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Immunology and Infection

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d'un solvant organique

Published: November 1, 2013 doi: 10.3791/50671
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono
* These authors contributed equally

Summary

Dégranulation des mastocytes, la libération de médiateurs de l'allergie, est important dans les allergies, l'asthme et la défense parasite. Ici, nous démontrons techniques 1 pour évaluer les effets des médicaments et des substances toxiques sur la dégranulation, la méthodologie utilisée récemment pour exposer l'effet inhibiteur puissant agent antibactérien triclosan de 2.

Abstract

Les mastocytes jouent un rôle important dans la maladie allergique et de défense immunitaire contre les parasites. Une fois activé (par exemple, par un allergène), ils dégranulent, un processus qui aboutit à l'exocytose des médiateurs de l'allergie. Modulation de la dégranulation des mastocytes par les drogues et les substances toxiques peuvent avoir des effets positifs ou négatifs sur la santé humaine. Fonction des mastocytes a été disséqué en détail l'utilisation des mastocytes de leucémie basophiles de rat (RBL-2H3), un modèle largement accepté de mastocytes des muqueuses de l'homme 3-5. Mât composant de cellules granulaires et le médiateur allergique β-hexosaminidase, qui est libéré linéairement parallèlement à l'histamine à partir de mastocytes 6, peuvent facilement et de façon fiable être mesurées par réaction avec un substrat fluorogène, ce qui donne l'intensité de fluorescence mesurable dans un essai de micro-plaque qui se prête à études à haut débit 1. Initialement publié par Naal et al. 1, nous avons adapté ce test de dégranulation pour le dépistage oles médicaments et les substances toxiques F et démontrer son utilité ici.

Le triclosan est un agent antibactérien à large spectre qui est présent dans de nombreux produits de consommation et a été trouvé pour être une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau humaine 7-11, bien que le mécanisme de cet effet est inconnue. Ici, nous démontrons une analyse de l'effet du triclosan sur la dégranulation des mastocytes. Nous avons récemment montré que le triclosan affecte fortement la fonction des cellules de mât 2. Dans un effort pour éviter l'utilisation d'un solvant organique, le triclosan est dissous directement dans un tampon aqueux avec la chaleur et l'agitation, et la concentration résultante est confirmée par spectrophotométrie UV-Vis (avec ε = 4,200 280 L / M / cm) 12. Ce protocole a le potentiel pour être utilisé avec une variété de produits chimiques afin de déterminer leurs effets sur la dégranulation des mastocytes, et plus largement, leur potentiel allergique.

Introduction

Les mastocytes sont très granulé cellules immunitaires effectrices qui servent de médiateurs clés dans l'asthme, les allergies, parasite de la défense et la carcinogenèse 13-16. Ils résident dans presque tous les tissus vascularisés 15, où ils stockent en toute sécurité médiateurs inflammatoires et allergiques dans les granules cytoplasmiques avant d'être activée à dégranuler. Dégranulation est l'exocytose des granules liés à la membrane, ce qui entraîne la libération de médiateurs pharmacologiquement actives telles que l'histamine, la tryptase, et leucotriènes 15. Ce procédé conduit à l'initiation de type I des réactions d'hypersensibilité qui sont essentiels à la défense de montage contre les parasites ainsi que le lancement des réactions allergiques, asthmatiques, et cancérigène 15.

Les mastocytes et les basophiles expriment des récepteurs FceRI, les récepteurs de haute affinité pour les immunoglobulines E (IgE) 17. L'exposition à un allergène ou antigène provoque l'agrégation de multiples récepteurs FceRI IgE liés 17, et c'est ce so-disant «réticulation» de récepteurs Fc des IgE liés qui déclenche le processus de dégranulation: une cascade d'événements tyrosine phosphorylation, l'activation de la phospholipase C, flux de calcium dans les magasins internes, et l'afflux de calcium dans la cellule 18. Cet afflux de calcium est nécessaire à la dégranulation, et, en outre, les signaux de fusion des granules avec la membrane avant de provoquer l'exocytose des granules 15. Expérimentalement, un ionophore du calcium peuvent être utilisés pour faire la navette calcium directement à travers la membrane de la cellule 19, ce qui évite pratiquement tout transduction du signal étapes avant l'étape de l'influx de calcium 20, permettant l'identification d'une cible de la voie par un produit toxique comme étant en amont ou en aval de signalisation de calcium 20.

