Summary
Un esempio di un farmaco a base di acido nano polymalic è presentato verso la progettazione razionale di medicina personale che è applicabile al cancro. Esso descrive la sintesi di un farmaco nano per trattare il cancro al seno umano HER2-positivo in un topo nudo.
Introduction
Nell'era post-genomica, quando genomi di cancro sono stati svelati (National Center for Biotechnology e The Cancer Genome Atlas), il futuro del trattamento del cancro rappresenterà la diversità genetica dei tumori, spesso all'interno dello stesso tumore 1-4. Bioinformatica e veloce, non costoso il sequenziamento del DNA permette l'acquisizione di geni maligni / mutazioni a livello personale 2,4,5. Una volta che sono stati identificati i geni, i pazienti saranno trattati con la medicina personalizzata per modificare o tacere la loro espressione di geni maligni 6. La necessità di indirizzare le cellule tumorali e fornire farmaci all'interno di queste cellule richiede sistemi di consegna polifunzionali. Ovviamente, i farmaci nano in grado di soddisfare questo requisito 7.
In un'onda che agita di scoperte nanoparticelle sono dimostrati adatti per portare carichi di farmaci chemioterapici, proteine e / o materiale geneticamente attiva alle cellule tumorali. Tuttavia, gli effetti negativi restano da annunciovestita. Una riguardava l'assenza di biodegradabilità può provocare deposizione di materiale in tessuto sano e organi con il rischio di provocare malattie. Per minimizzare la deposizione, abbiamo introdotto acido polymalic non tossico e non immunogenica, che è di origine microbica e biodegradabile di H 2 O e CO 2 8. Usiamo il polimero di sintetizzare un tipo covalente all-in-one di farmaco nano. Esso contiene chemioterapici attaccati chimicamente come Temozolomide, doxorubicina, o oligonucleotidi antisenso e gruppi funzionali che servono stravaso, il targeting dei tessuti, la consegna endosomolytic. I farmaci sono intrinsecamente spaccati dalla piattaforma nano quando sono arrivati nella cellula tumorale bersaglio, rigenerando così la loro attività farmaceutica pieno.
Descriviamo il metodo di produzione microbica della piattaforma polimero nano, la sua purificazione, e la sintesi chimica di un farmaco nano contenente Trastuzumab (Herceptin) per il cancrotargeting e un oligonucleotide antisenso per l'inibizione di HER2 sovrapproduzione. Nell'applicare il farmaco nano al cancro xenogenico umano HER2-positivo seno in topi nudi, dimostriamo elevata efficacia del trattamento del cancro. I principi per un orientamento tumore e silenziamento genico introdotto qui per polymalic farmaci acido nano possono essere applicati nel trattamento di altri casi di cancro.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono conformi alle norme di polizia ufficiali, comprese le procedure chirurgiche e non chirurgiche eseguite in vivo e sono in piena conformità con i protocolli IACUC.
1. Bioproduzione di Acido Polymalic
- Far crescere una cultura seme da sferule su agar e trasferire plasmodi a 100 ml di terreno di coltura con un 25 ° C Thermo dichiarato incubatore e basale terreno di coltura 8,9.
- Produrre una quantità di gravità ricco 500 ml micro plasmodia sotto al riparo dalla luce per evitare sporulazione.
- Preparare 80 g CaCO3 sospesi in 8 L medio basale in 10 L bioreattore nave. Trasferire 500 ml micro plasmodia imballato nel recipiente di reazione montato e consentire bioprocess per 75 ore a 25 ° C, 10 L / min flusso di aria filtrata e 150 rpm agitazione mediante agitatore meccanico segmento.
- Terminerà quando il brodo di coltura ha pH 4.8 indica la fine della produzione di PMLA e misurare il contenuto PMLA da tlui idrossamato / Fe (III) test.
- Raffreddare il brodo a 17 ° C e consentono alle cellule di depositarsi per gravità.
- Raffreddare a 4 ° C e regolare a pH 7,5, usa 2 M NaOH. Pompare il surnatante con una colonna riempita con 1,5 L di DEAE-cellulosa in fondo direzione verso l'alto (DEAE grana grossa, equilibrata con 20 mM Tris-HCl pH 7,5 a 5 ° C).
- Lavare con 3 colonne di tampone contenente 0,3 M NaCl dopo aver cambiato direzione dall'alto verso il basso ed eluire PMLA in presenza di 0,7 M NaCl.
