Summary
自然免疫応答は、病原体感染に対する生物を保護します。自然免疫応答の重要な構成要素は、食細胞の呼吸バーストは、侵入する微生物を殺す活性酸素種を生成します。我々は、先天性免疫応答が化学的に誘発されたときに生成される活性酸素種を定量化する呼吸バーストアッセイを記載している。
Abstract
食細胞の呼吸バーストは病原体感染に対する自然免疫応答の一部であり、活性酸素種（ROS）の産生を伴う。 ROSは毒性があり、食作用を受けた微生物を死滅させるように機能する。食細胞由来のROSのインビボ定量は堅牢な自然免疫応答をマウントする生物の能力に関する情報を提供する。ここでは、食細胞の呼吸バーストの化学誘導時に全体のゼブラフィッシュ胚におけるROSを定量化し、比較するためのプロトコルを記述します。この方法は、ROSによる酸化の際に蛍光性となる非蛍光化合物を利用する。個々のゼブラフィッシュ胚は、マイクロプレートのウェルにピペットおよび呼吸バーストの化学誘導物質の有無にかかわらず、この蛍光性基質中でインキュベートする。各ウェルの蛍光をマイクロプレートリーダーを用いて、所望の時点で定量化される。蛍光読み取りは、バックグラウンド蛍光を除去するように調整され、次いで同時対応のないt検定を使用してmpared。この方法は、異なる発達段階で、そのようなタンパク質のノックダウン、過剰発現、あるいは薬理学的薬剤を用いた治療などの実験操作に応答したゼブラフィッシュ胚の呼吸バーストの可能性を比較することができます。この方法はまた、成体ゼブラフィッシュの腎臓および他のいくつかの魚種からの全解剖腎臓または細胞調製物中の呼吸バースト応答をモニターするために使用することができる。私たちは、このプロトコルの相対的なシンプルさと適応性は、既存のプロトコルを補完し、より良い自然免疫応答を理解しようと研究者を対象としています信じています。
Introduction
先天性および適応免疫：免疫システムは、2つのブランチで構成されている。自然免疫は、進化的に適応免疫よりも古代のです。脊椎動物は、先天性および適応ブランチの両方を有するのに対し、無脊椎動物は、現在、唯一の自然免疫を有すると考えられている。適応免疫は、特定の病原体に特異的かつ長期的な免疫を付与しながら、先天性免疫は、細菌、ウイルス、および真菌の侵入に対する即時応答である。自然免疫応答の重要な側面は、外国の侵略者を巻き込むと破壊する食細胞（ 例えば 、マクロファージ、好中球）の炎症と採用になりサイトカインやケモカインの放出を伴う。
成功した自然免疫応答が関与：侵入する微生物の（1）認識、適切なシグナル伝達カスケード（サイトカインおよびケモカインの例リリース）の（2）の誘導、食細胞の（3）適切な発達/十分な数、（4）感染の部位への食細胞の遊走、病原体（5）を飲み込み、そして微生物の貪食（6）の破壊。これらのステップのいずれか1の欠乏は圧倒されたホストにつながる、感染に屈する可能性があります。それはすべての植物や動物の病原体に対する防御の最前線であるため、堅牢な自然免疫応答は、生物の健康に不可欠です。脊椎動物では、それはまた、適応免疫応答を増強する1。そのため、我々はそれをよりよく理解し、その機能を最適化するために、自然免疫応答のすべての側面を評価することができることが重要です。
多くのモデル生物は、 アラビドプシスから℃の範囲、自然免疫の研究に使用されている培養したヒト細胞へのマウスにショウジョウバエの虫 。自然免疫の研究にゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）のモデルシステムを使用する利点は、ゼブラフィッシュは、先天性および適応の両方のIMで、脊椎動物であるということですmunity、まだ自然免疫と獲得免疫の開発が一時的に分離されています。適応免疫は約4〜6週間の受精後2を発生する、完全に機能するようになるまでのゼブラフィッシュは、単に感染に対する防御のための自然免疫に依存しています。遺伝子操作、光学的透明性と迅速な、外部の開発のためのツールに加えて、ゼブラフィッシュ胚における守備の原則モードなどの自然免疫は、 生体内での自然免疫応答の複雑さを研究するする単純化したモデルが用意されています。
