler ve kemokinlerin örn. ayırıcı) (2) indüksiyon; fagositik hücrelerin (3) düzgün gelişimi yeterli / numaraları; (4) Enfeksiyon bölgelerinde fagositlerin göç; patojenlerin (5) yutulma ve sardı mikroorganizmaların (6) imha. Bu adımlardan herhangi birinde bir eksiklik bunalan ana yol ve enfeksiyona yenik olabilir. Tüm bitki ve hayvanlarda patojenlere karşı ilk savunma hattı olduğu için sağlam bir doğal immün yanıt organizmaların sağlığı için çok önemlidir. Omurgalılarda, aynı zamanda adaptif bağışıklık tepkisini 1 güçlendirir. Bu nedenle, biz daha iyi anlamak ve onun işlevini optimize etmek için doğal immün yanıtın tüm yönleriyle değerlendirmek mümkün olduğu önemlidir.
Çoğu model organizma Arabadopsis dan C arasında değişen, doğuştan gelen bağışıklık incelemek için kullanılır kültürlenmiş insan hücrelerine farelerine Drosophila için elegans. Doğuştan gelen bağışıklık çalışma zebrafish (Br.rerio) model sistemi kullanmanın bir avantajı, zebra balığı, doğal ve adaptif hem im ile, bir omurgalı olmasıdırimzalamıstır, henüz doğal ve adaptif bağışıklığın gelişmesi geçici ayrılmış edilir. Adaptif bağışıklık tamamen işlevsel hale gelene kadar Zebra balığı yaklaşık 4-6 hafta sonrası döllenme 2 oluştuğu, sadece enfeksiyona karşı koruma için doğuştan bağışıklık güveniyor. Genetik manipülasyon, optik berraklık ve hızlı, dış gelişimi için araçlara ek olarak, zebra balığı embriyoların savunma prensibi modu olarak doğuştan gelen bağışıklık in vivo olarak doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin karmaşıklıklarını çalışma için hangi basitleştirilmiş bir model sağlar.
Çoklu protokolleri zebrafish embriyolarda doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin farklı yönleriyle değerlendirmek için geliştirilmiştir. Mikrodiziler ve RNAseq zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ile ortaya sitokin profilleri insanlarınkine benzeyen ve aynı zamanda doğal bağışıklık 3,4 beklenmedik genleri olduğunu ileri sürmüşlerdir onaylamıştır. Zebra balığı embriyo ve floresan, Transgen ve şeffaflıkpatojen ve zebrabalıkları ic suşları gerçek zamanlı in vivo dinamik konak-patojen etkileşimleri görselleştirme için izin verir. Nötrofil spesifik miyoloperoksidaz promoter 5,6 veya makrofaj özgü MPEG1 promoter 7 kontrolü altında GFP sentezleyen transgenik zebra balığı embriyolarının görselleştirmek ve ölçmek phagocyte göç lokalize enfeksiyonlar 8 siteleri yanı sıra fagositoz ve yıkımı ve görselleştirmek için mümkün kılmıştır floresan 8,9 patojenler etiketli. Zebrafish embriyoları, aynı zamanda, yüksek verimli deneyler ve kimyasal ekranlarının üretimi için uygundurlar. Bu duruma göre, enfeksiyon 10 ve kimyasal olarak neden olduğu hasarı 11 bölgelerine göç fagosit üzerine transcriptome analizi, yüksek verimli yöntemleri yakın zamanlarda geliştirilmiştir.