Dégranulation peut être mesuré rapidement et efficacement en surveillant la libération de β-hexosaminidase dans un surnageant de cellules, qui est libéré à partir des granulés linéairement le long d'histamine 6, mais is beaucoup plus facile à détecter à l'aide d'une simple réaction enzyme-substrat, et un lecteur de microplaque pour doser le produit fluorescent. Ce dosage en microplaque, tel que décrit dans la section du protocole, est basée sur une méthode robuste développé à l'origine par Naal et al. 1, qui quantifie le clivage du substrat fluorogénique 4-méthylumbelliféryl-N-acétyl-β-D-glucosaminide par β- hexosaminidase. Nous avons modifié l'analyse des effets des essais de médicaments et de substances toxiques, avec triclosan a mis en évidence ici. Cette méthode quantifie de manière fiable la dégranulation, est une alternative peu coûteuse pour, par exemple, les méthodes de détection par cytométrie en flux offre 21, et a le potentiel pour se prêter gentiment de criblage à haut débit d'une grande variété de médicaments anti-allergiques, ainsi que immunotoxiques ou de produits chimiques allergènes. Ce dernier point est particulièrement important à la lumière du rapport de 2007 du Conseil national de recherches "Tests de toxicité au 21ème siècle: une vision et une Stratgie "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), qui milite pour le développement de tests de toxicologie à haut débit qui utilisent la culture cellulaire pour réduire l'utilisation coûteuse des animaux de laboratoire traditionnels tels que la souris. Le protocole mis au point par la dégranulation Naal et al. 1 et modifié par nous 2, utilise la lignée de cellules RBL-2H3 qui est un modèle bien accepté homologue à mastocytes des muqueuses de l'homme ou des basophiles 5.3. (Méthodes de culture de cellules RBL-2H3 sont détaillés dans Hutchinson et al. 22). Ce test pourrait probablement être adapté à tout type de mastocytes ci-joint.

Triclosan (TCS) est un antimicrobien à large spectre qui a été utilisé pendant plus de 30 ans dans les hôpitaux, les produits de soins personnels et des biens de consommation 23,24. Le mode d'action pour caractéristique antimicrobienne de TCS est l'inhibition de la biosynthèse des acides gras, probablement en inhibant énoyl-acylréductase protéine porteuse 25,26. Il se trouve dans le monde entier dans une vaste gamme de produits de consommation tels que gel douche, lotion pour les mains, dentifrice, rince-bouche, et savons pour les mains à des concentrations allant jusqu'à 0,3% ou de 10 mm 24. L'utilisation généralisée du TCS a donné lieu à des niveaux détectables chez l'homme et 27-29 dans les rivières et les ruisseaux 30. Une étude réalisée par Allmyr et al. 27 a démontré que TCS et ses métabolites sont présents à la fois dans le plasma et le lait des mères qui allaitent. Surtout, TCS est facilement absorbé par la peau 31-37. Queckenberg et al. 37 ont trouvé ~ absorption de 10% d'une ~ 70 mM crème TCS dans la peau de l'homme dans les 12 heures, aboutissant à une concentration significative dans la peau, où les mastocytes résident.

TCS a été cliniquement prouvé pour gérer la maladie allergique de la peau humaine 7-11, mais le mécanisme par lequel TCS soulage les maladies allergiques de la peau a été inconnue 38. Utilisation de la detaile de dosage en microplaque fluorescentd Dans cette vidéo, nous avons récemment démontré que TCS, à des concentrations aussi faibles que 2 pm, atténue considérablement la fonction des mastocytes et la dégranulation, fournissant une explication possible de ces données cliniques 2. En plus de fournir une explication à ces données cliniques, nos résultats à Palmer et al. 2 suggèrent que TCS vise molécules de signalisation en aval de l'afflux de calcium. En raison de l'importance de la signalisation dans de nombreux immunologique et d'autres processus biologiques calcium, TCS pourrait avoir des effets négatifs sur une grande variété de processus biologiques nécessaires. En fait, Udoji et al. 39 a montré que TCS supprime l'activité des cellules tueuses naturelles humain lytique, une autre fonction immunitaire innée importante.

Au-delà de son potentiel comme une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau (ou, au contraire, comme un immunotoxique), TCS peut aussi être un perturbateur endocrinien 40-49. Ainsi, une procédure claire sur la façon de préparer ce produit chimique en solution is d'intérêt pour les toxicologues. Parce que TCS est une petite molécule hydrophobe, les véhicules organiques sont souvent utilisés pour le rendre plus soluble dans l'eau. Dans la plupart des études de toxicité où TCS a été testé, la préparation a impliqué dissolution dans l'eau à l'aide d'un solvant organique tel que l'éthanol, l'acétone, ou de l'huile 2,50,51. Toutefois, il arrive souvent ces solvants sont biologiquement actifs eux-mêmes, ce qui complique l'interprétation de la substance d'essai données 51. En fait, selon Rufli et al. 52 et 53 autres, il est recommandé que des solutions de test pour les expériences de toxicité aquatique sont préparés en utilisant des méthodes physiques par rapport aux méthodes chimiques, en raison du potentiel de solvants chimiques pour créer des artefacts de toxicité. Nous avons précédemment montré que TCS dissous dans 0,24% éthanol / eau (vol / vol) et traitée aux ultrasons pendant 30 min amortit RBL dégranulation des mastocytes 2. L'éthanol à des concentrations supérieures à 0,24% a été montré pour freiner la dégradation des mastocytesnulation 54,55-exemples des effets potentiellement confondants de solvants organiques sur les études de toxicité.

