Summary
La respuesta inmune innata protege a los organismos contra la infección por patógenos. Un componente fundamental de la respuesta inmune innata, el estallido respiratorio de fagocitos, genera especies reactivas del oxígeno que matan los microorganismos invasores. Se describe un ensayo de estallido respiratorio que cuantifica las especies reactivas del oxígeno producido cuando la respuesta inmune innata es inducida químicamente.
Abstract
La explosión respiratoria de los fagocitos es parte de la respuesta inmune innata a la infección por patógenos e implica la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). ROS son tóxicos y funciona para matar los microorganismos fagocitadas. En la cuantificación in vivo de fagocito-ROS derivados proporciona información con respecto a la capacidad de un organismo para montar una respuesta inmune innata robusta. Aquí se describe un protocolo para cuantificar y comparar ROS en embriones de pez cebra enteros tras la inducción química de la explosión respiratoria de los fagocitos. Este método hace uso de un compuesto no fluorescente que se vuelve fluorescente tras la oxidación por ROS. Individuales embriones de pez cebra se pipetean en los pocillos de una microplaca y se incubaron en este sustrato fluorogénico con o sin un inductor químico de la explosión respiratoria. La fluorescencia en cada pocillo se cuantifica en puntos de tiempo deseado utilizando un lector de microplacas. Las lecturas de fluorescencia se ajustan para eliminar la fluorescencia de fondo y después se compared usando una prueba t no pareada. Este método permite la comparación del potencial de explosión respiratoria de los embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo y en respuesta a manipulaciones experimentales tales como la precipitación de proteínas, la sobreexpresión, o tratamiento con agentes farmacológicos. Este método también puede ser usado para monitorear la respuesta de estallido respiratorio en los riñones disecados enteras o preparaciones de células de riñones de adultos de pez cebra y algunas otras especies de peces. Creemos que la relativa simplicidad y adaptabilidad de este protocolo se complementan los protocolos existentes y serán de interés para los investigadores que buscan comprender mejor la respuesta inmune innata.
Introduction
El sistema inmune está compuesto por dos ramas: la inmunidad innata y adaptativa. La inmunidad innata es evolutivamente más antigua que la inmunidad adaptativa. Los invertebrados se cree actualmente que sólo tienen inmunidad innata, mientras que los vertebrados poseen tanto las ramas innata y adaptativa. Mientras que la inmunidad adaptativa confiere inmunidad específica y duradera a ciertos agentes patógenos, la inmunidad innata es una respuesta inmediata a las bacterias invasoras, virus y hongos. Un aspecto crucial de la respuesta inmune innata implica la liberación de citocinas y quimiocinas, lo que resulta en la inflamación y el reclutamiento de fagocitos (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos) para engullir y destruir los invasores extraños.
La respuesta inmune innata exitosos involucran: (1) el reconocimiento de microorganismos invasores; (2) la inducción de las cascadas de señalización apropiados (por ejemplo, liberación de citocinas y quimiocinas); (3) de desarrollo adecuado / números adecuados de células fagocíticas; (4) La migración de los fagocitos a sitios de infección; (5) inmersión de patógenos, y (6) la destrucción de microorganismos envueltos. Una deficiencia en cualquiera de estos pasos podría dar lugar al huésped que está siendo abrumado por, y sucumbir a la infección. Una respuesta inmune innata robusta es vital para la salud de los organismos, ya que es la primera línea de defensa contra los patógenos en todas las plantas y animales. En los vertebrados, sino que también potencia la respuesta inmune adaptativa 1. Por lo tanto, es fundamental que seamos capaces de evaluar todos los aspectos de la respuesta inmune innata, a fin de comprender mejor y optimizar su función.
Muchos organismos modelo se utilizan para estudiar la inmunidad innata, que van desde Arabidopsis a C. elegans a Drosophila a ratones a células humanas cultivadas. Una ventaja de utilizar el pez cebra (Danio rerio) sistema modelo para estudiar la inmunidad innata es que el pez cebra es un vertebrado, con im tanto innata y adaptativadad, sin embargo, el desarrollo de la inmunidad innata y adaptativa están temporalmente separados. El pez cebra se basan únicamente en la inmunidad innata para la protección contra la infección hasta que la inmunidad adaptativa sea plenamente funcional, que produce alrededor de 4-6 semanas después de la fecundación 2. Además de las herramientas para la manipulación genética, la claridad óptica y rápido desarrollo, externa, la inmunidad innata como el modo de principio de defensa en embriones de pez cebra ofrece un modelo simplificado en el que para estudiar la complejidad de la respuesta inmune innata en vivo.
