Summary
Ett exempel på en nano läkemedel baserat på polyäppelsyra presenteras mot rationell design av personlig medicin som är tillämplig på cancer. Det beskriver syntesen av en nano läkemedel mot HER2-positive human bröstcancer i en naken mus.
Introduction
I den postgenomiska eran då genom av cancer har avslöjad (National Center for Biotechnology och Cancer Genome Atlas), kommer framtida behandling av cancer står för den genetiska mångfalden av tumörer ofta inom samma tumör 1-4. Bioinformatik och snabb, inte dyrt DNA-sekvensering möjliggör förvärv av maligna gener / mutationer på ett personligt plan 2,4,5. När gener har identifierats, ska patienter behandlas med personlig medicin för att ändra eller tysta deras uttryck av maligna gener 6. Behovet av att rikta cancerceller och leverera läkemedel in i dessa celler kräver flerfunktionella leveranssystem. Uppenbarligen kan nano droger uppfylla detta krav 7.
I en svallande våg av upptäckter nanopartiklar har visat sig vara lämpligt att bringa nyttolaster av kemoterapeutiska läkemedel, proteiner och / eller genetiskt aktivt material till cancerceller. Men negativa effekter återstår att annonsenklädd. En av dem i samband med frånvaro av biologisk nedbrytbarhet kan orsaka avsättning av material i frisk vävnad och organ med sannolikheten att framkalla sjukdomar. För att minimera avlagring införde vi icke-toxisk och icke-immunogen polyäppelsyra, som är av mikrobiellt ursprung och biologiskt nedbrytbar till H2O och CO 2 8. Vi använder polymeren för att syntetisera en allt-i-ett kovalent typ av nano drog. Den innehåller kemiskt kopplade kemoterapeutika såsom Temozolomide, doxorubicin, eller antisensoligonukleotider och funktionella grupper som tjänar extravasation, vävnads inriktning endosomolytic leverans. Drogerna är inneboende klyvs från nano-plattform när de kom i den riktade tumörcellen och därigenom regenerera sin fulla läkemedelsverksamhet.
Vi beskriver metoden för mikrobiell framställning av polymeren nano plattformen, dess rening, och den kemiska syntesen av en nano läkemedel som innehåller Trastuzumab (Herceptin) för cancermålinriktning och en antisensoligonukleotid för hämning av HER2-överproduktionen. Vid tillämpning av nano drogen till xenogent mänsklig HER2-positiv bröstcancer på nakna möss, visar vi hög effektivitet av cancerbehandling. Principerna för tumör inriktning och geners uttryck introduceras här för polyäppelsyra nano droger kan användas vid behandling av andra fall av cancer.
Protocol
Alla experiment följa officiella djur föreskrifter inklusive kirurgiska och icke-kirurgiska ingrepp i vivo och är i full överensstämmelse med IACUC protokoll.
1. Bioproduktion av polyäppelsyra
- Odla ett frö kultur från små sfärer på agar och överföra plasmodia till 100 ml odlingsmedium med hjälp av en 25 ° C Thermo anges inkubator och basala odlingsmedium 8,9.
- Producera en mängd av gravitationspackade 500 ml mikro plasmodier under utestängning av ljus i syfte att undvika sporbildning.
- Förbered 80 g CaCO 3 suspenderades i 8 L basalt medium i 10 L bioreaktor kärlet. Överför 500 ml packade mikro Plasmodia in i den monterade reaktionskärlet och låt bioprocess för 75 timmar vid 25 ° C, 10 L / min flöde av filtrerad luft och 150 rpm omrörning med en segment omrörare.
- Avsluta när odlingsvätskan har pH 4,8 som indikerar slutet på produktionen av PMLA och mät PMLA innehåll av than hydroxamatet / Fe (III)-analys.
- Kyl buljongen till 17 ° C och tillåta cellerna att sedimentera genom gravitation.
- Kyl till 4 ° C och justera till pH 7,5, använd 2 M NaOH. Pump supernatanten genom en kolonn fylld med 1,5 L av DEAE-cellulosa i riktning nerifrån och upp (grovkornig DEAE, jämviktad med 20 mM Tris-HCl pH 7,5 vid 5 ° C).
- Tvätta med 3 kolonner av buffert innehållande 0,3 M NaCl efter att ändra riktning från toppen till botten och eluera PMLA i närvaro av 0,7 M NaCl.
