Summary
Mastceldegranulering, de vrijlating van allergische mediatoren, is belangrijk bij allergie, astma, en parasiet defensie. Technieken 1 voor de beoordeling van effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen op degranulatie Hier laten we zien, methodologie onlangs gebruikt om de krachtige remmende effect van antibacterieel middel triclosan 2 vertonen.
Abstract
Mestcellen spelen een belangrijke rol bij allergische ziekten en immunologische afweer tegen parasieten. Eenmaal geactiveerd (bijvoorbeeld door een allergeen), zij degranuleren, een proces dat resulteert in de exocytose van allergische mediatoren. Modulatie van mestceldegranulatie door geneesmiddelen en toxische stoffen kunnen positieve of negatieve effecten op de menselijke gezondheid hebben. Mestcel functie ontleed in detail het gebruik van rat basofiele leukemie mestcellen (RBL-2H3), een algemeen aanvaard model van menselijke mucosale mestcellen 3-5. Mestcel granule component en allergische mediator β-hexosaminidase, dat lineair wordt vrijgegeven samen met histamine uit mestcellen 6, eenvoudig en betrouwbaar kunnen worden bepaald door reactie met een fluorogeen substraat, waardoor meetbare fluorescentie-intensiteit in een microplaat test die vatbaar is voor high-throughput studies 1. Oorspronkelijk gepubliceerd door Naal et al.. 1, hebben we deze degranulatie assay aangepast voor de screening of geneesmiddelen en toxische stoffen en demonstreren het gebruik ervan hier.
Triclosan is een breed-spectrum antibacterieel middel dat aanwezig is in vele consumentenproducten en is gevonden om een therapeutisch hulpmiddel bij humane allergische huidziekte 7-11, hoewel het mechanisme voor dit effect is niet bekend. Hier laten we een test voor het effect van triclosan op mestcel degranulatie. We toonden onlangs aan dat triclosan sterk beïnvloedt mestcel functie 2. In een poging om het gebruik van een organisch oplosmiddel te voorkomen, triclosan direct opgelost in een waterige buffer met warmte en roeren, en de resulterende concentratie wordt bevestigd met UV-Vis-spectrofotometrie (met ε 280 = 4.200 L / M / cm) 12. Dit protocol heeft het potentieel om te worden gebruikt met een verscheidenheid van chemicaliën om hun effecten op mestcel degranulatie bepalen, en meer algemeen, de allergene eigenschappen.
Introduction
Mestcellen zeer kristalsuiker immuuneffectorcellen die dienen als belangrijke bemiddelaars bij astma, allergieën, parasieten defensie en carcinogenese 13-16. Zij verblijven in bijna elk gevasculariseerd weefsel 15, waar ze veilig allergische en inflammatoire mediatoren slaan in cytoplasmatische korrels totdat geactiveerd om degranuleren. Degranulatie is de exocytose van membraan-gebonden korrels, waardoor de afgifte van farmacologisch werkzame mediatoren zoals histamine, tryptase en leukotriënen 15. Dit proces resulteert in de opening van type I overgevoeligheidsreacties die kritisch montage verdediging tegen parasieten als inleiding allergische, astmatische en carcinogeen reacties 15.
Mestcellen en basofielen expressie FcsRI receptoren, de hoge affiniteit receptoren voor immunoglobuline E (IgE) 17. Blootstelling aan een allergeen of antigen veroorzaakt aggregatie van meerdere IgE-receptoren gebonden FcsRI 17, en het is deze so zogenaamde "crosslinking" of IgE gebonden Fc receptoren die de degranulatie initieert: een cascade van tyrosine fosforylatie gebeurtenissen, de activering van fosfolipase C, efflux van calcium uit interne opslag en instroom van calcium in de cel 18. Dit calcium influx is noodzakelijk voor degranulatie en voorts signalen granule fusie met het membraan voor het veroorzaken granule exocytose 15. Experimenteel kan een calciumionofoor worden gebruikt shuttle calcium direct over het celmembraan 19, dat in wezen alle omzeilt signaaltransductie stappen vóór de calcium influx stap 20, voor de identificatie van een route doel door een giftige stof als stroomopwaarts of stroomafwaarts van calcium signalering 20.
Degranulatie kan snel en effectief worden gemeten door het volgen van het vrijkomen van β-hexosaminidase in cel supernatant, die lineair vrijkomt uit de granules samen met histamine 6, maar iis veel gemakkelijker te detecteren met behulp van een eenvoudige enzym-substraat reactie en een microplaat lezer assay het fluorescerende product. Dit microplaat test, zoals beschreven in de paragraaf protocol is gebaseerd op een robuuste methode oorspronkelijk ontwikkeld door Naal et al.. 1, waarbij de splitsing van het fluorogene substraat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide kwantificeert door β- hexosaminidase. We hebben de test aangepast om te testen effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen, met triclosan gemarkeerd hier. Deze methode betrouwbaar kwantificeert degranulatie, is een goedkoop alternatief voor bijvoorbeeld flowcytometrische gebaseerde detectiemethoden 21, en heeft de potentie om zich goed lenen voor high-throughput screening van een groot aantal anti-allergische geneesmiddelen, alsmede immuno of allergene stoffen. Dit laatste punt is bijzonder belangrijk in het licht van de 2007 National Research Council rapport "Onderzoek naar de toxiciteit in de 21e eeuw: Een visie en een Stratgie "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), die pleit voor de ontwikkeling van high-throughput toxicologische tests die celcultuur gebruiken om het kostbare gebruik van traditionele proefdieren zoals muizen te verminderen. De degranulatie protocol ontwikkeld door Naal et al.. 1 en gewijzigd door ons 2, maakt gebruik van de RBL-2H3 cellijn, die een goed geaccepteerd model homoloog aan menselijke mucosale mestcellen of basofielen 3-5. (Werkwijzen voor het kweken van RBL-2H3 cellen zijn beschreven in Hutchinson et al.. 22). Deze test kan waarschijnlijk worden aangepast aan elke aangesloten mast celtype.
Triclosan (TCS) is een breed-spectrum antimicrobiële die is gebruikt voor meer dan 30 jaar in ziekenhuizen, producten voor persoonlijke verzorging, en consumptiegoederen 23,24. De werkingswijze van antimicrobiële eigenschap TCS is de remming van vetzuur-biosynthese, waarschijnlijk door remming enoyl-acyldragereiwit reductase 25,26. Het is wereldwijd te vinden in een breed scala van consumentenproducten, zoals douchegel, handcrème, tandpasta, mondwater, en in de hand zepen bij concentraties tot 0,3% of 10 mM 24. Wijdverbreide gebruik van TCS heeft geresulteerd in detecteerbare niveaus in mensen 27-29 en in rivieren en beken 30. Een studie uitgevoerd door Allmyr et al.. 27 aangetoond dat TCS en zijn metabolieten aanwezig in zowel het plasma en melk van zogende moeders zijn. Belangrijker is TCS gemakkelijk geabsorbeerd in de huid 31-37. Queckenberg et al.. Gevonden 37 ~ 10% opname van een ~ 70 mM TCS room in menselijke huid binnen 12 uur, met een aanzienlijke concentratie in de huid, waar de mast cellen verblijven.
TCS is klinisch aangetoond dat de mens allergische huidziekte 7-11 beheren, maar het mechanisme waardoor TCS verlicht allergische huidziekten is onbekend 38 geweest. Met behulp van de fluorescerende microplate assay detailed in deze video, we onlangs aangetoond dat TCS, bij concentraties zo laag als 2 pM aanzienlijk gedempt mestcel functie en degranulatie, die een mogelijke verklaring voor deze klinische gegevens 2. Naast het leveren van een verklaring voor deze klinische data, onze bevindingen in Palmer et al.. 2 suggereren dat TCS richt signaalmoleculen stroomafwaarts van calcium influx. Vanwege het belang van calcium signaling in vele immunologische en andere biologische processen zouden TCS mogelijke nadelige effecten op een grote verscheidenheid van biologische processen noodzakelijk. In feite, Udoji et al.. 39 toonde aan dat TCS onderdrukt menselijke natuurlijke killer cel lytische activiteit, een andere belangrijke aangeboren immuunsysteem.
