Polymalic Acid-baserte Nano Biopolymere for målretting av flere tumor markører: en mulighet for personlig medisin?

Summary

Et eksempel på en nano stoff basert på polymalic syre er presentert mot den rasjonelle utforming av personlig medisin som er anvendbar til kreft. Den beskriver syntesen av et nano medikament til behandling av HER2-positiv human brystkreft i en naken mus.

Introduction

I det post-genomisk æra når genomer av kreft har blitt avslørt (National Center for Biotechnology and The Cancer Genome Atlas), vil fremtidig behandling av kreft står for genetisk mangfold av svulster ofte innenfor samme svulst ^1-4. Bioinformatikk og rask, ikke dyrt DNA-sekvensering tillater kjøp av ondartede gener / mutasjoner på et personlig nivå ^2,4,5. Når gener har blitt identifisert, vil pasienter bli behandlet med personlig medisin å endre eller taushet deres uttrykk for ondartede gener ^seks. Behovet for å målrette mot kreftceller, og å levere medikamenter inn i disse celler krever polyfunksjonelle leveringssystemer. Selvfølgelig, kan nano narkotika oppfylle dette kravet ^7.

I en bølgende bølge funn nanopartikler har vist seg egnet til å bringe nyttelast på kjemoterapeutiske legemidler, proteiner og / eller genetisk aktivt materiale til kreftceller. Men bivirkninger fortsatt å være annonsekledd. En av dem er relatert til fraværet av biologisk nedbrytbarhet kan forårsake avsetning av materiale i friskt vev og organer med en sannsynlighet for å fremkalle sykdommer. For å minimalisere avsetning, innførte vi ikke-toksisk og ikke-immunogen polymalic syre, som er av mikrobiell opprinnelse og biologisk nedbrytbare til _H2O og _CO2 ^8.. Vi bruker polymer å syntetisere en alt-i-ett kovalente type nano narkotika. Den inneholder kjemisk festet chemotherapeutics som Temozolomide, doxorubicin, eller antisense oligonukleotider og funksjonelle grupper som serverer bloduttredelse, vev målretting, endosomolytic levering. Stoffet er egentlig spaltes fra nano-plattformen da de kom i målrettede svulst celle, dermed gjenoppfriske sin fulle farmasøytisk aktivitet.

Vi beskriver en fremgangsmåte for mikrobiologisk fremstilling av polymeren nano-plattform, dens rensing og kjemisk syntese av et nano medikament som inneholder Trastuzumab (Herceptin) for cancermålretting og et antisens-oligonukleotid for inhibering av HER2-overproduksjon. Ved anvendelse av nano stoffet til xenogeneiske human HER2-positiv brystkreft på nakne mus, vi demonstrere høy effekt av kreftbehandling. Prinsippene for tumor målretting og genet stanse innført her polymalic syre nano stoffer kan anvendes ved behandling av andre tilfeller av kreft.

Protocol

Alle eksperimenter etterkomme offisielle dyre regler, herunder kirurgiske og nonsurgical prosedyrer utført in vivo og er i full overensstemmelse med IACUC protokoller.

En. Bioproduksjon av Polymalic Acid

1. Dyrk en såkultur fra spherules på agar og overføre plasmodia til 100 ml dyrkingsmedium ved hjelp av en 25 ° C inkubator og termo angitt basaldyrkningsmedium ^8,9.
2. Produsere en mengde av tyngdepakket 500 ml mikro plasmodia under utelukkelse av lys for å unngå sporulering.
3. Forbered 80 g CaCO ₃ suspendert i åtte L basal medium i 10 L bioreaktor fartøy. Overfør 500 ml pakket mikro plasmodia i den monterte reaksjonsbeholderen og lar bioteknologi etter 75 timer ved 25 ° C, 10 l / min strøm av filtrert luft og 150 rpm omrøring av en segment rører.
4. Avslutt når kulturkraften har pH 4.8 som indikerer slutten av produksjonen av PMLA og måle PMLA innhold av tHan hydroksamat / Fe (III)-analyse.
5. Avkjøl kokes til 17 ° C, og tillate cellene å slå seg ned ved tyngdekraften.
6. Avkjøl til 4 ° C og juster til pH 7,5, bruke 2 M NaOH. Pump supernatant gjennom en kolonne fylt med 1,5 l av DEAE-cellulose i retning nedenfra og oppover (grov korn DEAE, ekvilibrert med 20 mM Tris-HCl pH 7,5 ved 5 ° C).
7. Vask med tre kolonner med buffer inneholdende 0,3 M NaCl etter endring av retning fra topp til bunn og eluere PMLA i nærvær av 0,7 M NaCl.
8. Juster til 0,1 M CaCl ₂ og fremskynde PMLA-Kalsium med 80% iskald etanol. Fraksjonerer løpet Sephadex G25 i PMLA-kalsium fra 80 til 300 kDa, 50-80 kDa og 10-50 kDa, bruker vann i fravær av buffer og salt.
9. Før hver fraksjon over en Amberlite IR-120H ⁺ kolonne, og umiddelbart fryses gjennomstrømnings polymalic syre i flytende nitrogen for lyofilisering.
10. Løs opp i tørr aceton. Etter filtrering, fjernes løsningsmidleti tørr luft bekk, Lyofiliser og oppbevar ved minus 20 ° C.