Múltiples protocolos han sido desarrollados para evaluar las diferentes facetas de la respuesta inmune innata en embriones de pez cebra. Microarrays y RNAseq han validado que los perfiles de citoquinas producidas por la respuesta inmune innata de pez cebra son similares a la de los seres humanos y también han sugerido la implicación de los genes inesperados en la inmunidad innata 3,4. La transparencia del embrión de pez cebra y fluorescente, transgenic cepas de patógenos y pez cebra permiten la visualización de las interacciones huésped-patógeno dinámicas in vivo en tiempo real. Embriones de pez cebra transgénicos que expresan GFP bajo el control del promotor de la mieloperoxidasa de neutrófilos-específica 5,6 o el promotor específico de macrófagos MPEG1 7 han hecho posible para visualizar y cuantificar la migración de fagocitos a los sitios de infecciones localizadas 8, así como para visualizar la fagocitosis y la destrucción de marcado con fluorescencia patógenos 8,9. Embriones de pez cebra también son susceptibles a la generación de ensayos de alto rendimiento y pantallas químicos. En consecuencia, recientemente se han desarrollado métodos de alto rendimiento de análisis del transcriptoma después de la infección 10 y fagocitos migración a los sitios de lesión inducida químicamente 11.
De las técnicas mencionadas anteriormente, ninguno evaluar cuantitativamente la etapa final de la destrucción de patógenos por los fagocitos. Esta etapa finalimplica un estallido respiratorio (es decir, la producción de ROS y otros compuestos tóxicos), que mata a los patógenos envueltos. La enzima NADPH oxidasa es una fuente importante de ROS en células fagocíticas. Asamblea de las subunidades de la NADPH oxidasa resultados de la enzima en la transferencia de electrones al oxígeno, la generación de aniones superóxido. A través de reacciones enzimáticas posteriores, superóxido a continuación, puede ser convertido en peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso (Figura 1A). Es la explosión respiratoria de los fagocitos que mata a los patógenos y, por tanto, la cuantificación de la potencial explosión respiratoria de los embriones de pez cebra es indicativo de la salud inmune innato general. Hemos desarrollado un ensayo basado en la fluorescencia para cuantificar el estallido respiratorio en grupos de embriones de pez cebra individuales 12. Este ensayo utiliza la no fluorescente, forma reducida de un colorante permeable a las células disponibles comercialmente. Este colorante, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), se convierte en el fluorescentecompuesto ciento, 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCF), tras la oxidación. Los diversos ROS generados por el estallido respiratorio de fagocitos pueden oxidar H2DCFDA y generar fluorescencia 24. La aparición de la fluorescencia se puede utilizar para cuantificar y comparar la respuesta de estallido respiratorio entre los grupos de pez cebra. El acetato de miristato de forbol agonista de la proteína quinasa C (PMA) se utiliza para inducir químicamente NADPH oxidasa para producir ROS y por lo tanto aumentar lecturas de fluorescencia (Figura 1B). Aquí, ofrecemos un protocolo detallado de una versión modificada y optimizada de este embrión ensayo estallido respiratorio de pez cebra. Este ensayo se puede usar para comparar el estallido respiratorio entre los grupos de embriones de pez cebra individuales en el tiempo y / o en respuesta a las manipulaciones experimentales (por ejemplo, morfolino mediada desmontables de proteínas). El uso de este método, en conjunción con otros ensayos de inmunidad innata de pez cebra, proporcionará una imagen más completa de la compleja y críticarespuesta inmune innata.
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Protocol
1. Cuidado y mantenimiento de pez cebra
- Ganadería: spawn Misa adultos de pez cebra como se ha descrito previamente 13. Recoger los embriones generados como se ha descrito previamente 14.