- Regolare a 0,1 M CaCl 2 e precipitare PMLA-calcio con l'80% di etanolo ghiaccio freddo. Frazionare su Sephadex G25 in PMLA-calcio di 80-300 kDa, 50-80 kDa e 10 - 50 kDa, utilizzare acqua in assenza di buffer e sale.
- Passare ogni frazione su un 120H Amberlite IR + colonna, e congelare immediatamente l'acido polymalic flusso continuo in azoto liquido per liofilizzazione.
- Sciogliere in acetone asciutto. Dopo filtrazione, rimuovere il solventenel flusso di aria secca, lyophilize e conservare a -20 ° C.
2. Sintesi di base acida Polymalic Nano Drug
- Attivare gruppi carbossilici PMLA (P) mescolando 116 mg (1 mmol unità malyl) di PMLA-H in 1 ml di acetone anidro e 1 mmol N-idrossisuccinimmide e 1 mmol dicicloesil carbodimide in 2 ml di dimetilformammide (DMF). Mescolare a 20 ° C per 3 ore. Aggiungere 0,05 mmol di mPEG 5000-NH 2 (0,05% in moli di unità malyl) in 1 ml di DMF seguito da 0,05 mmol trietilammina (TEA).
- Aggiungere goccia a goccia sciolto in DMF 0,4 mmol dell'estere etilico leucina (Loet) (40 mol% di unità malyl), 0.1 mmol 2-tiolo-1-etilammina (2-MEA) (10 mol% di unità malyl) e 0,5 mmol TEA, tutto dissolto in DMF. Dopo ogni aggiunta, lasciare 1 ora e controllare il completamento reazione negativa ninidrina risposta (sottile strato-cromatografia, TLC).
- Non rimuovere detriti NHS-estere per idrolisi spontanea con soluzione salina tamponata con fosfato (30 min, pH 6,8). Desalt over PD-10 Colonna, avere "preconjugate" come una polvere bianca mediante liofilizzazione. Conservare in luogo asciutto a meno 20 ° C.
- Disciogliere 30 mg di anticorpo (mAb, IgG2a-κ) in 4,5 ml di 100 mM fosfato di sodio, NaCl 150 mM, pH 5,5.
- Ridurre legami disolfuro con Tris 5 mM (etil 2-carbossi) fosfina cloridrato per 30 min a 20 ° C e purificare su colonna PD-10.
- Sciogliere Mal-PEG 3400-Mal in 2 ml dello stesso tampone e aggiungere il mAb ridotta ad un volume finale di 10 ml e agitare per una notte a 4 ° C. Concentrato a 2,5 ml su Vivaspin 20, l'esclusione di 30 kD, e purificare su Sephadex G75. Verificare prodotto nel sec-HPLC e misurare quantità fotometrica a 280 nm di lunghezza d'onda.
- Attaccare Mal-PEG-Mal-mAb a "preconjugate" tioli ottenendo P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Per fare ciò, mescolando 5 ml di 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal di 50 mg (P / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA) nel suddetto tampone a pH 5,5, regolare la concentrazione di sulfhydryl a 2 mM e incubare a 20 ° C per 3 ore (resa 98%).
- Solubilizzare 3'-H 2 N-AON in DMF / PBS (pH 7,2) e reagire con N-succinimidil-3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP) in (1:1 v / v) DMF / metanolo (ninidrina prova ) e purificare AON-PDP over Sephadex-LH20 in metanolo, poi in acqua e lyophilize.
- Incubare 800 nmol AONs attivati nel buffer di 5.5 pH con quanto sopra predisposto Mal-PEG 3400-Mal-MAB-preconjugate durante la notte fino a quando la reazione di scambio disolfuro è terminata.
- Incorporare fluorescente Alexa Fluor 680-maleimide formando tioetereo con polimero-2-MEA-SH. Bloccare sulfidrili eccesso con 3 pyridyldithio-propionato (PDP) e purificare su Sephadex G75. Conservare a 4 ° C o scatto congelato a -80 ° C fino all'utilizzo.
3. Saggi e proprietà
- Effettuare test per purezza e stabilità in PBS e siero a 4 ° C e 37 ° C mediante analisi HPLC-sec. Utilizzare polistirene sulfonato come molecstandard di peso Ular. Misurare nano distribuzione delle dimensioni e zeta-potenzialità. Utilizzare sistemi commerciali.
- Aggiungere al campione 320 ml 160 ml di 10% (w / v) di cloruro di idrossilammonio e 160 microlitri di 10% (w / v) di NaOH. Dopo 10-15 minuti, mescolare con 160 ml di 5% (w / v) Fe (III) Cl 3 nel 12% (v / v), HCl e leggere un 540 di idrossamato / Fe (III). Calcola PMLA assumendo 1 mg / ml PMLA corrisponde a 2,5 A 540.