2. Syntese av Polymalic Acid-basert Nano Drug

1. Aktivering av karboksylgrupper PMLA (P) ved å blande 116 mg (1 mmol malyl enheter) av PMLA-H i 1 ml vannfritt aceton og 1 mmol N-hydroxysuccinimid og 1 mmol dicykloheksyl carbodimide i 2 ml dimetyl-formamid (DMF). Omrør ved 20 ° C i 3 timer. Til 0,05 mmol av mPEG _{5000-NH 2} (0,05 mol-% av malyl enheter) i 1 ml DMF, fulgt av 0,05 mmol trietylamin (TEA).
2. Legg dråpe messig oppløst i DMF 0,4 mmol leucin-etylester (Loet) (40 mol% av enheter malyl), 0,1 mmol 2-thiol-1-etylamin-(2-MEA) (10 mol% av malyl enheter) og 0,5 mmol TEA, alt oppløst i DMF. Etter hver tilsetning, tillater en time og sjekke for fullføringen av reaksjonen negativ ninhydrin-reaksjon (tynnsjikts-kromatografi viste TLC).
3. Do fjerne restene NHS-ester ved spontan hydrolyse med fosfat-bufret saltvann (30 min, pH 6.8). Avsalte løpet PD-10 Kolonne, tak "preconjugate" som et hvitt pulver ved frysetørking. Oppbevares tørt ved minus 20 ° C.
4. Oppløs 30 mg antistoff (mAb, IgG2a-κ) i 4,5 ml 100 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 5,5.
5. Reduser disulfidbindinger med 5 mM tris (2-karboksy-etyl) fosfin hydroklorid i 30 min ved 20 ° C og rense enn PD-10 kolonne.
6. Oppløs Mal-PEG _3400-Mal i 2 ml av den samme buffer og tilsett redusert mAb til sluttvolum på 10 ml og omrør over natten ved 4 ° C. Konsentrer til 2,5 ml i løpet Vivaspin 20, utelukkelse 30 kD, og ​​rense løpet Sephadex G75. Verifiserings produkt over sek-HPLC og måle mengden fotometrisk ved 280 nm bølgelengde.
7. Fest Mal-PEG-Mal-mAb til «preconjugate" tioler skaffe P / PEG ₅₀₀₀ (5%) / Loet (40%) / mAb (0.2%) / 2-MEA (10%). Dette kan gjøres ved å blande 5 ml av 200 nmol mAb-PEG _3400-Mal til 50 mg (P / mPEG ₅₀₀₀ / LOEt/2-MEA) i ovennevnte buffer pH 5,5, justere konsentrasjonen av sulfhydryl til 2 mM og inkuberes ved 20 ° C i 3 timer (utbytte 98%).
8. Oppløseliggjøre _3'-H2N-AON i DMF / PBS (pH 7,2), og reagere med N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio) propionat (SPDP) i (1:1 v / v) DMF / metanol (ninhydrin-test ) og rens AON-PDP i løpet Sephadex-LH20 i metanol, deretter i vann og Lyofiliser.
9. Inkuber 800 nmol aktiverte AONs på 5,5 pH-buffer med det ovenfor fremstilte Mal-PEG _{3400-Mal-mAb-preconjugate} over natten inntil disulfid utveksling reaksjonen er avsluttet.
10. Innlemme fluorescerende Alexa Fluor 680-maleimide forming tioeteren med polymer-2-MEA-SH. Blokk skytende sulfhydryls med 3-pyridylditio-propionat (PDP) og rens løpet Sephadex G75. Lagres ved 4 ° C eller snap frosset ved -80 ° C inntil videre bruk.

Tre. Analyser og Egenskaper

1. Utføre tester for renhet og stabilitet i PBS og serum ved 4 ° C og 37 ° C ved sek-HPLC-analyse. Bruk polystyren som MolecUlar vekt standarder. Mål nanostørrelsesfordeling og zeta-potensialer. Bruk kommersielle systemer.
2. Legg til 320 ul prøve 160 pl 10% (vekt / volum) hydroksylammoniumklorid og 160 pl av 10% (w / v) NaOH. Etter 10 til 15 minutter, blandes med 160 ul av 5% (w / v) Fe (III) Cl ₃ i 12% (v / v) HCl og lese A ₅₄₀ av hydroksamat / Fe (III). Beregn PMLA forutsatt at 1 mg / ml PMLA tilsvarer 2.5 A _540.
3. Hydrolysere nano medikament over natten i 2 M HCl ved 110 ° C og analysen eplesyre på reversert fase-kromatografi under henvisning til prøvene tilsatt maleinsyre-standarder. Cleave nano stoffet med 100 mM ditiotreitol og måle Morpholino-AON av kvantitative reversert fase HPLC mot Morpholino AON standarder.
4. Ta nano stoffet uten spalting og måle antistoff ved hjelp av et protein assay kit. Kvantifisere mPEG ved å la sin reaksjon med ammonium ferrothiocyanate, deretter pakke med kloroform og lese absorbans ved 510 nm bølgelengde ¹⁰
5. Utfør ELISA med 5 mL av nano narkotika (1-10 mikrogram MTB) pr brønntesting antistoff aktivitet og colligation. Bruk 0,5 ug / brønn transferrin-reseptor og HER2, henholdsvis plate-belagte antigener og peroksidase-koblet sekundære antistoffer.
6. Beregn oppnås% for AON, mPEG og mAb med hensyn til eplesyre (100%), og sammenligne med% beregnet ved utførelse (se eksempler Tabell 1 og Tabell 2).