Naast zijn potentieel als een therapeutisch hulpmiddel bij allergische huidziekte (of, omgekeerd, als immunotoxicant) kan TCS ook endocriene verstoorder is 40-49. Zo, een duidelijke procedure over hoe dit chemisch bereiden in oplossing is van belang zijn voor toxicologen. Omdat TCS is een klein hydrofoob molecuul, zijn organische voertuigen vaak gebruikt om het meer in water oplosbaar te maken. In de meeste toxiciteit wanneer TCS is getest, is betrokken preparaat oplossing in water met behulp van een organisch oplosmiddel zoals ethanol, aceton of olie 2,50,51. Echter, vaak tijden deze oplosmiddelen zijn biologisch actieve zelf, daardoor bemoeilijkt de interpretatie van de test chemische gegevens 51. In feite, volgens Rufli et al.. 52 en 53 anderen, wordt aanbevolen dat testoplossingen voor aquatische toxiciteit experimenten worden bereid met fysische werkwijzen via chemische werkwijzen vanwege de mogelijke chemische oplosmiddelen toxiciteit voorwerpen creëert. We hebben eerder aangetoond dat TCS opgelost in 0,24% ethanol / water (vol / vol) en gesoniceerd gedurende 30 min dempt RBL mestcel degranulatie 2. Ethanol bij hogere concentraties dan 0,24% is aangetoond mast cell afbraak dempennulation 54,55-voorbeelden van de potentieel verstorende effecten van organische oplosmiddelen op toxiciteit.
Niet alleen is het belangrijk om het effect van oplosmiddelen op het organisme of cellen voor onderzoek beschouwen, maar het is ook belangrijk om het effect van een oplosmiddel toezicht op de teststof zelf. Bijvoorbeeld, Skaare et al.. 51 vonden dat oplossen TCS in polyethyleenglycol (vaak gevonden in tandpasta en mondwater) verzwakt anti-bacterieel en anti-plaque effecten bij gezonde vrouwelijke vrouwen, terwijl oplossen in olie als gevolg van een volledig verlies van functie. Daarom is het vermogen van verschillende oplosmiddelen te moduleren ingedeeld en geneesmiddelen met inbegrip TCS, het effect worden overwogen in deze ontwerpen. Gebruik van oliën of smaakstoffen kunnen interfereren met de effecten van TCS in diverse producten 50,51.
In een poging om de noodzaak om organische oplosmiddelen te elimineren, verbeterde we op onze werkwijze voor het oplossen TCS 2 door het elimineren van het gebruik van een organisch solventileren. In het huidige protocol, ontbinden we TCS korrels direct in waterige buffer met warmte (≤ 50 ° C), en controleer de concentratie van deze TCS voorraad door UV-Vis spectrofotometrie. Deze verbeteringen zijn mogelijk omdat TCS is oplosbaar in water tot 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) en is aangetoond dat afbraak weerstaan bij verhitting tot 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. We hebben ook het extra voordeel van UV-Vis spectrofotometrie als bedrijf ook bekend dat sterk absorbeert bij 280 nm 58 met een molaire extinctiecoëfficiënt van 4200 L / mol / cm 12.
Dit protocol voorziet in een eenvoudige, maar effectieve manier om TCS korrels oplossen in een buffer zonder de hulp van een organisch oplosmiddel, zoals lage kosten en snelle verificatievan de concentratie, en beschrijft een krachtige fluorescerende microplate assay voor de monitoring chemische effecten op mestceldegranulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk op dat alle buffer recepten in een tabel aan het eind van het protocol tekst.
DAG 1:
1. Bereiding van Cellen
- Plan uit 96-well plaat setup regeling, centreren proefmonsters op de lay-out, om randeffecten te vermijden. Allocate triplo voor elke geteste concentratie TCS (± degranulatie stimulerende antigeen of ionofoor), alsmede drievoud voor spontane afgifte (geen degranulatie stimulerend), maximale afgifte (0,2% Triton X-100 [TX] detergent lysis), en wells gereserveerd voor achtergrond monsters (die geen cellen bevatten). Voor elke repliceren experimentele dag, kies een nieuwe gerandomiseerde indeling van de TCS monsterconcentraties.
- Warme RBL media (recept verstrekt in tabel) en trypsine in 37 ° C waterbad.
- Controleer RBL cellen in T-25 kolf (2-4 dagen sinds vorige passage en minder dan 3-4 maanden, omdat ze werden ontdooid) voor algemene tekenen van goed genezenth: juiste pH aangegeven door de kleur van de media, en het ontbreken van bewolking. Plaats de kolf onder een lichtmicroscoop te bevestigen dat de kolf vrij is van verontreinigingen en dat de cellen worden weergegeven gezonde, goed confluent, en meestal bevestigd. Merk op dat de cellen moeten worden gecontroleerd op besmetting met mycoplasma ongeveer elke zes weken 22.
| Behandeling | Triplo |
| Gestimuleerd, 0 uM TCS | A7, B7, C7, F4, G4, H4 |
| Gestimuleerd, 0.001 uM TCS | F6, G6, H6 |
| Gestimuleerd, 0.1 uM TCS | A4, B4, C4 |
| Gestimuleerd, 1 uM TCS | A6, B6, C6 |
| Gestimuleerd, 5 uM TCS | F5, G5, H5 |
| Gestimuleerd, 10 uM TCS | A3, B3, C3 |
| Gestimuleerd, 15 uM TCS | A5, B5, C5 |
| Gestimuleerd, 20 uM TCS | F7, G7, H7 |
| Gestimuleerd, plus hoogste [TCS] | F3, G3, H3 |
| Spontane, No TCS (inclusief bespot) | A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8 |
| TX-100, No TCS | D10, D11, D12, E10, E11, E12 |
| Geen Cellen, achtergrond, plus hoogste [TCS] | G10, G11, G12, H10, H11, H12 |
Klik hier voor grotere afbeelding .
- Neem de RBL cel kolf in de steriele weefselkweek (TC) kap. De cellen worden aan het bot bevestigdtom van de kolf. Werken onder de TC kap en met behulp van standaard steriele techniek, verwijder al het papier uit fles met steriele pipet, de cellen blijven gehecht aan de bodem van de kolf. Vervolgens afspoelen flacon met 2 ml trypsine, gooi deze wassen.
- Voeg exact 2 ml trypsine tot bodem van de kolf te dekken. Zet in 37 ° C incubator gedurende 5 minuten om de cellen los van de bodem van de kolf.
- Na 5 min, raakte de zijkant van de kolf met een open handpalm om cellen los te maken. Onmiddellijk, voeg 18 ml RBL media om cellen te wassen de kolf en het trypsine te lessen. Onmiddellijk de cel-media-trypsine mengsel uit de kolf en over te dragen aan een nieuwe, steriele 50 ml buis (het totale volume in deze buis is nu 20 ml).
- Na mengen voorzichtig maar grondig verwijderen 50 pi celsuspensie van deze buis, en naar een 1,5 ml steriele microcentrifugebuis, een monster te tellen. Neem dit voorbeeld, evenals de 50 ml0; buis die de cel-media-trypsine mengsel uit de TC kap aan de stationaire.
- Spin de 50 ml buis in centrifuge (met de juiste balans) gedurende 8 min bij 500 xg; deze kracht pellets cellen effectief.
- Gedurende de rotatie tijd tellen van de cellen in het monster die geïsoleerd vóór het spinnen. Hiertoe eerste 50 pi trypan blauwe kleurstof toevoegen 50 pi cellen in 1,5 ml buis en voorzichtig maar grondig pipet op en neer 5x te mengen. Onmiddellijk overdracht 10 ul van dit mengsel op het glas hematocytometer en tellen cellen in het raster verdeeld volgens instructies van de fabrikant. Tel ten minste 100 cellen voor redelijke statistische resultaten.
- Terug in de TC kap, verwijder supernatant van cellen die werden afgedraaid.
- Cap de cel buis en flick pellet op de bodem van de buis om cellen los te maken.
- Media aan getrypsiniseerd cellen een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen / ml op basis van het aantal cellen opleveren. Meng goed maar voorzichtig aan cellen gesuspendeerd tijdens het bekledingsprocede houden. Met een Pipetman, zet 100 ul cellen / putje in een 96-well plaat (platte, zwarte bodem), naar aanleiding van de plaat sjabloon vel. Randomize hoe de cellen worden toegevoegd aan de wells aan systematische fout, en meng na elke set van drie putten te vermijden wordt toegevoegd. Zorg ervoor dat cellen niet om te zetten in de putten gelabeld voor de achtergrond van monsters.
- Als alle cellen zijn overgedragen, plaatst de plaat deksel op de plaat, en over te dragen aan de incubator (37 ° C / 5% CO 2) 's nachts. Opruimen na standaard steriele techniek.
DAG 2:
2. Bereiding van Triclosan
- Met behulp van een maatcilinder, maatregel 250 ml Tyrodes Buffer (recept gegeven in tabel) in een 500 ml Erlenmeyer kolf label "TCS-buffer. 'Toevoegen roerstaafje. Gebruik glaswerk, roer bar, aangewezen voor gebruik met TCS thermometer.