- Idrolizzare il farmaco nano pernottamento a 2 M HCl a 110 ° C e l'acido malico saggio su cromatografia a fase inversa con riferimento ai campioni arricchiti con gli standard di acido malico. Cleave il farmaco nano con ditiotreitolo 100 mM e misurare Morpholino-AON per quantitativa HPLC in fase inversa rispetto agli standard Morpholino AON.
- Prendere farmaco nano senza scissione e misurare l'anticorpo utilizzando un kit di analisi delle proteine. Quantificare mPEG permettendo la sua reazione con ferrothiocyanate ammonio, poi estrarre con cloroformio e leggere l'assorbanza a 510 nm di lunghezza d'onda 10
- Eseguire ELISA con 5 ml di farmaco nano (1-10 mg mAb) per pozzetto testare attività degli anticorpi e colligation. Utilizzare 0,5 mg / pozzetto transferrina recettore HER2 e, rispettivamente, come antigeni piastre rivestite e anticorpi secondari perossidasi accoppiato.
- Calcola raggiunto% per AON, MPEG e mAb per quanto riguarda l'acido malico (100%) e confrontare con il% previsto dal progetto (vedi esempi Tabella 1 e Tabella 2).
4. Sperimentazione in vitro
- Incubare il farmaco nano con cellule tumorali in coltura e misura cellule sopravvissute nel tempo la loro attività per ridurre reagente giallo [3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-solfofenil )-2H-tetrazolio, sale interno] (MTS) ad un colorante blu e leggere l'assorbanza relativa con un fotometro. Seguire le istruzioni del fornitore kit.
- Preparare estratti cellulari in vitro o ex vivo per Western blotting. Utilizzare gelida di estrazione bUffer che contiene SDS e inibitore della proteasi cocktail. Proteine separate, riducendo elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide.
- Fare western blotting per le proteine di interesse negli estratti del campione. Utilizzare anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina.
- Utilizzare microscopia confocale a dimostrare l'assorbimento cellulare e co-localizzazione di nano piattaforma polimerica droga, AON e endosomi con etichettatura fluorescenza. Attaccare Alexa Fluor 680 alla piattaforma coniugato nano e Lissamine di AONs come etichette fluorescenza. Utilizzare un microscopio scanner spettrale 5X e cellule tumorali viventi per visualizzare la distribuzione delle molecole marcate
- Membrane endosomi macchia con colorante fluorescente stirilico Rosso e dimostrano endosome colocalization o il rilascio.
5. Sperimentazione in vivo
- Preparare il modello del mouse carcinoma mammario HER2-positivo umano (nude topo Tac: Cr: (MCR)-Foxnnm). Inserire un 0,72 mg di 17β-estradiolo rilascio di pellet (90 giorni di rilascio) subcutaneously nel collo di ogni topo.
- Poi iniettare 1 x 10 7 cellule tumorali BT-474 per via sottocutanea nel fianco destro e far crescere il tumore.
- Iniziare il trattamento quando i tumori sono 120 mm 3 dimensioni iniettando nella vena della coda 150 coniugato nano microlitri contenente 2,5 mg / kg AON e / o 4,5 mg / kg di ciascun anticorpo. Per il trattamento iniettare due volte a settimana, totalmente sei volte.
- Misurare le dimensioni del tumore con pinze a doppio deboli e calcolare i volumi utilizzando la formula (lunghezza x profondità x larghezza) x (π / 6). Euthanize animali 2 settimane dopo l'ultima iniezione e dopo sedazione con una soluzione di ketamina e Dexmedetomidine seguita da dislocazione cervicale.
- Isolare i tumori e le sezioni macchia con H & E per la valutazione morfologica.
- Per valutare la distribuzione della droga su scala animale, utilizzare un sistema di imaging di fluorescenza. Iniettare il farmaco 680 nano etichettato Alexa Fluor e immagini a 24 e 48 ore.
- Eutanasia dell'animale e rilevare la Fluorescence in tumori e organi isolati e perfusi.