Yukarıda listelenen tekniklerin hiçbiri nicel fagositlerce patojen imha son aşamasını değerlendirmek. Bu son aşamayuttu patojenleri öldürmek bir solunum patlaması (yani ROS üretimi ve diğer toksik bileşikler) içerir. Enzimi NADPH oksidaz fagositik hücrelerde ROS önemli bir kaynağıdır. Oksijene elektron transferi NADPH oksidaz enzimi sonuç alt birimlerin montajı, süperoksit anyonlar üreten. Daha sonra enzimatik reaksiyon yoluyla, süperoksit sonra hidrojen peroksit ve hidroklorik asitten (Şekil 1A) dönüştürülebilir. Bu patojenler öldürür ve bu nedenle, zebra balığı embriyoların solunum patlaması potansiyelinin ölçümü genel olarak doğuştan gelen bağışıklık sağlık göstergesidir fagositlerin solunum patlaması olduğunu. Bireysel embriyolar zebrafish 12 gruplar halinde solunum patlamaları ve ölçmek için bir floresan bazlı bir deney geliştirilmiştir. Bu deney, bir ticari olarak temin edilebilir, hücre-geçirgen boyanın floresan olmayan, indirgenmiş formu kullanır. Bu boya, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (H2DCFDA), floresan dönüştürülüroksidasyon üzerine cent bileşik, 2 ', 7'-diklorofloresandiasetat (DCF),. Fagosit solunum patlaması tarafından üretilen çeşitli ROS H2DCFDA okside ve floresan 24 üretebilirsiniz. Floresans görünümü zebrabalıkları grupları arasında solunum patlaması yanıtı ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Protein kinaz C agonist forbol miristat asetat (PMA) kimyasal olarak ROS üretimi için NADPH oksidaz uyarılması ve bu nedenle floresan okumaları (Şekil 1 B) arttırmak için kullanılır. Burada, bu zebra balığı embriyo solunum patlaması deneyinin değiştirilmiş ve optimize edilmiş bir versiyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu deney, zaman ve / veya deneysel manipülasyonlar (örneğin, morfolino aracılığında protein yok etme) tepki olarak tek zebrafish embriyoların gruplar arasındaki solunum patlamaları ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntemin kullanılması, diğer zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık deneyleri ile bağlantılı olarak, karmaşık ve kritik ilişkin daha eksiksiz bir görüntü sağlayacakDoğuştan gelen bağışıklık tepkisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Zebra balığı Bakım ve Onarım
- Hayvancılık: Kitle yumurtlamaya yetişkin zebrabalıkları olarak önce 13 tarif. 14, daha önce tarif edildiği gibi kökenli embriyolar toplayın.
- Mikroenjeksiyon (istenirse) gibi gen ürünlerini aşırı ifade edilmesi için gen ürünleri ya da mRNA demonte morfolino oligonükleotitler ile Microinject 1-4 hücre aşamasında embriyoların zebra balığı, daha önce tarif edilen 15.
- Mock yeterli bir havuz korumak kontrolleri enjekte (en az 48 oturma, sahte deneysel manipüle balık 96 kuyu mikroplağı doldurmak için gerekli olan, kumanda balık ve 48 yaşam enjekte).
- Embriyoların bakımı: yumurta su içinde 28 ° C'de derin petri tabaklarında embriyolar büyümek istenilen gelişimsel aşamada (a solunum burst cevabını zebra balığı embriyolar bu protokolü kullanılarak tespit edilebilir değildir kadar (60 ug / ml Instant Ocean Deniz Tuz suda otoklava damıtılmış) daha genç 2 gün) gübreleme 12 sonrası. Not: o olmuştur1-fenil-2-tiyoüre (PTU) veya golden/slc24a5 mutant zebrabalıkları kullanımı ya aracılığıyla zebra balığı embriyolarının pigmentasyonu önlemek önemli PMA (yayınlanmamış veriler, 48, 72 de test edilmiş embriyolar, ve 96 ile floresan uyarılmasını değiştirmediğini bserved hpf).
- Plastik bir transfer pipet ile günlük ölü embriyolar çıkarın.
- Dikkatle eski yumurta suyu süzün ve her gün yeni yumurta su ile doldurmak.
- Dechorionate embriyolar: Deney gününde, embriyolar gibi dechorionate (embriyoların chorions hala ise) önce iki ince forseps 14 (bu, solunum patlaması deneyi de yetişkin zebrabalıkları 12 ve böbrek için ayrıntılı protokoller kesilerek böbrekler üzerinde gerçekleştirilebilir kullanılarak tarif yetişkin zebrafish diseksiyon önce) 16,17 tarif edilmiştir.
2. Çözüm Hazırlığı
- H2DCFDA bir stok solüsyonu hazırlayın: H2DCFDA 1 mg tartılır.
- Di1 mg / ml stok çözelti yapmak için, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1 ml H2DCFDA arasında ssolve 1 mg.
- 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, bu stok çözeltinin 22 ul alikotları olun.