Non seulement il est important de considérer l'effet de solvants sur l'organisme ou de cellules utilisées pour l'étude, mais il est aussi important de surveiller l'effet d'un solvant sur le produit chimique d'essai lui-même. Par exemple, Skaare et al. 51 ont constaté que la dissolution de TCS en polyéthylène glycol (on trouve couramment dans les dentifrices et les rince-bouche) affaibli effets anti-bactériennes et anti-plaque chez les femmes femelles en bonne santé tout en dissolution dans les huiles causé une perte complète de la fonction. Par conséquent, la capacité des différents solvants pour moduler toxiques et de drogues, y compris TCS, les effets doivent être pris en compte dans la conception des essais. L'utilisation des huiles ou des additifs de saveur peut interférer avec les effets de TCS dans divers produits 50,51.

Dans un effort pour éliminer la nécessité d'utiliser des solvants organiques, nous avons amélioré notre méthode pour dissoudre TCS 2 en éliminant l'utilisation d'un sol organiquedéfouler. Dans le présent protocole, on dissout granules TCS directement dans le tampon aqueux à chaleur (≤ 50 ° C), puis vérifiez la concentration de ce stock TCS par spectrophotométrie UV-Vis. Ces améliorations sont possibles parce que TCS est soluble dans l'eau jusqu'à 40 pm ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) et a été montré pour résister à la dégradation lorsqu'il est chauffé à 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Nous avons également l'avantage supplémentaire de la spectrophotométrie UV-Vis, comme TCS est également connu pour absorber fortement à 280 nm 58 avec un coefficient d'extinction molaire de 4,200 L / mol / cm 12.

Ce protocole fournit un moyen simple, mais efficace pour dissoudre granules TCS dans un tampon sans l'aide d'un solvant organique, notamment le faible coût et la vérification rapidede la concentration, et décrit un dosage de la microplaque fluorescente puissant pour surveiller les effets chimiques sur la dégranulation des mastocytes.

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Protocol

Notez que toutes les recettes tampons sont inclus dans un tableau à la fin du texte du protocole.

JOUR 1:

1. Préparation des cellules

  1. Planifiez 96 puits schéma d'installation de la plaque, centrage des échantillons d'essai sur le tracé afin d'éviter les effets de bord. Allouer trois répétitions pour chaque TCS concentration testée (± dégranulation stimulant de l'antigène ou ionophore), ainsi que trois exemplaires pour la libération spontanée (pas stimulant de dégranulation), libération maximale (0,2% de Triton X-100 [TX] détergent lyse), ainsi que puits réservé aux échantillons de fond (qui ne contiennent pas de cellules). Pour chaque jour de l'expérience répétition, choisissez une nouvelle disposition aléatoire des concentrations des échantillons TCS.
  2. Chaud médias RBL (recette fournie dans le tableau) et la trypsine dans 37 ° C au bain d'eau.
  3. Vérifiez cellules RBL par T-25 flacon (2-4 jours depuis le dernier passage et à moins de 3-4 mois, car ils ont été décongelés) des signes généraux d'une bonne guérisonth: pH correct indiqué par la couleur des médias, et l'absence de nébulosité. Placer le ballon sous un microscope optique pour confirmer que le flacon est exempt de contamination et que les cellules semblent en bonne santé, bien confluent, et surtout attaché. Notez que les cellules doivent être vérifiés pour contamination par des mycoplasmes environ toutes les six semaines 22.
Traitement Triplicatas
Stimulée, 0 uM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Stimulée, 0,001 uM TCS F6, G6, H6
Stimulée, 0,1 uM TCS A4, B4, C4
Stimulée, 1 uM TCS A6, B6, C6
Stimulée, 5 um TCS F5, G5, H5
Stimulée, 10 uM TCS A3, B3, C3
Stimulée, 15 uM TCS A5, B5, C5
Stimulée, 20 uM TCS F7, G7, H7
Stimulé, plus haut [TCS] F3, G3, H3
Spontané, No TCS (comprend moque) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, No TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Aucune cellule, Fond, plus haut [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

Figure 1
Cliquez ici pour agrandir l'image .