Representative Results
Inibizione del cancro al seno HER2-positivo umano mettendo a tacere l'espressione del recettore HER2 e bloccando HER2-segnalazione 12
Strategia
Tra le diverse forme di cancro al seno umano, i tumori HER2-positivi hanno il peggior risultato clinico. Presentiamo il successo nel trattamento del carcinoma mammario HER2 overexpressing umano nel modello di topo nudo. La strategia comporta il farmaco nano attivo sia il silenziamento immediata della via di segnalazione HER2 impiegando Herceptin e HER2-specifico AON per bloccare la sintesi dipendente HER2-mRNA del recettore (Figura 1). Il coniugato nano piombo, che contiene Herceptin e anti-HER2 AON è mostrato in Figura 3, unitamente a due controlli privi di uno o AON Herceptin. Il composto di piombo contenuta anti-MsTfRmAb per raggiungere stravaso attivo transcitosi through legame TfR endoteliali dei vasi tumorali. Molto meno assorbimento nel tumore è stata osservata in assenza dell'anticorpo e stato attribuito a tumore effetto dipendente EPR 13. Versioni fluorescenti dei coniugati nano contenenti Alexa Fluor 680 sono stati sintetizzati per studi di imaging.
. Figura 1 Meccanismo di consegna AON nelle cellule di carcinoma mammario HER2-positivo e inibizione della crescita tumorale in alto a sinistra:. Nano coniugato adattato dalla Figura 3. In basso a sinistra: vasi tumorali che esprimono TfR mouse sulla superficie. Il farmaco nano lega al recettore e entra nel tumore da transcitosi. Inoltre, un certo grado di accesso al tumore è possibile attraverso gli strati endoteliali disordinati che partecipano tumore dipende migliore assorbimento e retention (EPR) 13. Successivamente, il nanodrug lega a HER2 espresso sulle cellule tumorali umane e interiorizza in endosomi precoci. Legatura blocchi anche HER2 via di segnalazione. Dopo maturazione di endosomi e loro acidificazione, viene attivato il meccanismo endosome fuga del farmaco nano. Nanodrug entrare nel citoplasma viene rilasciata dalla piattaforma nano per scissione del disolfuro distanziatore e si lega a HER2-mRNA blocco HER2-sintesi. Blocco della sintesi estende blocco dei HER2-segnalamento e induce inibizione della crescita tumorale.
Produzione microbica della piattaforma acido polymalic
La piattaforma coniugato nano, acido polymalic (PMLA), è stato prodotto da microplasmodia colta Physarum polycephalum e purificata dal brodo come descritto nel protocollo e raffigurato in Figura 2. Produzione e purificazione erano lisce e riproducibile. Era importante cont tempo rol, pH e temperatura per evitare scissione spontanea del polimero. Un accurato lavaggio ed eluizione del DEAE-colonna è raccomandato al fine di eliminare DNA, carboidrati, tossine e materiale colorato. Estrema purezza è stato ottenuto dopo dissoluzione in acetone anidro e rimuovere il materiale insolubile. Importo totale dei prodotti PMLA era di 5 ± 1 g per la campagna. Quantità di 1,5 ± 0,5 g altamente purificati PMPLA di M w 80.000-100.000 sono stati raggiunti riproducibile quando si utilizza il 10 L bioreattore. Profili di eluizione Sec-HPLC sono simmetrici. Analisi light scattering dinamico in base alla distribuzione numero indicato un singolo picco corrispondente ad un diametro idrodinamico di 8 ± 1 nm e indice di polidispersità di PDI = 0.10 ± 0.02, calcolata dal software dello strumento per particelle sferiche assunte. Zeta-potenziale era -22 ± 2 mV (pH 7.5).
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Figura 2. Produzione e purificazione di acido polymalic da coltura micro plasmodia di Physarum polycephalum (adattato da Lee et al. 9). Acido Polymalic (PMLA) è ottenuto da plasmodia di Physarum polycephalum in un bioreattore e raccolti dal supernatante di coltura legandosi su scambiatore anionico (DEAE). L'eluente è etanolo-precipitato come sale di calcio. Soluzioni di sale di calcio sono Mw-frazionata over Sephadex-G25. PMLA contenenti decimali vengono convertiti dal Ca-sale in acido over Amberlite IR-120H +. La libera PMLA è finalmente liofilizzato per produrre polvere bianco secco.
La sintesi chimica del nano coniugato piombo
P / MPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%)
Le strutture schematiche del farmaco nano piombo e di due coniugati precursore nano sono mostrati in Fig. ure 3. Il cavo contiene tutti i componenti, mentre i precursori sono stati progettati mancare sia AON HER2 o l'anticorpo Herceptin. Oltre AON e mAbs, composti contenuti polietilenglicole, MPEG 5000, per minimizzare legarsi alle proteine plasmatiche, passaggio attraverso il sistema reticolo-endoteliale (RES), e la degradazione mediante clivaggio enzimatico. La sequenza antisenso 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'è complementare al mRNA Her2 ed è stato accuratamente testato in vitro su varie linee cellulari che esprimono HER2 avere elevata specificità verso bloccando HER2 sintesi e non mostrare gli effetti off-target.