- Alüminyum folyo H2DCFDA stok solüsyonu hacimde sarın ve her H2DCFDA ışığa duyarlı olduğu için mümkün karanlıkta tutmak.
- 3 aya kadar -20 ° C'de saklayın H2DCFDA alikotları.
- DİKKAT - phorbol myristate asetat (PMA) bir stok solüsyonu hazırlayın: uygun kişisel koruyucu donanım (örneğin eldiven, gözlük ve maske) kullanarak PMA 1 mg tartılır.
- 1 mg / ml stok çözelti yapmak için DMSO içinde 1 ml PMA çözülür.
- 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 11 ul alikotları olun.
- 3 aya kadar -80 ° C 'de PMA stok çözeltisi saklayın alikotları.
- H2DCFDA bir çalışma çözeltisi hazırlayın: Deney gününde, 1 ve 1 parça H2DCFDA stok solüsyonu ekleyerek bir H2DCFDA çalışma çözeltisi yapmakbölüm DMSO (500 ug / ml nihai konsantrasyon H2DCFDA). Örneğin, H2DCFDA stok çözeltisinden 20 ul ekleyin ve bir folyo 20 ul DMSO 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü tamamladı.
- PMA bir çalışma çözeltisi hazırlayın: Deney gününde, serbest su (20 ug / ml PMA son konsantrasyon), nükleaz 49 kısım 1 parça PMA stok solüsyonu ekleyerek bir PMA çalışma çözeltisi hazırlanır. Örneğin, bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 490 ul nükleaz içermeyen su içinde 10 ul PMA stok çözelti seyreltik.
- H2DCFDA bir dozlama çözeltisi hazırlandı: Deney gününde, yumurta su içinde 1 ug / ml H2DCFDA bir nihai konsantrasyonuna sahip bir çözelti elde H2DCFDA dozlama. Dozaj solüsyonların hacimleri, arzu edildiği gibi hazırlanan tadil edilmiş, ancak reaktiflerin son konsantrasyonları muhafaza emin olabilir. Böbrekler, yerine yumurta su (fenol kırmızısı olmaksızın,% 50 DMEM,% 50 F-12), Dulbecco değiştirilmiş Eagle medium/F-12 aynı hacimde kullanın. H2DCFDA 5 ml yapmakçözelti dozaj, konik santrifüj tüpü folyo ile sarılmış ve 'H' etiketli bir 15 ml 5 yumurta ml su (ya da DMEM/F-12) transfer etmek için bir 5 ml serolojik pipet kullanın.
- Konik tüp 'H' etiketli ve atın 15 ml yumurta su (veya DMEM/F-12) 10 ul çıkarın.
- (Bu hacim 48 embriyo veya böbrek örneklerinde (tam 96 kuyu mikrolevhanın yarısı için yeterlidir) karıştırmak için 'H' ve vorteks etiketli 15 ml konik tüp içine H2DCFDA çalışma çözeltisi 10 ul ekleyin ve bu kuyular düzeyi ölçümleri sağlayacak eşiğe).
- H2DCFDA + PMA bir dozlama çözeltisi hazırlandı: Deney gününde, son konsantrasyonları ile bir H2DCFDA + PMA dozlama solüsyonu yapmak: H2DCFDA - 1 ug / ml ve PMA - 400 ng / ml. , H2DCFDA + PMA dozlama çözeltisi 5 ml yapmak 'H + P' etiketli yeni bir 15 mL konik tüp içine 5 yumurta ml su (ya da DMEM/F-12) transfer etmek için bir 5 ml serolojik pipet kullanın.
- _ 110 Kaldır6, konik tüp 'H + P' olarak, atmak 15 ml yumurta, su (ya da DMEM/F-12) ile başlatılmıştır.
- H2DCFDA çalışma çözeltisinin 10 ul, etiketli 15 ml konik tüp 'H + P' ve karıştırmak için girdap (bu hacim 48 numune ya da tam bir 96 çukurlu mikrolevhanın diğer yarısı için yeterlidir içine PMA çalışma çözeltisi 100 ul ekle .)
- Buz üzerinde dozlama çözüm tutun.
3. Mikroplaka Okuyucu Programlama
- Mikrolevha okuyucu Güç: enstrüman hazırlayın.
- Işık kaynağı ısıtın.