複数のプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚における先天性免疫応答の異なるファセットを評価するために開発されてきた。マイクロアレイおよびRNAseqは、ゼブラフィッシュ自然免疫応答によって誘発されるサイトカインプロフィールがヒトのものと同様であり、また、先天性免疫3,4の予想外の遺伝子の関与が示唆されていることを検証しています。ゼブラフィッシュ胚および蛍光の透明性、トランスジーン病原体およびゼブラフィッシュのIC株は、リアルタイムで、生体内で動的な宿主-病原体相互作用の可視化を可能にします。好中球特有のミエロプロモーター 5,6またはマクロファージ特異的MPEG1プロモーター 7の制御下にGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚は、食作用および破壊を視覚化するために局所的な感染症の8と同様の部位への食細胞の遊走を可視化し、定量化することが可能になってきた蛍光標識された病原体8,9。ゼブラフィッシュ胚はまた、ハイスループットアッセイおよび化学スクリーンの生成に適している。従って、感染10と化学的に誘発される損傷の部位11に食細胞の移行の際にトランスクリプトーム解析のハイスループット法が最近開発されている。
上記の技術のうち、どれも定量的に食細胞による病原体の破壊の最終段階を評価しません。この最終段階飲み込ま病原体を殺す呼吸バースト（ すなわち 、ROSの生産および他の毒性化合物）を伴う。酵素NADPHオキシダーゼは、食細胞内ROSの主要な源である。酸素への電子の伝達におけるNADPHオキシダーゼ酵素結果のサブユニットのアセンブリー、スーパーオキシドアニオンを生成する。その後の酵素反応を介して、スーパーオキシドは、その後過酸化水素および次亜塩素酸（ 図1A）に変換することができる。これは、病原体を殺すため、ゼブラフィッシュ胚の呼吸バーストの可能性の定量化は、全体的な自然免疫の健康の指標である食細胞の呼吸バーストです。私たちは、個々のゼブラフィッシュ胚12のグループで呼吸バーストを定量化するための蛍光ベースのアッセイを開発しました。このアッセイは、市販の、細胞浸透性色素の非蛍光、還元体を利用する。この色素は、2 '、7'-ジクロロジアセテート（H2DCFDA）は、fluoresに変換される酸化時セント化合物、2 '、7'-ジクロロフルオレセイン（DCF）。食細胞呼吸バーストによって生成された多様なROSがH2DCFDAを酸化し、蛍光24を生成することができます。蛍光の出現は、ゼブラフィッシュのグループ間の呼吸バースト応答を定量化し、比較することができる。プロテインキナーゼCアゴニストホルボールミリステートアセテート（PMA）は、化学的にROSを生成するNADPHオキシダーゼを誘導し、従って、蛍光読み取り（ 図1B）を増加させるために使用される。ここに、我々は、このゼブラフィッシュ胚呼吸バーストアッセイの修正と最適化されたバージョンの詳細なプロトコルを提供する。このアッセイは、経時的および/ または実験操作（ 例えば、モルホリノ媒介性タンパク質ノックダウン）に応答して、個々のゼブラフィッシュ胚の呼吸バースト群間を比較するために使用することができる。この方法の使用は、他のゼブラフィッシュ先天性免疫アッセイと連動して、複雑で重要なのより完全な像を提供する先天性免疫応答。
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Protocol
1。ゼブラフィッシュケアとメンテナンス
- 畜産：マススポーン大人のゼブラフィッシュは、以前に13を説明した。以前に14を説明したように生成された胚を収集します。
- マイクロインジェクション（必要な場合）：ホリノオリゴヌクレオチドを用いたマイクロインジェクション1-4細胞期のゼブラフィッシュ胚以前に15を説明するように遺伝子産物を過剰発現するように遺伝子産物またはmRNAをノックダウンする。
- モックの十分なプールを維持するには、コントロールを注入された（少なくとも48の生活、モックが実験的に操作魚が96ウェルマイクロプレートを埋めるために必要とされる、コントロールの魚と48の生活に注射）。
- 胚を維持：卵の水に28℃で、深いペトリ皿の中の胚を育てる目的の発達段階（呼吸バースト応答はゼブラフィッシュ胚でこのプロトコルを使用して検出可能でなくなるまで（60μg/ mlのインスタントオーシャンシーソルト水オートクレーブ蒸留）より若い2日）は受精12を投稿してください。注：は、Oでした1 -フェニル-2 -チオ尿素の使用（PTU）のいずれかを介してゼブラフィッシュ胚における色 素沈着を予防またはgolden/slc24a5変異体ゼブラフィッシュが大幅にPMA（未発表データ、48でテスト胚、72、および96によって蛍光の誘導を変化させないことをbserved HPF）。