4. In vitro testing

1. Inkuber nano medikament med dyrkede cancerceller og måle overlevende celler over tid ved deres aktivitet til å redusere gul reagens [3 - (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophenyl )-2H-tetrazolium, indre salt] (MTS) til et blått fargestoff og lese relative absorbans med et fotometer. Følg instruksjonene av settet leverandøren.
2. Forbered Celleekstraktene in vitro eller ex vivo for Western blotting. Bruk iskald utvinning bUffer som inneholder SDS og proteasehemmer cocktail. Separate proteiner ved å redusere SDS-polyakrylamidgel-elektroforese.
3. Gjør western blotting for proteiner av interesse i de utvalgte ekstrakter. Bruk sekundære antistoffer konjugert til alkalisk fosfatase.
4. Bruk konfokalmikroskopi å demonstrere celleopptak og samlokalisering av nano stoffet polymer plattform, AON og endosomes med fluoresens merking. Fest Alexa Fluor 680 til nano konjugert plattform og Lissamine til AONs som fluorescens etiketter. Bruk av et mikroskop 5X spektral scanner og levende cancerceller for å visualisere fordelingen av de merkede molekyler
5. Flekk endosome membraner med styryl Red fluorescerende fargestoff og demonstrere endosome colocalization eller frigjøring.

5. In vivo Testing

1. Forbered menneske HER2-positiv brystkreft musemodell (nude mus Tac: Cr: (MCR)-Foxnnm). Sett inn en 0,72 mg 17β-østradiol slippe pellet (90-dager release) subcutaneously i halsen av hver mus.
2. Deretter injisere en x 10 ⁷ BT-474 kreftceller subkutant i høyre flanke og la svulsten vokse.
3. Begynn behandling når tumorer er 120 mm ³ i størrelse ved å injisere inn i halevenen 150 pl nano konjugat inneholdende 2,5 mg / kg AON-og / eller 4,5 mg / kg av hvert antistoff. For behandling injisere to ganger per uke, totalt seks ganger.
4. Måle tumorstørrelse av målepunkter dobbelt så svake og beregne volumene ved bruk av formelen: (lengde x dybde x bredde) x (π / 6). Avlive dyrene 2 uker etter den siste injeksjonen og etter sedasjon med en oppløsning av ketamin og dexmedetomidin fulgt av cervical dislokasjon.
5. Isoler svulster og beis seksjoner med H & E for morfologisk evaluering.
6. For å vurdere narkotika distribusjon på et dyr skala, bruke en fluorescens imaging system. Injisere Alexa Fluor 680 merket nano narkotika og bilde på 24 og 48 timer.
7. Avlive dyret og oppdage fluorescence i isolerte og perfusert svulster og organer.

Representative Results

Hemming av human HER2-positiv brystkreft med stanse HER2 reseptor uttrykk og blokkerer HER2-signale ¹²

Strategi

Blant ulike former for menneskelig brystkreft, HER2-positive svulster har den verste klinisk utfall. Vi presenterer en vellykket behandling av menneskelig HER2-overekspresjon brystkreft i naken mus modell. Strategien omfatter nano stoffet aktiv i både den umiddelbare stanse av HER2 signalveien anvendelse Herceptin og HER2-spesifikk AON for blokkering av HER2-mRNA avhengig syntese av reseptoren (fig. 1). Ledningen nano-konjugatet, som inneholder Herceptin og anti-HER2 AON er vist i figur 3, sammen med to styringer som er blottet for enten Herceptin eller AON. Ledningen sammensatte inneholdt anti-MsTfRmAb å oppnå aktiv bloduttredelse ved transcytosis through binding til endothelial TfR av svulsten fartøy. Mye mindre opptak i tumoren ble observert i fravær av antistoff, og ble tilskrevet tumor avhengig EPR virkning ^13. Fluorescent versjoner av nano konjugater inneholder Alexa Fluor 680 ble syntetisert for bildediagnostikk.