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Figura 3. Nano coniuga per curare il cancro al seno HER2-positivo umana. Leading farmaco nano (struttura in alto) contiene due farmaci (Herceptin, AON HER2). Le versioni 2 e 3 contengono solo uno dei farmaci. Assorbimento di 1 e 2 nelle cellule tumorali HER2-overexpressing umani è gestito dal legame di Herceptin. Nano coniugato 3, che non contiene Herceptin, ricevuta anti-HuTfRmAb per endosomi assorbimento da parte delle cellule umane. La coniugazione con Alexa Fluor 680 era facoltativo per scopi di imaging. La barra rossa rappresenta la piattaforma di nano coniugato PMLA / Loet (40%). % Indica la frazione di residui di acido malico consumati nel legame del ligando indicato (quantità totale di residui di acido malico nel nanodrug = 100%).
Figura 4. Sintesi chimica di nanoconiugati P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Dall'alto in basso:. Sintesi di PMLA-N-idrossi estere succinimidyl (PMLA-NHS) di carbossilati pendente (attivazione chimica). Sostituzione di NHS dalla formazione di ammide con 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), metil-PEG 5000-ammina (mPEG 5000-NH 2), trileucine (LLL) o leucina etilico (Loet). Questa "preconjugate" attribuisce mAb-Mal-PEG-Mal da tioetereo formazione e di AON dalla formazione di ponti disolfuro scindibili. Leftover 2-MEA è limitato formando amidoethyl-dithio-propionico. Viene mostrato solo allacciamento di un singolo mAb. Più allegati sono gestiti utilizzando miscele di anticorpi monoclonali. Percentuale% indica frazioni di carbossilati legati a vari ligandi (100% gratis PMLA).
I coniugati nano sono stati sintetizzati come indicato in Fig. ure 4. Il peso molecolare calcolato di piomboconiugato era 719.000. La resa globale della sintesi era del 45 ± 5% per quanto riguarda il contenuto di acido malico. In media, le 862 unità malyl (= 100%) della piattaforma di 100 kDa PMLA, il 40% realizzato Loet, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% e 0,2% Herceptin anti-MsTfR mAb. L'importo per ogni anticorpo corrisponde a una media di 1,7 molecole per molecola di piattaforma PMLA. Il% progettato e la% verificato mediante analisi gruppo erano gli stessi di ± 5%. Un esempio è il caso riportato nella tabella 1 per il calcolo del contenuto sperimentale di acido malico, AON, mAb e MPEG 5000 e nella tabella 2 mostra il confronto con il contenuto di progettazione. L'elevata purezza secondo i criteri di cui alla sezione 3 è stato raggiunto sulla base di rese elevate di reazione e separazione efficiente dall'esclusione formato (per esempio senza mAb e mAb-nanoconjugate sono separati da 1 min a sec-HPLC), e la solubilità nei solventi selettivi. L'attività degli anticorpi monoclonali era dimostrato di essere mantenuti anche nano sintesi dei farmaci, ed è stato confermato che i due tipi di anticorpi sono stati montati sulla stessa piattaforma polimero. Il risultato dell'esperimento atipica ELISA è mostrato in fig ure 5. In generale, i saggi per l'analisi quantitativa gruppo per l'acido malico, AON, proteine, PEG e per ELISA erano robusti, ottenendo risultati riproducibili quando condotto da diversi personale e strumentazione non solo nel caso della sintesi riportata, ma anche quando utilizzati per l'analisi di altre nanoconjugates sintetizzati.
Tabella 1. Calcolo della composizione nanodrug con riferimento al contenuto di acido malico.
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Tabella 2. Confronto sperimentale nano composizione farmaco con composizione creazione.