  1. Prenez le flacon de cellules RBL dans la culture de tissu stérile (TC) de la hotte. Les cellules sont fixées au bottom du ballon. Travaillant sous le capot TC et utilisant une technique stérile standard, Retirez tous les supports flacon avec pipette stérile, les cellules restent attachées au fond du flacon. Ensuite, rincer flacon avec 2 ml de trypsine, puis jeter ce lavage.
  2. Ajouter exactement 2 ml de trypsine pour couvrir le fond du flacon. Mise en incubation à 37 ° C pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher du fond du flacon.
  3. Après 5 min, a frappé le côté de la fiole avec une paume ouverte pour desserrer les cellules. Immédiatement, ajouter 18 ml médias RBL pour laver les cellules hors du ballon et d'étancher la trypsine. Prendre immédiatement le mélange de cellules-media-trypsine sur le flacon et transférer dans un nouveau tube stérile de 50 ml (volume total dans ce tube est maintenant de 20 ml).
  4. Après avoir mélangé doucement mais complètement, retirez 50 pl de suspension cellulaire à partir de ce tube, et de les transférer dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml, ce qui est un exemple pour être comptés. Prenez cet échantillon, ainsi que les 50 ml0; tube contenant le mélange de cellules-media-trypsine sur le capot TC à la paillasse.
  5. Faites tourner le tube de 50 ml dans la centrifugeuse (avec équilibre) pendant 8 min à 500 xg; cette force cellules pellets efficacement.
  6. Au cours de la durée de rotation, de compter les cellules dans l'échantillon qui ont été isolés avant le filage. Pour ce faire, commencez par ajouter 50 ul de colorant bleu trypan à 50 pi de cellules dans un tube de 1,5 ml, et doucement mais complètement pipette de haut en bas 5x pour mélanger. Immédiatement, transférer 10 ul de ce mélange à la hématocytomètre de verre, et compter les cellules dans la zone de la grille en suivant les instructions du fabricant. Comptez au moins 100 cellules pour obtenir des résultats statistiques raisonnables.
  7. Retour dans la hotte TC, retirer le surnageant de cellules qui ont été centrifugée.
  8. Boucher le tube de la cellule, et feuilleter culot au fond du tube pour détacher des cellules.
  9. Ajouter des médias sur les cellules trypsinisés pour obtenir une densité de 0,5 x 10 6 cellules / ml, sur la base du nombre de cellules. Mais bien mélanger délicatement pour garder les cellules en suspension lors de la procédure de placage. L'utilisation d'un Pipetman, mettre 100 cellules / puits dans une plaque de 96 puits (, fond noir mat), suite à la feuille de modèle de plaque. Randomisent comment les cellules sont ajoutées dans les puits afin d'éviter une erreur systématique, et mélanger après chaque ensemble de trois puits sont ajoutés. Veillez à ne pas mettre les cellules dans les puits marqués pour les échantillons de fond.
  10. Une fois que toutes les cellules ont été transférées, placez le couvercle de la plaque sur la plaque, et transfert à l'étuve (37 ° C / 5% de CO 2) pendant une nuit. Nettoyer après une technique stérile standard.

JOUR 2:

2. Préparation du Triclosan

  1. En utilisant une éprouvette graduée, mesure 250 ml Tyrodes Buffer (recette fournie dans le tableau) dans un Erlenmeyer de 500 ml portant la mention «TCS-tampon." Ajouter une barre d'agitation. Utiliser de la verrerie, le barreau d'agitation, d'un thermomètre désigné pour une utilisation avec TCS seulement.
  2. Toujours à cette époque, mesure 250Tyrodes ml dans un flacon séparé 500 Erlenmeyer, "tampons de contrôle." étiqueté verrerie de l'utilisation, mélanger bar, un thermomètre qui ne sont pas désignés pour TCS. Ajouter une barre d'agitation.
  3. Peser 0,0022 g de granulés TCS et transférer dans une fiole "TCS-tampon" (qui contient 250 ml Tyrodes Buffer). Pour transférer efficacement granulés Erlenmeyer, utiliser 10 ml à partir de la mesure 250 ml Tyrodes à laver peser bateau, en s'assurant que tous TCS a été transféré.
  4. Lieu flacon "TCS-tampon» sur une plaque de cuisson de combinaison / plaque d'agitation magnétique, et mis à agiter à une vitesse manageably élevé. Une fois bien mélangé, ce stock TCS nominalement de 30 uM (concentration réelle sera calculé après chauffage). (Faites tout ce mélange dans une hotte chimique.)
    1. Toujours à cette époque, placer le "tampon contrôle" flacon (ne contenant pas TCS) sur une seconde plaque de cuisson / plaque d'agitation magnétique de combinaison et mettez-le sous agitation à une vitesse similaire.
  5. Allumez la lampe UV / Vis à réchauffer la lampe pour une utilisation ultérieure.
  6. Chauffer la solution "TCS-tampon" à 50 ° C en remuant constamment. Une fois à température, temps pendant 90 min. Au cours de la 90 min, continuera de surveiller la température à 50 ° C et la vitesse d'agitation approprié fréquemment.
    1. En même temps, chauffer la solution "tampon de contrôle" (qui est juste 250 ml de tampon Tyrode plaine) à 50 ° C avec agitation continue. Après avoir atteint 50 ° C, le temps de 90 min, pendant laquelle la température dans le temps (tenue à 50 ° C) et l'agitation sont tous les deux contrôlés.
  7. À la fin des années 90 min, prendre les deux erlenmeyers hors les plaques chauffantes et le transfert à la paillasse.
  8. Utilisation de la fonction de balayage de longueur d'onde sur un spectrophotomètre UV / Vis, vide la machine sur 1 ml de la solution chauffée "de commande de tampon" avant de numériser 1 ml de solution chauffée "TCS-tampon». Vérifiez la forme du spectre, uned enregistrement valeur d'absorbance à 280 nm. Pour déterminer la concentration, utiliser l'équation de Beer-Lambert (A 280 = ε 280 ℓ c) en utilisant un ε 280 de 4200 L / mol / cm et 12 ℓ de 1 cm.
  9. Après avoir déterminé la concentration TCS, ajouter 0,249 g de sérum albumine bovine (BSA) à la 249 ml restants de la solution "TCS-tampon», et bien mélanger.
    1. Simultanément, ajouter 0,249 g BSA au 249 ml restants de la solution "tampon de contrôle", et bien mélanger.

JOUR 2:

3. Antigène stimulée par dosage de dégranulation Utilisation des cellules RBL-2H3

  1. Avant de commencer, vérifiez le pH de tous les tampons utilisés, et de s'assurer qu'ils sont clairs et non trouble: cela inclut tampon de Tyrode, un tampon d'acétate de sodium, le carbonate et le tampon glycine (recettes présentées dans le tableau).
  2. Chaudes médias RBL et la trypsine dans 37 ° C au bain d'eau.
  3. Assurez-BT (1 mg / ml0; BSA dans un tampon Tyrode): 0,05 g de BSA + 50 ml de tampon Tyrode (X2). Mettre dans le 37 ° C au bain d'eau.
  4. Faire 0,2% de Triton X-100: 3.136 ml de BT + 64 pl de 10% de Triton X-100 (concentration finale de Triton X-100 est de 0,2%). Bien mélanger par inversion, mais ne vortex. Mettre dans le 37 ° C au bain d'eau.
  5. Commencer la préparation du TCS et du tampon Tyrode chauffée (étapes "2" ci-dessus). Remarque: Ne commencez pas à l'étape suivante (exposition IgE) jusqu'à ce que le "TCS-tampon» et solutions "de commande de tampon" atteignent 50 ° C et agiter pour le 70 premières minutes du temps de 90 min de chaleur / remuant.
  6. Une fois les deux solutions ont été agités à 50 ° C pendant 70 min, faire hausse de 0,1 pg / ml anti-DNP IgE de souris (Sigma) dans les médias RBL pour puits d'échantillon d'être sensibilisés (100 pl / puits). IgE actions ne devrait pas être plus de 30 jours lorsqu'il est conservé à 4 ° C; enregistrer quel âge le stock est. Feuilletez pour mélanger, mais ne vortex IgE.
  7. Sous une hotte TC,ajouter 0,6 ul Stock IgE (actions est de 1 mg / ml) à 6 ml médias RBL dans un tube de 50 ml. Dans un second tube de 50 ml, ajouter 6 ml de milieu RBL plaine seulement (ce qui est prévu pour échantillons non sensibilisés).
  8. Vidage de tous les médias de plaque de 96 puits (qui a été préparé à J1) dans l'évier, et mettre la plaque sous le capot TC.
  9. Ajouter hasard 100 médias ul / mélange IgE aux puits qui devraient être stimulées (48 puits au total). Ce mélange n'est pas destiné à «spontané», les échantillons «de fond» «TX», et.
  10. Ajouter au hasard 100 pi support ordinaire RBL seulement pour les «TX», «spontanée» et «puits de fond».
  11. Remettre le couvercle de la plaque sur la plaque, puis déplacer la plaque dans 5% de CO 2/37 ° C incubateur pendant 1 heure.
  12. Pendant 1 heure d'incubation, suivez les étapes 3.13 à 3.24.
  13. Sur la paillasse, préparer les dilutions d'antigène. Ajouter 0,53 ul de 1,6 mg / ml de bouillon DNP-BSA + 850 pi & #160; BT pour obtenir une concentration en antigène de 1 pg / ml. Vortex et inverser ce stock pour mélanger.
  14. Une fois "TCS-tampon» et «tampon de contrôle" ont été chauffés puis agité pendant 90 min à 50 ° C, continuer sur le reste de la préparation pour le protocole TCS (aller à étapes 2.6 - 2.8.1). Après la BSA est dissous dans les deux solutions, continuez ci-dessous.
  15. Commencer à préparer les tampons d'exposition, avec ± Ag, ± TCS. Tout d'abord, à partir de l'échantillon de 249 ml de solution "TCS-tampon" (qui a déjà été chauffé et agité pendant 90 min), 50 ml de transfert à un nouveau tube conique de 50 ml. Retirer 20 pi de cette aliquote 50 et remplacez-le par 20 pi de l'antigène 1 pg / ml préparée plus tôt pour une concentration en antigène finale de 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex et inverser.
    1. Étiquette cette "Tube 1, Haute TCS / + Ag / + BT." Elle est utilisée pour les dilutions et plus l'exposition de concentration TCS.
    2. Sur l'échantillon de 249 ml de solution "tampon de contrôle", transférer 50 ml dans un nouveau tube de 50 ml. Retirer 20 pi de cette nouvelle aliquote de 50 ml et les remplacer par 20 pi de l'antigène 1 pg / ml préparée plus tôt pour une concentration en antigène finale de 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex et inverser.
      1. Étiquette cette "Tube 2, No TCS / + Ag / + BT". Utilisé pour les dilutions TCS et 0 pM exposition de concentration TCS.
    3. Maintenant, prenez 50 ml de solution "TCS-tampon" et mettre dans un autre tube de 50 ml. Retirer 20 ul de cette nouvelle aliquote de 50 ml et la remplacer par 20 pi de plaine BT. Vortex et inverser. Aucun antigène est ajouté.
      1. Nommez ce "Tube 3, Haute TCS / Non Ag / + BT." Ceci est utilisé pour le fond.
    4. Transférer 50 ml de solution "tampon de contrôle» à un autre tube de 50 ml. Sortez 20 pi de cette NE w 50 ml aliquote et remplacez-le par 20 pi de plaine BT. Vortex et inverser. (Non Ag est ajouté.)
      1. Nommez ce "Tube 4, No TCS / Non Ag / + BT." Ceci est utilisé pour le fond et les échantillons spontanés.
    BSA TCS Antigène
    Tube 1 Coche High [] Coche
    Tube 2 Coche NO Coche
    Tube 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> High [] NO
    Tube 4 Coche NO NO
    1. Calculer et enregistrer des volumes de dilutions après la détermination de la concentration du stock "TCS-tampon». Le volume total pour chaque concentration de dilution devrait être de 1 ml et doit être préparé dans un tube à centrifuger stérile. Utilisez P2 calibré et P1000 Pipteman.
    Concentration Haute Triclosan + Tyrodes + BSA 0,0004 ug / ml Ag
    (Tube 1 ci-dessus)     		Chauffé BT 0,0004 ug / ml Ag
    (Tube 2 ci-dessus)
    20 uM
    10 uM
    5uM
    1 nM
    0,1 uM
    0,001 uM
    0 uM (haut de la plaque) ----------------------- 500 pi plus un autre 500 pi
    0 uM (en bas de la plaque) ----------------------- 500 pi plus un autre 500 pi
    1. Après 1h IgE incubation, se plaque sur incubateur et mélanger tous les médias dans l'évier. (Note: si des produits chimiques de test sont connus pour être plus toxiques que le produit consommateur TCS, l'élimination des déchets dangereux peut être nécessaire.)
    2. L'utilisation d'un Combitip, lavez hasard cellules dans la plaque de 96 puits avec BSA-Tyrodes Buffer (200pl / puits). Libérer le tampon de lavage sur les côtés du puits, plutôt que directement sur les cellules fixées, afin d'éviter de perturber les cellules attachées. Répétez le processus une deuxième fois.
    3. Pour préparer les traitements pour l'application, vortex et inverser dilutions droite avant l'addition à la plaque.
    4. En commençant par la partie supérieure de la plaque: ajouter au hasard trois exemplaires de 200 ul chacune des solutions d'antigène (avec des concentrations correctes de TCS) dans les puits correspondants. Continuez vers le bas de la plaque. Ajouter la solution "de commande de tampon" plus Ag (de "Tube 2" ci-dessus) pour tous "se moque" de la plaque.
    5. Ajouter 200 pi de solutions appropriées aux puits correspondants:
      1. Ajouter 200 ul de 0,2% de Triton X-100 puits à "TX" désignés.
      2. Ensuite, ajouter 200 pi du tube 3 pour les 3 puits étiquetés «Background (BKGD)-Plus TCS" sur la plaque.
      3. Enfin, ajouter 200 ulTube de 4 à 6 puits étiquetés «spontanée».
    6. Incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C / 5% de CO 2.
    7. Pendant 1 h d'incubation: Obtenez deux seaux de glace (un pour la plaque "vieux" dans l'incubateur et un pour nouvelle plaque). Dégel 4 méthylumbelliféryl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide (4-MU) à température ambiante pendant jusqu'à 40 minutes, en gardant à l'aluminium car il est sensible à la lumière.
      1. Une fois 4-MU stock est décongelé, maquillage solution 4-MU travail: 150 Stock pl + 14,85 ml de tampon acétate froid (recette donnée dans le tableau); vortex et retourner. Gardez dans un tube à centrifuger de 50 ml, enveloppé dans du papier, et sur la glace jusqu'à utilisation.
      2. Utiliser Combitip, ajouter hasard 100 pi solution de travail 4-MU froid dans le fond de chaque puits d'une nouvelle Grenier noir de plaque de 96 puits (le seau à glace # 2). Lancer première en ajoutant la solution de travail de manière aléatoire à l'intérieur de la partie supérieure de la plaque, de façon aléatoire à l'intérieur de la partie inférieure de la plaque, de façon aléatoire à l'intérieur de Triton X-100 puits,et, enfin, de façon aléatoire à l'intérieur de puits de fond.
      3. Sortez nouvelle boîte de P200 conseils pour la prochaine étape.
    8. A la fin du 1-h d'incubation, mettre la plaque de cellules de l'incubateur sur seau à glace # 1, pipette surnageant de haut en bas 4-5x (doucement, ne pas introduire de bulles), en passant autour du puits pour un bon mélange mais sans toucher les cellules tout en mélangeant . Systématiquement, prendre 25 ul d'échantillon dans chaque puits et la placer dans la nouvelle plaque avec le substrat (le même ordre d'échantillons, comme prévu initialement out). Introduire à la pipette de haut en bas pour mélanger l'échantillon à fond quand à nouveau puits, sans introduire de bulles.
    9. Incuber pendant 30 min à 37 ° C / 5% de CO 2.
    10. Après 30 minutes d'incubation, ajouter 200 pi au hasard de froid tampon glycine-carbonate par puits (en utilisant Combitip) pour remplir les puits jusqu'à 325 pi totale. (Ajoutez Cet ajout au Triton X-100 échantillons dernier, pour éviter de Triton X-100 débordement). Vérifiez les bulles avant plaque de lecture (poche avec une pipette propre P10te pointe à la pop des bulles).
    11. Exécutez la plaque dans le lecteur de plaque à fluorescence (allez à la section 4).

