Summary
דוגמא של תרופה הננו על בסיס חומצת polymalic מוצגת לקראת תכנון רציונלים של רפואה אישית כי הוא ישים לסרטן. הוא מתאר את הסינתזה של תרופת ננו לטיפול בסרטן השד אנושי מסוג HER2 חיובי בעכבר בעירום.
Introduction
בעידן פוסט גנומי, כאשר הגנום של הסרטן כבר נפרם (המרכז הלאומי לביוטכנולוגיה והגנום סרטן האטלס), טיפול עתידי בסרטן יביא בחשבון מגוון גנטי של גידולים לעתים קרובות בתוך אותו הגידול 1-4. ביואינפורמטיקה ורצפי DNA מהירים, לא יקרים מאפשר רכישה של גנים / מוטציות ממאירות ברמה אישית 2,4,5. ברגע שהגנים זוהו, חולים יטופלו בתרופה מותאמת אישית כדי לשנות או להשתיק את הביטוי שלהם של גנים ממאירים 6. הצורך לפגוע בתאי סרטן ולספק תרופות לתאים אלה קוראים למערכות אספקת polyfunctional. ברור, תרופות ננו יכולות לענות על דרישה זו 7.
בגל גואה של גילויי חלקיקים הוכיחו מתאימים להביא מטענים של תרופות כימותרפיות, חלבונים ו / או חומר גנטי פעיל לתאי סרטן. עם זאת, תופעות לוואי להישאר להיות מודעהלהתלבש. אחד מהם קשורות להיעדרם של פריקות ביולוגית עלול לגרום בתצהיר של חומר ברקמות ואיברים בריאים עם הסיכוי לעורר מחלות. כדי למזער את התצהיר, הצגנו חומצה רעילה ואינו immunogenic polymalic, שהוא ממוצא חיידקים ומתכלים לH 2 O ו-CO 2 8. אנו משתמשים בפולימר לסנתז סוג קוולנטיים All-in-אחד מסמי ננו. הוא מכיל chemotherapeutics המצורפת כימי כגון temozolomide, דוקסורוביצין, או אנטיסנס וקבוצות פונקציונליות המשרתות extravasation, מיקוד רקמות, משלוח endosomolytic. הסמים הם ביקע מהותי מפלטפורמת ננו כשהם הגיעו לתאים סרטניים הממוקדים, ובכך התחדשות פעילות התרופות המלאה שלהם.
אנו מתארים את שיטת הייצור של חיידקים של פלטפורמת ננו הפולימר, הטיהור שלה, ואת הסינתזה הכימית של תרופה המכילה ננו Trastuzumab (הרצפטין) לטיפול בסרטןמיקוד ומולקולת אנטיסנס קצר לעיכוב של ייצור יתר של HER2. ביישום תרופת ננו לסרטן xenogeneic אדם חיובי ל-HER2 השד בעכברים בעירום, אנחנו מדגימים יעילות גבוהה של הטיפול בסרטן. עקרונות מיקוד גידול והשתקת הגן הציג כאן עבור תרופות הננו חומצת polymalic יכולים להיות מיושמים בטיפול במקרים אחרים של הסרטן.
Protocol
כל הניסויים לעמוד בתקנות בעלי החיים רשמיות לרבות פעולות כירורגיות ונזקקו לניתוח שבוצעו in vivo והנם בהתאם מלאים עם פרוטוקולי IACUC.
1. Bioproduction של Polymalic חומצה
- לגדול תרבות זרע מspherules על אגר ולהעביר plasmodia 100 מדיום תרבות מיליליטר באמצעות 25 ° C תרמו האמורה חממה ותרבות בינוני בסיס 8,9.
- לייצר כמות גדושה הכבידה 500 plasmodia מייקר מיליליטר מתחת להדרה של אור על מנת למנוע נביגה.
- הכן 80 קאקו גרם 3 מושעה ב8 בינוני הבזליים L ב10 כלי bioreactor L. העבר 500 מיליליטר plasmodia מיקרו ארוז בתוך כלי תגובה הרכובים ולאפשר Bioprocess ל75 שעה ב ° C25, 10 L / זרימת דקות של אוויר מסונן ו150 ערבוב סל"ד ידי בוחש מגזר.
- לסיים כאשר מרק התרבות יש pH 4.8 יציין את סוף הייצור של PMLA ולמדוד PMLA תוכן על ידי tהוא hydroxamate assay / Fe (III).
- מצנן את המרק ל17 ° C ולאפשר לתאים להתיישב על ידי כוח הכבידה.
- מגניב 4 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה-pH 7.5, להשתמש 2 M NaOH. לשאוב supernatant דרך עמודה מלאה ב1.5 L של DEAE-תאית בתחתית הכיוון למעלה (DEAE גרגר גס, equilibrated עם 20 מ"מ טריס-HCl pH 7.5 ב 5 מעלות צלזיוס).
- לשטוף עם 3 עמודות של מאגר המכיל 0.3 M NaCl לאחר שינוי הכיוון מלמעלה עד למטה וelute PMLA בנוכחות 0.7 M NaCl.
- התאם ל0.1 M CaCl 2 ולזרז PMLA-סידן עם 80% אתנול קר כקרח. Fractionate מעל Sephadex G25 לPMLA סידן של 80-300 kDa, 50-80 kDa, ו10-50 kDa, להשתמש במים בהיעדר החיץ ומלח.