Figura 5. ELISA per la misurazione di affinità anticorpale dopo la sintesi chimica, e per la dimostrazione di aerei legame degli anticorpi differenti. Il farmaco nano contiene anticorpo mAb (A) e l'anticorpo monoclonale (B) contro antigeni A e B, rispettivamente. Piastre ELISA sono rivestiti con antigene (A). Libero mAb (A), libero mAb (B), e farmaci nano vengono applicati alle piastre ELISA. Dopo il lavaggio, gli anticorpi sono testati con perossidasi secondario anticorpi accoppiati specifici sia per mAb (A) o mAb (B), mentre solo mAb (A) è legato all'antigene (A). Si è visto che il farmaco libero e nano coniugato con mAb (A), e indirettamente coniugato mAb (B) dello stesso nano molecola del farmaco, ma non libero mAb (B), Vengono mantenute sul piatto. La dipendenza dalla concentrazione mostra affinità di legame comparabili per mAb libera e coniugata (A), che indica che la coniugazione chimica non ha influenzato l'attività di legame dell'anticorpo. Inoltre, la co-legatura di mAb (B) con mAb (A) sulla stessa entità fisica (piattaforma nano) comporta anticorpo mAb (B) rilevamento. I risultati sperimentali riportati sono riferiti al TfRmAb anti-umano (A) e anti-topo TfRmAb (B). Risultati simili sono stati indicati per le altre coppie di anticorpi testati, come anti-MsTfR mAb e anti-HER2 monoclonale (Herceptin).
L'indagine fisico-chimiche indicato diametro idrodinamico 22,1 ± 2,3 nm per P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (piombo, i due- versione droga), 20.1 ± 2.4 nm per la P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (la versione droga AON) , e 15,1 ± 1,2 nm per P / MPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (versione farmaco Herceptin). Zeta-potenziali a pH 7.5 Erano in questo ordine -5.2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, e -4,1 ± 0,4 mV. Va ricordato che il diametro idrodinamico misurata di coniugati nano non ha seguito additività dei diametri misurati per componenti liberi.
La consegna della droga nano attraverso la membrana cellulare tumorale e rilasciare nel citoplasma dopo 0 hr e 3h r
La consegna di farmaco nano attraverso la membrana cellulare da endosomi assorbimento è mostrato in Fig. 6 ure dopo 0 ore e 3 ore. Etichette fluorescenza sono attaccate alla piattaforma nano farmaco (Alexa Fluor 680, verde) e di AON (Lissamine, rosso). La loro sovrapposizione è mostrato in pannelli D & L e insieme alla fluorescenza di endosomi etichettati (blu) in pannelli G & O. Coefficienti di correlazione di Pearson (R (r) sono stati calcolati dalle immagini materia di co-localizzazione di piattaforme / endosomi, AON / endosomi, piattaforma / AON per 0 ore e 3 ore. Tegli 3 image hr indicata rilascio dalla endosomi nel citoplasma e dissociazione di AON dal farmaco nano glutatione-dipendente disolfuro scissione nel citoplasma.
Figura 6. Microscopia confocale per nano coniugato assorbimento da parte delle cellule bersaglio (adattato da Ding et al. 11). Le cellule sono state incubate per 30 min a 37 ° C con farmaco nano che era stato letto marcato con Alexa Fluor 680 (verde) alla piattaforma polimero e con Lissamine (rosso) attaccato al AON. Inoltre, endosomi sono state colorate con FM1-43 (blu). La localizzazione è indicata dopo 0 ore (A) e 3 ore (B) incubazione. Pannelli A, ab, e B, ij spettacolo colorazione dai soli fluorofori nano coniugati, ela loro co-localizzazione in A, cd & B, kl. Inoltre, la colorazione di endosomi è mostrato in pannelli A, E & B, M e la colocalizzazione di nano coniugato e pannelli endosomesin A, fg & B, n. Pannelli A, h & B, contrasto p spettacolo di fase per rispettivi pannelli. (C) di correlazione di Pearson coefficienti R (r) per la colocalizzazione di piattaforma-endosomi, AON-endosomi, piattaforma AON calcolato per 0 ore e 3 ore. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Inibizione di cancro al seno umano in vitro e in vivo
In inibizione della crescita in vitro di iperespressione di HER2 linea cellulare BT-474 in comconfronto con bassa linea cellulare esprimente MDA-MB-231 è mostrato in Fig. ure 7. Grado di inibizione è del 50% e del 30%, rispettivamente, dal piombo nano coniugato P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inibizione dagli altri composti è inferiore ma superiore per BT-474 che per MDA-MB-231 cellule. Linea cellulare BT-474 è stata scelta per il trattamento del cancro al seno xenogenici topo.