- Justera till 0,1 M CaCl2 och fälla PMLA-kalcium med 80% iskall etanol. Fraktionera över Sephadex G25 i PMLA-kalcium av 80 till 300 kDa, 50-80 kDa och 10-50 kDa, använda vatten i frånvaro av buffert och salt.
- Passera varje fraktion över en Amberlite IR 120H + kolonn, och omedelbart frysa genomströmnings polyäppelsyra i flytande kväve under lyofilisering.
- Lös upp i torr aceton. Efter filtrering, avlägsnande av lösningsmedeli torr luftström, lyofilisera och förvara vid -20 ° C.
2. Syntes av polyäppelsyra-baserade Nano Drug
- Aktivera karboxylgrupperna PMLA (P) genom blandning av 116 mg (1 mmol malyl enheter) av PMLA-H i 1 ml vattenfri aceton och 1 mmol N-hydroxisuccinimid och 1 mmol dicyklohexyl-karbodiimid i 2 ml dimetylformamid (DMF). Rör om vid 20 ° C under 3 timmar. Addera 0,05 mmol av mPEG 5000-NH2 (0,05 mol-% av malyl enheter) i 1 ml DMF, följt av 0,05 mmol trietylamin (TEA).
- Lägg droppvis upplöst i DMF 0,4 mmol leucinetylester (Loet) (40 mol-% av malyl enheter), 0,1 mmol 2-tiol-1-etylamin (2-MEA) (10 mol-% av malyl enheter) och 0,5 mmol TEA, alla upplöstes i DMF. Efter varje tillsats, tillåta 1 timme och kontrollera reaktions slutförande av negativ ninhydrin svar (tunt lager-kromatografi, TLC).
- Ta bort överblivna NHS-ester genom spontan hydrolys med fosfatbuffrad koksaltlösning (30 min, pH 6,8). Avsalta över PD-10 Kolonn, få "preconjugate" som ett vitt pulver genom frystorkning. Förvaras torrt vid minus 20 ° C.
- Lös upp 30 mg antikropp (mAb, IgG2a-κ) i 4,5 ml 100 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 5,5.
- Minska disulfidbindningar med 5 mM Tris (2-karboxi-etyl) fosfin hydroklorid under 30 min vid 20 ° C, och renar över PD-10-kolonn.
- Lös Mal-PEG 3400-Mal i 2 ml av samma buffert och tillsätt den reducerade mAb vid slutlig volym av 10 ml och rör om över natt vid 4 ° C. Koncentrera till 2,5 ml över Vivaspin 20, utanförskap 30 kD, och rena över Sephadex G75. Verifiera produkt över sek-HPLC och mäta mängden fotometer vid 280 nm våglängd.
- Fäst Mal-PEG-Mal-mAb till "preconjugate" tioler erhålla P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Gör detta genom att blanda 5 ml av 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal till 50 mg (P / mPEG 5000 / LOEt/2-MEA) i ovanstående buffert, pH 5,5, justera koncentrationen av sulfhydryl till 2 mM och inkubera vid 20 ° C under 3 tim (utbyte 98%).
- Solubilisera 3'-H2N-AON i DMF / PBS (pH 7,2) och reagera med N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio) propionat (SPDP) i (01:01 v / v) DMF / metanol (ninhydrintest ) och rena AON-PDP över Sephadex-LH20 i metanol, sedan i vatten och lyofilisera.
- Inkubera 800 nmol aktiverade AONs i 5,5 pH-buffert med ovan beredda Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate natten tills disulfidutbytesreaktion avslutas.
- Införliva fluorescerande Alexa Fluor 680-maleimiden bildar tioeter med polymer-2-MEA-SH. Blockera överskott sulfhydryler med 3-pyridylditio-propionat (PDP) och rena över Sephadex G75. Lagra vid 4 ° C eller snabbfrystes vid -80 ° C tills vidare användning.
3. Assays and Properties
- Utför test för renhet och stabilitet i PBS och serum vid 4 ° C och 37 ° C genom SEC-HPLC-analys. Använd polystyrensulfonat som molecular viktsstandarder. Mät nano storleksfördelning och Zeta-potentialer. Använd kommersiella system.
- Lägg till 320 | il prov 160 | il av 10% (vikt / volym) hydroxylammoniumklorid och 160 | il 10% (vikt / volym) NaOH. Efter 10 till 15 minuter, blandas med 160 pl av 5% (vikt / volym) Fe (III) Cl 3 i 12% (vol / vol) HCl och läs A 540 av hydroxamat / Fe (III). Beräkna PMLA antagande 1 mg / ml PMLA motsvarar 2,5 A 540.