- Ook op dit moment, maatregel 250ml Tyrodes in een aparte 500 ml erlenmeyer, met het label "controle buffer." Gebruik glaswerk, roer bar, thermometer die niet zijn aangewezen voor TCS. Voeg een roerstaafje.
- Weeg 0,0022 g TCS korrels en over te dragen aan "TCS-buffer" fles (die 250 ml Tyrodes Buffer bevat). Om efficiënt korrels dragen aan erlenmeyer, gebruiken 10 ml van de gemeten 250 ml Tyrodes te wassen wegen boot, zorg ervoor dat alle TCS is overgedragen.
- Place "TCS-buffer" kolf op een combinatie kookplaat / magnetische roerplaat, en zet deze om te roeren bij een beheersbaar hoge snelheid. Eenmaal goed gemengd, zal dit TCS voorraad nominaal zijn 30 uM (feitelijke concentratie wordt berekend na verhitting). (Hebben alle mixen in een zuurkast.)
- Ook op dit moment, plaats de "control buffer" kolf (die geen TCS) op een tweede combinatie kookplaat / magnetische roerplaat, en zet deze om te roeren met een vergelijkbare snelheid.
- Schakel de UV / Vis lamp op te warmen de lamp voor later gebruik.
- Verhit de "TCS-buffer"-oplossing tot 50 ° C onder voortdurend roeren. Eenmaal op temperatuur, tijd 90 minuten. Tijdens de 90 min, blijven controleren 50 ° C temperatuur en passende roersnelheid vaak.
- Tegelijkertijd, verwarm de "control buffer"-oplossing (dat slechts 250 ml vlakte Tyrodes buffer) tot 50 ° C onder voortdurend roeren. Bij het bereiken van 50 ° C, de tijd voor 90 min, gedurende welke tijd de temperatuur (houd bij 50 ° C) en roeren beide bewaakt.
- Aan het einde van de 90 min, neem beide erlenmeyers van de kookplaten en transfer naar de stationaire.
- Met de golflengte scanfunctie op een UV / Vis spectrofotometer blanco de machine 1 ml van de verwarmde "controlebuffer" oplossing voor het scannen 1 ml verwarmd "TCS-buffer" oplossing. Controleer de vorm van het spectrum, eend opnemen extinctie bij 280 nm. Om de concentratie te bepalen, gebruiken de Beer-Lambert vergelijking (A 280 = ε 280 ℓ c) met behulp van een ε 280 van 4200 L / mol / cm 12 en ℓ van 1 cm.
- Na bepalen van de concentratie TCS, voeg 0.249 g runderserumalbumine (BSA) aan de resterende 249 ml van de "TCS-buffer"-oplossing en meng.
- Tegelijkertijd, voeg 0.249 g BSA om de resterende 249 ml "controlebuffer" oplossing en meng.
DAG 2:
3. Antigeen-gestimuleerde degranulatie assay gebruik RBL-2H3 cellen
- Voordat u begint, controleer de pH van alle buffers worden gebruikt, en ervoor zorgen dat ze zijn duidelijk en niet bewolkt is: dit omvat Tyrodes buffer, natriumacetaat buffer, en glycine carbonaat buffer (recepten verstrekt in tabel).
- Warme RBL media en trypsine in 37 ° C waterbad.
- Voeg BT (1 mg / ml0, BSA in Tyrodes buffer): 0,05 g BSA + 50 ml Tyrodes buffer (X2). Doe in 37 ° C waterbad.
- Voeg 0,2% Triton X-100: 3.136 ml BT + 64 ui 10% Triton X-100 (eindconcentratie van Triton X-100 0,2%). Meng goed door, maar niet vortex. Doe in 37 ° C waterbad.
- Start voorbereiding van de TCS en verwarmde Tyrodes buffer (stappen "2," hierboven). Opmerking: Gebruik de volgende stap (IgE belichting) niet starten totdat het "TCS-buffer" en "controle buffer" oplossingen te bereiken 50 ° C en roer voor de eerste 70 min van de 90 min warmte / roeren tijd.
- Zodra beide oplossingen werden bij 50 ° C gedurende 70 min geroerd, samenstelling 0,1 ug / ml anti-DNP IgE muis (Sigma) in RBL media voor monsterhouders zijn gesensibiliseerd (100 ul / putje). IgE voorraad mag niet ouder zijn dan 30 dagen indien bewaard bij 4 ° C; registreren hoe oud de voorraad is. Flick te mengen, maar niet vortex IgE.
- Onder een TC kap,voeg 0,6 pl IgE voorraad (voorraad is 1 mg / ml) tot 6 ml RBL media in een 50 ml buis. In een tweede buis 50 ml, voeg 6 ml van alleen platte RBL media (dat is bestemd voor nonsensitized monsters).
- Dump alle media van 96-well plaat (dat is opgesteld op dag 1) in de gootsteen, en breng de plaat onder de TC motorkap.
- Willekeurig 100 gl medium / IgE mengsel putten die worden gestimuleerd (48 wells totaal) toegevoegd. Dit mengsel is niet bedoeld voor "spontane", "TX," en "achtergrond" samples.
- Willekeurig 100 ul vlakte RBL media toe alleen "TX", "spontaan," en "achtergrond" bronnen.
- Doe plaat deksel op de plaat, en verplaats plaat in 5% CO 2/37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Gedurende 1 uur incubatie, volgt u de stappen 3,13-3,24.
- Op de werkbank, bereiden het antigeen verdunningen. Voeg 0,53 ul van 1,6 mg / ml voorraad DNP-BSA + 850 pl & #160, BT een antigen concentratie van 1 ug / ml te krijgen. Vortex en keer deze voorraad te mengen.
- Once "TCS-buffer" en "control buffer" zijn verwarmd en vervolgens gedurende 90 min bij 50 ° C, verder met de rest van de voorbereiding van de TCS protocol (ga naar stap 2.6 - 2.8.1). Nadat de BSA wordt opgelost in beide oplossingen, verder hieronder.
- Beginnen met de voorbereiding van de blootstelling buffers, met ± Ag, ± TCS. Ten eerste, de 249 ml van "TCS-buffer"-oplossing (reeds verwarmd en gedurende 90 min), 50 ml overgang naar een nieuwe 50 ml conische buis. Verwijder 20 ul van deze 50 ml aliquot en vervangen door 20 pl van de 1 ug / ml antigeen bereid eerder een uiteindelijke antigen concentratie van 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex en zwenken.
- Label deze "Buis 1, Hoge TCS / + Ag / + BT." Het wordt gebruikt voor verdunningen en hoogste TCS blootstellingsconcentratieverplichting.
- Van de 249 ml monster van "controle buffer"-oplossing, dragen 50 ml van een nieuwe 50 ml buis. Verwijder 20 ul van deze nieuwe 50-ml aliquot en vervangen door 20 pl van de 1 ug / ml antigeen bereid eerder een uiteindelijke antigen concentratie van 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex en zwenken.
- Label deze "Tube 2, No TCS / + Ag / + BT". Gebruikt voor TCS verdunningen en 0 uM TCS blootstellingsconcentratieverplichting.
- Neem nu uit 50 ml "TCS-buffer"-oplossing en in een andere 50-ml tube. Verwijder 20 ul van deze nieuwe 50-ml aliquot en te vervangen door 20 ui vlakte BT. Vortex en zwenken. Geen antigeen toegevoegd.
- Label deze "Tube 3, High TCS / Nee Ag / + BT." Dit wordt gebruikt voor de achtergrond.
- Overdracht van 50 ml "control buffer" oplossing voor een ander 50-ml tube. Nemen 20 ul van deze ne w 50-ml aliquot en te vervangen door 20 ui vlakte BT. Vortex en zwenken. (Geen Ag wordt toegevoegd.)
- Label deze "Buis 4, No TCS / Nee Ag / + BT." Dit wordt gebruikt voor de achtergrond en spontane monsters.
BSA TCS Antigeen Buis 1 
Hoog [] Buis 2 NO Buis 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Hoog [] NO Tube 4 NO NO - Bereken en registreer volumes verdunningen na de concentratiebepaling van de "TCS-buffer" stock. Totale volume voor elke verdunning concentratie moet 1 ml en moet worden bereid in een steriele microcentrifugebuis. Gebruik gekalibreerd P2 en P1000 Pipetman.