- Örn Uyarımı'nı: floresan okumak için bir program kurmak 485 nm; Emisyon: 528 nm; Optik Pozisyon: Üst 510 nm; Hassasiyet: 65, önce okuma için bir 5 saniye sallayarak adım.
4. 96 Peki Mikroplate Set Up (bkz. Şekil 2)
- Malzemeleri toplayın: dechorionated embriyolar, siyah 96 kuyu mikrolevhanm, P200 pipet ve yemekleri ile eldeipuçları, H2DCFDA ve H2DCFDA + PMA dozaj çözümleri ile buz kovası, çok kanallı P200 pipet, iki steril rezervuarlar, alüminyum folyo, ve makas.
- 96 çukurlu bir mikrolevhanm her kuyuya Transferi Bir embriyo: kullanımlar makas, bir pipet kesmek şekilde açıklıktan uygun embriyolar veya böbrekler.
- Arzu edildiği gibi (her farklı için pipet değiştirme gerekli değildir 100 ul bir P200 pipet ayarlamak ve siyah, 96 gözlü mikroplaka kuyuların kadar yumurta içine suyun (ya da DMEM/F-12) ile birlikte bir embriyo transferi embriyo deneysel bir durum içinde örnek, ama) deneysel koşullar arasında ipuçlarını değiştirmek gerekli olabilir. Bu toplanan verilerin çarpık eğilimi olarak, artık chorions aktarılmasını önlemek için emin olun. Böbreklerin transferi için, (100 ul'ye ayarlanır) daha büyük bir hacim pipet kullanılabilir ve gerekirse pipet uçları, daha büyük bir delik boyutu elde etmek için kesilebilir. Bu embriyo ya da böbrek numune olmadan kuyu birleştirmek için gerekli olabilir, fakat olabilirBazı deneysel manipülasyonlar kontrol etmek için dozaj çözümleri.
- Dozajlama çözümleri ekle: steril 25 ml'lik hazne içine H2DCFDA dozaj çözüm dökün.
- Eş zamanlı olarak, 96 gözlü mikroplaka (H2DCFDA 500 ng / ml nihai konsantrasyon) ile ilgili bir kolon içine H2DCFDA dozlama çözeltisinin 100 ul pipet için bir çok kanallı pipet P200 ve sekiz ipuçlarını kullanın.
- (Genellikle altı sütun ya da 48 kuyu bütün bir 96 sıra mikroplağı dolum varsa) istediğiniz gibi birçok sütun için bu (ipuçları değişen gerekli değildir) tekrarlayın. Kontrol embriyo örnekler ve deneysel olarak manipüle embriyo numunelerin yarısı yarısına bu solüsyonu (örneğin, bir 96 oyuklu mikro-plaka kurmak Şekil 2'de gösterilmiştir, bu oyuklar (turuncu renkli), PMA ile uyarılan olmayan örneklerde eşiğe veriler sağlayacaktır) .
- Yeni bir steril 25 mi rezervuara H2DCFDA + PMA dozlama çözeltisi dökün.
- Bir çok kanallı pipet P200 ve simult sekiz ipuçlarını kullanınerişmesi (ipuçları değiştirme gerekli değildir, H2DCFDA-500 ng / ml PMA-200 ng / ml 'lik nihai konsantrasyonlar) 96 gözlü mikroplaka (Şekil 2' de renkli kırmızı), geri kalan sütun halinde H2DCFDA + PMA dozlama çözeltisinin 100 ul pipet .
- Alüminyum folyo ile örtünüz.
- De her bir çözüm homojenizasyonu için 150 rpm'de, yaklaşık 20 saniye boyunca mikroplak çalkalayın.
- Okumak değilken 28 ° C'de inkübe mikroplağı.
5. Floresan Kantitasyonu
- Zamanda mikroplak oku = aşama 3.1.2 'de tarif edilen parametreler kullanılarak PMA eklenmesinden sonra 0 sa.
- Ölçümlerinin istenilen zaman aralığında her birkaç dakikada alarak devam veya daha sonraki bir zaman noktasına kadar 28 ° C folyo sarılı mikroplağı inkübasyon ve ardından (örneğin 4 saat PMA eklenmesinden sonra) istenen bir zamanda uç nokta ölçü almak.
- Plastik bir t kullanınKuyulardan embriyolar almak için ransfer pipet.