- Hydrolysera nano drogen över natten i 2 M HCl vid 110 ° C och analysen äppelsyra på omvänd fas-kromatografi med hänvisning till prover spetsas med äppelsyra standarder. Klyva nano läkemedel med 100 mM ditiotreitol och mäta Morpholino-AON av kvantitativ omvänd fas HPLC mot Morpholino AON standarder.
- Ta nano läkemedel utan klyvning och mäta antikroppar med hjälp av en proteinanalyssats. Kvantifiera mPEG genom att låta sin reaktion med ammonium ferrothiocyanate, sedan extrahera med kloroform och läs absorbans vid 510 nm våglängd 10
- Utför ELISA med 5 pl av nano läkemedel (1-10 mikrogram mAb) per väl testa antikroppsaktivitet och colligation. Använd 0,5 ug / brunn transferrinreceptor och HER2, respektive, såsom plattbelagd antigener och peroxidas-kopplade sekundära antikroppar.
- Beräkna uppnått% för AON, MPEG och mAb vad gäller äppelsyra (100%) och jämför med% avsett utformning (se exempel tabell 1 och tabell 2).
4. In vitro-testning
- Inkubera nano drogen med odlade cancerceller och mått överlevande celler över tiden genom att deras aktivitet för att reducera gul reagens [3 - (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfofenyl )-2H-tetrazolium, inre salt] (MTS) till ett blått färgämne och läsa relativ absorbans med en fotometer. Följ instruktionerna från satsen leverantören.
- Förbered cellextrakt in vitro eller ex vivo för Western blotting. Använd iskall utvinning bUffer som innehåller SDS och proteashämmare cocktail. Separata proteiner genom reducerande SDS-polyakrylamidgelelektrofores.
- Gör western blotting för proteiner av intresse i provextrakt. Använd sekundära antikroppar konjugerade med alkaliskt fosfatas.
- Använd konfokalmikroskopi att visa cellupptag och co-lokalisering av nano drogpolymer plattform, AON och endosomes hjälp av fluorescensmärkning. Bifoga Alexa Fluor 680 till nano konjugat plattform och Lissamine till AONs som fluorescens etiketter. Använd ett mikroskop 5X spektral scanner och levande cancerceller för att visualisera fördelningen av de märkta molekylerna
- Fläck endosome membran med styryl Röd fluorescerande färg och visa endosome colocalization eller utsläpp.
5. In vivo-testning
- Förbered mänskliga HER2-positiv bröstcancer musmodell (naken mus Tac: Cr: (MCR)-Foxnnm). Sätt i en 0,72 mg 17β-östradiol släppa pellets (90-dagars release) subcutaneously i halsen på varje mus.
- Injicera sedan 1 x 10 7 BT-474 tumörceller subkutant i den högra flanken och låta tumören växer.
- Starta behandling när tumörer är 120 mm 3 i storlek genom injicering i svansvenen 150 | il nano konjugat innehållande 2,5 mg / kg AON och / eller 4,5 mg / kg av varje antikropp. För behandling injicera två gånger per vecka, totalt sex gånger.
- Mät tumörstorlek med bromsok dubbelt så svaga och beräkna volymer med hjälp av formel (längd x djup x bredd) x (π / 6). Euthanize djur 2 veckor efter den sista injektionen och efter behandling med lugnande medel med en lösning av ketamin och Dexmedetomidin följt av cervikal dislokation.
- Isolera tumörer och fläcksektioner med H & E för morfologisk bedömning.
- För bedömning av läkemedelsdistribution på en djurskala, använd en fluorescens avbildningssystem. Injicera Alexa Fluor 680 märkta nano läkemedlet och bild vid 24 och 48 tim.
- Avliva djuret och upptäcka fluorescence i isolerade och perfusion tumörer och organ.