- להעביר בכל שבריר מעל 120H Amberlite IR + טור, ומייד להקפיא את חומצת polymalic זרימה דרך בחנקן נוזלי לlyophilization.
- מתמוסס באצטון היבש. לאחר סינון, להסיר ממסבזרם אוויר יבש, Lyophilize ולאחסן ב 20 ° C. מינוס
2. סינתזה של תרופות Nano מבוססות חומצת Polymalic
- הפעל קבוצות carboxyl של PMLA (P) על ידי ערבוב 116 מ"ג (1 מילימול יחידות malyl) של PMLA-H ב 1 מיליליטר של אצטון נטול מים ו1 מילימול carbodimide dicyclohexyl N-hydroxysuccinimide ו1 mmol ב2 פוראמיד מיליליטר דימתיל (DMF). מערבבים ב20 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. הוספת 0.05 מילימול של MPEG 5000-NH 2 (% 0.05 mol של יחידות malyl) בDMF מיליליטר 1 ואחריו 0.05 מילימול triethylamine (TEA).
- הוסף טיפה מומסת חכם בDMF 0.4 מילימול לאוצין אתיל אסתר (LOEt) (40% mol של יחידות malyl), 0.1 mmol 2-תיאול-1-ethylamine (2-MEA) (10% mol של יחידות malyl) ו0.5 מילימול תה, כל מומס בDMF. לאחר כל הוספה, לאפשר 1 שעות ולבדוק להשלמת תגובה על ידי שלילי ninhydrin תגובה (שכבת כרומטוגרפיה דקה, TLC).
- אל תסיר NHS-אסתר שאריות ידי הידרוליזה ספונטנית עם פוספט שנאגרו מלוח (30 דקות, pH 6.8). Desalt מעל פ"ד-10 עמודה, להשיג "preconjugate" כאבקה לבנה על ידי lyophilization. יבש חנות ב 20 ° C. מינוס
- ממיסים 30 נוגדן מ"ג (מב, IgG2a-κ) ב4.5 מיליליטר של 100 נתרן זרחה מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 5.5.
- להפחית את אגרות חוב דיסולפיד עם 5 מ"מ טריס (אתיל 2-carboxy) hydrochloride phosphine ל30 דקות ב20 מעלות צלזיוס ולטהר מעל PD-10 עמודה.
- ממיסים Mal-PEG 3400-Mal ב2 מיליליטר של אותו המאגר ולהוסיף את מב המופחת בנפח סופי של 10 מ"ל ומערבבים לילה בשעה 4 ° C. להתרכז כדי 2.5 מיליליטר מעל 20 Vivaspin, הדרת 30 KD, ולטהר מעל Sephadex G75. ודא מוצר מעל שניות-HPLC ולמדוד כמות photometrically ב280 אורך גל.
- צרף Mal-PEG-Mal-מב ל" preconjugate "thiols קבלת P / / LOEt (40%) / מב (0.2%) / 2-MEA (10%) PEG 5000 (5%). עושה זאת על ידי ערבוב 5 מיליליטר של 200 nmol מב-PEG 3400-Mal 50 מ"ג (P / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA) בpH החיץ מעל 5.5, להתאים את הריכוז של sulfhydryl ל2 מ"מ ולדגור על 20 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (להניב 98%).
- Solubilize 3'-H 2 N-AON בDMF / PBS (pH 7.2) ומגיב עם propionate N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) (SPDP) ב( 1:1 V / V) DMF / מתנול (ninhydrin מבחן ) ולטהר AON-PDP מעל Sephadex-LH20 במתנול, ולאחר מכן במים וLyophilize.
- דגירה 800 nmol AONs הופעל במאגר 5.5 pH עם 3400-Mal-מב-preconjugate Mal-PEG מוכן לעיל לילה עד שתגובת מטבע דיסולפיד הוא הופסק.
- לשלב ניאון אלקסה פלואוריד 680-maleimide להרכיב thioether עם פולימר-2-MEA-SH. לחסום sulfhydryls העודף עם 3-pyridyldithio-propionate (PDP) ולטהר מעל Sephadex G75. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או הצמד קפוא ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
3. מבחני ונכסים
- לבצע בדיקות לטוהר ויציבות ב-PBS וסרום על 4 מעלות צלזיוס ו37 ° C על ידי ניתוח שניות-HPLC. השתמש sulfonate הקלקר כMolecסטנדרטים משקל תואר בלבד. למדוד התפלגות גודל ננו וזטה פוטנציאלים. שימוש במערכות מסחריות.
- הוסף למדגם μl 320 160 μl של 10% (w / v) כלוריד hydroxylammonium ו160 μl של 10% (w / v) NaOH. אחרי 10-15 דקות, לערבב עם 160 μl של 5% (w / v) Fe (III) Cl 3 ב12% (v / v) HCl ולקרוא 540 של hydroxamate / Fe (III). חישוב PMLA הנחת 1 מ"ג / מיליליטר PMLA מתאים ל2.5 540.