. Figur 1 Mekanisme AON levering i HER2-positiv brystkreft celler og tumorvekst hemming Øvre venstre hjørne:. Nano konjugat tilpasset fra figur 3. Nedre venstre hjørne: Muse tumor fartøy uttrykker TfR på overflaten. Nano stoffet binder seg til reseptoren, og går inn i tumoren ved transcytosis. I tillegg er det mulig i noen grad av adgang til tumoren gjennom den endoteliske uordnede lag som deltar i tumor avhengig forbedret opptak og retentipå (EPR) ^13. Deretter binder nanodrug til HER2 uttrykt på de menneskelige kreftceller og internalizes inn tidlig endosomes. Bindende blokkerer også HER2 signalveien. Etter modning av endosomer og deres surgjøring, blir endosome flukt mekanisme av nano medikament aktivert. Nanodrug inn i cytoplasma frigjøres fra nano-plattformen ved reduktiv spaltning av de disulfid-spacer og binder seg til HER2-mRNA blokkering HER2-syntese. Blokkering av syntesen strekker blokkering av HER2-signalisering og induserer tumorvekst inhibering.

Mikrobiell produksjon av polymalic syre plattform

Nano konjugat plattform, polymalic syre (PMLA), ble produsert av helstøpt microplasmodia av Physarum polycephalum og renset fra suppen som beskrevet i protokollen og som er avbildet i figur 2.. Produksjon og rensing var glatt og reproduserbar. Det var viktig å forts rol tid, pH og temperatur for å unngå spontan spaltning av polymeren. Grundig vasking og eluering fra DEAE-kolonnen er anbefalt for å fjerne DNA, karbohydrater, toksiner og farget materiale. Ekstrem renhet ble oppnådd etter oppløsning i vannfri aceton og fjerning av uløselig materiale. Total mengde produsert PMLA var 5 ± 1 g per kampanje. Mengder av 1,5 ± 0,5 g høyt renset PMPLA av M _w 80,000-100,000 ble reproduserbart oppnådd ved bruk av 10 L bioreaktor. Sec-HPLC-eluering profilene var symmetrisk. Dynamisk lysspredning analyse i henhold til tallfordeling indikerte en enkelt topp som tilsvarer et hydrodynamisk diameter på 8 ± 1 nm og en polydispersitetsindeks på PDI = 0,10 ± 0,02, beregnes av instrumentet programvare for antatt sfæriske partikler. Zeta-potensialet var -22 ± 2 mV (pH 7,5).

/ 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Produksjon og rensing av polymalic syre fra dyrkede mikro plasmodia av Physarum polycephalum (tilpasset fra Lee et al. ^9). Polymalic syre (PMLA) fremstilles fra plasmodia av Physarum polycephalum i en bioreaktor og hentes fra kultursupernatanten ved binding på anionbytter (DEAE). Elueringsmidlet er etanol-utfelles som kalsiumsalt. Løsninger av kalsiumsaltet er Mw-fraksjonert i løpet Sephadex-G25. PMLA inneholdende fraksjoner blir konvertert fra Ca-salt i syre enn Amberlite IR-120H ^+. Den frie PMLA er endelig frysetørket for å gi tørt, hvitt pulver.

Kjemisk syntese av ledningen nano-konjugatet

P / mPEG ₅₀₀₀ (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a NTI-MsTfRmAb (0,2%)

De skjematiske strukturer av bly nano medikament og av to forløper nano-konjugater er vist i figur 3. ure. Ledningen inneholder alle bestanddeler, mens forløperne ble utformet til å mangle enten AON _HER2 eller antistoffet Herceptin. Foruten AON og mAbs kan forbindelsene inneholdt polyetylenglykol, mPEG _5000, for å minimere binding til plasmaproteiner, klaring gjennom retikuloendoteliale system (RES), og nedbrytning ved enzymatisk spalting. Den anti sekvensen 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'var komplementær til HER2 mRNA og har blitt nøye testet in vitro på flere HER2-uttrykke cellelinjer for å oppnå høy spesifisitet mot blokkering HER2 syntese og ikke viser off-target effekter.

8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Fig. 3. Nano konjugater for å behandle humant HER2-positiv brystkreft. Ledende nano narkotika (topp struktur) inneholder to legemidler (Herceptin, AON _HER2). Versjon 2 og 3 inneholder bare ett av narkotika. Opptak av en og to inn i menneskelige HER2-overekspresjon kreftceller forvaltes av binding av Herceptin. Nano-konjugat 3, som ikke inneholder Herceptin, mottok anti-HuTfRmAb endosome for opptak av de humane celler. Konjugering med Alexa Fluor 680 var valgfritt for bildebehandling formål. Den røde linjen representerer nano konjugert plattform PMLA / Loet (40%). % Angir brøkdelen av eplesyre rester som forbrukes i binding av angitte ligand (total mengde av eplesyre rester i nanodrug = 100%).