Representative Results
Hämning av humant HER2-positiv bröstcancer genom att tysta HER2-receptorn uttryck och blockerar HER2-signalering 12
Strategi
Bland olika former av mänsklig bröstcancer, HER2-positiva tumörer har den sämsta kliniska resultatet. Vi presenterar den framgångsrika behandlingen av humant HER2-överuttryckande bröstcancer i naken musmodell. Strategin innebär att nano drogen aktiv i både det omedelbara tysta av HER2 signalväg använder Herceptin och HER2-specifika AON för att blockera den beroende syntesen av receptorn HER2-mRNA (Figur 1). Den bly-nano-konjugat, som innehåller Herceptin och anti-HER2 AON visas i figur 3 tillsammans med två kontroller som saknar antingen Herceptin eller AON. Den lead innehöll anti-MsTfRmAb att uppnå aktiv extravasation av transcytos through bindning till endotel TfR av tumörkärlen. Mycket mindre upptag i tumören observerades i frånvaro av antikroppen och tillskrevs tumörberoende EPR-effekt 13. Fluorescerande versioner av nano konjugat innehåller Alexa Fluor 680 syntetiserades för imaging studier.
. Figur 1 Mekanism av AON leverans till HER2-positiva bröstcancerceller och tumörtillväxthämning övre vänstra hörnet:. Nano konjugat anpassas från figur 3. Nedre vänstra hörnet: Mouse tumörkärl uttrycker TfR på ytan. Nano läkemedel binder till receptorn och kommer in i tumören genom transcytos. Dessutom kan en viss grad av tillgång till tumören genom de oordnade endothelial lager som deltar i tumörberoende ökat upptag och retentipå (EPR) 13. Därefter binder nanodrug till HER2 uttrycks på humana cancerceller och internaliserar in tidiga endosomer. Bindande blockerar också HER2 signalväg. Efter mognaden av endosomes och deras försurning är endosome flyktmekanism nano drogen aktiverad. Nanodrug kommer in i cytoplasman frigörs från nano plattform genom reduktiv klyvning av disulfid-spacer och binder till HER2-mRNA blockerande HER2-syntes. Blockering av syntesen sträcker blockering av HER2-signalering och inducerar tumörtillväxthämning.
Mikrobiell produktion av den polyäppelsyra plattform
Nano-konjugat-plattformen, polyäppelsyra (PMLA), producerades av odlade microplasmodia av Physarum polycephalum och renas från buljongen enligt beskrivningen i protokollet och som visas i figur 2. Produktion och rening var jämna och reproducerbara. Det var viktigt att forts rol tid, pH och temperatur för att undvika spontan klyvning av polymeren. Noggrann tvättning och eluering av DEAE-kolonnen rekommenderas för att avlägsna DNA, kolhydrater, toxiner och färgat material. Extrem renhet erhölls efter upplösning i vattenfri aceton och ta bort olösligt material. Total mängd producerad PMLA var 5 ± 1 g per kampanj. Mängder av 1,5 ± 0,5 g högt renat PMPLA av Mw 80,000-100,000 var reproducerbart uppnås vid användning av 10 L bioreaktor. Sec-HPLC elueringsprofiler var symmetrisk. Dynamisk Ijusspridningsanalys enligt antalet distributioner angav en enda topp motsvarande en hydrodynamisk diameter på 8 ± 1 nm och ett polydispersitetsindex av PDI = 0,10 ± 0,02, beräknad av instrumentets programvara för förmodade sfäriska partiklar. Zeta-potentialen var -22 ± 2 mV (pH 7,5).
/ 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Produktion och rening av polyäppelsyra från odlade mikro plasmodier av Physarum polycephalum (anpassad från Lee et al. 9). Polyäppelsyra (PMLA) framställs av plasmodia av Physarum polycephalum i en bioreaktor och uppsamlades från odlingssupernatanten genom bindning på anjonbytare (DEAE). Elueringsmedlet etanolutfälldes såsom kalciumsalt. Lösningar av kalciumsaltet är Mw-fraktionerades över Sephadex-G25. PMLA innehållande fraktioner omvandlas från Ca-salt i syran över Amberlite IR-120H +. Den fria PMLA slutligen frystorkas för att ge torrt vitt pulver.
Kemisk syntes av ledningen nano-konjugat
P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%)
De schematiska strukturerna hos ledningen nano läkemedlet och av två prekursor nano konjugaten visas i figur ure 3. Blyet innehåller alla beståndsdelar, medan föregångarna var utformade för att sakna antingen AON HER2 eller antikroppen Herceptin. Förutom AON och mAbs, de föreningar som ingår polyetylenglykol, mPEG 5000, för att minimera bindning till plasmaproteiner, avslut genom retikuloendotelialsystemet (RES), och nedbrytning av enzymatisk klyvning. Antisense-sekvensen 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'var ett komplement till Her2-mRNA och har noggrant testats in vitro på flera HER2-uttryckande cellinjer för att med hög specificitet mot blockerar HER2 syntes och inte visa upp målgruppen effekter.