Concentratie Hoge Triclosan + Tyrodes + BSA 0,0004 ug / ml Ag
(Beeldbuis 1 van boven)Verwarmd BT 0,0004 ug / ml Ag
(Buis 2 van boven)20 uM 10 uM 5 uM 1 uM 0.1 uM 0.001 uM 0 uM (bovenkant van de plaat) ----------------------- 500 pi plus nog eens 500 ul 0 uM (onderkant van de plaat) ----------------------- 500 pi plus nog eens 500 ul - Na 1-uur IgE incubatie, neem plaat uit incubator en gooi alle media in de gootsteen. (Opmerking: als test-chemicaliën worden bekend te zijn giftiger dan het consumentenproduct TCS, kunnen gevaarlijk afval nodig zijn.)
- Met behulp van een Combitip, willekeurig cellen wassen in de 96-well plaat met BSA-Tyrodes Buffer (200ul / putje). Laat de wasbuffer op de zijkanten van de putjes, in plaats van direct op de gehechte cellen, om te voorkomen dat verstoring van de aangehechte cellen. Herhaal dit proces een tweede keer.
- Voor behandelingen samen voor de toepassing, vortex en zwenken verdunningen vlak voor toevoeging aan de plaat.
- Vanaf de bovenkant van de plaat: Willekeurig drievoud van 200 pl elk van de antigeen oplossingen (met de juiste concentraties TCS) aan de desbetreffende putjes. Doorgaan naar onderkant van de plaat. Voeg "controlebuffer"-oplossing plus Ag (van "Tube 2" boven) om alle 'spot' op het bord.
- Voeg 200 ul van passende oplossingen voor overeenkomstige putten:
- Voeg 200 ul van 0,2% Triton X-100 "TX"-aangegeven putjes.
- Vervolgens, voeg 200 ul van Tube 3 om de 3 putten label "Achtergrond (Bkgd)-Hoogste TCS" op het bord.
- Tot slot, voeg 200 ulTube van 4-6 wells label "Spontaneous."
- Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Gedurende 1 uur incubatie: Verkrijg twee emmers ijs (een voor de "oude" plaat in incubator en een voor de nieuwe plaat). Dooi 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glucosaminide (4-MU) bij kamertemperatuur gedurende maximaal 40 minuten, het in folie omdat het lichtgevoelig.
- Zodra 4-MU is voorraad ontdooid, make up 4-MU werkende oplossing: 150 ul voorraad + 14,85 ml koud acetaat buffer (recept gegeven in tabel), vortex en zwenken. Houd in 50 ml centrifugebuis, verpakt in folie en op ijs tot gebruik.
- Met behulp Combitip, willekeurig voeg 100 ul koud 4-MU werkende oplossing in de bodem van elk putje van een NIEUWE Grenier zwarte 96-well plaat (op ijs emmer # 2). Beginnen bij het toevoegen van de werkoplossing willekeurig binnen de bovenzijde van de plaat, willekeurig in de bodem van het schaaltje, willekeurig in Triton X-100 putten,en tenslotte willekeurig binnen achtergrond putjes.
- Ga uit nieuwe doos van P200 tips voor de volgende stap.
- Aan het einde van de 1-uur incubatie, zet cell plaat uit incubator op ijsemmer # 1, pipet supernatant omhoog en omlaag 4-5x (voorzichtig, niet introduceren bubbels), die rond de put voor een goede menging, maar niet aanraken van de cellen tijdens het mixen . Systematisch, neem 25 ul monster uit elk putje en plaats in de nieuwe plaat met substraat (zelfde bestellen van monsters, zoals oorspronkelijk gepland). Pipet op en neer om te proeven grondig te mengen wanneer in nieuw goed, zonder dat er luchtbellen.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Na 30 min incubatie, willekeurig voeg 200 ul van koude glycine-carbonaat buffer per putje (met behulp Combitip) om putten te vullen tot 325 ul totaal. (Voeg deze toevoeging aan de Triton X-100 samples laatste, naar Triton X-100 spillover te vermijden). Controleer of bellen voordat leesplaat (poke met schone P10 pipette tip om eventuele luchtbellen pop).
- Draaien de plaat in de fluorescentieplaatlezer (ga naar hoofdstuk 4).
DAG 2:
4. Fluorescerende Plate Reader Instructies en Data Analysis
- Open Gen5 programma, en geopend experiment sectie.
- Zet de plaat lezer en inlegplaat (linksboven is A1).
- Protocol
Procedure Lees om aangepaste metingen stellen. Weet niets over monsters, duplo, enz., toe te voegen om ruwe fluorescentie data te verzamelen van elk putje. - Onder "lezen" kiezen "fluorescentie", "Endpoint", "Normal Speed," "Gain 40," "excitatie 360/40," "Emission 460/40," Optics positie: Top 50%. Top optische offset: 7mm. Nee schudden, geen vertraging, geen kinetiek, geen beeldscherm goed, temperatuur: incubator af.
- Kies platte zwarte bodem, 96-well plaat (Grenier 96-well, vlakke bodem).
- Omgaan met de plaat layout: Protocol plaatindeling. Opgezet monsters zonder opgave herhalingen, verdunningen, enz.
- Plaat lezen.
- Bestand opslaan: Klik op de "Excel" knop, die gegevensbestand zal exporteren naar Excel. Doe dit voor plaat lay-out en voor de matrix. Sla het bestand op de computer en op een USB-drive.
- In Excel, aftrekken van het gemiddelde voor de achtergrond lezen van elk monster, met inbegrip van Triton X-100 putten.
- Bereken relatieve% degranulatie door te delen elke waarde (al hebben had achtergrond afgetrokken) door de gemiddelde Triton X-100 waarde, en vervolgens vermenigvuldig met 100 om het percentage te maken.
- Gemiddelde alle drievoud, en berekent de standaarddeviatie. Graph data in excel als gemiddelde waarden ± standaarddeviatie. Voor statistische testen, nu naar Prism software van GraphPad.
DAG 2:
5. Ionofoor Gestimuleerd degranulatie Assay gebruik RBL-2H3 cellen
- Volg protocol voor "Voorbereiding van de cellen" (deel 1, dag 1) en "Voorbereiding van triclosan" (hoofdstuk 2, Dag 2), zoals hierboven beschreven. De plaat layout voorbeeld voor ionofoor stimulatie wordt hieronder weergegeven.
Behandeling Triplo Gestimuleerd, 0 uM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4 Gestimuleerd, 0.001 uM TCS F6, G6, H6 Gestimuleerd, 0,01 uM TCS F3, G3, H3 Gestimuleerd, 0.1 uM TCS A4, B4, C4 Gestimuleerd, 1 uM TCS A6, B6, C6 Gestimuleerd, 5 uM [TCS F5, G5, H5 Gestimuleerd, 10 uM TCS A3, B3, C3 Gestimuleerd, 15 uM TCS A5, B5, C5 Gestimuleerd, 20 uM TCS F7, G7, H7 Spontane, met DMSO, zonder TCS (inclusief bespot) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8 TX-100, met DMSO, zonder TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12 Geen cellen achtergrond, met DMSO, plus hoogste [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12 
Klik hier voor grotere afbeelding . - Voordat u begint, controleer de pH van alle buffers worden gebruikt, en ervoor zorgen dat ze zijn duidelijk en niet bewolkt. Tyrodes, natriumacetaat buffer en glycine carbonaat buffer (recepten verschaft in tabel).
- Bereid een 50 ml conische buis van BT door het toevoegen van 0,05 g BSA naar 50 ml Tyrodes buffer en door vortexen goed te mengen. Incubeer bij 37 ° C waterbad.
- Voeg 0,2% Triton X-100 met 0,0032% DMSO (de uiteindelijke concentratie calcium ionofoor voertuig) door toevoeging van 96 ui 10% Triton X-100-4,704 ml BT. Meng goed. Vervolgens neem 0.155 ul van deze oplossing en gooi. Voeg nu terug in 0.155 pl 100% DMSO.
- Bereid een 5 mM voorraadoplossing (2,5 mg / ml) van de ionofoor A23187 van poeder door toevoeging van 400 gl vers 100% DMSO in de ionofoor flacon en vortexen te mengen. Eenmaal in oplossing,over te dragen aan een 1,5-ml conische buis, inhoud opnemen en de datum van vandaag en de vervaldatum (3 maanden van voorbereiding juiste wijze zijn opgeslagen bij -20 ° C).
- Als alternatief, als met behulp van een bevroren voorraad vandaag, ontdooien op ijs, en controleer of de 5 mM A23187 ionofoor is goed gemengd en duidelijk. Draaikolk, flick, en zwenken dit bestand voor gebruik. Datum van bereiding en Lot # van deze A23187 record.