Figur 4. Kjemisk syntese av nanokonjugater P / Loet / AON _HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Fra topp til bunn:. Syntese av PMLA-N-hydroxy succinimidyl ester (PMLA-NHS) av anheng karboksylater (kjemisk aktivering). Utskifting av NHS ved amid-dannelse med 2-merkapto-1-aminoethan (2-MEA), metyl-PEG _5000-amin (mPEG _{5000-NH 2),} trileucine (LLL) eller leucin-ethylester (Loet). Denne "preconjugate" legger MAB-Mal-PEG-Mal med tioeter dannelse og AON ved dannelsen av spaltbare disulfidbindinger. Left 2-MEA er avkortet forming amidoethyl-ditio-propionsyre. Bare festing av en enkelt mAb er vist. Flere vedlegg styres ved hjelp av blandinger av mAbs. Prosentvis% betegner fraksjoner av karboksylater bundet til ulike ligander (100% gratis PMLA).

Den nano-konjugater ble syntetisert som beskrevet i figur 4. ure. Den beregnede molekylvekt av ledningenkonjugat var 719000. Det totale utbyttet av syntesen var 45 ± 5% med hensyn til den eplesyre-innhold. I gjennomsnitt av de 862 malyl enheter (= 100%) av 100 kDa PMLA plattformen, båret 40% Loet, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% Herceptin og 0,2% anti-MsTfR mAb. Beløpet for hver antistoff tilsvarte et gjennomsnitt på 1,7 molekyler per molekyl av PMLA plattform. Den% designet og den% verifisert av gruppen analysen var den samme innenfor ± 5%. Et eksempel er tilfelle angitt i tabell 1 for beregning av den eksperimentelle innhold av eplesyre, AON, mAb og mPEG ₅₀₀₀ og i tabell 2 viser at sammenlignet med innholdet av design. Den høye renhet i henhold til kriteriene i henhold til punkt 3 ble oppnådd på basis av høy reaksjons utbytter og effektiv separasjon ved størrelseseksklusjon (f.eks fri mAb og mAb-nanoconjugate er adskilt med 1 min på sek-HPLC), og selektiv løselighet i oppløsningsmidler. Aktiviteten av monoklonale antistoffer var vist seg å bli beholdt i hele nano medikament syntese, og det ble bekreftet at de to typer av antistoffer ble montert på den samme polymer plattform. Resultatet av atypiske ELISA-forsøket er vist i Fig. 5 ure. Generelt er analyser for kvantitativ analyse for gruppen eplesyre, AON, protein, PEG, og for ELISA var robust, hvilket ga reproduserbare resultater når utført av forskjellige personell og instrumentering, ikke bare i tilfelle av den rapporterte syntese, men også når det brukes til analyse av andre syntetiserte nanoconjugates.

Tabell 1.. Beregning av nanodrug sammensetning med henvisning til eplesyre-innhold.

668table2.jpg "width =" 600 "/>
Tabell 2. Sammenligning av eksperimentell nano narkotika komposisjon med designet komposisjon.

Figur 5. ELISA for måling av antistoff affinitet etter kjemisk syntese, og for påvisning av multiple binding av forskjellige antistoffer. Nano stoffet inneholder antistoff mAb (A) og antistoff mAb (B) mot antigener A og B, respektivt. ELISA-plater blir belagt med antigen (A). Free mAb (A), fri mAb (B), og nano stoffet anvendes på ELISA-platene. Etter vasking, blir antistoffene testet med sekundær peroksidase koblet antistoffer som er spesifikke for enten mAb (A) eller mAb (B), mens bare mAb (A) er bundet til antigen (A). Det ses at fri og nano legemiddel konjugert med mAb (A), og indirekte konjugert mAb (B) av den samme nano medikamentmolekylet, men ikke fri mAb (B), Beholdes på plate. Konsentrasjonen avhengighet viser sammenlign bindingsaffiniteter for fritt og konjugert mAb (A), noe som indikerer at den kjemiske konjugering påvirket ikke antistoffbindingsaktivitet. Videre, co-ligation av MAB (B) med MAB (A) på samme fysiske enhet (nano-plattformen) resultater i antistoff MAB (B) deteksjon. De eksperimentelle resultater som er vist her viser til anti-human TfRmAb (A) og anti-mus TfRmAb (B). Lignende resultater er blitt vist for andre antistoff par som ble testet, slik som anti-MsTfR mAb og anti-HER2-mAb (Herceptin).

De fysisk-kjemiske undersøkelser indikerte hydrodynamisk diameter 22,1 ± 2,3 nm for P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (bly, de to- medikament-versjon), 20,1 ± 2,4 nm for P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (det AON medikament versjon) , og 15,1 ± 1,2 nm for P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (Herceptin narkotika versjon). Zeta-potensialene ved pH 70,5 var i denne rekkefølgen -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, og -4,1 ± 0,4 mV. Det bør nevnes at den målte hydrodynamiske diameter av nano konjugater ikke fulgte additivitet av diameter målt for frie komponenter.