- Hayvan bakımı ve kullanım protokolü tricaine MS222 örneğin daldırma göre embriyolar Euthanize.
- Biyolojik tehlikeli atık konteynerine mikroplakadan ve diğer tek kullanımlık malzemelerin imha.
6. Veri Analizi
- Eğer floresan değerleri (PMA, Tablo 1 eklenmesinden sonra örneğin 4 saat) karşılaştırmak istiyorum hangi zaman noktasında karar verin.
- Bireysel PMA-kaynaklı kontrol grubunun floresans değerlerinden ortalama un kaynaklı kontrol grubunun floresan Değ.Çıkar.
- Ve PMA olmadan deney grubu için bu işlemi tekrarlayın.
- Iki sütun, kontrol + PMA grubu ve deney + PMA grupta (Tablo 2) bu normalize floresan değerleri saklayın.
- Kontrol + PMA uzakta dışarı normalize floresan değerleri için ortalamalar ve standart sapmalar hesaplayınp ve deney + PMA grubudur.
- (Tablo 2) istatistiksel önemini belirlemek için bir paylaşılmamış t-testi kullanılarak normalize floresan değerleri karşılaştırın.
- Grafik kontrol grubu ve + PMA uygun standart sapmalar hata çubukları ile yansıtma deney + PMA grubu anlamına gelir.
- Grafiği ve şekil açıklamasında anlamlılık düzeyini (Şekil 2) kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, biz 48 de Zebra balığı embriyolarının solunum patlaması yanıtı (yabani tip, AB arka) karşılaştıran veri ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) sağlar. Bizim kontrol grubu ve deney grubu olarak 72 hpf embriyolar gibi davranıyordu 48 hpf embriyolar. Kullanılan örneklem büyüklüğü 24 un kaynaklı embriyolar ve gelişim aşamasında başına 24 PMA-kaynaklı embriyolar oldu. (Bağıl Floresan Birimleri (RFU) in) Ham floresan okumaları 4 saat PMA eklenmesinden sonra mikroplak okunmasıyla elde edilmiştir. Ham floresan değerleri Tablo 1 'de verilmektedir. Ham floresan değerleri bir 72 HPF embriyo haricinde (48 = HPF 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU anlamına gelir) ile, 72 HPF un neden olduğu embriyolar daha 48 HPF un neden olduğu embriyolar sürekli olarak daha yüksekti. Bu iki numune içinde değişkenlik (standart sapma: 48 hpf = 549 RFU ±, 72 hpf = 513 RFU ±) yaklaşık olarak eşit, ama 72 hpf grubu ortalama (standart deviatio göre daha değişikn ortalama bir yüzdesi olarak:% 72 = 48 HPF, 223 =% 72 HPF). PMA-kaynaklı gruplarda, ham floresan değerleri 72 HPF popülasyonda (48 HPF PMA = 3.798 RFU, 72 HPF PMA = 5.825 RFU araçları) çok daha yüksektir. Orada 48 HPF PMA-kaynaklı grubu (standart sapma: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1.365 RFU) 'den 72 HPF PMA-kaynaklı grubunda daha değişkenlik, ancak ortalama göre değişkenlik yaklaşık olarak eşit olduğu (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA =% 23).
Floresan arka plan seviyelerinde değişkenlik hesaba katılması için, normalleştirilmiş floresan değerleri (PMA-kaynaklı değeri eksi uygun gelişim aşamasında olan un neden olduğu değerlerin ortalamasını) hesaplandı. Bu normalleştirilmiş floresan değerleri, ortalama, standart sapma ve 48 ve 72 HPF gruplar için p-değeri ile birlikte, Tablo 2'de verilmiştir. Bu verilerin bir grafiğidir, Şekil 2'de sağlanmıştır. Normalleştirilmiş floresan değerleri sürekli olarak yüksek olan48 HPF grubuna göre 72 HPF grubunda Gher (şu anlama gelir: 48 = HPF RFU 3040, 72 5596 = HPF RFU) ve değişebilirlik ortalamanın göre (48 HPF = 27%, 72 HPF =% 24) ile benzerdir. Bu deney, solunum patlaması 72 HPF zebra balığı embriyolar daha ROS üretebilir ve bu nedenle PMA ile indüksiyondan sonra 48 HPF embriyolar daha güçlü bir solunum patlaması tepkisi ortaya çıkardı. Bu bulgu, 48 HPF embriyolara kıyasla 72 HPF embriyolarda granülosit 18 artan bir dizi dahil olmak üzere, hücrelerin artan bir sayıda olabilir. Istatistiksel verileri karşılaştırmak için t-test solunum patlaması yanıt (* p = 2 X 10 -9) 48 hpf embriyolar daha 72 hpf embriyoların önemli ölçüde farklı olduğunu doğruladı.