- プラスチックホールピペットで毎日死んで胚を削除します。
- 慎重に古い卵の水をデカントし、毎日新しい卵の水で補給してください。
- 実験当日、dechorionate胚（胚は彼らの絨毛膜に残っている場合）以前に2細かい鉗子14を用いて説明したように（この呼吸バーストアッセイはまた、腎臓のための大人のゼブラフィッシュ12および詳細なプロトコルから解剖腎臓に実行できます。Dechorionate胚大人のゼブラフィッシュからの解剖は、以前）16,17に記載されている。
2。溶液の調製
- H2DCFDAの原液を準備します。H2DCFDA 1mgを秤量。
- ディ1 mg / mlのストック溶液を作るためにジメチルスルホキシド（DMSO）1ml中のH2DCFDAのssolve 1ミリグラム。
- 1.7ミリリットルマイクロ遠心管中でこの原液22μlのアリコートを作る。
- アルミ箔でH2DCFDA原液の一定分量をラップし、H2DCFDAは感光性であるため、暗い可能な限りおいてください。
- 最大3ヶ月間-20℃で保存H2DCFDA分量。
- 注意-ホルボールミリステートアセテート（PMA）の原液を準備し、適切な個人用保護具（ すなわち 、手袋、ゴーグルとマスク）を使用して、PMA 1mgを秤量。
- 1 mg / mlのストック溶液を作るためにDMSO 1ml中にPMAを溶解する。
- 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに11μLずつを加えます。
- 最大3ヶ月間-80℃でのPMA原液の店舗ずつ。
- H2DCFDAのワーキング溶液を調製します。実験の日に、1に1部H2DCFDA原液を添加することにより、H2DCFDAワーキング溶液を作る部品のDMSO（500μg/ mlのH2DCFDA最終濃度）。例えば、H2DCFDAストック溶液20μlを追加し、ホイルに20μlのDMSOを1.7 mlマイクロチューブを包んだ。
- PMAのワーキング溶液を調製：実験の日に、49の部分に、ヌクレアーゼフリーの水を1部、PMAのストック溶液を添加することによって、PMA作業溶液を作る（20μg/ mlのPMA最終濃度）。例えば、1.7ミリリットルのマイクロチューブに490μlのヌクレアーゼフリーの水で10μlのPMA原液を希釈。
- H2DCFDAの投与溶液の調製：実験の日に、卵の水に1μg/ mlのH2DCFDAの最終濃度でH2DCFDAの投与溶液を作る。投与溶液の調製容積は、所望のように変更したが、試薬の最終濃度が維持されていることを確認することができる。腎臓の場合は、代わりに卵の水、（フェノールレッドなしで、50％のDMEM、50％のF-12）ダルベッコ改変イーグルmedium/F-12の同じボリュームを使用しています。 H2DCFDAの5ミリリットルを作成するには解決策を投与、コニカル遠心管をホイルで包み、 'H'とラベル15ミリリットルに5卵mlの水（またはDMEM/F-12）を転送するために5ミリリットル血清学的ピペットを使用しています。
- 15ミリリットルから10卵の水の液（またはDMEM/F-12）を削除 'H'とラベル円錐管、廃棄します。
- （このボリュームは48胚または腎臓サンプル（全96ウェルマイクロプレートの半分のために十分である）混合する「H」とボルテックスラベル15ミリリットルコニカルチューブにH2DCFDA作業液10μlを追加し、これらのウェルは、レベルの測定を提供します）バックグラウンド蛍光の。
- 実験の日に、最終濃度でH2DCFDA + PMAの投与溶液行います：H2DCFDA + PMAの投与溶液を準備しH2DCFDAを - 1μg/ mlのとPMA - 400 ng / mlの。 H2DCFDA + PMA投与溶液5mlを加えるには、「H + P」という新しい15ミリリットルコニカルチューブに卵、水（またはDMEM/F-12）の5ミリリットルを転送するために5ミリリットル血清学的ピペットを使用しています。
- _ 110を削除する6; 'H + P」とラベル15ミリリットルから卵、水（またはDMEM/F-12）のL円錐管、廃棄します。
- 、H2DCFDAワーキング溶液10μlを追加 'H + P」とラベル付けされ、その後15ミリリットルに、PMA作業溶液100μlを加え円錐管と混合する渦（このボリュームは、48サンプルまたは完全な96ウェルマイクロプレートの他の半分のために十分である）。
- 氷上の投与溶液を保管してください。