Levering av nano stoffet gjennom svulsten cellemembranen og slipper inn i cytoplasma etter 0 hr og 3t r

Leveringen av nano stoffet gjennom cellemembranen ved endosome opptak er vist i figur ure 6 etter 0 timer og 3 timer. Fluorescens etikettene er festet til nano narkotika plattform (Alexa Fluor 680, grønn) og til AON (Lissamine, rød). Deres superposisjon er vist i panel D & L og sammen med fluorescensen av merket endosomer (blått) på panelene G og O. Pearsons korrelasjonskoeffisient (R (r) ble beregnet ut fra bildene om samlokalisering av plattform / endosomes, AON / endosomes, plattform / AON for 0 timer og 3 hr. Than tre timers image indikert utgivelse fra endosomes inn i cytoplasma og dissosiasjon av AON fra nano stoffet ved glutation-avhengige disulfide spalting i cytoplasma.

Figur 6. Konfokalmikroskopi for nano konjugat opptak av målceller (tilpasset fra Ding et al. ^11). Celler ble inkubert i 30 min ved 37 ° C med nano stoffet som hadde blitt dobbelt merket med Alexa Fluor 680 (grønn) ved polymer plattformen og med Lissamine (rødt) som er festet til AON. I tillegg ble endosomer farget med FM1-43 (blå). Lokalisering vises etter 0 timer (A) og 3-t (B) inkubering. Paneler A, AB, & B, ij showet farging av nano konjugerte fluoroforene alene, ogderes samlokalisering i A, cd & B, kl. I tillegg er farging av endosomes vist i paneler A, E & B, M og colocalization av nano konjugat og endosomesin paneler A, fg & B, nei. Paneler A, h & B, P viser fasekontrast for respektive paneler. (C) Pearsons korrelasjonskoeffisienter R (r) for colocalization av plattform-endosomes, AON-endosomes plattform AON beregnet for 0 timer og 3 hr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hemming av human brystkreft in vitro og in vivo

In vitro vekstinhibering av HER2 overekspresjon cellelinje BT-474 i comlignet med lavt som uttrykker cellelinje MDA-MB-231 er vist i Fig. 7. ure. Grad av hemming er 50% og 30%, henholdsvis, av ledelsen nano konjugert P / MPEG / Loet / AON _HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inhibering av de andre forbindelsene er mindre, men høyere for BT-474 enn for MDA-MB-231-celler. BT-474-cellelinjen ble valgt for behandling av xenogeneiske brystkreft mus.

Figur 7. In vitro vekst hemming av økt forekomst av HER2 BT-474 brystkreftceller og lav uttrykker MDA-MB-231 celler (tilpasset fra Inoue et al. ^12). Sammenligning av veksthemming for økt forekomst av HER2 BT-474 brystkreft cellelinje ( venstre) og av HER2 lav uttrykke brystkreft cellelinje MDA-MB-231 (til høyre). TfR (s) betegner anti-MsTfRmAb og TfR (Hu / Ms) betegner anti-HuTfRmAb & anti-MsTfRmAb. Ledningen nano narkotika, P / MPEG / Loet / AON _HER2 / Herceptin / TfR (MS), og nano narkotika blottet for enten Herceptin eller AON _HER2 er sammenlignet med PBS, Herceptin og AON _HER2. I fravær av Herceptin, ble anti-MsTfRmAb konjugert til å gi endosome opptak av tumorcellene. Konsentrasjonen var 40 pg / ml med hensyn til antistoffer, 4 mM med hensyn til AON _HER2, 4 uM endoporter (anvendelse av AON). Betydning merket med *, P <0.05: **, P <0.02: ***, P <0,003 sammenlignet med PBS.

Resultatene av in vivo-behandling i figur 8 er presentert for mus med BT-474 HER2 overekspresjon human brystkreft. Veksten ble hemmet> 95% av ledelsen nanodrug inneholder Herceptin og HER2-spesifikke AON i forhold til kontrollene behandlet kun med PBS (Fig ure 8). Hemmingvar 60% eller mindre med Herceptin alene, P / MPEG / Loet / Herceptin eller P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western blot analyse av tumorekstrakt viste hemming av både HER2 syntese og Akt fosforylering, men ingen endring av total Akt og rengjøring enzym GAPDH. PARP ble spaltet i korrespondanse med et øket nivå av apoptose. Bilder av tumor etter behandling, og vevssnitt farget med H & E illustrerer tumorregresjon som vist i Fig. 9. ure.