- Hydrolyze תרופת ננו הלילה ב2 M HCl ב110 ° C וחומצת מאלית assay בכרומטוגרפיה שלב הפוך עם התייחסות לדגימות ממוסמרות לתקני חומצת מאלית. קליב תרופת ננו עם 100 dithiothreitol מ"מ ולמדוד morpholino-AON על ידי HPLC שלב התהפך כמותית נגד הסטנדרטים morpholino AON.
- קח את התרופה הננו ללא מחשוף ולמדוד נוגדנים באמצעות ערכת assay חלבון. לכמת MPEG כך שהוא מאפשר התגובה שלה עם ferrothiocyanate אמוניום, ואז לחלץ עם כלורופורם ולקרוא הספיגה ב 510 ננומטר אורך גל 10
- לבצע ELISA עם 5 μl של תרופת ננו (1-10 מב מיקרוגרם) לכל גם בדיקת פעילות נוגדנים וcolligation. השתמש 0.5 קולט מיקרוגרם / גם transferrin וHER2, בהתאמה, כאנטיגנים מצופים צלחת ונוגדנים משני מצמידים peroxidase.
- חישוב% המושג עבור AON, MPEG ומב ביחס לחומצת מאלית (100%) ולהשוות עם% נועדו על ידי עיצוב (ראה דוגמאות טבלה 1 וטבלה 2).
4. בדיקה במבחנה
- דגירה הסמים ננו עם תאים בתרבית סרטן ומידה ששרדו תאים לאורך זמן על ידי הפעילות שלהם כדי להפחית מגיב צהוב [3 - (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4 sulfophenyl- )-2H-tetrazolium, מלח פנימי] (MTS) לצבע כחול ולקרוא הספיגה היחסית עם פוטומטר. עקוב אחר הוראות על ידי ספק הערכה.
- הכן תמציות תאים במבחנה או vivo לשעבר למערבי סופג. השתמש ב מיצוי קר כקרחuffer המכיל SDS ומעכבי פרוטאז קוקטייל. חלבונים נפרדים על ידי צמצום ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide.
- האם מערבי סופג לחלבונים של עניין בתמציות המדגם. השתמש בנוגדנים משני מצומדת לphosphatase אלקליין.
- השתמש במיקרוסקופ confocal להפגין ספיגת תא ושיתוף לוקליזציה של פלטפורמה הננו תרופת פולימר, AON וendosomes באמצעות תיוג פלואורסצנטי. צרף אלקסה פלואוריד 680 לפלטפורמה המצומד ננו וLissamine לAONs כתוויות הקרינה. השתמש במיקרוסקופ סורק רפאים 5X ותאי סרטן חיים כדי להמחיש את ההפצה של המולקולות שכותרתו
- קרומי endosome כתם עם צבע פלואורסצנטי Styryl אדום ולהפגין colocalization endosome או שחרור.
5. בדיקה בvivo
- הכן את המודל חיובי ל-HER2 האנושי בעכבר סרטן השד (Tac עירום עכבר: Cr: (MCR)-Foxnnm). הכנס 17β-אסטרדיול 0.72 מ"ג שחרור גלולה (שחרור 90 ימים מסחר) שלubcutaneously בצווארו של כל עכבר.
- אז מזריק 1 x 10 7 תאים סרטניים BT-474 מתחת לעור לתוך האגף הימני ולתת לגידול לגדול.
- להתחיל טיפול כאשר גידולים הם 120 מ"מ 3 בגודל על ידי הזרקה לוריד הזנב 150 המצומד ננו μl מכיל 2.5 מ"ג / קילוגרם AON ו / או 4.5 מ"ג / קילוגרם של כל נוגדן. לטיפול להזריק פעמיים בשבוע, לגמרי שש פעמים.
- למדוד את גודל גידול עם מחוגה פעמיים החלשה ולחשב כמויות תוך שימוש בנוסחה (אורך רוחב x עומק x) x (π / 6). להרדים בעלי חיים 2 שבועות לאחר הזריקה האחרונה ולאחר הרגעה עם תמיסה של קטמין וDexmedetomidine אחריו נקע בצוואר הרחם.
- לבודד את הגידולים וחתכים כתם עם H & E להערכה המורפולוגיים.
- להערכת הפצת סמים בקנה מידה של בעלי חיים, להשתמש במערכת דימות פלואורסצנטי. להזריק את תרופת 680 ננו כותרת אלקסה פלואוריד ותמונה ב24 ו48 שעות.
- להרדימו ולזהות פלואורידescence בגידולים ואיברים מבודדים וperfused.
Representative Results
עיכוב של סרטן השד מסוג HER2 חיובי אדם על ידי השתקת ביטוי הקולטן HER2 וחסימת 12 HER2-איתות
אסטרטגיה
בין צורות שונות של סרטן השד אנושי, יש לי גידולים חיוביים ל-HER2 התוצאה הקלינית הגרועה ביותר. אנו מציגים את הטיפול המוצלח של סרטן השד מסוג HER2-overexpressing אדם במודל עכבר בעירום. האסטרטגיה כרוכה בסמים הננו פעילים בשתי ההשתקה המיידית של מסלול איתות HER2 העסקת הרצפטין וAON HER2 הספציפי לחסימת הסינתזה תלויה HER2-mRNA של הקולטן (איור 1). המצומד ננו העופרת, המכיל הרצפטין ואנטי HER2 AON מוצג באיור 3 יחד עם שני פקדים שהם נטולות או הרצפטין או AON. המתחם להוביל הכיל אנטי MsTfRmAb להשיג extravasation הפעיל על ידי transcytosis throאיכס מחייב לאנדותל TFR של כלי הגידול. הרבה פחות ספיגה לתוך הגידול נרשמה בהעדר הנוגדנים ויוחסה לגידול אפקט EPR תלוי 13. גרסאות ניאון של conjugates ננו המכיל פלואוריד אלקסה 680 היו מסונתזים לבדיקות הדמיה.