    JOUR 2:

    4. Instructions du lecteur de plaque fluorescente et analyse des données

    1. Ouvrez Gen5 programme, et la section d'expérimentation ouverte.
    2. Allumez le lecteur de plaque et la plaque d'insertion (coin supérieur gauche est A1).
    3. Protocole Flèche Procédure Flèche Lire à mettre lectures personnalisées. Ne pas ajouter quoi que ce soit sur ​​des échantillons, répétitions, etc, afin de recueillir des données de fluorescence brutes de chaque puits.
    4. Sous la rubrique «Lire», choisissez «fluorescence», «Endpoint», «vitesse normale», «Gain 40", "excitation 360/40», «Emission 460/40," position Optique: Top 50%. Top optique décalage: 7mm. Aucune secousse, aucun retard, aucun cinétique, aucun moniteur bien, température: incubateur off.
    5. Choisissez fond noir mat, plaque de 96 puits (Grenier 96 puits, fond plat).
    6. Traiter avec la disposition de la plaque: Protocole Flèche le plan de la plaque. Mettre en place des échantillons sans indiquer répète, dilutions, etc
    7. Plate Flèche lire.
    8. Enregistrer le fichier: Cliquez sur le bouton "Excel", qui exportera fichier de données au format Excel. Pour ce faire, la mise en page de la plaque et de la matrice. Enregistrez le fichier sur l'ordinateur et sur une clé USB.
    9. Dans Excel, il faut soustraire la moyenne de lecture de base de chaque échantillon, y compris Triton X-100 puits.
    10. Calculer relatif% dégranulation en divisant chaque valeur (ayant déjà avaient fond soustrait) par le Triton X-100 Valeur moyenne, puis multiplier par 100 pour obtenir un pourcentage.
    11. Moyenne tous les trois exemplaires, et de calculer l'écart type. Représenter graphiquement des données dans Excel que les valeurs moyennes ± écart-type. Pour les tests statistiques, maintenant passer par le logiciel Prism GraphPad.