- La microinyección (si se desea): microinject 1-4 etapa de célula embriones de pez cebra con oligonucleótidos de morfolino a desmontables productos de genes o de ARNm para sobreexpresar productos de genes como se ha descrito previamente 15.
- Mantener un número adecuado de simulacro controles inyectados (por lo menos 48 Viviendo, maqueta inyecta peces de control y 48 Viviendo, pescado manipulado experimentalmente se necesitan para llenar un pozo de microplacas 96).
- Mantener embriones: Crecer embriones en placas de Petri de profundidad a 28 ° C en agua de huevo (60 g / ml instantánea del mar del océano de la sal en el agua destilada en autoclave-) hasta la etapa de desarrollo que desee (una respuesta estallido respiratorio no es detectable mediante este protocolo en embriones de pez cebra menores de 2 días después de la fertilización 12). Nota: Ha sido observed que la prevención de la pigmentación en embriones de pez cebra a través de ya sea el uso de 1-fenil 2-tiourea (PTU) o el pez cebra mutante golden/slc24a5 no altera significativamente la inducción de la fluorescencia por PMA (datos no publicados, los embriones a las 48, 72, y 96 HPF).
- Retire embriones muertos a diario con una pipeta de transferencia de plástico.
- Decantar cuidadosamente el agua del huevo de edad y reponer con agua nueva diaria de huevos.
- Embriones Dechorionate: En el día del experimento, los embriones dechorionate (si los embriones se encuentran todavía en sus chorions) como se describió anteriormente utilizando dos pinzas finas 14 (este ensayo estallido respiratorio también se puede realizar en los riñones disecados de adultos de pez cebra 12 y los protocolos detallados para los riñones la disección de adultos de pez cebra se han descrito anteriormente 16,17).
2. Preparación de la Solución
- Preparar una solución madre de H2DCFDA: Pesar 1 mg de H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg de H2DCFDA en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución de 1 mg / ml.
- Hacer 22 alícuotas de esta solución madre en 1,7 ml tubos de microcentrífuga.
- Envuelva las alícuotas de H2DCFDA solución madre en papel de aluminio y guardar en la oscuridad siempre que sea posible, porque H2DCFDA es sensible a la luz.
- Alícuotas tienda H2DCFDA a -20 ° C hasta por 3 meses.
- PRECAUCIÓN - Preparar una solución madre de acetato miristato de forbol (PMA): Pesar 1 mg de PMA utilizando el equipo adecuado de protección personal (por ejemplo, guantes, gafas y mascarilla).
- Disolver la PMA en 1 ml de DMSO para obtener una solución madre de 1 mg / ml.
- Hacer 11 alícuotas de 1,7 ml tubos de microcentrífuga.
- Tienda alícuotas de PMA solución madre a -80 ° C durante un máximo de 3 meses.
- Prepare una solución de trabajo de H2DCFDA: En el día del experimento, hacer una solución de trabajo H2DCFDA añadiendo 1 parte de solución H2DCFDA acciones a 1DMSO parte (concentración final de 500 mg / ml H2DCFDA). Por ejemplo, añadir 20 l de solución madre H2DCFDA y 20 l de DMSO a una lámina envuelto 1,7 ml tubo de microcentrífuga.
- Prepare una solución de trabajo de PMA: En el día del experimento, hacer una solución de trabajo PMA mediante la adición de 1 parte de solución de PMA acciones a 49 partes por nucleasa libre de agua (concentración final de 20 mg / ml de PMA). Por ejemplo, diluir 10 l PMA solución madre en 490 l de nucleasa libre de agua en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
- Preparar una solución de dosificación de H2DCFDA: En el día del experimento, hacer una solución de dosificación H2DCFDA con una concentración final de 1 mg / ml en agua H2DCFDA huevo. Los volúmenes preparados de las soluciones de dosificación se pueden modificar si lo desea, pero asegúrese de que se mantienen las concentraciones finales de los reactivos. Para los riñones, en lugar de agua de huevo, usar el mismo volumen de medium/F-12 de Dulbecco modificado de Eagle (50% de DMEM, 50% de F-12, sin rojo de fenol). Para hacer 5 ml de H2DCFDAdosificación de solución, utilice un 5 ml pipeta serológica para transferir 5 ml de agua de huevo (o DMEM/F-12) en un 15 ml tubo de centrífuga cónico envuelto en papel de aluminio y etiquetado 'H'.