. איור 1 מנגנון של משלוח AON לתאי סרטן השד חיובי ל-HER2 ועיכוב גדילת גידול פינה השמאלית עליונה:. המצומד ננו מותאם מהאיור 3. פינה השמאלית תחתונה: כלי גידול מאוס להביע TFR על פני השטח. תרופת ננו נקשר לקולטן ונכנסה לגידול על ידי transcytosis. כמו כן, במידה מסוימת של גישה לגידול אפשרית באמצעות שכבות האנדותל המופרעות המשתתפות בגידול ספיגה משופרת תלויה וretentiב( EPR) 13. בשלב בא, nanodrug נקשר HER2 הביע על תאי הסרטן האנושיים ומפנים לתוך endosomes המוקדמת. בלוקים גם מחייבים HER2 מסלול איתות. לאחר ההבשלה של endosomes וההחמצה שלהם, מנגנון בריחת endosome של התרופה הננו מופעל. Nanodrug כניסה לציטופלסמה הוא שוחרר מפלטפורמת ננו ידי מחשוף רדוקטיבי של spacer דיסולפיד ונקשר לHER2-mRNA חסימת HER2-סינתזה. חסימת הסינתזה מרחיבה חסימה של HER2-איתות וגורמת לעיכוב גדילת גידול.
ייצור מיקרוביאלי של פלטפורמת חומצת polymalic
פלטפורמת ננו המצומד, חומצת polymalic (PMLA), הופקה על ידי microplasmodia התרבותי של polycephalum Physarum ומטוהר מהמרק כפי שתואר בפרוטוקול ומתואר באיור 2. ייצור והטיהור היו חלקים ושחזור. זה היה חשוב להמשך זמן רול, pH וטמפרטורה, כדי למנוע מחשוף ספונטני של הפולימר. כביסה וelution של DEAE הטור זהירים מומלץ על מנת להסיר DNA, פחמימות, רעלים וחומרי צבע. טוהר קיצוני הושג לאחר ההמסה באצטון נטול מים והסרת חומר בלתי מסיס. הסכום כולל של PMLA הפיק היה 5 ± 1 גרם לכל קמפיין. סכומי 1.5 ± 0.5 גרם מטוהרים מאוד PMPLA של M w 80,000-100,000 הושגו reproducibly בעת השימוש בbioreactor 10 L. פרופילי elution Sec-HPLC היו סימטריים. ניתוח פיזור אור דינמי על פי התפלגות מספר מצויינים שיא יחיד המתאים לקוטר הידרודינמית של ננומטר 8 ± 1 ומדד polydispersity של PDI = 0.10 ± 0.02, המחושב על ידי תוכנת המכשיר לחלקיקים כדוריים בדויים. זטה פוטנציאל היה -22 ± 2 mV (pH 7.5).
/ "Width =" 50668/50668fig2highres.jpg 500 "/>
איור 2. ייצור וטיהור של חומצת polymalic מplasmodia מיקרו התרבותי של polycephalum Physarum (המותאמת מ-Lee et al. 9). חומצת Polymalic (PMLA) מיוצרת מplasmodia של polycephalum Physarum בbioreactor ונאספה מsupernatant התרבות באמצעות קשירה על מחליף אניון (DEAE). Eluent הוא-זירז אתנול כמו מלח סידן. פתרונות של מלח סידן הם MW-מופרד על Sephadex-G25. הם שברים המכילים PMLA יומרו מCa-מלח לחומצה מעל + IR-120H Amberlite. PMLA החופשי סוף סוף lyophilized להניב אבקה לבנה יבשה.
סינתזה כימית של ננו המצומד להוביל
P / MPEG 5000 (5%) / LOEt (40%) / AON (2.5%) / הרצפטין (0.2%) / NTI-MsTfRmAb (0.2%)
המבנים סכמטי של תרופת ננו עופרת ושל שני conjugates ננו המבשר מוצגים באיור יור 3. העופרת מכילה את כל המרכיבים, ואילו סימנים מקדימים נועדו חסר או HER2 AON או הנוגדן הרצפטין. חוץ מAON והבז, התרכובות מכילות פוליאתילן גליקול, MPEG 5000, כדי למזער מחייב לחלבוני פלזמה, שחרור דרך מערכת reticulo-אנדותל (המיל '), והשפלה על ידי מחשוף האנזימטית. רצף antisense 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 "היה משלים לHER2-mRNA ונבדק בקפידה במבחנה בכמה שורות תאים המבטאים-HER2 להשיג סגוליות גבוהה לכיוון חסימת HER2 סינתזה ולא מראה השפעות מחוץ היעד.