Figura 7. In vitro di inibizione della crescita di iperespressione di HER2 BT-474 cellule di cancro al seno e basso esprimere MDA-MB-231 cellule (adattato da Inoue et al. 12). Confronto di inibizione della crescita per iperespressione di HER2 BT-474 linea cellulare di carcinoma mammario ( sinistra) e di HER2 partire esprimendo linea cellulare di carcinoma mammario MDA-MB-231 (a destra). TfR (s) denota anti-MsTfRmAb e TfR (Hu / Ms) denota anti-HuTfRmAb e anti-MsTfRmAb. Il farmaco nano piombo, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms), e le droghe nano privi di una Herceptin o AON HER2 sono confrontati con PBS, Herceptin e AON HER2. In assenza di Herceptin, anti-MsTfRmAb stato coniugato per fornire endosomi assorbimento da parte delle cellule tumorali. Le concentrazioni erano 40 mg / ml per quanto riguarda gli anticorpi, 4 micron per quanto riguarda la AON HER2, 4 mM endoporter (applicazione di AON). Importanza indicato con *, P <0,05: **, p <0.02: ***, P <0.003 rispetto con PBS.
I risultati del trattamento in vivo in Figura 8 sono presentati per topi portatori BT-474 iperespressione di HER2 cancro al seno umano. La crescita è stata inibita> 95% dal nanodrug piombo contenente Herceptin e HER2-specifica AON rispetto ai controlli trattati solo con PBS (Fig. 8 ure). Inibizioneera del 60% o meno con Herceptin da solo, P / MPEG / Loet / Herceptin o P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western blot di estratti tumorali ha mostrato l'inibizione della sintesi sia HER2 e fosforilazione di Akt, ma nessun cambiamento di totale Akt e le pulizie enzima GAPDH. PARP è stato segmentato in corrispondenza di un aumento del livello di apoptosi. Foto di tumore dopo il trattamento, e sezioni di tessuto colorate con H & E illustrando regressione del tumore sono mostrati in figura ure 9.
Figura 8. Dimensioni del tumore e le proteine durante il trattamento con piombo e precursori di droghe nano (adattato da Inoue et al.) 12. Una dimensione. Tumore per i vari trattamenti (giorno 21 al giorno 42, totalmente 8 iniezioni). Barre indicano normadeviazioni dalla media. Il cavo coniugato con anti-Her2 AON e Herceptin era superiore a uno solo Herceptin o singolo farmaco contenente coniugati nano. B. Effetto dei vari trattamenti sulla espressione di HER2, fosforilata Akt, totale Akt, PARB, PARB spaccati e GAPDH sono rappresentati da western blotting. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9. Trattamento del BT-474 tumore HER2-positivo materno in topi nudi. Regressione tumorale e necrosi / apoptosi in sezioni di tessuto (adattato da Ionue et al. 12). Superiore: riduzione del tumore (frecce rosse). Indicazione del pellet estrogeni per sostenere la crescita del tumore (freccia blu). Lower: ematossilina & Eosine (H & E) colorazione di sezioni tumorali. Proliferazione tumorale è mostrato dalla densità della cellule tumorali. Il tessuto necrotico è visto dove sono state eliminate le cellule tumorali. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il percorso sperimentale per la preparazione di farmaci nano da un polimero naturale biodegradabile è presentato che può essere utilizzato nella sintesi di medicina personale. La descrizione inizia con la produzione controllata e purificazione di acido polymalic, che è una piattaforma versatile per nano sintesi dei farmaci. Utilizzando tecniche riproducibili, il polimero viene ottenuto con alto peso molecolare e in estrema purezza adatto per sintesi farmaceutiche. La sintesi è descritta per un farmaco nano che viene mostrato per trattare efficacemente il cancro al seno HER2-positivo. La descrizione può essere tradotto in sintesi della maggior parte degli altri farmaci nano per il trattamento del cancro. Targeting coinvolge anticorpi come Herceptin che legano uno specifico antigene tumorale come proteina HER2 o qualsiasi altro marcatore tumorale che è efficiente internalizzato. Il farmaco nano offre una selezione di oligonucleotidi antisenso e chemioterapici che efficacemente inibire la crescita del tumore in treatment. Nell'esempio, Herceptin legame HER2 e specifico ricottura oligonucleotide antisenso con-HER2 codifica mRNA determinato blocco continuo di HER2-segnalamento e severa riduzione del cancro al seno HER2-positivo. Basato sul principio di fondo di targeting per tumore e l'inibizione dell'espressione genica mediante oligonucleotidi antisenso abbiamo aggiornato sintetizzato diversi altri farmaci nano e con successo inibito glioblastoma umano preclinica e cancro al seno triplo-negativo 11,14-18.