- Retire 10 l de agua de huevo (o DMEM/F-12) a partir de los 15 ml tubo cónico como 'H' y descarte.
- Añadir 10 l de solución de trabajo H2DCFDA en el tubo cónico de 15 ml etiquetado 'H' y agitar para mezclar (en este volumen es suficiente para 48 embriones o muestras de riñón (la mitad de un muy bien microplaca 96) y estos pozos suministrarán mediciones de nivel de la fluorescencia de fondo).
- Preparar una solución de dosificación de H2DCFDA + PMA: En el día del experimento, hacer una solución H2DCFDA + PMA de dosificación con concentraciones finales de: H2DCFDA - 1 g / ml y PMA - 400 ng / ml. Para hacer 5 ml de solución de dosificación H2DCFDA + PMA, utilizar una pipeta serológica de 5 ml para transferir 5 ml de agua de huevo (o DMEM/F-12) en un nuevo tubo cónico de 15 ml etiquetados 'H + P'.
- Retire 110 _6; l de agua de huevo (o DMEM/F-12) a partir de los 15 ml tubo cónico como 'H + P' y descarte.
- Añadir 10 l de solución de trabajo H2DCFDA, a continuación, añadir 100 l de solución de trabajo de PMA en el tubo cónico de 15 ml etiquetados 'H + P' y mezclar en vórtex (este volumen es suficiente para 48 muestras o el otro medio de un completo así microplaca de 96 ).
- Mantenga las soluciones de dosificación en el hielo.
3. Lector de microplacas Programación
- Preparar el instrumento: Encienda el lector de microplacas.
- Calentar la fuente de luz.
- Establecer un programa para leer la fluorescencia: por ejemplo, excitación: 485 nm; emisión: 528 nm; Óptica Posición: top 510 nm; Sensibilidad: 65, con un temblor paso 5 segundos antes de la lectura.
4. 96 Bueno microplacas Set Up (ver Figura 2)
- Reúna los materiales: Obtenga platos con embriones dechorionated, negro microplaca 96, pipeta p200 yconsejos, cubo de hielo con H2DCFDA y soluciones de dosificación H2DCFDA + PMA, multicanal p200 pipeta, dos depósitos de estériles, papel de aluminio y tijeras.
- Transferencia de un embrión en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos: Utilice unas tijeras para cortar una punta de pipeta de tal manera que los embriones o los riñones en forma a través de la abertura.
- Establecer una pipeta p200 a 100 l y transferir un embrión junto con el agua de huevo (o DMEM/F-12) en la mayor cantidad de los pocillos de una microplaca de 96 negro así lo desea (no es necesario cambiar la punta de la pipeta para cada diferente muestra embrión dentro de una condición experimental, pero puede ser necesario cambiar las puntas entre las condiciones experimentales). Asegúrese de evitar la transferencia de chorions residuales, ya que estos tienden a sesgar los datos recogidos. Para la transferencia de los riñones, una pipeta de volumen grande (ajustado a 100 l) se puede utilizar y puntas de pipeta puede ser cortado para obtener un tamaño de diámetro más grande, si es necesario. Puede ser necesario incorporar pocillos sin muestras de embriones o renales, pero conlas soluciones de dosificación para controlar para algunas manipulaciones experimentales.
- Añadir soluciones de dosificación: Verter solución de dosificación H2DCFDA en un estéril 25 ml depósito.
- Utilizar una pipeta multicanal y p200 ocho consejos para pipetear simultáneamente 100 l de solución de dosificación H2DCFDA en una columna en la microplaca de 96 pocillos (concentración final 500 ng / ml de H2DCFDA).
- Repita este (cambiando las propinas no es necesario) para tantas columnas como se desee (normalmente seis columnas o 48 pozos si llenar toda una microplaca de 96 pocillos). Añadir esta solución a la mitad de las muestras de embriones de control y la mitad de las muestras de embriones manipulados experimentalmente (un ejemplo de 96 pocillos de microplacas configurado se muestra en la figura 2, estos pozos (de color naranja) proporcionará los datos de fluorescencia de fondo en las muestras no inducidas con PMA) .