"Width =" 8/50668fig3highres.jpg 500 "/>
איור 3. ננו conjugates לטיפול בסרטן השד מסוג HER2 החיובי אנושי. תרופה מובילה ננו (מבנה עליון) מכילה שתי תרופות (הרצפטין, AON HER2). גרסאות 2 ו -3 מכילות רק אחת מהתרופות. ספיגה של 1 ו -2 לתאי גידול מסוג HER2 ביתר אדם מנוהלת על ידי מחייב של הרצפטין. ננו המצומד 3, אשר אינו מכיל הרצפטין, קיבל אנטי HuTfRmAb לספיגת endosome ידי התאים האנושיים. נטיה עם אלקסה פלואוריד 680 הייתה אופציונלית למטרות הדמיה. הפס האדום מייצג את הפלטפורמה המצומד ננו PMLA / LOEt (40%). % מציין את החלק היחסי של שאריות חומצת מאלית נצרכו בקשירה של ליגנד המצוין (הסכום כולל של שאריות חומצת מאלית בnanodrug = 100%).
איור 4. סינתזה הכימית של ננוconjugates P / LOEt / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin מלמעלה למטה:. סינתזה של succinimidyl אסתר PMLA-N-הידרוקסי (PMLA-NHS) של carboxylates תליון (הפעלה כימית). החלפה של שירותי הבריאות על ידי היווצרות אמיד עם 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), מתיל-PEG 5000-אמין (MPEG 5000-NH 2), trileucine (LLL) או ethylester לאוצין (LOEt). זה "preconjugate" מייחס מב-Mal-PEG-Mal ידי thioether היווצרות וAON על ידי יצירת קשרי דיסולפיד cleavable. שאריות 2-MEA הוא כתרים ויצר amidoethyl-dithio-propionic חומצה. רק חיבור של מב בודד מוצג. קבצים מצורפים מרובים מנוהלים באמצעות תערובות של בז. אחוז% מציין שברים של carboxylates קשור לליגנד השונים (לPMLA בחינם 100%).
Conjugates ננו היו מסונתז כפי שתואר ביור איור 4. המשקל המולקולרי המחושב של העופרתהמצומד היה 719.000. התשואה הכוללת של הסינתזה הייתה 45 ± 5% ביחס לתוכן חומצת מאלית. בממוצע, של 862 יחידות malyl (= 100%) של פלטפורמת kDa PMLA 100, 40% נשאו LOEt, 5% MPEG, 2% AON 2%, 0.2% הרצפטין ו0.2% נגד MsTfR מב. הסכום עבור כל נוגדן תואם את ממוצע של 1.7 מולקולות למולקולה של פלטפורמת PMLA. % תוכננו ו% מאומתים על ידי ניתוח קבוצה היו זהים בתוך 5% ±. דוגמה לכך היא המקרה נתון בטבלה 1 לחישוב התוכן הניסיוני של חומצת מאלית, AON, מב וMPEG 5000 ובטבלה 2 מראה את ההשוואה עם התוכן על ידי עיצוב. טוהר הגבוה על פי הקריטריונים לפי סעיף 3 הושג על בסיס תשואות תגובה גבוהות והפרדה יעילה על ידי הרחקת גודל (לדוגמא בחינם מב ומב-nanoconjugate מופרדים על ידי 1 דקות בשניות-HPLC), ומסיסות סלקטיבית בממסים. הפעילות של נוגדנים חד שבטיים הייתה הראה להישמר לאורך סינתזת תרופת ננו, והוא אישר כי שני סוגים של נוגדנים נאספו על אותה פלטפורמת הפולימר. התוצאה של ניסוי ELISA טיפוסי מוצגת ביור איור 5. באופן כללי, מבחני לניתוח כמוני לקבוצת חומצת מאלית, AON, חלבון, PEG ולELISA היו חזקים, מניב תוצאות לשחזור המבוצע על ידי כוח אדם ומכשור שונים לא רק במקרה של הסינתזה דיווחה, אלא גם כאשר נעשה שימוש לניתוח של nanoconjugates מסונתז אחר.
טבלת 1. חישוב הרכב nanodrug עם התייחסות לתוכן חומצת מאלית.
"Width =" 668table2.jpg 600 "/>
טבלה 2. השוואה של הרכב תרופה הננו ניסיוני עם הרכב שתוכנן.
איור 5. ELISA למדידת זיקת נוגדן לאחר סינתזה כימית, ועל הפגנה של מחייב מרובה של נוגדנים שונים. תרופת ננו מכילה נוגדני מב (א) ונוגדנים מב (ב ') נגד אנטיגנים A ו-B, בהתאמה. צלחות ELISA מצופות באנטיגן (א '). מב חינם (), בחינם מב (ב '), ותרופה הננו מוחלים על צלחות ELISA. לאחר כביסה, הנוגדנים נבדקו עם נוגדנים בשילוב peroxidase המשני ספציפיים לאו מב (א) או מב (ב '), בעוד שרק מב (א) הוא חייב אנטיגן (א'). זה נראה כי תרופה ללא תשלום וננו מצומד עם מב (א '), ובאופן עקיף מצומדת מב (ב) לאותה מולקולת תרופת ננו, אבל לא בחינם מב (ב), נשמרים על הצלחת. תלות הריכוז מציגה זיקות מחייבות השוואה למב החופשי ומצומדת (א '), מצביעה על כך שהנטייה הכימית לא השפיעה על פעילות מחייבת נוגדן. יתר על כן, שיתוף קשירה של מב (ב ') עם מב (א) על אותה הישות הפיסית (פלטפורמת ננו) תוצאות בזיהוי נוגדן מב (ב'). תוצאות הניסוי שמוצגים כאן מתייחסות לTfRmAb אנטי אנושי () ואנטי העכבר TfRmAb (ב '). תוצאות דומות הוכחו לזוגות אחרים נוגדן שנבדקו, כגון אנטי MsTfR מב ואנטי HER2 מב (הרצפטין).