Figur 8. Tumor størrelse og proteiner ved behandling med nano medikamenter bly og forløper (tilpasset fra Inoue et al. ^12.). A. Tumor størrelse for de ulike behandlinger (dag 21 til dag 42, totalt 8 injeksjoner). Linjene indikerer standardavvik fra gjennomsnittet. Ledningen konjugert med anti-HER2 AON og Herceptin var overlegen til enten Herceptin alene eller enkelt nano konjugater. B narkotika inneholder. Effekten av ulike behandlinger på uttrykk av HER2, fosforylert Akt, total Akt, parB spaltes parB og GAPDH vist av western blotting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 9. Behandling av HER2-positiv BT-474 human brystkreft på nakne mus. Tumorregresjon og nekrose / apoptose i vevssnitt (tilpasset fra Ionue et al. ^12). Øvre: Krymping av tumoren (røde piler). Angivelse av østrogenet pellet for å støtte tumorvekst (blå pil). Lower: hematoksylin & eosin (H & E) farging av tumor seksjoner. Voksende svulst er vist ved den tett pakking av kreftceller. Nekrotisk vev er sett der kreftcellene er eliminert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den eksperimentelle rute for fremstillingen av nano medikamenter fra en biologisk nedbrytbar polymer som naturlig er presentert som kan brukes i syntesen av personlig medisin. Beskrivelsen starter med kontrollert produksjon og rensing av polymalic syre, som er en allsidig plattform for nano medikament syntese. Ved hjelp av reproduserbare teknikker, er polymeren oppnådd med høy molekylvekt, og i ekstreme renhetsgrad egnet for farmasøytisk synteser. Syntesen er beskrevet for en nano medikament som er vist å effektivt behandle HER2-positiv brystkreft. Beskrivelsen kan oversettes til synteser av de fleste andre nano legemidler for behandling av kreft. Targeting omfatter antistoffer som Herceptin som binder en tumorspesifikt antigen som HER2 protein eller enhver annen tumormarkør som er effektivt internalisert. Nano stoffet gir et utvalg av antisens-oligonukleotider og kjemoterapeutika som vil effektivt hemme veksten av kreft under treling. I eksemplet, Herceptin binding til HER2 og spesifikk antisens oligonukleotid annealing med HER2-kodende mRNA resulterte i forlenget blokkering av HER2-signalisering og alvorlig reduksjon av HER2-positiv brystkreft. Basert på det underliggende prinsippet om svulst målretting og hemming av genuttrykk ved antisens oligonukleotider har vi to-date syntetisert flere andre nano narkotika og hell hemmet preklinisk human glioblastom og trippel-negative brystkreft ^11,14-18.

Den syntetiske arbeidet starter med fremstilling av sterkt renset nano medikament plattformen, som er polymalic syre fra kultursupernatanten av Physarum polycephalum (en art av "slam mold"-familien). Fremstillingen streker høye molekylvekter av polymeren i prinsippet tillater feste av en rekke antistoffer, peptider, oligonukleotider og andre molekyler som fungerer i den aktive medikamentavgivelse, og tumorvekst inhibering. Following den kontrollerte dyrkning og rensing, og reproduserbar kvalitet av polymer i forutsigbare utbytter blitt produsert. Polymeren er lagret under praktiske forhold for ethvert tidspunkt.

Syntesen av PMLA nano konjugater som begynner med den kjemiske aktiveringen av polymer-anheng karboksylater er utført i et par syntetiske trinn. I mellom trinnene, kan syntesen være eventuelt sperres slik at fremstilling av vilkårlige mengder av mellomprodukter, og således kan brukes i opp skalering. Fremdriften av syntesen blir etterfulgt av TLC, og sec-HPLC, og at både sammensetning og aktivitet av nano medikament kontrolleres ved gruppespesifikke kvantitative kjemiske analyser, ELISA, og en rekke fysiske målinger. Vår erfaring er at disse syntesene har blitt kommet jevnt og reproduserbart med gode avlinger og renhet. Ved å velge spesifisiteten av antistoff og antisense oligonukleotider noen variant av nano stoffet er gunstig syntetisert som trengs i personalized medisin.