Daha genel bir anlamda, PMA ilave edilmesinden sonra zaman noktası t = 0 saatte, ham floresan değerleri PMA-kaynaklı ve un neden olduğu gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olmamalıdır. Ham floresan değerleri increas olacakçok daha büyük bir artış, PMA-kaynaklı embriyolar 12 meydana gelen hem de un kaynaklı ve kaynaklı numuneler, zaman içinde örn. Un kaynaklı grubu ile karşılaştırıldığında, PMA-kaynaklı grubunda ham floresan değerlerindeki artış, yaklaşık olarak 1-2 saat daha büyük olan Zebrafish embriyo gelişim aşamasına bağlı olarak PMA (eklenmesinden sonra istatistiksel olarak önemli hale gelecektir embriyolar) genç embriyoların daha hızlı solunum patlaması tepki montaj. Normalize floresan değerleri (kaynaklı eksi un kaynaklı) 48 ve 72 saat sonra döllenme ve 72 ve 96 saat sonra döllenme arasında ortaya çıkan daha küçük bir fark ile meydana gelen en büyük fark, zebra balığı embriyolarının artan gelişim aşamasında artmalıdır. Ham floresan sayı 5 ila 60-kat (48 ve 96 saat sonra döllenme arasında) Zebrafish embriyo gelişim aşamasına bağlı olarak, un kaynaklı grubuna PMA-kaynaklı grubu, göreceli olarak daha yüksek olmalıdır. VaryasyonBu şekilde tek tek zebra balığı embriyo örnekleri arasında ortaya çıkar, bu muamele başına yaklaşık olarak 24 embriyo örnekleri kullanılması önerilir.
Şekil 1. Bir fagosit içinde respiratuar patlama kimyasal indüksiyon diyagramı. (A), bu solunum patlaması tahlilde, PMA NADPH oksidaz, süperoksit anyon üretimini indüklemek için kullanılır. Süperoksit süperoksit dismutaz oksijen ve hidrojen peroksit haline dönüştürülür. Hidrojen peroksit ve klorid anyonlar, miyeloperoksidaz tarafından hipokloröz aside dönüştürülür. Birçok farklı ROS yükseltgenmiştir sırasında flüoresan olmayan boya, H2DCFDA, floresan bileşiği, DCF, dönüştürülür. Flüoresans ölçümü solunum patlaması yanıt dışarı okuma kadar (B) diyagramı.
lt = "Şekil 2" fo: İçerik-width = "4.5in" src = "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
Şekil 2. Solunum patlaması deneyi için, deney tasarımının şematik. Bireysel embriyolar, zebra balığı, 96 gözlü bir mikroplaka kuyu içine aktarılır dechorionated. Beyaz özetlenen Oyuklar kontrol embriyoları ve deney grubundan embriyo siyah içeren özetlenen kuyuları içermektedir. H2DCFDA veya H2DCFDA + PMA dozaj çözeltiler (sırasıyla, portakal veya kırmızı renkli), uygun oyuklara ilave edilir. Floresan bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülür. Solunum burst deney verileri daha sonra analiz göre ve sunulmuştur. Bu şekildeki tablo, Tablo 2'de gösterilen normalleştirilmiş floresan değerleri bir alt kümesidir. Bu şekilde grafik ortalama, standart sapma ve Tablo 2'de gösterilir Bu makalede yer alan tüm veri kümesi için, p-değeri içerir. * P = 2 X 10-9.