חקירת physicochemical הצביעה קוטר הידרודינמית 22.1 ± 2.3 ננומטר עבור P / MPEG (5%) / LOEt (40%) / AON (2%) / הרצפטין (0.2%) / אנטי MsTfRmAb (0.2%) (עופרת, שני גרסת סמים), 20.1 ± 2.4 ננומטר עבור P / / LOEt (40%) / AON (2%) / אנטי MsTfRmAb (0.2%) / אנטי HuTfRmAb (0.2%) (גרסת הסמים AON) MPEG (5%) , ו15.1 ± 1.2 ננומטר עבור P / MPEG (5%) / LOEt (40%) / הרצפטין (0.2%) (גרסת תרופת הרצפטין). זטה פוטנציאלים ב-pH 7.5 היו בסדר זה -5.2 ± 0.4 mV, -5.7 ± 0.6 mV, ו-4.1 ± 0.4 mV. יש לציין כי הקוטר הידרודינמית נמדד של conjugates ננו לא פעל additivity של הקטרים שנמדדו עבור רכיבים חופשיים.
משלוח הסמים ננו דרך קרום התא הסרטני ולשחרר לתוך הציטופלסמה לאחר r 0 שעות ו3H
המשלוח של הסמים ננו דרך קרום התא על ידי ספיגת endosome מוצג ביור איור 6 אחרי 0 שעות ו 3 שעות. תוויות הקרינה המחוברים לפלטפורמת ננו הסמים (אלקסה פלואוריד 680, ירוקה) וAON (Lissamine, אדום). סופרפוזיציה שלהם מוצגת בלוחות D & L ויחד עם הקרינה של endosomes שכותרתו (כחולה) בלוחות G & O. מקדמי המתאם של פירסון (R (r) חושבו מהתמונות לגבי שיתוף לוקליזציה של הפלטפורמה / endosomes, AON / endosomes, פלטפורמה / AON ל0 שעות ו 3 שעות. Tהוא 3 שעות תמונה הצביע שחרור מendosomes לתוך הציטופלסמה והניתוק של AON מסמי ננו ידי מחשוף דיסולפיד גלוטתיון תלוי בציטופלסמה.
איור 6. מיקרוסקופיה confocal לספיגה המצומד ננו ידי תאי יעד (עיבוד דינג et al. 11). תאים הודגרו למשך 30 דקות ב37 ° C עם תרופת ננו שהיה פעמיים שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 680 (ירוק) בפלטפורמת הפולימר ועם Lissamine (אדום) הצמוד לAON. בנוסף, endosomes הוכתמה FM1-43 (כחול). לוקליזציה מוצגת אחרי 0 שעה (א) ו 3 שעות דגירה (ב '). פנלים, ab, וארוחת בוקר, מכתים מופע ij ידי fluorophores המצומד ננו לבד, ושיתוף הלוקליזציה שלהם ב, CD & B, KL. בנוסף, צביעת endosomes מוצגת בלוחות, דואר וארוחת בוקר, מ 'וcolocalization של הצמוד ננו ופנלי endosomesin, FG וארוחת בוקר, לא. פנלים, H & B, בניגוד שלב מופע p עבור פנלים בהתאמה. (C) נמצא מתאם פירסון מקדמי R (r) לcolocalization של פלטפורמת endosomes, AON-endosomes, פלטפורמה-AON שמחושב ל0 שעות ו 3 שעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עיכוב של סרטן השד אנושי במבחנה in vivo
בעיכוב גדילת מבחנה של שורת תאים ביתר HER2 BT-474 בcomparison עם שורת תאים המבטאת נמוכה מד"א-MB-231 מוצג ביור איור 7. תואר של עיכוב הוא 50% ו30%, בהתאמה, על ידי המצומד ננו P / MPEG / LOEt / AON HER2 / הרצפטין / אנטי MsTfRmAb העופרת. עיכוב על ידי התרכובות האחרות הוא פחות אך גבוה יותר עבור BT-474 מאשר למד"א-MB-231 תאים. שורת תאי BT-474 נבחרה לטיפול בסרטן השד בעכבר xenogeneic.