Nærmere regler for vellykket behandling av human HER2-positiv brystkreft er gyldige representanter for utarbeidelse av mus kreft modeller, anvendelse av nano narkotika, bildebehandling, og analyse av tumorvekst. Resultatene av in vitro-levedyktighets tester er nyttige i å velge cellelinjen og den ledende stoff som skal brukes i dyreforsøk. In vivo Xenogen avbildning bekrefter at nano stoffet er faktisk leveres inn i svulsten. Resultater av western blotting avslører om nivået på visse proteiner svarte i den anslåtte mote under kreftbehandling. Måling av tumorstørrelse informerer om suksessen til behandling, det vil si om hemming, resesjon eller regresjon. Det beskrevne eksempel viser vår erfaring med andre polymalic nano stoffer syrebaserte indikerer en høy grad av forutsigbarhet, reproduserbarhet og fravær av betydelige toksisitet. Nyere resultater på giftighet og effekt av flere targeted polymalic syre konjugater for trippel-negative brystkreft behandling er i sterk støtte for denne oppfatningen ^18. Et viktig trekk er at vår nano stoffet er i stand til å trenge gjennom bio-barrierer: endothelial barriere ved uttredelse inn i tumor interstitiell, tumorcellemembran ved endosome opptak, og endosome membran avbrudd under innvirkningen av de leucin-ethylester eller trileucine grupper. Ekstravasering og endosome opptak blir på en pålitelig måte oppnås ved de spesifikke antistoffer som er festet til nano stoffet. Anti-mus-transferrin-reseptor antistoff medierer effektiv innstrømning inn i svulsten etter transcytosis, sannsynligvis fordi reseptoren er overuttrykt i de fleste tumor vaskulatur. Et annet antistoff som er festet på de samme nano konjugerte molekyl funksjoner spesifikt dirigere nano stoffet inn i mottakeren tumorcelle. Tilstedeværelsen av begge antistoffer er en for transcytosis og den andre for endosome opptak, vesentlig for optimal funksjon. Kvantitativ analyse av malic syre og antistoffet er sterkt anbefalt for å kontrollere en optimal sammensetning av nano stoffet. Endelig skal det bemerkes at alt-i-ett-kovalente nano medikament leverer medikamentet i kjemisk bundet til, danner en rute gjennom verts vaskulaturen inn i mottageren tumorcelle. Kjemisk vedlegget gjengir de fleste medikamenter inaktive (prodroger) før de er rekonstituert som gratis narkotika ved spalting fra nano konjugert plattformen ved målrettede området. Dette er viktig fordi den reaktive modalitet gir en høy grad av sikkerhet under levering og en minimal sannsynlighet for å fremkalle skadelige bivirkninger. Allsidighet, effekt og sikkerhet er uunnværlige kjennetegn på god personlig medisin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA)	Sigma-Aldrich	30078-25G
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories, Burlingame, CA
90-Day release 17β-estradiol pellet	Innovative Research of America
Alexa Fluor 680 C2 maleimide	Invitrogen	A20344
Amberlite IR 120H	Sigma-Aldrich	6428
Antifoam Y-30 Emulsion	Sigam-Aldrich	A5758
Anti-laminin-411 chain mAbs	Santa Cruz	SC-59980
Anti-pAkt mAb	Cell Signalling	9271S
Anti-PARB mAb	BD Biosciences	556494
Anti-von Willebrand Factor antibody	Abcam	AB6994
Bacto Yeast Extract	Bacto, Dickinson/Sparks, MD	212720
Beta-actin	Cell Signalling	3700
BT-474	ATCC	HTB-20
Calcium Carbonate	Alfa Aesar	36337
Cell Proliferation Assay kit	Promega, Madison, WI, USA	PR-G3580
Centriplus 100	Millipore	4414
Dicyclohexylcarbodimide	Fluka	36650
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Eosin	Cardinal Health	S7439-4
Galardin (MMP-inhibitors)	Santa Cruz	SC-994
GAPDH	Cell Signalling	2118
Hematoxilin	Cardinal Health	S7439-3
Hemin from porcine	Sigma-Aldrich	51280
Herceptin	Genentech	15534
Herceptin (Western blotting)	Cell Signalling	2165S
IgG2a-kappa murine malignoma	Sigma	M77695X5m
Immun-Star AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
Immun-StarTM AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
LAL Reagent water	Lonza, MD	W50-1000
Laminin-411 mAbs	Abcam
Leucine ethyl ester (LOEt)	Sigma-Aldrich	61850-10G-F
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests	Cambrex BioScience	N384
Lissamin-Morpholino AON	Gene Tools	Custom made
L-malic acid	Sigma-Aldrich	M6413
Malate dehydrogenase	Sigma-Aldrich	M2634
Mal-PEG-Mal	Laysan	mal-PEG-mal-3400
Matrigel	BD Biosciences	354248
Milk, nonfat powdered	Proteomics	M203-10G
Morpholino oligonucleotides	GeneTools	custom made
mPEG5000	Lysan	mPEG-NH2-5000
N-hydroxysuccinimde (NHS)	ACROS Organics	15727100
Ninhydrin	Merck	1.06762.0100
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich	Invitrogen	LC2001
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm	Invitrogen	LC2001
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x)	Invitrogen	LC3675
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]	Taconic
PBS pH 7.2 10x	Gibco	10010-49
PBS pH 7.2 1x	Gibco	70013
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851
Physarum polycephalum M3CVII	ATCC	204388
Pierce BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Protease inhibitor cocktail	Roche	1.18362E+11
Protein Detector ELISA Kit	KPL	54-62-18
Sephadex G-25 superfine	GE Healthcare	17-0031
Sephadex G-75	GE Healthcare	17-0050
Sephadex-LH20	GE Healthcare	17-0090
SKBR-3	ATCC	HTB-30
SPDP	Proteochem	C1116
Streamline-DEAE	GE Healthcare	17-0994
Styryl Red FM 1-43	Life Technologies	T-3163
TBS 10x	Bio-Rad	170-6435
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
TLC, silica coated aluminia sheets	Merck, Darmstadt, DE	60F254
Trileucine (LLL)	Bachem	H-3915
Triton X-114	Sigma-Aldrich	X114
Tween®20	Sigma-Aldrich	P1379
Vivaspin 20	VWR	14005-302
DAPI	Vector Laboratories, Burlingame, CA
Dexmedetomidine	Pfizer
Atipamezole	Pfizer
Carprofen	Pfizer
Betadine	Foster and Smith, Wisconsin