Tablo 1. Un kaynaklı Ham floresan değerleri (portakal renkli) ve bağlı (kırmızı background) 48 ya da 72 saat sonra döllenme (HPF) PMA ilave edildikten sonra 4 saat sonra, sırasıyla zebra balığı embriyolar (beyaz ya da siyah sayılar). Ortalama un neden olduğu örnekler için hesaplanır.
| 48 hpf embriyolar | 72 hpf embriyolar | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Ortalama | 758 | 230 | |||
| 48 hpf embroys + PMA | 72 HPF embriyolar + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tablo 2. Normalizasyon ve verilerin istatistiki karşılaştırması. Normalleştirilmiş floresan değerleri elde etmek için, her biri PMA-kaynaklı flüoresans değeri ve uygun un neden olduğu ortalama bir değer arasındaki farkı hesaplar. İstatistiksel eşleştirilmemiş t-testi kullanılarak veri bu iki takım karşılaştırın. Ortalamalar ve standart sapmalar hesaplayın. (Şekil 2'deki gibi) grafik biçiminde ortalama, standart sapma ve p-değer (ler) gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fagositlerin birincil işlevi patojenleri tespit yutmak ve yok etmektir. Uygun bir solunum patlamaları üretmek için fagositoz yeteneği bu işlev için kritik öneme sahiptir. Böylece, solunum patlaması tepkisinin ölçümü kişi ve / veya deneysel manipülasyonlar tepki olarak grupları arasında genel olarak doğuştan gelen bağışıklık sağlık ve fonksiyon karşılaştırma yapmak için bir yöntemdir. Burada biz neden ölçmek ve tek tek zebra balığı embriyoların gruplar arasındaki solunum patlaması yanıt karşılaştırmak için bir protokol açıklar. Kısacası, PMA enzim NADPH oksidaz ile ROS üretimi ile sonuçlanır. Bu ROS olmayan bir floresan boya üzerinde hareket eden ve bir floresan bileşik oluşturmak için okside. Bir mikroplaka okuyucu her iyi nispi floresan tespit etmek için kullanılır. PMA indüksiyondan sonra oluşturulan floresans solunum patlaması potansiyeli ve zebra balığı embriyoların genel doğuştan gelen bağışıklık sağlık göstergesidir. Normalleştirilmiş floresan seviyesinin karşılaştırılmasıbir çiftlenmemiş t-testi kullanılarak gruplar arasında PMA neden Cence zebrafish gruplar arasındaki solunum patlaması potansiyeli önemli bir fark olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Solunum patlaması yanıtta önemli farklılıklar sonuçlanan deneysel manipülasyonlar doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları, fagosit solunum patlaması için gerekli örneğin gen ürünleri, solunum patlaması tepkisini kuvvetlendiren veya antagonize uyuşturucu içgörüler sağlayacaktır.
Zebrabalıkları modelinde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin farklı yönleriyle tahlil protokolleri (bkz) geliştirilmiştir. Bu tekniklerin nispeten az sayıda ROS üretimini ölçmek. Bu makalede ayrıntılı teknik PMA ile bir doğal bağışıklık yanıtının uyarılması üzerine zebra balığı embriyolarının ROS üretimini ifade etmektedir. Bu teknik aynı zamanda PMA indu için kullanıldığı izole edilmiş tam kan örnekleri üzerinde yapılan solunum patlaması deneylere benzerBir solunum patlaması yanıt ce ve daha sonra üretilen ROS bir flüorojenik alt-tabaka (örneğin, Phagoburst, Orpegen Pharma) kullanılarak ölçülür. Zebra balığı anterior böbrek yetişkin hematopoez 19 site insan kemik iliği, benzer olduğu gibi burada tarif edilen bir yöntem olup, yetişkin zebrabalıkları 13 bütün zebra balığı embriyolar, hem de parçalara böbrekler kullanılabilir. Burada tarif edilen bu metod başka balık çeşitleri ve yavrusu böbrek gibi fathead 20 hücre preparatları gibi hücre sistemleri ile kullanılmak için yeterince çok yönlüdür.