3。マイクロプレートリーダープログラミング
- マイクロプレートリーダーの電源をオンにします。楽器を準備します。
- 光源のウォームアップ。
- 蛍光読み込むプログラムが設定しますが例えば励起：485 nmの、放射：528 nmの、光学位置：トップ510ナノメートル、感度：65、先読みにステップを振っ5秒で。
4。 96穴マイクロプレートのセットアップ（ 図2を参照）
- 消耗品を収集します。絨毛膜を除去した胚と皿、黒の96ウェルマイクロプレート、P200ピペッターとを取得ヒント、H2DCFDAおよびH2DCFDA + PMA投与溶液、マルチチャンネルP200ピペッター、2無菌貯水池、アルミニウム箔およびはさみでアイスバケット。
- 96穴マイクロプレートの各ウェルに転送1胚：使用はさみピペットチップをカットするように開口部を通って適合する胚または腎臓。
- 必要に応じて（それは各々が異なるため、ピペットチップを変更する必要はありません100μlにP200ピペッターを設定し、黒の96ウェルマイクロプレートのウェルのような多くに卵、水（またはDMEM/F-12）と一緒に1胚を転送胚の実験条件内のサンプルが、これは実験条件間でチップを交換する必要があるかもしれない）。これらは、収集されたデータをゆがめる傾向があるので、残留絨毛膜を転送しないようにしてください。腎臓の転送のために、（100μlに設定された）大きな体積ピペッターを使用することができ、必要に応じてピペットチップは、より大きな孔サイズを得るために切断することができる。これは、胚または腎臓試料なしでウェルを組み込むことが必要であるが、有することができるいくつかの実験操作を制御するために投与溶液。
- 投与溶液を追加し、滅菌25ミリリットルリザーバーにH2DCFDAの投与溶液を注ぐ。
- 同時に96ウェルマイクロプレート（H2DCFDAの500 ng / mlの最終濃度）に1列にH2DCFDA投与溶液100μlをピペットするためにマルチチャンネルP200ピペッターおよび8のヒントを参考にしてください。
- （全体の96穴マイクロプレートを充填した場合、通常は6列または48ウェルの）必要な数の列に対して、この（TIPSの変更が必要ありません）を繰り返します。対照胚サンプルと実験的に操作胚サンプルの半分は半分にこのソリューションを追加します（例：96ウェルマイクロプレートを設定し、図2に示されている、これらのウェル（オレンジ色）、PMAで誘導していない試料では、バックグラウンド蛍光データを提供します） 。
- 新しい滅菌25ミリリットルリザーバーにH2DCFDA + PMAの投与溶液を注ぐ。
- simultするマルチチャンネルP200ピペッターおよび8のヒントを参考にしてくださいaneously（、ヒントを変更することは必要ありませんミリリットルH2DCFDA-500 NG /およびPMA-200 ng / mlの最終濃度）を96ウェルマイクロプレートの残りの列（ 図2の赤で表示）にH2DCFDA + PMA投与溶液100μlをピペット。
- アルミホイルでマイクロプレートをカバーしています。
- 各ウェル内の溶液を均質化する150 rpmで約20秒間、マイクロプレートを横に振る。
- それが読まれていないときに28℃でマイクロプレートをインキュベートする。
5。蛍光定量
- ステップ3.1.2で説明したパラメータを使用して、PMAの添加後の時間= 0時間目に、マイクロプレートをお読みください。
- （PMAの添加後4時間など ）所望の時間間隔のための測定を数分おきに撮影を続行以降の時点まで、28℃でのホイル包まれたマイクロプレートをインキュベートし、目的の時点で、エンドポイントの測定を行う。
- プラスチックtを使用するウェルから胚を取得する順伝達ピペット。
- 、あなたの動物のケアと使用プロトコルに従ってトリカインMS222における例えば浸漬胚を安楽死させる。
- バイオハザード廃棄物容器内のマイクロプレートや他の使い捨て材料を処分。
6。データ解析
- あなたは、蛍光値を比較したいと思いますた時点（PMA、 表1を加えた後例えば 4時間）を決定します。
- 個々のPMA誘導対照群の蛍光値からの平均非誘導対照群の蛍光値を引きます。
- PMAとない実験群のためにこれを繰り返します。
- 2列、コントロール+ PMA群と実験+ PMA群（ 表2）、これらの正規化された蛍光値を格納します。
- コントロール+ PMA grouの正規化された蛍光値のための平均と標準偏差を計算するPと実験+のPMAグループ。