8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Nano konjugat för att behandla human HER2-positiv bröstcancer. Ledande nano läkemedel (övre struktur) innehåller två läkemedel (Herceptin, AON HER2). Versioner 2 och 3 endast innehåller ett av läkemedlen. Upptag av 1 och 2 i humana HER2-överuttrycktumörceller hanteras av bindning av Herceptin. Nano-konjugat 3, som inte innehåller Herceptin, fick anti-HuTfRmAb för endosome upptag av mänskliga celler. Den konjugering med Alexa Fluor 680 var frivillig för avbildningsändamål. Den röda stapeln representerar nano konjugat plattform PMLA / Loet (40%). % Indikerar den fraktion av äppelsyrarester som förbrukas i bindning av den indikerade liganden (totala mängden av äppelsyra rester i nanodrug = 100%).
Figur 4. Kemisk syntes av nanokonjugat P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Uppifrån och ner:. Syntes av PMLA-N-hydroxy succinimidylester (PMLA-NHS) i hängande karboxylater (kemisk aktivering). Ersättning av NHS genom amidbildning med 2-merkapto-1-aminoethan (2-MEA), metyl-PEG 5000-amin (mPEG 5000-NH 2), trileucin (LLL) eller leucin-etylester (Loet). Denna "preconjugate" fäster mAb-Mal-PEG-Mal av tioeter bildning och AON genom bildande av klyvnings disulfidbindningar. Leftover 2-MEA är maximerad bildar amidoethyl-ditio-propionsyra. Endast fastsättning av en enda mAb visas. Flera bilagor hanteras med hjälp av blandningar av mAbs. Andel% anger fraktioner av karboxylater bundna till olika ligander (100% gratis PMLA).
Nano konjugat syntetiserades såsom skisseras i fig. ure 4. Den beräknade molekylvikten av blyetKonjugatet var 719.000. Det totala utbytet av syntesen var 45 ± 5% med avseende på äppelsyrahalt. I genomsnitt av de 862 malyl enheter (= 100%) av den 100 kDa PMLA plattformen, 40% genom Loet, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% Herceptin och 0,2% anti MsTfR mAb. Beloppet för varje antikropp motsvarade i genomsnitt 1,7 molekyler per molekyl PMLA plattform. Den% konstruerad och% kontrolleras av gruppanalys var desamma inom ± 5%. Ett exempel är fallet i tabell 1 för beräkning av den experimentella halten av äppelsyra, AON, mAb och MPEG 5000 och i Tabell 2 visar en jämförelse med innehållet från designen. Den höga renhet enligt kriterierna i avsnitt 3 uppnåddes på grundval av höga reaktions avkastning och effektiv separation genom storlek utslagning (t.ex. gratis mAb och mAb-nanoconjugate separeras med 1 min på sek-HPLC), och selektiv löslighet i lösningsmedel. Aktiviteten av monoklonala antikroppar var visat att kvarhållas genom hela nanoläkemedelssyntes, och det bekräftades att de två typer av antikroppar som sammansattes på samma polymer-plattform. Resultatet av atypisk ELISA-experiment visas i figur ure 5. I allmänhet är de analyser för kvantitativ gruppanalys för äppelsyra, AON, protein, PEG och för ELISA var robust, vilket gav reproducerbara resultat när den anordnas av olika personal och instrumentering inte bara när det gäller den rapporterade syntes, utan även när de används för analys av andra syntetiserade nanoconjugates.
Tabell 1. Beräkning av nanodrug komposition med hänvisning till äppelsyrahalt.
668table2.jpg "width =" 600 "/>
Tabell 2. Jämförelse av experimentella nanoläkemedelskomposition med designad sammansättning.