Bütün zebra balığı embriyolarının ROS tespit etmek için alternatif bir yöntem, bir in vivo hidrojen peroksit sensörünün kullanır. Bir redoks-duyarlı floresan proteini için mesajcı RNA zebra balığı embriyoların içine enjekte edilir ve fluoresan oranı 21 yaralama kuyruk fin aşağıdaki zaman içinde izlenir. Bu genetik olarak kodlanmış redoks sensörü temporal görselleştirme izin verir vein vivo olarak hidrojen peroksit üretiminin mekansal dinamiği. Bu yöntemin uygulanması yaralı epitel hücreleri tarafından salınan hidrojen peroksit gösteren ilk doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ilk olarak varış öncesinde, üretilen hidrojen peroksit fagositler 21 toplamak için bir sinyal olarak hareket eder bu şaşırtıcı sonuç ortaya çıkardı. Bu teknik, güçlü ve bilgilendirici, zaman alıcı ve teknik olarak zor embriyolojik ve mikroskopi prosedürleri içerir iken. Bu redoks sensörü de sadece bir doğal bir bağışıklık yanıtı sırasında işleyen çok ROS, hidrojen peroksit için özeldir.
Yukarıda tartışılan yaklaşım ile karşılaştırıldığında, bizim yöntem de ROS vivo olarak ölçer ve henüz teknik olarak daha az zorlu ve daha çok fiziksel yara göre, bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi oluşturmak için bir kimyasal kullanır. Özel olarak, hidrojen peroksit üretimi büyüklüğüne yukarıdaki yöntem, tersine, bizim prosedür ölçerROS toplam düzeyi. Tek bir ROS tespit için bir avantajı, doğal bağışıklık tek başına bu bileşik için roller açıklanacaktır olmasıdır. Yukarıda tarif edilen yöntemle benzer şekilde, bizim yaklaşım aynı zamanda tüm hayvanda gerçekleştirilen doğasında avantajları ve dezavantajları paylaşmaktadır. Fagositoz ve respiratuar patlama deneyler, izole edilmiş kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilir zaman ortadan kalkar çevreleri arasındaki etkileşimler, bu bütün hayvan deneylerde korunur. Bununla birlikte, bütün hayvan kullanımı muhtemelen (örneğin, ROS, nonphagocyte NADPH oksidaz mitokondriyal türevi) non-fagosit kaynaklardan ROS saptanması ile sonuçlanır. Fagosit türevi ROS tespit etmeye yönelik bir yöntem özgünlüğünü gidermek için bir girişim olarak, bu deney, solunum patlaması fagosit özgü NADPH oksidaz 9 eksik zebra balığı embriyolar uygulandı bir çalışmada anılacaktır. Phagocyte özel NADPH oksidaz p47phox veya p91p aşağı morfolino-aracılı vuruş yoluyla önlendihox proteini. Zebra balığı embriyolarda, tahlil gelişim aşamasında, bu NADPH oksidaz alt birimlerinin ekspresyon kan hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlandırılmıştır, muhtemelen 22,23 makrofajlar. Phagocyte özel NADPH oksidaz eksik embriyoların solunum patlaması potansiyel yaklaşık üçte biri kontrolleri 9 (kişisel iletişim, Dr Robert Wheeler) olmasıydı. Bu sonuç solunum patlaması deney fagositler dışındaki kaynaklardan ROS tespit yapar iken, tespit edilen floresan çoğunluğu fagosit NADPH oksidaz ile solunum patlama atfedilebilir göstermektedir. Bu deneyde spesifısitesi artırılabilir NADPH oksidaz PMA, bir protein kinaz C agonist, bir eylem önlemek için, bis-indolylmaleimid'dir I (Bisi), protein kinaz C'nin bir farmakolojik inhibitörü kullanılması ile gösterilmiştir. Bisi ile PMA-kaynaklı zebra balığı böbrek veya embriyoların tedavi öncesi un neden olduğu kontrollere 12 benzer floresan seviyeleri ile sonuçlandı. İdeal solunumpatlama deneyi phagocyte özgü ROS sayısal ve zamanla görsel olabilir hem bir in vivo yüksek verimlilik tahlil olacaktır. Bu mümkün olduğu kadar, burada tarif edilen yöntemin, hızlı doğası ve teknik kolaylığı kullanışlı bir alternatif sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Kim laboratuvar, yararlı tartışmalar ve veri paylaşımı için Zebrafish bakım ve onarım, Dr Robert Wheeler Mark Nilan geçmiş ve şimdiki üyelerine de teşekkür ve NIH hibe 3RO1GM087308-02S1 ve 1P20RR024475-01A2 ve Maine Tarım ve Orman olur finansman için Station (Yayın Numarası 3303) Deney.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.