- （ 表2）の統計的有意性を決定するために、対応のないt検定を用いて正規化された蛍光値を比較する。
- グラフコントロール+ PMAグループと適切な標準偏差を反映してエラーバーを用いた実験+ PMAグループの手段。
- グラフ上や図の凡例（ 図2）における有意水準を記録します。
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Representative Results
ここでは、48および72時間後に受精（HPF）でのゼブラフィッシュ胚（野生型、AB型、バックグラウンド）での呼吸バースト応答を比較するデータを提供する。 48 HPFの胚は、我々の実験群としての対照群および72 HPFの胚を務めた。使用したサンプル·サイズは24非誘導胚および発達段階ごとの24 PMA誘導胚だった。 （相対蛍光単位（RFU）で生）蛍光読み取りを4時間PMAの添加後、マイクロプレートを読み取ることによって得た。生の蛍光値を表1に示す 。生の蛍光値は1 72のHPF胚の例外（：48 HPF = 758 RFU、72 HPF = 230 RFU手段）と、72のHPF非誘導胚より48 HPFの非誘導胚で一貫して高かった。これら二つの試料内変動が（標準偏差：48 HPF = 549 RFU±、72 HPF = 513 RFU±）ほぼ等しいだったが、72 HPFグループは平均（標準deviatioに関して、より多様= 72パーセント48 HPF、= 223パーセント72 HPF）：平均値の割合としてN。 PMA誘導群では、生の蛍光値は72 HPF集団における（：48 HPF PMA = 3798 RFU、72 HPF、PMA = 5825 RFU手段）、主に高かった。そこに48 HPF PMA誘導グループ（標準偏差：48 HPF PMA = 831 RFU、72 HPF、PMA = 1365 RFU）よりも72 HPF PMA誘導群ではより多くのばらつきがあったが、平均値についての変動がほぼ等しいた（48ゼブラPMA = 22％、72ゼブラPMA = 23％）。
蛍光のバックグラウンドレベルの変動を考慮するために、正規化された蛍光値（PMA誘発性の値を引いた適切な発生段階の非誘導の値の平均）を算出した。これらの正規化された蛍光値は、48および72ゼブラグループに対する平均、標準偏差およびp値と共に、 表2に示す 。このデータのグラフを図2に設けられている。正規化された蛍光値は一貫してハイテクです48 HPF群よりも72 HPFグループ内gherは（意味：48 HPF = 3040 RFU、72 HPF = 5596 RFU）と変動は、平均値を基準（48 HPF = 27％、72 HPF = 24％）と似ています。この呼吸バーストアッセイは72 HPFのゼブラフィッシュ胚はより多くの活性酸素を生成するため、PMAで誘導後に48 HPFの胚よりも堅牢な呼吸バースト応答をすることができることを明らかにした。この知見は、48ゼブラ胚と比較して72ゼブラ胚における顆粒球18の数の増加を含む、細胞数の増加にあってもよい。統計的データを比較する独立t検定は、呼吸バースト応答が48ゼブラ胚より72ゼブラ胚において有意に異なることが確認された（* p = 2×10 -9）。
より一般的な意味では、PMAの添加後の時刻t = 0時間の時点で、生の蛍光値は、PMA誘導性および非誘導群間で統計的に異なってはならない。生の蛍光値はincreasますPMA誘導胚12において発生するはるかに大きな増加に伴う非誘導および誘導両方のサンプルの経時E、。非誘導群と比較して、PMA誘導群では生の蛍光値の増加は、高齢で、ゼブラフィッシュ胚の発達段階に応じて、（時間、PMAの添加後に約1〜2、統計学的に有意になる若い胚より速く呼吸バースト応答を開始胚）。正規化された蛍光値は（誘起マイナス非誘導）48および72時間後に受精および72および96時間後に受精との間に生じる差が小さいとの間に発生する最大の違いは、ゼブラフィッシュ胚の増加発達段階に増やす必要があります。生の蛍光番号は5〜60倍（48および96時間後に受精の間）ゼブラフィッシュ胚の発達段階に応じて、非誘導グループへのPMA誘導グループ相対的に高くあるべきである。変動個々のゼブラフィッシュ胚のサンプル間で発生します、したがって、治療あたり約24胚のサンプルを使用することをお勧めします。