Figur 5. ELISA för mätning av antikroppsaffinitet efter kemisk syntes, och för demonstration av multipel bindning av olika antikroppar. Nano läkemedlet innehåller antikropp mAb (A) och antikropp mAb (B) mot antigener A och B, respektive. ELISA-plattor beläggs med antigen (A). Fri mAb (A), fri-mAb (B), och nano läkemedel appliceras på ELISA-plattor. Efter tvättning antikropparna testades med sekundär peroxidas-kopplade antikroppar specifika för antingen mAb (A) eller mAb (B), medan endast mAb (A) är bunden till antigen (A). Det kan ses att fri och nano läkemedel konjugerat med mAb (A), och indirekt konjugerad mAb (B) i samma nanoläkemedelsmolekylen, men inte fri mAb (B), Kvarhålls på plattan. Koncentrationsberoendet visar jämförbara bindningsaffiniteter för fri och konjugerad mAb (A), vilket indikerar att den kemiska konjugeringen inte påverkade antikroppbindningsaktivitet. Dessutom samarligation av mAb (B) med mAb (A) på samma fysiska enhet (nano-plattform) leder antikropp mAb (B) upptäckt. De experimentella resultat som visas här avser anti-human TfRmAb (A) och anti-mus TfRmAb (B). Liknande resultat har visats för andra antikropps-par som testades, såsom anti-MsTfR mAb och anti-HER2-mAb (Herceptin).
Den fysikalisk undersökning visade hydrodynamisk diameter 22,1 ± 2,3 nm för P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (bly, två- drog version), 20,1 ± 2,4 nm för P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (AON drogen version) , och 15,1 ± 1,2 nm för P / MPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (den Herceptin drogen versionen). Zeta-potentialerna vid pH 7.5 Var i denna ordning -5.2 ± 0.4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, och -4,1 ± 0,4 mV. Det bör nämnas att den uppmätta hydrodynamisk diameter nano konjugat inte följde additiva diametrarna mätta gratis komponenter.
Leverans av nano läkemedel genom tumörcellmembranet och utsläpp i cytoplasman efter 0 timmar och 3h r
Leveransen av nano läkemedlet genom cellmembranet genom endosom upptag visas i figur ure 6 efter 0 tim och 3 tim. Fluorescens etiketter är fästa nanodrogplattform (Alexa Fluor 680, grön) och AON (Lissamine, röd). Deras superposition visas i paneler D & L och tillsammans med fluorescens av märkta endosomes (blå) i paneler G & O. Pearsons korrelationskoefficienter (R (r) beräknades från bilderna om co-lokalisering av plattform / endosomes, AON / endosomes, plattform / AON för 0 timmar och 3 tim. Than 3 tim bild indikerade frigivning från endosomes i cytoplasman och dissociation av AON från nano drogen genom glutation beroende disulfid klyvning i cytoplasman.
Figur 6. Konfokalmikroskopi för nano-konjugat upptag av målceller (anpassad från Ding et al. 11). Celler inkuberades under 30 min vid 37 ° C med nano läkemedel som hade dubbel märkt med Alexa Fluor 680 (grön) vid polymer plattform och med Lissamine (röd) fäst AON. Därutöver har endosomes färgas med FM1-43 (blå). Lokalisering visas efter 0 tim (A) och 3 h (B) inkubation. Paneler A, ab, & B, ij show färgning enbart av nano konjugat fluoroforer, ochderas co-lokalisering i A, cd & B, kl. Dessutom är färgning av endosomes visas i paneler A, E och B, m och samlokalisering av nano-konjugat och endosomesin panelerna A, fg & B, nej. Paneler A, H & B, p show fas kontrast för respektive paneler. (C) Pearsons korrelationskoefficienter R (r) för samlokalisering av plattforms-endosomes, AON-endosomes med plattform AON beräknat för 0 timmar och 3 tim. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Inhibering av human bröstcancer in vitro och in vivo
I tillväxt vitro hämning av HER2 överuttryck cellinje BT-474 i comrelse med låg uttryckande cellinjen MDA-MB-231 visas i Fig. ure 7. Graden av hämning är 50% och 30%, respektive, av den ledande nano konjugat P / mPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inhibering av de andra föreningarna är mindre men högre för BT-474 än för MDA-MB-231-celler. BT-474-cellinjen valdes för behandling av xenogen bröstcancer mus.