- Verter la solución de dosificación H2DCFDA + PMA en una nueva, depósito de 25 ml estéril.
- Use una pipeta multicanal p200 y ocho consejos para simultaneously pipetear 100 l de solución de dosificación H2DCFDA + PMA en las columnas restantes (rojo de color en la figura 2) de la microplaca 96 (de cambiar las boquillas no es necesario, las concentraciones finales de 500 ng H2DCFDA-/ ml y PMA-200 ng / ml) .
- Cubrir la placa con papel de aluminio.
- Agite la microplaca durante aproximadamente 20 segundos a 150 rpm para homogeneizar las soluciones en cada pocillo.
- Incubar la microplaca a 28 ° C cuando no se está leyendo.
5. La cuantificación de la fluorescencia
- Leer la microplaca en el tiempo = 0 h después de la adición de PMA utilizando los parámetros descritos en el paso 3.1.2.
- Siga tomando mediciones cada pocos minutos para el intervalo de tiempo deseado o se incuba la microplaca lámina envuelto a 28 ° C hasta un momento posterior y luego tomar una medición de punto final a una hora determinada (por ejemplo, 4 horas después de la adición de PMA).
- Utilice un plástico transfer pipeta para recuperar los embriones procedentes de los pozos.
- La eutanasia a los embriones de acuerdo a su cuidado de los animales y el protocolo de uso, por ejemplo, la inmersión en MS222 tricaína.
- Deshágase de la microplaca y otros materiales desechables en el recipiente para residuos biológicos peligrosos.
6. Análisis de Datos
- Decidir sobre el punto de tiempo en el que usted desea comparar los valores de fluorescencia (por ejemplo, 4 horas después de la adición de PMA, Tabla 1).
- Restar valor de fluorescencia del grupo de control-inducida ONU promedio de los valores de fluorescencia del grupo de control inducida por PMA individual.
- Repita esto para el grupo experimental con y sin PMA.
- Guarde estos valores de fluorescencia normalizados en dos columnas, el grupo de control + PMA y el grupo experimental + PMA (Tabla 2).
- Calcular las medias y las desviaciones estándar para los valores de fluorescencia normalizados del control + Grou PMAP y el grupo experimental + PMA.
- Comparar los valores de fluorescencia normalizados usando un test t no apareado para determinar la significancia estadística (Tabla 2).
- Gráfico de los medios de control + grupo de PMA y el grupo experimental + PMA con barras de error reflejan las desviaciones estándar correspondientes.
- Anote el nivel de significación en el gráfico y en la leyenda de la figura (Figura 2).
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Representative Results
Aquí, ofrecemos datos que comparan la respuesta estallido respiratorio en los embriones de pez cebra (de tipo silvestre, AB fondo) a 48 y 72 horas después de la fecundación (HPF). Los 48 embriones HPF actuado como nuestro grupo de control y los 72 HPF embriones como nuestro grupo experimental. El tamaño de la muestra utilizada fue de 24 embriones inducidos por la ONU-y 24 embriones PMA inducida por la etapa de desarrollo. Las lecturas de fluorescencia en bruto (en unidades de fluorescencia relativa (RFU)) se obtuvieron mediante la lectura de la microplaca 4 horas después de la adición de PMA. Valores de fluorescencia primas se incluyen en la Tabla 1. Valores de fluorescencia primas fueron consistentemente más altas en los 48 HPF embriones inducidos ONU-que las 72 HPF embriones inducidos ONU-, con la excepción de un embrión de 72 HPF (medias: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU). La variabilidad dentro de estas dos muestras era aproximadamente igual (desviaciones estándar: 48 HPF = ± 549 RFU, 72 hpf = ± 513 RFU), pero el grupo 72 HPF varió más con respecto a la media (deviatio estándarn como un porcentaje de la media: 48 HPF = 72%, 72 hpf = 223%). En los grupos inducidas por PMA, los valores de fluorescencia primas eran en su mayoría más alta en la población HPF 72 (medio: 48 HPF PMA = 3798 RFU, 72 HPF PMA = 5825 RFU). No hubo más variabilidad en el grupo de PMA inducida por 72 HPF que el 48 HPF grupo inducida por PMA (desviaciones estándar: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1.365 RFU), pero la variabilidad con respecto a la media era aproximadamente igual (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