図1。食細胞内呼吸バーストの化学的誘導の図。 （A）は、この呼吸バーストアッセイでは、PMAは、NADPHオキシダーゼによりスーパーオキシドアニオンの産生を誘導するために使用される。スーパーオキシドは、スーパーオキシドジスムターゼ、酸素と過酸化水素に変換される。過酸化水素および塩化物アニオンは、ミエロペルオキシダーゼにより次亜塩素酸に変換される。多くの異なるROSによって酸化する際、非蛍光染料、H2DCFDAは、蛍光化合物、DCFに変換される。蛍光の定量化は、呼吸バースト応答のうちリードがいかにの（B）図。
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図2。呼吸バーストアッセイのための実験計画の概略。個人がゼブラフィッシュ胚を96ウェルマイクロプレートのウェルに移している絨毛膜を除去。含まれている白の対照胚と黒で概説ウェルで概説されたウェルは、実験群からの胚を含んでいる。 H2DCFDAまたはH2DCFDA + PMAの投与溶液は、適切なウェル（それぞれ、オレンジまたは赤で表示）に追加されます。蛍光マイクロプレートリーダーを用いて定量する。呼吸バーストアッセイデータは、その後、分析され比較され、提示される。この図の表には、表2に表示された正規化された蛍光値のサブセットです。この図のグラフは、平均、標準偏差及び表2に表示されている本稿で提示データセット全体のためのp値を有している。 * P = 2×10から9。
表1。非誘導からの生の蛍光値（オレンジ色の背景）と誘導した（赤の背景）48または72時間後に受精（HPF）、PMAの添加後4時間で、それぞれゼブラフィッシュの胚（白または黒の数字）。平均を非誘導サンプルについて計算される。
| 48 HPFの胚 | 72 HPFの胚 | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| 平均 | 758 | 230 | |||
| 48のHPF embroys + PMA | 72 HPF胚+ PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ TR>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
表2。正規化とデータの統計的比較。正規化された蛍光値を取得するには、各PMA誘導蛍光値および適切な非誘導の平均値との差を計算します。統計学的に不対t検定を用いてこれら2つのデータセットを比較する。平均と標準偏差を計算します。 （ 図2のように）グラフ形式で平均、標準偏差およびp値（s）を表示する。
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Discussion
食細胞の主な機能は、検出巻き込む、および病原体を破壊することである。適切な呼吸バーストを生成する食細胞の能力は、この機能のために重要である。したがって、呼吸バースト応答の定量化は、個体群間および/または実験操作に応答して一般的な先天性免疫の健康および機能の比較を可能にする一つの方法である。ここでは、誘導し、定量化、および個々のゼブラフィッシュ胚のグループ間の呼吸バースト応答を比較するためのプロトコルを記述します。要するに、PMAは、酵素NADPHオキシダーゼによってROSの産生をもたらす。これらのROSは、非蛍光色素に作用し、蛍光化合物を形成するために、それを酸化する。マイクロプレートリーダーは、各ウェル中の相対蛍光を検出するために使用される。 PMA誘導の際に発生した蛍光は、呼吸バースト電位及びゼブラフィッシュ胚の一般的な先天性免疫の健康の指標である。 fluoresの正規化されたレベルの比較対応のないt検定を用いて群間のPMA誘導性cenceは、ゼブラフィッシュのグループ間の呼吸バースト電位に有意差があるかどうかを決定するために使用することができる。呼吸バースト応答の有意な差をもたらし実験操作は、自然免疫のメカニズム、食細胞呼吸バーストのために必要な例えば遺伝子産物、呼吸バースト応答を増強するか、拮抗する薬への洞察を提供します。
ゼブラフィッシュモデルにおける自然免疫応答のさまざまな側面をアッセイするプロトコルは（概要を参照）が開発されてきた。これらの技術の比較的少数のは、ROSの産生を測定。この記事で詳述技術はPMAで自然免疫応答の刺激によりゼブラフィッシュ胚におけるROSの産生を定量化する。この技術は、PMAはまたinduのに使用される単離された全血試料に対して実行呼吸バーストアッセイと同様である呼吸バースト応答をCE、その後、生成されたROSは、蛍光基質（ 例えば Phagoburst、Orpegenファーマ）を用いて測定している。ゼブラフィッシュ前方腎臓、成人造血19の部位であるヒト骨髄、に類似しているように、ここで説明する方法は、成体ゼブラフィッシュ13からの全ゼブラフィッシュ胚、ならびに解剖腎臓と共に使用することができる。ここで説明する方法は、他の魚種等ファットヘッドミノー20腎臓からの細胞調製物などの細胞系で使用するのに十分汎用性があります。