איור 7. עיכוב צמיחה במבחנה של HER2 ביתר BT-474 תאי סרטן השד ונמוך מבטא מד"א-MB-231 תאים (עיבוד Inoue et al. 12). השוואה של עיכוב גדילה עבור HER2 ביתר שורת תאי סרטן שד BT-474 ( משמאל) ושל HER2 שורת תאי סרטן שד המבטאת נמוכה מד"א-MB-231 (מימין). TFR (ים) מציין אנטי MsTfRmAb וTFR (הו / גב ') מציין אנטי HuTfRmAb & נגד MsTfRmAb. התרופה הננו להוביל, P / MPEG / LOEt / AON HER2 / הרצפטין / TFR (גב), ותרופות הננו נטולות או הרצפטין או AON HER2 הם בהשוואה עם PBS, הרצפטין וAON HER2. בהעדרו של הרצפטין, אנטי MsTfRmAb היה מצומדת לספק ספיגת endosome על ידי תאי הגידול. ריכוזים היו 40 מיקרוגרם / מיליליטר בכל קשורים לנוגדנים, מיקרומטר 4 ביחס לAON HER2, 4 endoporter מיקרומטר (יישום של AON). משמעות כונה על ידי *, P <0.05: **, P <0.02: ***, P <לעומת 0.003 עם PBS.
התוצאות בטיפול vivo באיור 8 מוצגות לעכברי נושאי BT-474 HER2 ביתר סרטן השד אנושי. צמיחה הייתה עצורה> 95% על ידי nanodrug להוביל מכיל הרצפטין וAON HER2 הספציפי בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופלה רק עם PBS (יור איור 8). עכבההיה 60% או פחות עם הרצפטין לבד, P / MPEG / LOEt / הרצפטין או P / MPEG / LOEt / AON / אנטי MsTfRmAb / אנטי HuTfRmAb. ניתוח כתם המערבי של תמציות גידול הראה עיכוב של שתי סינתזת HER2 וזירחון AKT, אך לא חלתי שינוי של AKT הכולל ואנזים משק GAPDH. PARP היה ביקע בהתכתבות עם רמה מוגברת של אפופטוזיס. תמונות של גידול לאחר טיפול, וחתכים רקמה צבעוניים עם H & E הממחישה רגרסיה גידול מוצגות באיור יור 9.
איור 8. גודל גידול וחלבונים בטיפול בתרופות עופרת ומבשר ננו (עיבוד Inoue et al. 12). גודל גידול. לטיפולים השונים (היום 21 ליום 42, לגמרי 8 זריקות). ברים לציין סטנדרטייםסטיות מממוצעות. ההובלה מצומדת עם אנטי HER2 AON והרצפטין הייתה עדיפה על שני הרצפטין לבד או conjugates אחת תרופה המכילה ננו. ב '. השפעה של הטיפולים השונים על הביטוי של HER2, Akt פוספורילציה, Akt סך הכל, PARB, PARB וGAPDH ביקע מוצגים על ידי מערבי סופג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9. טיפול בסרטן השד האנושי BT-474 HER2 החיובי בעכברים בעירום. רגרסיה גידול ונימק / אפופטוזיס בסעיפי רקמות (עיבוד Ionue et al. 12). עליון: כיווץ של הגידול (חיצים אדומים). אינדיקציה של גלולה אסטרוגן כדי לתמוך בצמיחת גידול (חץ כחול). Lower: מכתים Hematoxilin & Eosine (H & E) סעיפים גידול. גידול מתרבים מוצג על ידי האריזה הצפופה של תאים סרטניים. רקמת נמקים נתפס שבו תאים סרטניים בוטלו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
המסלול הניסיוני להכנת תרופות הננו מפולימר טבעי מתכלה מוצג בם ניתן להשתמש בסינתזה של רפואה אישית. התיאור מתחיל בייצור והטיהור המבוקר של חומצת polymalic, אשר היא פלטפורמה תכליתית עבור סינתזת תרופת ננו. באמצעות שימוש בטכניקות לשחזור, הפולימר שהושג עם משקל מולקולרי גבוה ובטוהר קיצוני מתאים לסינתזות תרופות. הסינתזה מתוארת לתרופה ננו, שיוצגה לטיפול בסרטן השד מסוג HER2 החיובי ביעילות. התיאור יכול להיות מתורגם לסינתזות של רוב תרופות ננו האחרות לטיפול בסרטן. מיקוד כרוך נוגדנים כגון הרצפטין שקושרים אנטיגן הסרטני ספציפי, כגון חלבון HER2 או כל סמן גידול אחר שהפנים ביעילות. התרופה הננו מספקת מבחר של אנטיסנס וchemotherapeutics כי תהיה יעיל לעכב את הצמיחה של הסרטן תחת treatment. בדוגמא, הרצפטין מחייב HER2 וחישול מולקולת אנטיסנס ספציפי עם mRNA הביא לחסימה מתמשכת של HER2-איתות וצמצום חמור של סרטן השד מסוג HER2 חיובי קידוד-HER2. בהתבסס על העיקרון הבסיסי של מיקוד גידול ועיכוב של ביטוי גנים על ידי אנטיסנס יש לנו מסונתז עדכני מספר תרופות ננו אחרות וגליובלסטומה עכבות בהצלחה פרה אדם וסרטן השד משולש שלילי 11,14-18.
העבודה סינתטית מתחילה עם הכנת פלטפורמה לסמים הננו מטוהר מאוד, שהוא חומצת polymalic מsupernatant התרבות של polycephalum Physarum (מינים של המשפחה "עובש רפש"). ההכנה מדגישה משקולות מולקולריות גבוהות של הפולימר, באופן עקרוני ומאפשר חיבור של מספר רב של נוגדנים, פפטידים, oligonucleotides ומולקולות אחרות הפועלות באספקת סמים פעילה ועיכוב גדילת גידול. Following culturing וטיהור מבוקרים, איכות שחזור של פולימר בתשואות צפויות כבר מיוצרת. הפולימר מאוחסן בתנאים נוחים לכל עת.