Para tener en cuenta la variabilidad en los niveles de fondo de la fluorescencia, se calcularon los valores de fluorescencia normalizada (valor inducida por PMA menos la media de los valores inducidos por las Naciones Unidas de la etapa de desarrollo apropiada). Estos valores de fluorescencia normalizados se proporcionan en la Tabla 2, junto con los medios, desviaciones estándar y valor de p para los 48 y 72 HPF grupos. Un gráfico de estos datos se proporciona en la Figura 2. Los valores de fluorescencia normalizados son consistentemente higher en el grupo de 72 HPF que el grupo HPF 48 (significa: 48 HPF = 3.040 RFU, 72 hpf = 5.596 RFU) y la variabilidad es similar con respecto a la media (48 HPF = 27%, 72 hpf = 24%). Este ensayo de estallido respiratorio reveló que embriones de pez cebra 72 HPF son capaces de producir más de ROS y por lo tanto montar una respuesta estallido respiratorio más robusto que 48 HPF embriones después de la inducción con PMA. Este hallazgo puede ser debido a un aumento del número de células, incluyendo un aumento del número de granulocitos 18, en 72 hpf embriones en comparación con 48 embriones hpf. Una prueba t no pareada para comparar estadísticamente los datos confirmó que la respuesta estallido respiratorio es significativamente diferente en 72 HPF embriones de 48 HPF embriones (* p = 2 X 10 -9).
En un sentido más general, en el momento en el punto t = 0 h después de la adición de PMA, los valores de fluorescencia en bruto deben no ser estadísticamente diferente entre la inducida por PMA y los grupos inducida por la ONU-. Los valores de fluorescencia primas serán cada veze en el tiempo en las muestras tanto de la ONU-inducidos e inducidos, con un aumento mucho mayor que ocurre en los embriones inducida por PMA 12. El aumento en los valores de fluorescencia primas en el grupo inducida por PMA, en comparación con el grupo inducida por un-, se convertirá estadísticamente significativa en aproximadamente 1-2 horas después de la adición de PMA (dependiendo de la etapa de desarrollo de los embriones de pez cebra, con mayores embriones montar una respuesta más rápida ráfaga respiratoria que los embriones más jóvenes). Valores de fluorescencia normalizada (inducida por la ONU, menos inducida) deberían aumentar con la etapa de desarrollo cada vez mayor de embriones de pez cebra, con la mayor diferencia se produce entre 48 y 72 h después de la fertilización y una menor diferencia se produce entre 72 y 96 h después de la fertilización. Números de fluorescencia primas deben ser de 5 a 60 veces mayor en el grupo inducida por PMA en relación con el grupo inducida por un-, dependiendo de la etapa de desarrollo de los embriones de pez cebra (entre 48 y 96 h después de la fertilización). Variaciónse producirá entre las muestras de embrión de pez cebra individuales, por lo tanto, se recomienda que se usen aproximadamente 24 muestras de embriones por tratamiento.
Figura 1. Diagrama de la inducción química de la explosión respiratoria dentro de un fagocito. (A) En este ensayo de estallido respiratorio, la PMA se utiliza para inducir la producción de aniones superóxido por la NADPH oxidasa. El superóxido se convierte en oxígeno y peróxido de hidrógeno por la superóxido dismutasa. Peróxido de hidrógeno y aniones cloruro se convierten en ácido hipocloroso por mieloperoxidasa. El colorante no fluorescente, H2DCFDA, se convierte en el compuesto fluorescente, DCF, cuando se oxida por muchos ROS diferentes. (B) Diagrama de cómo la cuantificación de la fluorescencia es una lectura de la respuesta de estallido respiratorio.