全体ゼブラフィッシュ胚においてROSを検出するための別の方法は、in vivoでの過酸化水素センサを利用する。レドックス感受性蛍光タンパク質のメッセンジャーRNAは、ゼブラフィッシュ胚に注入され、蛍光比を、尾のフィン創傷21以下の時間をかけて監視される。この遺伝的にコード化された酸化還元センサーは、時間の可視化を可能にし、インビボでの過酸化水素製造の空間的動態。この方法の適用は、過酸化水素が負傷した上皮細胞によって放出された過酸化水素は21食細胞を補充するためのシグナルとして作用することを示唆し、第一の先天性免疫細胞の最初に先行到着を生じたことを驚くべき結果が明らかになった。この技術は、強力かつ有益ながら、時間がかかり、技術的に困難で発生学的と顕微鏡手順が含まれます。このレドックスセンサーはまた、1つ先天性免疫応答の間に機能する多くのROSのある過酸化水素、特異的である。
上記のアプローチと比較すると、我々の手法は、in vivo、ROSに測定し、まだ技術的に厳しくないですし、自然免疫応答ではなく、物理的な傷を誘導するために化学物質を使用しています。具体的には過酸化水素の産生を測定する上記の方法とは対照的に、我々の手順は、測定ROSの総レベル。シングルのROSを検出することの利点は、自然免疫において単独でその化合物の役割を解明することができるということである。前述の方法と同様に、私たちのアプローチは、動物全体で行われているの固有の利点と欠点を共有しています。貪食および呼吸バーストアッセイは、単離された血液試料に対して実行されたときに除去され、それらの環境との間の相互作用は、これらの全動物アッセイにおいて保存されている。しかし、動物全体の使用が可能性が高い（ 例えばミトコンドリア由来ROS、nonphagocyte NADPHオキシダーゼ）非食細胞源からのROSの検出結果。食細胞由来のROSを検出するための手法の特異性に対処するための試みとして、我々はこの呼吸バーストアッセイを食細胞特有のNADPHオキシダーゼ9を欠いているゼブラフィッシュ胚で行われた研究に言及。食細胞固有のNADPHオキシダーゼは、p47phoxやp91pのダウンモルホリノ媒介ノックを経由して阻害されたHOXタンパク質。ゼブラフィッシュ胚において、アッセイ発達段階で、これらのNADPHオキシダーゼサブユニットの発現は、血液細胞のサブセットに制限され、そう22,23マクロファージ。食細胞固有のNADPHオキシダーゼを欠いた胚の呼吸バーストの可能性が約3分の1のコントロール9（私信、ロバート·ウィーラー）のことでした。この結果は、我々の呼吸バーストアッセイは、食細胞以外の供給源からのROSを検出しないが、検出される蛍光の大半は食細胞NADPHオキシダーゼを介して呼吸バーストに起因し得ることを示唆している。このアッセイのさらなる特異性NADPHオキシダーゼにPMA、プロテインキナーゼCアゴニストの作用を防止するために、ビスインドリルマレイミドI（BISI）、プロテインキナーゼCの薬理学的阻害剤を用いて実証した。 BISIとPMA誘導ゼブラフィッシュ腎臓や胚の前処理は非誘導コントロール12に類似した蛍光レベルをもたらした。理想的な呼吸バーストアッセイは、食細胞特異ROSの両方を定量化し、経時的に視覚化することができるin vivoでのハイスループットアッセイである。これが可能になるまで、ここで説明する方法の急速な性質や技術的な容易さは、便利な代替手段を提供します。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、キム·ラボ、有用な議論やデータ共有のためのゼブラフィッシュのケアとメンテナンス、ロバート·ウィーラーのためのマークNilanの過去と現在のメンバーに感謝して、NIHの助成金3RO1GM087308-02S1と1P20RR024475-01A2およびメイン州農林う資金調達のために駅（公開番号3303）を試してみてください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
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