Figur 7. In vitro-tillväxtinhibering av HER2-överuttryck BT-474 bröstcancerceller och lågt uttryck MDA-MB-231-celler (anpassat från 12 Inoue et al.). Jämförelse av tillväxthämning för HER2-överuttryck BT-474 bröstcancercell-linje ( vänster) och av HER2 låg uttryck bröstcancercellinje MDA-MB-231 (till höger). TfR (s) betecknar anti-MsTfRmAb och TfR (Hu / Ms) betecknar anti-HuTfRmAb & anti-MsTfRmAb. Blyet nano drog, P / mPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms), och nano droger som saknar antingen Herceptin eller AON HER2 jämförs med PBS, Herceptin och AON HER2. I avsaknad av Herceptin, var anti-MsTfRmAb konjugerat att ge endosome upptag av tumörcellerna. Koncentrationerna var 40 mikrogram / ml med avseende på antikroppar, 4 ^ M med avseende på AON HER2, 4 ^ M endoporter (tillämpning av AON). Signifikans betecknad med *, P <0,05: **, P <0,02: ***, P <0,003 jämfört med PBS.
Resultaten av in vivo-behandling i fig. 8 visas för möss som bär BT-474 Her2-överuttryckande human bröstcancer. Tillväxten hämmades> 95% av den ledande nanodrug med Herceptin och HER2-specifika AON i jämförelse med kontroller som behandlats enbart med PBS (Fig. ure 8). Hämningvar 60% eller mindre med Herceptin enbart P / MPEG / Loet / Herceptin eller P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western blot-analys av tumörextrakt visade hämning av både HER2-syntes och Akt fosforylering, men ingen förändring av det totala Akt och hushållning enzymet GAPDH. PARP klövs i motsvarighet till en ökad grad av apoptos. Bilder av tumör efter behandling, och vävnadssnitt färgade med H & E åskådliggör tumörregression visas i figur ure 9.
Figur 8. Tumörstorlek och proteiner under behandling med bly och föregångare nano droger (anpassad från Inoue et al. 12). A. Tumörstorlek för de olika behandlingarna (dag 21 till dag 42, totalt 8 injektioner). Staplarna anger standardavvikelser från medelvärdet. Blyet konjugerat med anti-Her2 AON och Herceptin var överlägsen antingen Herceptin enbart eller enstaka läkemedel som innehåller nano konjugat. B. Effekten av de olika behandlingarna på uttryck av HER2, fosforyleras Akt, totalt Akt, PARB, klyvs PARB och GAPDH visas av Western blotting. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Behandling av HER2-positiv BT-474 human bröstcancer på nakna möss. Tumör regression och nekros / apoptos i vävnadssnitt (anpassad från Ionue et al. 12). Övre: Krympning av tumören (röda pilar). Uppgift om östrogen pellets för att stödja tumörtillväxt (blå pil). Lower: hematoxilin & eosin (H & E) färgning av tumörsektioner. Prolifererande tumör visas av den täta packningen av tumörceller. Nekrotisk vävnad ses där tumörcellerna har eliminerats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den experimentella väg för framställning av nano läkemedel från en biologiskt nedbrytbar polymer presenteras som kan användas i syntesen av personlig medicin. Beskrivningen startar med den kontrollerade produktionen och reningen av polyäppelsyra, som är en mångsidig plattform för nano läkemedelssyntes. Använda reproducerbara tekniker är den erhållna polymeren med hög molekylvikt och i extrem renhet lämplig för farmaceutiska synteser. Syntesen beskrivs för en nano läkemedel som visat sig effektivt behandla HER2-positiv bröstcancer. Beskrivningen kan översättas till synteser av de flesta andra droger nano för behandling av cancer. Targeting innebär antikroppar såsom Herceptin som binder ett tumörspecifikt antigen såsom HER2 protein eller någon annan tumörmarkör som effektivt intern. Nano drog levererar ett urval av antisens-oligonukleotider och kemoterapeutika som effektivt kommer att inhibera tillväxten av cancern enligt Treatment. I exemplet, Herceptin binder till HER2 och specifik antisenseoligonukleotid glödgning med HER2-kodande mRNA ledde ihållande blockering av HER2-signalering och kraftig minskning av HER2-positiv bröstcancer. Baserat på den underliggande principen för tumör målinriktning och hämning av genexpression genom antisense oligonukleotider har vi uppdaterat syntetiserat flera andra nano droger och framgångsrikt hämmade prekliniska mänskligt glioblastom och trippel-negativ bröstcancer 11,14-18.
Den syntetiska Arbetet inleds med utarbetandet av högt renat nanodrogplattform, vilket är polyäppelsyra från odlingssupernatanten av Physarum polycephalum (en art av "slemsvamp" familj). Framställningen betonar höga molekylvikter för den polymer, i princip gör det möjligt att ansluta olika antikroppar, peptider, oligonukleotider och andra molekyler som fungerar i aktiv läkemedelstillförsel och tumörtillväxthämning. Following kontrollerad odling och rening, har reproducerbar kvalitet av polymer i förutsägbara avkastning producerats. Polymeren lagras under lämpliga förhållanden för någon tid.