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Figura 2. Esquema del diseño experimental para el ensayo de estallido respiratorio. Individual dechorionated embriones de pez cebra se transfieren a los pocillos de una microplaca 96. Los pozos descritos en blanco contienen embriones de control y los pozos describen en negro contienen embriones del grupo experimental. Soluciones de dosificación H2DCFDA o H2DCFDA + PMA se añaden a los pocillos apropiados (de color naranja o rojo, respectivamente). La fluorescencia se cuantificó usando un lector de microplacas. A continuación, se analizan los datos de ensayo estallido respiratorio, en comparación, y se presentó. La tabla en esta figura es un subconjunto de los valores de fluorescencia normalizados que se muestran en la Tabla 2. La gráfica en esta cifra se incluyen los medios, desviaciones estándar y valor de p para todo el conjunto de datos presentados en este manuscrito, que también se muestra en la Tabla 2. * P = 2 X 10 - 9.
Tabla 1. Valores de fluorescencia inducida por primas de un-(naranja de fondo) e inducida (fondo rojo) 48 o 72 h después de la fecundación (HPF) embriones de pez cebra (números blancos o negros, respectivamente) a las 4 horas después de la adición de PMA. La media se calcula para las muestras inducidas-un.
| 48 embriones HPF | 72 embriones HPF | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Significar | 758 | 230 | |||
| 48 embroys HPF + PMA | 72 hpf embriones + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tabla 2. La normalización y la comparación estadística de los datos. Para obtener los valores de fluorescencia normalizada, calcular la diferencia entre cada valor de fluorescencia inducida por PMA y el valor promedio inducida ONU-apropiada. Estadísticamente comparar estos dos conjuntos de datos utilizando una prueba t no pareada. Calcular las medias y las desviaciones estándar. Visualice los medios, desviaciones estándar, y el valor de p (s) en forma gráfica (como en la Figura 2).
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Discussion
La función primaria de los fagocitos es detectar, engullir, y destruir patógenos. La capacidad de los fagocitos para producir una explosión respiratoria adecuada es crítica para esta función. Por lo tanto, la cuantificación de la respuesta de la explosión respiratoria es un método para permitir la comparación de la salud inmune innata y las funciones generales entre los grupos de personas y / o en respuesta a manipulaciones experimentales. Aquí se describe un protocolo para inducir, cuantificar y comparar la respuesta estallido respiratorio entre los grupos de embriones de pez cebra individuales. En resumen, la PMA se traduce en la producción de ROS por la enzima NADPH oxidasa. Estas ROS actúan en un colorante no fluorescente y se oxidan para formar un compuesto fluorescente. Un lector de microplacas se utiliza para detectar la fluorescencia relativa en cada pocillo. La fluorescencia generada a inducción de PMA es indicativo del potencial de explosión respiratoria y la salud inmune innato general de embriones de pez cebra. Comparación del nivel normalizado de fluorescenciacencia entre los grupos inducidos PMA utilizando una prueba t no pareada se puede utilizar para determinar si hay una diferencia significativa en el potencial de estallido respiratorio entre los grupos de pez cebra. Las manipulaciones experimentales resultantes en diferencias significativas en la respuesta de explosión respiratoria se proporciona una visión de los mecanismos de la inmunidad innata, por ejemplo, productos de genes necesarios para la explosión respiratoria de los fagocitos, los fármacos que potencian o antagonizan la respuesta de estallido respiratorio.
Protocolos de ensayo de las diferentes facetas de la respuesta inmune innata en el modelo de pez cebra se han desarrollado (véase la Introducción). Relativamente pocas de estas técnicas miden la producción de ROS. La técnica se detalla en este artículo cuantifica la producción de ROS en embriones de pez cebra a la estimulación de una respuesta inmune innata con PMA. Esta técnica es similar a los ensayos de estallido respiratorio realizadas en aislados muestras de sangre entera, en la que la PMA también se utiliza para induce una respuesta de estallido respiratorio, y entonces el ROS generado se midió utilizando un sustrato fluorogénico (por ejemplo Phagoburst, Orpegen Pharma). El método descrito aquí se puede utilizar con embriones de pez cebra enteros, así como los riñones disecados de adultos de pez cebra 13, como la parte anterior del riñón pez cebra es análoga a la médula ósea humana, que es el sitio de la hematopoyesis adulto 19. El método descrito aquí también es lo suficientemente versátil para ser utilizado con otras especies de peces y sistemas de células, como las preparaciones de células de riñones Piscardo fathead 20.