- Eenmaal "TCS-buffer" en "controle buffer" zijn verwarmd en 90 minuten geroerd, blijven de rest van de voorbereiding op de TCS-protocol (ga naar stap 2.6-2.8.1). Na het BSA is goed gemengd in beide oplossingen, gaat u verder met de resterende protocol stappen.
- Van de 249 ml monster van "TCS-buffer"-oplossing, dragen 50 ml van een nieuwe 50 ml conische buis. Verwijder 1.8 ul van de ml aliquot 50 en voeg 1,8 ul van 5 mM ionofoor voorraad. Vortex 3x voor 8 seconden en zwenken 3x. Uiteindelijke ionofoor concentratie is 180 nM. Merk op dat deze concentratie van A23187 afhankelijk van stock potentie en een ionofoor A23187 dosis respons wordt aanbevolen om een concentratie van A23187 dat degranulatie niveau van ongeveer 20% maximale afgifte, dat is geïdentificeerd als een cytotoxisch voor RBL-2H3 uitlokt identificeren cellen door cytotoxiciteit assay (zie 2).
- Label deze "Buis 1, Hoge TCS / + ionofoor / + BT." Gebruikt voor verdunningen en hoogste TCS blootstellingsconcentratieverplichting.
- Van de 249 ml monster van "controle buffer"-oplossing, dragen 50 ml van een nieuwe 50 ml conische buis. Take out 1.8 ul van de ml aliquot 50 en voeg terug in 1,8 ul van 5 mM ionofoor voorraad. Vortex 3x voor 8 seconden en zwenken 3x. Uiteindelijke ionofoor concentratie 180 nM.
- Label deze "Tube 2, No TCS / + ionofoor / + BT." Dit wordt gebruikt voor verdunningen en 0 uM TCS concentraties.
- Van de 249 ml monster van R 20; TCS-buffer "-oplossing, dragen 50 ml van een nieuwe 50 ml conische buis. Take out 1.8 ul van de nieuwe 50 ml aliquot en voeg 1,8 pl van 100% DMSO. Vortex 3x voor 8 seconden en keer 3x, geen ionofore wordt toegevoegd.
- Label deze "Tube 3, High TCS / Nee ionofoor / + BT / + DMSO"; gebruikt voor de achtergrond.
- Van de 249 ml monster van "controle buffer"-oplossing, dragen 50 ml van een nieuwe 50 ml conische buis. Haal 1.8 ul van de nieuwe 50 ml aliquot en voeg 1,8 pl van 100% DMSO. Vortex 3x voor 8 seconden en zwenken 3x. Geen ionofore wordt toegevoegd.
- Label deze "Buis 4, No TCS / Nee ionofoor / + BT / + DMSO"; gebruikt voor vrijgave samples spontaan.
BSA TCS Ionofoor Vervaardigd 100% DMSO Buis 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Hoog [] NO Buis 2 NO NO Buis 3 Hoog [] NO Tube 4 NO NO eck mark "fo: content-width =" .1 "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> - Bereken en registreer volumes verdunningen na de concentratiebepaling van de "TCS-buffer" stock. Gebruik gekalibreerd P2 en P1000 Pipetman. Totale volume voor elke verdunning concentratie moet 1 ml zijn, en moet worden voorbereid op een steriele microcentrifugebuis:
Concentratie Hoge Triclosan + Tyrodes + BSA 180 nM A23187 (Tube 1 van boven) Verwarmd BT 180 nM A23187 (Tube 2 van boven) 20 uM 15 uM 10 uM 5 uM 1 uM <td>0.1 uM 0.001 uM 0 uM (bovenkant van de plaat) ---------------------------------- 500 pi plus nog eens 500 ul 0 uM (onderkant van de plaat) ---------------------------------- 500 pi plus nog eens 500 ul - Neem de cellen uitgeplaat gisteren uit de incubator, en leeg de media in de gootsteen. Met een Combitip, willekeurig wassen cellen in de 96-well plaat met BT (200 ul / putje). Herhaal de wasbeurt een tweede keer.
- Voor behandelingen samen voor de toepassing, vortex en zwenken verdunningen vlak voor toevoeging aan de plaat. Vanaf de bovenkant van de plaat: Willekeurig drievoud van 200 pl elk van de juiste concentratie van TCS toevoegen corresponding goed. Doorgaan naar onderkant van de plaat. Voeg "controlebuffer"-oplossing plus A23187 (van "Tube 2" boven) om alle 'spot' op het bord.
- Voeg 200 ul van passende oplossingen voor overeenkomstige putten:
- Voeg 200 ul van 0,2% Triton X-100 "TX"-aangegeven putjes.
- Vervolgens, voeg 200 ul van Tube 3 om de 3 putten label "Achtergrond (Bkgd)-Hoogste TCS" op het bord.
- Tot slot, voeg 200 ul van Tube 4 tot zes putten label "Spontane."
- Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Tijdens de 1 uur incubatie: Verkrijg twee emmers ijs (een voor de "oude" plaat in incubator en een voor de nieuwe plaat). Dooi 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glucosaminide (4-MU) bij kamertemperatuur gedurende maximaal 40 minuten, het in folie omdat het lichtgevoelig.
- Zodra 4-MU is voorraad ontdooid, make up 4-MU werkende solutiop: 150 ul voorraad + 14,85 ml koud acetaat buffer (recept gegeven in tabel), vortex en zwenken. Houd in 50 ml centrifugebuis, verpakt in folie en op ijs tot gebruik.
- Met behulp Combitip, willekeurig voeg 100 ul koud 4-MU werkende oplossing in de bodem van elk putje van een NIEUWE Grenier zwarte 96-well plaat (op ijs emmer # 2): eerst beginnen met het toevoegen van de werkende oplossing willekeurig binnen de top van de plaat, willekeurig in de bodem van het schaaltje, willekeurig in Triton X-100 putjes en uiteindelijk in willekeurige achtergrond putjes.
- Ga uit nieuwe doos van P200 tips voor de volgende stap.
- Aan het einde van de 1-uur incubatie, zet cell plaat uit incubator op ijsemmer # 1, pipet supernatant omhoog en omlaag 4-5x (voorzichtig, niet introduceren bubbels), die rond de put voor een goede menging, maar niet aanraken van de cellen tijdens het mixen . Systematisch, neem 25 ul monster uit elk putje en plaats in de nieuwe plaat met substraat (zelfde bestelling van samples, zoals oorspronkelijk gepland). Pipet op en neer om te proeven grondig te mengen wanneer in nieuw goed, zonder dat er luchtbellen.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Na 30 min incubatie willekeurig voeg 200 ul koude glycine carbonaat-buffer per putje (met Combitip) aan putjes vullen tot 325 ul totaal (maken dit aanvullende Triton X-100 samples laatste, Triton X-100 spill voorkomen). Controleer of bellen voordat leesplaat (poke met schone P10 pipet tip om eventuele luchtbellen pop).
- Draaien de plaat in de fluorescentieplaatlezer (Volg alle stappen in paragraaf 4).
Procedure 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij verwarmen tot 50 ° C gedurende 90 min, UV-Vis absorptie spectrum voor TCS produceert een sterke, gladde kromme tussen ~ 260 en 300 nm, met een piek bij 280 nm, zoals getoond in figuur 1. UV-Vis spectrofotometrie is daarom een belangrijk instrument dat kan worden gebruikt om de concentratie te berekenen, omdat de gepubliceerde molaire absorptiecoëfficiënt bij 280 nm 4.200 L / mol / cm 12. Wij hebben gevonden dat TCS niet vallen uit oplossing gedurende het tijdsbestek van de degranulatie gehele experiment, na ° C verwarmen 50 (gegevens niet getoond).
Na het gebruik van deze verwarmingsmethode TCS direct oplossen in waterige buffer, het effect van TCS onderzocht mastceldegranulering met fluorescentie-gebaseerde test die is geoptimaliseerd van Naal et al.. 1 Deze test neemt het niveau van β-hexosaminidase vrijgelaten uit mast cellen na een uur incubatie bij het detecteren van een fluorogeen substraat product. Of gestimuleerd degranuleren van DNP-BSEen antigeen (Figuur 2) of calcium ionofoor A23187 (figuur 3), kan men duidelijk zien dat TCS veroorzaakt een significante dosis-responsieve remming van de afgifte van β-hexosaminidase (ie degranulatie).