Syntesen av PMLA nano konjugat börjar med kemisk aktivering av polymer-hängande karboxylater sker i några syntetiska steg. I mellan stegen, kan syntes valfritt vänt möjliggör beredning av godtyckliga mängder intermediärer och därmed kan användas i upp skalning. Framskridandet av syntesen följs med TLC och SEC-HPLC, och både sammansättning och aktivitet av nano drogen styrs av gruppspecifika kvantitativa kemiska analyser, ELISA, och en variation av fysikaliska mätningar. Vår erfarenhet är att dessa synteser har gått smidigt och reproducerbart med utmärkta utbyten och renhet. Genom att välja specificitet antikropp och antisensoligonukleotider någon variant av nano läkemedel är gynnsamt syntetiseras som behövs i personalized medicin.
Arbetsformerna för framgångsrik behandling av humant HER2-positiv bröstcancer är giltiga representanter för beredning av cancer mus modeller, tillämpning av nano droger, bildbehandling och analys av tumörtillväxt. Resultaten av in vitro-viabilitet tester är användbar i valet av cellinje och det ledande läkemedlet som skall användas i djurexperiment. In vivo Xenogen avbildning validerar att nano läkemedlet verkligen avges till tumören. Resultat av Western blotting avslöjar huruvida nivån av vissa proteiner reagerade i den förutsagda mode under cancerbehandling. Mätningar av tumörstorlek informerar om framgången med behandlingen, dvs om hämning, recession eller regression. Det beskrivna exemplet återspeglar vår erfarenhet med andra polyäppelsyra baserade nano droger tyder på en hög grad av förutsägbarhet, reproducerbarhet och frånvaro av anmärkningsvärd toxicitet. Nya resultat på toxicitet och effekt för flera targeted polyäppelsyra konjugat för trippel-negativ bröstcancer behandling är i starkt stöd för denna uppfattning 18. En viktig egenskap är att vår nano drog kan tränga biologiska hinder: den endothelial barriär genom extravasation in i tumören interstitiell, tumörcellmembran genom endosome upptag, och endosommembransönderbrytning enligt beslut av leucin etylester eller trileucin grupper. Extravasering och endosome upptag tillförlitligt uppnås genom de specifika antikroppar kopplade till nano drogen. Anti-mus transferrinreceptor antikropp förmedlar effektivt tillströmning i tumören genom transcytos, förmodligen för att receptorn är överuttryckt på de flesta tumörkärl. En annan antikropp fäst på samma nano konjugatmolekyl funktioner specifikt rikta nano drogen i mottagaren tumörcellen. Förekomsten av både antikroppar, är det en för transcytos och den andra för endosome upptag, en förutsättning för optimal funktion. Kvantitativ analys av malic syra och antikropp rekommenderas för att kontrollera optimala sammansättningen av nano drogen. Slutligen bör det noteras att den allt-i-ett kovalent nano drog levererar läkemedel i kemiskt bifogade formuläret väg genom värdkärlsystemet i mottagaren tumörcellen. Kemisk infästning gör de flesta läkemedel inaktiva (prodrugs) tills de är färdigberedda som fria läkemedel genom klyvning från nano-konjugat plattformen på den riktade platsen. Detta är viktigt eftersom reaktive modalitet ger en hög grad av säkerhet vid leverans och en minimal chans att framkalla skadliga biverkningar. Mångsidighet, effekt och säkerhet är nödvändiga attribut för god personlig medicin.
Disclosures
Författarna Julia Y. Ljubimova, Keith L. Svart, och Eggehard Holler är aktieägare i Arrogene Technology Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| 90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
| Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
| Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
| Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
| Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
| Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
| Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
| Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
| GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
| Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
| Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| Herceptin | Genentech | 15534 | |
| Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
| IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
| Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
| Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
| L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
| Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
| Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
| Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) | Invitrogen | LC3675 | |
| Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
| Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
| Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | Proteochem | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
| Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| Dexmedetomidine | Pfizer | ||
| Atipamezole | Pfizer | ||
| Carprofen | Pfizer | ||
| Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |
References
- Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
- Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).
- Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
- Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
- Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. , (2013).
- Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
- Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. , Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).
- Lee, B. -S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
- Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
- Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
- Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
- Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
- Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
- Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
- Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).