Il lavoro di sintesi inizia con la preparazione della piattaforma farmaco nano altamente purificato, che è acido polymalic dal supernatante di coltura di Physarum polycephalum (una specie della famiglia "Dictyostelium"). La preparazione sottolinea alti pesi molecolari del polimero, in principio permettendo attaccamento di numerosi anticorpi, peptidi, oligonucleotidi e altre molecole funzionanti nella somministrazione di farmaci attivi e inibizione della crescita tumorale. Following la coltura e purificazione controllato, è stato prodotto qualità riproducibile del polimero dei rendimenti prevedibili. Il polimero viene conservato in condizioni convenienti per ogni momento.
La sintesi di PMLA coniugati nano iniziano con l'attivazione chimica dei polimeri carbossilati-sospensione avviene in pochi passaggi sintetici. Tra passaggi, la sintesi può essere opzionalmente messa in attesa permettendo preparazione di quantità arbitrarie di intermedi e quindi può essere utilizzato in una scalatura. Il progresso della sintesi viene seguito mediante TLC e sec-HPLC, e sia la composizione e l'attività del farmaco nano è controllata mediante saggi specifici gruppi chimici quantitativa, ELISA, e una varietà di misure fisiche. La nostra esperienza è che queste sintesi sono stati progressi senza intoppi e riproducibile con ottimi rendimenti e purezza. Scegliendo la specificità di anticorpi e oligonucleotidi antisenso qualsiasi variante di farmaco nano è favorevole sintetizzato come desiderato nella personalized medicina.
Le modalità di trattamento efficace del carcinoma mammario HER2-positivo umana sono rappresentanti validi per la preparazione di modelli di cancro del mouse, applicazione di farmaci nano, imaging e analisi della crescita tumorale. I risultati dei test di vitalità in vitro sono utili per selezionare la linea cellulare e il farmaco che porta da utilizzare nell'esperimento animale. In vivo Xenogen immagini convalida che il farmaco nano è infatti consegnato nel tumore. Risultati di western blotting rivela se il livello di alcune proteine risposto nel modo previsto durante il trattamento del cancro. Misurazione della dimensione del tumore informa il successo del trattamento, cioè circa inibizione, recessione o regressione. L'esempio descritto riflette la nostra esperienza con altri farmaci a base di acido nano polymalic indicano un grado elevato di prevedibilità, riproducibilità e assenza di tossicità notevole. Recenti risultati sulla tossicità e l'efficacia di molteplici tconiugati dell'acido polymalic argeted per il trattamento triplo negativo cancro al seno sono in forte sostegno di questa nozione 18. Una caratteristica fondamentale è che il nostro farmaco nano è in grado di penetrare bio-barriere: la barriera endoteliale da stravaso nel interstiziale del tumore, la membrana delle cellule tumorali da endosome assorbimento, e la rottura della membrana degli endosomi per azione dei gruppi leucina etilico o trileucine. Stravaso e endosome assorbimento sono affidabile realizzati dagli anticorpi specifici collegati al farmaco nano. Anticorpo recettore di transferrina antitopo media afflusso efficace nel tumore da transcitosi, probabilmente perché il recettore è iperespresso in più vasi tumorali. Un anticorpo differente attaccato alle stesse funzioni nano coniugato molecola in particolare dirigere il farmaco nano nella cellula tumorale destinatario. La presenza di entrambi gli anticorpi, quello per transcitosi e l'altra per endosome assorbimento, è essenziale per il funzionamento ottimale. Analisi quantitativa di macido Alic e anticorpo è altamente raccomandato per controllare la composizione ottimale del farmaco nano. Infine va notato che il farmaco covalente nano all-in-one batte farmaco in forma divisoria chimicamente tragitto attraverso il sistema vascolare ospitante nella cellula tumorale destinatario. Attacco chimico rende la maggior parte dei farmaci inattivi (profarmaci) finché non sono ricostituiti come farmaci gratuiti per scissione dalla piattaforma nano coniugato presso il sito di destinazione. Questo è importante perché la modalità riattivazione fornisce un elevato grado di sicurezza durante la consegna e una minima possibilità di evocare effetti collaterali nocivi. Versatilità, efficacia e sicurezza sono attributi indispensabili di una buona medicina personalizzata.
Disclosures
Gli autori Julia Y. Ljubimova, Keith L. Nero, e Eggehard Holler sono azionisti di Arrogene Technology Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| 90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
| Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
| Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
| Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
| Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
| Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
| Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
| Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
| GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
| Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
| Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| Herceptin | Genentech | 15534 | |
| Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
| IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
| Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
| Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
| L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
| Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
| Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
| Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) | Invitrogen | LC3675 | |
| Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
| Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
| Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | Proteochem | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
| Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| Dexmedetomidine | Pfizer | ||
| Atipamezole | Pfizer | ||
| Carprofen | Pfizer | ||
| Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |
References
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