Figuur 2 is representatief voor de resultaten verkregen voor IgE-gesensibiliseerde RBL-cellen die werden geïncubeerd gedurende 1 uur in "TCS-buffer" of "control buffer" en blootgesteld aan een DNP-BSA antigeen dosis van 0,0004 ug / ml. Deze concentratie van DNP-BSA wekte een gemiddelde absolute degranulatie respons van 22,5% ± 0,1 (gemiddelde ± standaarddeviatie) in afwezigheid van TCS. Statistisch significante remming van de degranulatie begon op 5 uM, waarbij degranulatie niveaus waren 0,79-voudige ± 0.05 (gemiddelde ± SD) van de 0 uM TCS controle niveaus. Aangezien de TCS concentratie toeneemt, er een groter dempend effect van TCS, met een sterke dosis-responsrelatie. TCS, bij 20 uM, zal bt geheel heft de degranulatie reactie, tot een niveau ongeveer gelijk aan spontane degranulatie (waarbij geen antigeen aanwezig is). Kortom, deze figuur toont sterke remming van multivalente antigeen-gestimuleerde mastceldegranulering vanwege de hoge geverifieerde TCS, zonder het gebruik van organische oplosmiddelen.
In figuur 3 is calcium ionofoor A23187 gebruikt als een manier om het mechanisme van TCS-geïnduceerde demping van degranulatie van mestcellen RBL onderzoeken. A23187 gebruikt als alternatief stimulerend omdat het omzeilt de FceRI crosslinking en andere signalerende gebeurtenissen stroomopwaarts van calcium influx, maar nog steeds veroorzaakt degranulatie. RBL mast cellen werden 1 uur geïncubeerd in "TCS-buffer" of "control buffer" met een calciumionofoor dosis van 180 nM. Aangezien TCS, deze concentratie van A23187 wekte een gemiddelde absolute degranulatie respons van 25,1% ± 4,7 (gemiddelde ± standaarddeviatie). Remming van degranulatie werdgevonden met zo weinig als 1 uM TCS (0.63 ± 0.11 [gemiddelde ± SD]). Aangezien TCS concentratie toeneemt, neemt de ernst van de remming: bij 5 uM, 0,21-voudige van de ± 0.04 0 uM TCS controleniveaus, bij 10 uM, 0,09 ± 0,05, bij 15 uM, 0.077 ± 0.006, en bij 20 uM , 0.09 ± 0.02 (gemiddelde ± SD). In feite, van 5 uM en hogere concentraties TCS, niveaus van A23187-geïnduceerde degranulatie bleken bij het niveau van spontane controle (wanneer geen A23187 aanwezig is helemaal). Kortom, figuur 3, in combinatie met figuur 2, geeft aan dat de moleculaire gebeurtenissen doelwit van TCS waarschijnlijk stroomafwaarts van calcium influx.
Figuur 1:. Vertegenwoordiger TCS UV-Vis absorptie spectrum TCS heeft een robuuste erwtk bij 280 nm voor een gemakkelijke bepaling van A 280, en bieden de mogelijkheid om de molaire extinctiecoëfficiënt van 4200 L / mol / cm 12 om de feitelijke concentratie van TCS opgelost in Tyrodes buffer bepalen. De gele lijn geeft de piek bij 280 nm. In dit voorbeeld is de extinctie bij 280 nm is 0,11876, wat een TCS concentratie van 28.28 uM aangeeft. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2:. Een vertegenwoordiger degranulatie reactie van IgE-gesensibiliseerde RBL mast cellen blootgesteld aan 0,0004 ug / ml DNP-BSA antigeen en TCS (0-20 uM) Een spontane afgifte waarde (geen antigen aanwezig) wordt afgeschilderd als referentie. Waarden vertegenwoordigen betekenen7; standaarddeviatie van drievoudige monsters. Zoals vermeld, werden de gegevens genormaliseerd naar control (0 uM TCS) en significante verschillen vastgesteld Prism software met een one-way ANOVA gevolgd door post hoc test wordt een Tukey (vergelijkingen tot 0,001 uM TCS gemiddelde reactietijd). Betekenis wordt vertegenwoordigd door *** p <0,001. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3:. Een vertegenwoordiger degranulatie reactie van RBL mestcellen gestimuleerd met 180 nM A23187 calcium ionofoor in aanwezigheid van TCS (0-20 uM) Een spontane afgifte monster (geen ionofoor aanwezig) wordt weergegeven ter referentie. De waarden geven het gemiddelde ± standaardafwijking van monsters in drievoud. Zoals presented worden gegevens genormaliseerd op control (0 uM TCS) en significante verschillen vastgesteld Prism software met een one-way ANOVA gevolgd door post hoc test wordt een Tukey (vergelijkingen tot 0,001 uM TCS gemiddelde reactietijd). Betekenis wordt vertegenwoordigd door *** p <0,001; ** p <0,01. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In 2004, Naal et al.. 1 ontwikkelde een mestcel biosensor voor high-throughput testen van degranulatie. Het is een robuuste test die we hebben aangepast voor onze TCS studies en beschreven in deze video. Voorafgaand aan de Naal et al.. 1 assay mastceldegranulering waren routinematig beoordeeld via β-hexosaminidase 59-61, maar deze vroege methoden gebruikt fluorometers waarbij een monster tegelijk lezen. Belangrijk Naal et al.. gevestigde directe concordantie tussen hun meer high-throughput-methode met behulp van een microplaataflezer en de eerdere werkwijze waarbij monsters werden een-op-een-tijd af te lezen in een fluorometer. Kortom, Naal et al.. 1 sterk verbeterd de snelheid, kracht, eenvoud en betrouwbaarheid van de test door aanpassing aan een high-throughput microplaat platform, en door de integratie van verschillende wijzigingen in de workflow. Hier hebben we verder geschikt deze assay een studie van verschillende testverbindingen name here, De alomtegenwoordige drug TCS. De video worden de stappen van de zeer nuttige test. Daarnaast hebben we ook ontwikkeld een organisch-solvent-vrije methode van het toepassen van TCS in waterige buffer, en laten we een eenvoudige, goedkope procedure voor de verificatie van TCS concentratie. Deze methoden moeten nuttig de schijnbaar groeiende gebied van triclosan toxicologie. In deze discussie, we detail verschillende overwegingen voor het gebruik van deze degranulatie test om andere chemische stoffen testen.
TCS werd direct bereid in een waterige buffer zonder behulp van organische oplosmiddelen, concentratie werd gecontroleerd door UV-Vis spectrofotometrie (figuur 1) en het effect van TCS (<30 uM) werd onderzocht mestcel degranulatie (figuren 2 en 3) , met fluorescentie microplaat test om de aanwezigheid van β-hexosaminidase, een surrogaat marker voor degranulatie detecteren. Wij hebben gevonden dat TCS is de vrijgave van β-hexosa aanzienlijk dempenminidase van RBL mestcellen wanneer opgelost in een lage concentratie van ethanol (0,24% vol / vol) 2 of, zoals hier afgebeeld, direct in waterige buffer. Door het afzien van organisch oplosmiddel, eigenlijk zien we meer uitgesproken demping in antigeen-geïnduceerde degranulatie tegenover onze studies waarin TCS werd opgelost in 0,24% ethanol (vol / vol). Bijvoorbeeld, we hebben een> 50% afname van antigeen-geïnduceerde degranulatie (0,46-voudig ± 0,07), veel groter is dan ~ 25% reductie we gerapporteerd voor 10 uM TCS opgelost in 0,24% ethanol (0,76-voudig aangetoond ± 0,02) 2. In dezelfde geest, hebben we bepaald voor A23187-gestimuleerde cellen die, door 5 uM, TCS remt degranulatie om vrijlating niveaus spontaan; dit effect werd niet aangetoond tot 10 uM TCS in onze eerdere, ethanol-gebruik, studie 2. Er zijn twee mogelijke redenen voor deze discrepantie: ofwel een 0,24% ethanol voertuig 2 vermindert het vermogen TCS om actieve mast cel remmenl degranulatie, of de TCS die we gebruikten was minder geconcentreerd dan verwacht (omdat de concentraties niet werden geverifieerd door UV-Vis spectrofotometrie in de vorige studie 2). Wat de moleculaire doelwit voor TCS remming van mestcel degranulatie is het waarschijnlijk ergens zich in de signaaltransductiecascade stroomafwaarts van calcium influx 2. We gebruikten calcium A23187 als een degranulatie stimulans om vroege signalering evenementen te omzeilen, en remmend effect TCS's aanhield, wat aangeeft dat de doelstelling voor TCS-remming in de degranulatie route wordt niet waarschijnlijk bovenstrooms gelegen van calciuminflux. We hebben eerder aangetoond dat ruffling membraan van deze cellen ook onderdrukt door TCS behandeling, suggereert de mogelijkheid van een gemeenschappelijke route doel 2.