Un método alternativo para detectar ROS en embriones de pez cebra, la que hace uso de un sensor de peróxido de hidrógeno in vivo en. El ARN mensajero para una proteína fluorescente sensible a redox es inyectado en embriones de pez cebra y la relación de fluorescencia se controla el tiempo tras la aleta de la cola hiriendo a 21. Este sensor de redox codificada genéticamente permite la visualización de la temporal ydinámica espacial de la producción de peróxido de hidrógeno en vivo. La aplicación de este método reveló el sorprendente resultado de que el peróxido de hidrógeno producido llegada precedido inicialmente de las primeras células inmunes innatas, lo que sugiere que el peróxido de hidrógeno liberado por las células epiteliales heridos actúa como una señal para reclutar los fagocitos 21. Esta técnica, aunque potente e informativo, implica mucho tiempo y procedimientos embriológicas y microscopía técnicamente difíciles. Este sensor de redox también es específica para el peróxido de hidrógeno, que es sólo una de las muchas que funcionan de ROS durante la respuesta inmune innata.
En comparación con el enfoque descrito anteriormente, nuestro método también mide in vivo de ROS, y sin embargo es técnicamente menos exigente y utiliza una sustancia química para inducir una respuesta inmune innata en lugar de una herida física. En contraste con el método anterior, que mide específicamente la producción de peróxido de hidrógeno, mide nuestro procedimiento de lanivel total de ROS. Una ventaja de la detección de un solo ROS es que los roles para que el compuesto por sí solo en la inmunidad innata pueden ser dilucidados. Similar al método descrito anteriormente, nuestro enfoque también comparte las ventajas y desventajas inherentes de que se realiza en todo el animal. Las interacciones entre los fagocitos y su entorno, que se elimina cuando los ensayos estallido respiratorio se realizan en muestras de sangre aislados, se conservan en estos ensayos con animales enteros. Sin embargo, el uso de todo el animal probablemente se traduce en la detección de ROS de fuentes no fagocíticas (por ejemplo, derivados de ROS mitocondrial, oxidasa NADPH nonphagocyte). En un intento de abordar la especificidad de nuestro método para la detección de los fagocitos derivados de ROS, nos referimos a un estudio en el que se realizó este ensayo estallido respiratorio en los embriones de pez cebra que carecen de fagocitos específica NADPH oxidasa 9. -Fagocito específica de NADPH oxidasa fue inhibida a través de golpe morfolino mediada por abajo de p47phox o p91pproteínas Hox. En embriones de pez cebra, en la etapa de desarrollo se ensayaron, la expresión de estas subunidades de NADPH oxidasa está restringido a un subconjunto de células de la sangre, probablemente los macrófagos 22,23. El potencial de explosión respiratoria de los embriones que carecen-fagocito de NADPH oxidasa específica era aproximadamente un tercio de la de los controles 9 (comunicación personal, el Dr. Robert Wheeler). Este resultado sugiere que mientras que nuestro ensayo de estallido respiratorio hace detectar ROS de fuentes distintas de los fagocitos, la mayoría de la fluorescencia detectada se puede atribuir a la explosión respiratoria de los fagocitos a través de la NADPH oxidasa. Además especificidad de este ensayo se demostró usando bis-indolilmaleimida I (BISI), un inhibidor farmacológico de la proteína quinasa C, para evitar la acción de PMA, un agonista de la proteína quinasa C, en la NADPH oxidasa. Pre-tratamiento de los riñones o los embriones de pez cebra inducidas por PMA con Bisi resultó en niveles de fluorescencia similares a controles inducido un-12. Un respiratoria idealesensayo de estallido sería un ensayo de alto rendimiento in vivo donde-fagocito específica de ROS podría ser tanto cuantificó y se visualizó con el tiempo. Hasta que esto sea posible, la naturaleza rápida y la facilidad técnica del método descrito aquí proporciona una alternativa útil.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros anteriores y actuales del laboratorio de Kim, Mark Nilan para el cuidado de pez cebra y el mantenimiento, el Dr. Robert Wheeler útil para los debates y el intercambio de datos, y las subvenciones del NIH 3RO1GM087308-02S1 y 1P20RR024475-01A2 y el Maine Agrícolas y Forestales Estación Experimental (Publicación 3303) para su financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
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