הסינתזה של ננו conjugates PMLA החל בהפעלה הכימית של carboxylates פולימר התליון מתבצעת בכמה צעדים סינטטיים. בין צעדים, סינתזה יכולה להיות ממוקמת באופן אופציונלי בהמתנה ומאפשרת הכנת כמויות שרירותיות של תשומות לייצור ובכך ניתן להשתמש בעד קנה מידה. ההתקדמות של סינתזה ואחריו TLC והשניות-HPLC, ושניהם בהרכב והפעילות של התרופה הננו נשלט על ידי מבחני קבוצה ספציפית כימי כמותית, ELISA, ומגוון רחב של מידות פיזיות. הניסיון שלנו הוא שהסינתזות האלה כבר התקדמו בצורה חלקה וreproducibly עם תשואות וטהרה מצוינות. על ידי בחירה הספציפיות של oligonucleotides הנוגדנים וantisense כל גרסה של תרופת ננו היא לטובה מסונתזת כנדרש בPErsonalized רפואה.
שיטות של הטיפול המוצלח של סרטן השד מסוג HER2 החיובי האנושי הן נציגים תקפים להכנת דגמי סרטן העכבר, יישום של תרופות ננו, הדמיה, וניתוח של גידול. התוצאות של בדיקות במבחנה כדאיות שימושיות בבחירת הקו הסלולרי והתרופה המובילה לשימוש בניסויים בבעלי החיים. בvivo ההדמיה Xenogen מאמתת כי התרופה הננו מועברת אכן לתוך הגידול. תוצאות מערביות סופג מגלה אם רמת חלבונים מסוימים הגיבה בצורה הצפויה במהלך טיפול בסרטן. מדידה של גודל גידול מודיעה על ההצלחה של הטיפול, כלומר כ עיכוב, מיתון או רגרסיה. הדוגמא המתוארת משקפת את הניסיון שלנו עם תרופות אחרות polymalic מבוסס חומצת ננו שמעידות על מידה גבוהה של חיזוי, שחזור והעדר הרעילות ראויה לציון. תוצאות אחרונות על רעילות ויעילות של t מרובהconjugates חומצת polymalic argeted לטיפול בסרטן השד משולש שלילי נמצא בתמיכה חזקה של רעיון זה 18. תכונת מפתח היא שתרופת ננו הוא מסוגל לחדור ביו מחסומים: מחסום האנדותל ידי extravasation לתוך ביניים גידול, קרום התא הסרטני על ידי ספיגת endosome, ושיבוש קרום endosome על ידי פעולה של קבוצות ethylester אוצין או trileucine. Extravasation וספיגת endosome הם השיגו באופן מהימן על ידי הנוגדנים הספציפיים המצורפים לתרופת ננו. נוגדני רצפטור transferrin אנטי עכבר מתווך זרם יעיל לגידול על ידי transcytosis, כנראה בגלל שהקולט הוא ביטוי יתר על רוב כלי דם של גידול. נוגדנים שונים קשורים בפונקציות מולקולת המצומד הננו זהות באופן ספציפי הכוונת הסמים הננו לגידול תא הנמען. נוכחותם של שני הנוגדנים, אחת לtranscytosis והשני לספיגת endosome, הוא חיוניים לתפקוד אופטימלי. ניתוח כמותי של מ 'חומצה ונוגדני Alic מומלץ ביותר על מנת לשלוט בהרכב אופטימלי של תרופת ננו. לבסוף יש לציין כי התרופה הננו קוולנטיים כל אחד ב-מספקת תרופה בטופס מצורף כימי בדרכם דרך כלי דם המארח לגידול תא הנמען. קובץ מצורף כימי הופך את רוב התרופות לא פעיל (prodrugs) עד שהם מחדש כמו תרופות בחינם על ידי מחשוף מהפלטפורמה המצומד ננו באתר הממוקד. זה חשוב כי שיטת ההפעלה מחדש מספקת רמה גבוהה של בטיחות במהלך לידה וסיכוי מינימאלי לעורר תופעות לוואי מזיקות. צדדיות, יעילות ובטיחות הן תכונות הכרחיות של רפואה מותאמת אישית טובה.
Disclosures
המחברים ג'וליה י Ljubimova, קית' ל שחור, וEggehard הולר הם בעלי מניות של Arrogene טכנולוגיה בע"מ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| 90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
| Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
| Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
| Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
| Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
| Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
| Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
| Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
| GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
| Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
| Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| Herceptin | Genentech | 15534 | |
| Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
| IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
| Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
| Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
| L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
| Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
| Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
| Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) | Invitrogen | LC3675 | |
| Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
| Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
| Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | Proteochem | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
| Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| Dexmedetomidine | Pfizer | ||
| Atipamezole | Pfizer | ||
| Carprofen | Pfizer | ||
| Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |
References
- Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
- Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).
- Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
- Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
- Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. , (2013).
- Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
- Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. , Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).
- Lee, B. -S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
- Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
- Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
- Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
- Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
- Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
- Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
- Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).