Eerdere studies hebben de absorptie spectrum van TCS met een maximale piek bij 280 nm en een molaire absorptiecoëfficiënt werd geëvalueerd tot 4200 L / mol / cm zijn op dit wavelen gevondength (bij pH waarden onder de pKa) 12. Het is aangetoond dat het verwarmen van de TCS niet tot thermische afbraak 57, en een studie heeft aangetoond succes in TCS oplossen in water terwijl wordt ° C zonder steun van een organisch oplosmiddel 56-50 verhit. Wanneer een nieuwe teststof wordt gebruikt, de oplosbaarheid in de waterige buffer natuurlijk zorgvuldig worden overwogen. We hebben ook gevonden dat, bij het verwarmen de TCS, de vorm van de spectrale weergave niet beïnvloed of het wordt gedurende 40-90 min (gegevens niet getoond) suggereert dit een weinig degradatie van de TCS bij verhitting gedurende langere tijd. Merk echter op dat TCS oplossing groter is dan in 90 min 40 min. We hebben ook bevestigd dat TCS niet vallen uit oplossing gedurende de duur van de degranulatie experiment (gegevens niet getoond).
De DNP-BSA antigeen en calcium ionofoor concentraties die in deze studie werden gekozen op basis van antigeen en ionofoor dosisrespons assays, eend geselecteerd gematigde niveaus degranulatie wekken voor de representatieve figuren 2 en 3. Een voorbeeld van een antigen dosis respons bepaling kan worden gezien in Figuur 1A ons eerdere werk 2. Bij het bepalen van het antigeen of ionofoor concentratie worden gebruikt in het experiment, is het belangrijk te weten dat stimulerende dosis respons experimenten moeten periodiek worden uitgevoerd, typisch ten minste twee maanden, omdat RBL-2H3 cellen soms variabel functioneren. De concentratie die de gewenste degranulatie percentage oplevert kan variëren afhankelijk van de leeftijd van de cellen en de antigeen / ionofoor preparaat. Ook, zoals we hebben gezien met anorganische arseniet 22, kan absolute degranulatie percentages (niveaus van gebruikte antigeen) van invloed niveaus van toxische effecten op RBL degranulatie, zodat toxische dosis-respons moet worden gedaan op verschillende antigen / ionofoor concentraties. Het is ook belangrijk om de uiteindelijke conce overwegenntration DMSO vehikel bij het stimuleren van degranulatie met ionofore, aangezien degranulatie wordt beïnvloed door DMSO 62. We hebben gevonden de DMSO concentraties die in dit protocol zijn niet van invloed degranulatie, achtergrond lezingen, of 0,2% Triton X-100 waarden 2.
Naast het multivalente antigeen DNP-BSA en calcium ionofoor A23187, bestaan er verschillende methodes RBL-2H3 stimulatie. Een van deze methoden is stimulatie via blootstelling aan verbinding 48/80 samen met quercetine 63. Een andere is verknoping van IgE-receptoren gebonden met een anti-IgE IgG, zoals we eerder getest met TCS blootstelling 2. Veel andere stimulatie methoden bestaan, en elk van deze methoden richt een ander mechanistische aspecten van mestcel degranulatie. Deze plaat reader test kan worden aangepast voor gebruik met veel van deze alternatieve stimulatoren uitbouwen van het nut.
Deze degranulatie protocol heeft het potentieel om te worden gebruikt met een grote verscheidenheid aan chemische. In een studie van een teststof met behulp van deze test moeten controles worden uitgevoerd voor de volgende: (1) werking van de teststof op de achtergrond (geen cellen) metingen; (2) effect van het chemisch product op spontane degranulatie (cellen zonder IgE , geen antigeen geen ionofoor), (3) effect van de chemische on Triton-X-100 waarden van gelyseerde cellen (geen antigeen geen ionofoor). Deze tests kunnen gemakkelijk worden verwerkt in de plaatindeling. Eerder vonden we de TCS beïnvloedt geen van deze drie parameters 2. Bovendien moeten proeven uitgevoerd ter bepaling van de teststof niet interfereren met de β-hexosaminidase enzym / substraat reactie zelf in een celvrij preparaat, zoals beschreven in figuur S1 van het aanhangsel A aanvullende gegevenssectie van Palmer et al. 2. We vonden dat TCS niet interfereert met het vermogen van β-hexosaminidase het splitsen het fluorogene substraat 4-MU 2. Effecten van elke oplosmiddelen moet worden beschouwdin al deze controle-experimenten. Zo bevestigden we DMSO, het oplosmiddel voor de ionofoor, heeft geen effect op Triton-X-100 sample fluorescentie niveaus (gegevens niet getoond). We merken ook op dat we alle kunststoffen gebruikt in deze studie voor de niet met het endocrien verstorende bisfenol A gekozen, helaas, hoewel, alle kunststoffen die momenteel op de markt waarschijnlijk wel somige hormoonverstorende activiteit, die mogelijk zou kunnen verwarren gegevens 64.
In het geval dat oplossingen vereist is, moet met een aantal mogelijke aspecten van dit protocol worden beoordeeld. Bijvoorbeeld kan het zijn dat (1) spontane afgifte niveaus te hoog zijn (hoger dan ~ 7% van lysis waarden), (2) een dosis-respons met ofwel stimulerende en / of teststof wordt niet waargenomen, of (3) de TCS concentratie in oplossing te laag (minder dan 20 uM). In het eerste geval kan een hoge spontane niveau een indicatie van de cellen zijn in cultuur te lang of zijn besmet met mycoplasma worden, daarom, Probeer dan deze experimenten met RBL-2H3 cellen die zijn in cultuur tussen 2-20 weken, en regelmatig te testen voor mycoplasma. Als een stimulans dosis respons niet wordt nageleefd, kan het opgeloste stimulerende concentratie te laag zijn, en de voorraden moeten worden opnieuw gemaakt. Als voorbeeld, calcium ionofoor typisch verschaft als een dunne film te worden gereconstitueerd met DMSO, waarbij aandacht en veel vortexen. Daarnaast zou een nieuwe ionofoor voorraad met een ander lotnummer een andere potentie simpelweg te wijten aan veel-te-veel variatie hebben, daarom is een degranulatie dosisreactie aanbevolen bij elke nieuw gekochte ionofoor voorraad. Het is ook vermeldenswaard dat een duidelijk gebrek aan effect bij een bepaalde teststof een indicatie dat deze chemische stof een langere incubatietijd, om een effect te veroorzaken kunnen eisen zou kunnen zijn. Als u niet bereiken van een hoog TCS opbrengst in oplossing, controleren of de temperatuur is constant gebleven (50 ° C ± 5), terwijl de korrels oplossen in de buffer. Thij thermometer mag nooit aan de bodem van de kolf, een positie die zou leiden tot een overschatting van de temperatuur van de oplossing. Ook, zorg ervoor dat er constant krachtig roeren en dat de 90 min aftellen niet wordt gestart totdat de temperatuur eerst heeft bereikt 50 ° C.
Tabel voor het oplossen van problemen.
Probleem | Potentiële Reden | Oplossing | |||
TCS voorraad is vastbesloten te zijn <20 uM | Niet-uniforme verhitting van de oplossing | Zorg ervoor dat de thermometer zodanig is gepositioneerd dat het in de oplossing gesuspendeerd en de bodem van de kolf niet raken. | |||
Roeren is niet voldoende krachtig | Verhoog magnetisch roeren op geroerbakte plaat tot een niveau van roeren, dat is krachtig zonder dat de oplossing om te springen uit de kolf te bereiken. Ervoor te zorgen dat een geschikte grootte magnetische roerstaaf wordt gebruikt. | ||||
Problemen met spectrofotometer | Zorgen voor een degelijke warming-up van de UV-lamp (meestal 10 min), of vervang de lamp indien nodig. | ||||
Spontane degranulatie te hoog (> ~ 7%) | Cellen hebben abnormale genetische mutaties als gevolg van te veel tijd in cultuur verworven | Uitvoeren van experimenten met een nieuwe mobiele dooi. | Cellen sterven vanwege mechanische afschuiving | Bij het toevoegen van buffer of behandelingen hechtende cellen, wees voorzichtig de cellen niet te verstoren, door deze volumes toe te voegen voorzichtig aan de zijkanten van de microwells. Oefenen met de Combitip. | |
IgE / DNP-BSA geen release van beta-hexosaminidase veroorzaken dan vrijlating niveaus spontane | IgE is ouder dan 30 dagen heeft ondergaan ontdooien bevriezen | Gebruik een nieuwe, behoorlijk opgeslagen hoeveelheid van IgE. | |||
DNP-BSA is niet goed gemengd | Zorg ervoor dat de kleine omvang van de DNP-BSA Voeg aan de conische buis en to vortex grondig. | ||||
A23187 ionofoor geen release van beta-hexosaminidase veroorzaken dan vrijlating niveaus spontane | A23187 voorraad is niet goed opgelost | Product komt als een "dunne film", en moet opgelost worden met zorg en veel vortexen. Transfer gereconstitueerd voorraad naar een nieuwe 1.5-ml tube voor opslag. | |||
A23187 voorraad is niet goed opgeslagen | De voorraden zijn lichtgevoelig. Na reconstitutie Parafilm boven en opslag verpakt in folie bij -20 ° C. Als er een vraag over de opslag van een voorraad, weggooien en beginnen testen met een nieuwe voorraad. | ||||
180 nM ionofoor A23187 ontlokt geenhetzelfde relatieve degranulatie reactie, zoals die gevonden in een eerder assay | Lot-to-lot variatie ionofoor A23187 | Voer een dosis respons experiment voor elke nieuwe partij ionofoor. Ook wordt aanbevolen dat aandelen uit dezelfde partij worden getest, vanwege mogelijke variabiliteit in de reconstructie proces. |
Zoals in elke toxicologie / farmacologie experiment, moet de teststof niet openlijk giftig zijn bij de geteste concentraties. We raden behulp van methoden die test voor zowel apoptose en necrose, afzonderlijk of gecombineerd worden (zoals met klonogene assays), en tests voor algemene beschadiging van het plasmamembraan (zoals lactaat dehydrogenase lekkage). TCS bij concentraties in deze studie, is niet cytotoxisch voor RBL-2H3 cellen 2. Een bijzonder nota van zorg met de ionofore studies is dat ionofoor plus ionofoor voertuig(Waarschijnlijk DMSO), plus teststof, plus eventuele organische oplosmiddelen worden gebruikt, kan een potentieel cytotoxische brouwsel, die zorgvuldig moeten worden gecontroleerd, zoals gedaan in Palmer et al. zijn. 2
Ons protocol voor het bereiden TCS oplossingen zonder het gebruik van een organisch oplosmiddel geschikt voor verdere toxicologische experimenten van dit alomtegenwoordige chemische, zonder tussenkomst van oplosmiddel artefacten Zeer belangrijk aspect in aquatische toxicologie. Deze werkwijzen kunnen ook controle van de concentratie van TCS in oplossing en kwantificering van de effecten die chemicaliën, zoals TCS hebben op mestcel degranulatie. Dit protocol kan worden gebruikt om de effecten van een grote verscheidenheid van chemische stoffen op mestceldegranulatie, zoals verdachte hormoonontregelaars 55 beoordelen, en kan mogelijk worden opgeschaald voor high throughput screening. Bovendien kunnen andere mast celtypes worden gebruikt in deze assay toekomstige werkzaamheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
LMW en RHK worden ondersteund door Graduate School of Biomedical Science and Engineering (GSBSE) UMaine's; RHK werd ook gesteund door de Maine Landbouw & Forest Experiment Station. Aanvullende financiering werd verstrekt door het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen (NIH P20-GM103423), de Maine Landbouw & Forest Experiment Station (Grant Number ME08004-10, JAG), de Universiteit van Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) , en een onderzoek Starter Grant in Farmacologie / Toxicologie van de PhRMA foundation (JAG). Wij danken Drs. David Holowka en Barbara Baird voor het antigeen en cellen. We zijn dankbaar voor Hina Hashmi, Alejandro Velez en Andrew Abovian voor hulp met apparatuur en orders. Dit is Maine Landbouw & Forest Experiment Station publicatienummer 3311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RBL-2H3 Cells |
ATCC | CRL-2256 |
The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC |
| Triclosan/Irgasan |
Sigma | 72779 CAS# 3380-34-5 |
Should be stored in a low humidity environment |
| Trypsin |
Gibco | 25300-054 CAS# 3380-34-5 |
|
| EMEM |
Lonza | 12-611F |
|
| Fetal Bovine Serum |
Atlanta Biologicals | S11150 |
|
| Gentamycin Sulfate |
Lonza Biological Sciences | 17-518 |
|
| Albumin, Bovine Serum |
Calbiochem | 12659 CAS# 9048-46-8 |
|
| Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution) |
Pierce | 28314 CAS# 9002-93-1 |
|
| HEPES |
J.T Baker | 4153-01 CAS# 75277-39-3 |
|
| Magnesium Chloride |
VWR | BDH0244-500G CAS# 7791-18-6 |
|
| D-(+)-Glucose |
Biomedicals | 152527 CAS# 50-99-7 |
|
| Potassium Chloride Crystal |
J.T Baker | 3046-01 CAS# 7447-40-7 |
|
| Calcium chloride dihyrdate |
Acros Organics | 207780010 CAS# 10035-04-8 |
|
| Glycine |
Sigma | G8898 CAS# 56-40-6 |
|
| 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU) |
EMD Biosciences | 474502-250MG CAS # 37067-30-4 |
Wrap in foil – is light-sensitive |
| Anti-DNP Mouse IgE |
Sigma | D8406 |
Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month. |
| DNP-BSA |
Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University | Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018 |
|
| Calcium Ionophore A23187 |
Sigma | C75-22-1mg |
Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully |
| DMSO |
Sigma | D2650 CAS# 67-68-5 |
|
| Acetic Acid |
VWR | BDH3094-2 CAS# 64-19-7 |
|
| Anhydrous Sodium Carbonate |
Sigma | 222321 CAS# 497-19-8 |
|
| Sodium Chloride |
Sigma | 71376 CAS# 7647-14-5 |
|
| Hydrochloric Acid |
VWR | BDH3026 CAS# 7647-01-0 |
|
| Reference Buffer, pH 7 |
VWR | BDH5046 |
|
| Reference Buffer, pH 10 |
VWR | BDH5072 |
|
| Reference Buffer, pH 4 |
VWR | BDH5018 |
|
| pH electrode storage solution |
VWR | 14002-828 |
|
| Equipment: | |||
| DU 7500 Spectrophotometer |
Beckmann | No longer sold |
|
| Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software |
BioTek | Module S |
|
| Hematocytometer |
Hausser Scientific | 3110 |
|
| 7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate |
VWR | 97042-634 |
|
| Centrifuge |
Eppendorf | 5430 |
|
| Tissue culture water bath |
VWR | Model# 89032-206 |
|
| Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood) |
The Baker Company | Model# SG403A-HE |
|
| Tissue culture incubator |
ThermoScientific | Model# 3598 |
|
| Pipetman |
VWR | Range: P2-P1000 |
|
| Balance |
Mettler Toledo | Model# AG204 |
|
| pH meter |
Symphony/VWR | Model# SB70P |
|
| Pipet-Aid |
Drummond Scientific | 4-000-100 |
|
| Combitip dispenser |
Eppendorf | 4981 000.019 |
|
| Recipes: | |||
| Acetate Buffer, pH 4.4 |
Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml | Sterile Filter into autoclaved glass bottle |
|
| Substrate (4-MU) |
Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again | For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer |
|
| Glycine Carbonate Buffer, pH 10 |
26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| Tyrodes (2 L), pH 7.4 |
135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| RBL Cell Media |
Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only. | Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle |
|
| Plastic material used: | |||
| 200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack |
VWR | 53509-009 |
polypropylene |
| 1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery |
VWR | 89003-420 |
polyethylene |
| 10 µl micro tip low binding sterile |
VWR | 14217-704 |
polypropylene |
| Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force |
VWR | 20170-038 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-178 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-103 |
polypropylene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 690175 |
polystyrene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 658175 |
polystyrene |
| CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 607180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 710180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 606180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 760180 |
polystyrene |
| 1 cm cuvettes |
N/A | N/A |
polystyrene |
| CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate |
Greiner Bio One | 655086 |
polystyrene |
| Combitips |
Eppendorf | 022266501 |
Polypropylene/ polyethylene |
References
- Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
- Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
- Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
- Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
- Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
- Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
- Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
- Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
- Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861 (1997).
- Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
- Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
- Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
- Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
- Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
- Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
- Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
- Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
- Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
- Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
- Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
- Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
- Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
- Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
- McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
- Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
- Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
- Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
- Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
- Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
- Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937 (2002).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
- Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
- Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
- Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
- Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
- Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
- Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
- Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
- Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
- Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
- Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
- Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
- Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
- Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
- Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
- Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
- Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
- Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
- Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
- Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
- Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
- Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
- Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
- Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
- Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
- Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
- Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
- Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
- Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
- Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).