    JOUR 2:

    5. Test de dégranulation Ionophore stimulée Utilisation des cellules RBL-2H3

    1. Suivez protocole pour "Préparation de cellules» (article 1, Jour 1) et «Préparation du triclosan» (article 2, Jour 2), comme indiqué ci-dessus. L'exemple de disposition de la plaque de stimulation ionophore est illustré ci-dessous.
    Traitement Triplicatas
    Stimulée, 0 uM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
    Stimulée, 0,001 uM TCS F6, G6, H6
    Stimulée, 0,01 um TCS F3, G3, H3
    Stimulée, 0,1 uM TCS A4, B4, C4
    Stimulée, 1 uM TCS A6, B6, C6
    Stimulés, 5 um [TCS F5, G5, H5
    Stimulée, 10 uM TCS A3, B3, C3
    Stimulée, 15 uM TCS A5, B5, C5
    Stimulée, 20 uM TCS F7, G7, H7
    Spontané, avec DMSO, aucune TCS (comprend moque) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
    TX-100, avec DMSO, aucune TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
    Pas cellules fond, avec le DMSO, plus haut [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

    Figure 1 Cliquez ici pour agrandir l'image .

    1. Avant de commencer, vérifiez le pH de tous les tampons utilisés, et de s'assurer qu'ils sont clairs et non trouble. Tyrodes, le tampon d'acétate de sodium et de carbonate de tampon glycine (recettes présentées dans le tableau).
    2. Préparer un tube conique de 50 ml de BT en ajoutant 0,05 g BSA au tampon de Tyrode 50 ml et par vortex pour bien mélanger. Incuber à 37 ° C au bain d'eau.
    3. Ajouter 0,2% de Triton X-100 à 0,0032% de DMSO (la concentration en véhicule de l'ionophore calcique finale) en ajoutant 96 pl de 10% de Triton X-100 à 4,704 ml BT. Mélangez bien. Ensuite, sortez 0.155 pi de cette solution et la jeter. Maintenant, ajoutez retour à 0.155 pi de DMSO à 100%.
    4. Préparer un stock de 5 mM (2,5 mg / ml) de l'ionophore A23187 à partir de poudre en ajoutant 400 ul de frais 100% de DMSO dans le flacon de ionophore et vortex pour mélanger. Une fois en solution,transférer dans un tube conique de 1,5 ml, contenu de l'enregistrement et la date d'expiration et d'aujourd'hui (3 mois de préparation dans des conditions appropriées à -20 ° C).
      1. Sinon, si vous utilisez un stock congelé aujourd'hui, dégel de la glace, et vérifier que le mM ionophore A23187 5 est bien mélangé et clair. Vortex, chiquenaude, et inverser ce stock avant de l'utiliser. Record date de préparation et de Lot # de cette A23187.
    5. Une fois "TCS-tampon" et "tampon de commande" ont été chauffés et agités pendant 90 min, continuer le reste de la préparation pour le protocole TCS (aller étapes 2.6-2.8.1). Après la BSA est bien mélangé dans les deux solutions, continuez avec les étapes du protocole restants.
    6. Sur l'échantillon de 249 ml de solution "TCS-tampon", transférer 50 ml dans un nouveau tube conique de 50 ml. Enlevez 1,8 pl de la aliquote 50 et ajouter 1,8 ul de 5 mm stock ionophore. Vortex 3x pendant 8 secondes et inverser 3x. Concentration de ionophore final est de 180 nm. Notez que cette concentration de A23187 variera en fonction des stocks puissance, et une relation dose-réponse A23187 ionophore est recommandé d'identifier une concentration de A23187 qui suscite un niveau de dégranulation d'environ 20% libération maximale, qui a été identifié comme un non cytotoxique à RBL-2H3 cellules par test de cytotoxicité (voir 2).
      1. Étiquette cette "Tube 1, Haute TCS / + Ionophore / + BT.» Utilisée pour les dilutions et plus l'exposition de concentration TCS.
    7. Sur l'échantillon de 249 ml de solution "tampon de contrôle", transférer 50 ml dans un nouveau tube conique de 50 ml. Sortez 1,8 pl de la aliquote 50 et rajouter dans 1,8 l de 5 mm stock ionophore. Vortex 3x pendant 8 secondes et inverser 3x. Concentration de ionophore final est de 180 nM.
      1. Étiquette cette "Tube 2, No TCS / + Ionophore / + BT." Elle est utilisée pour la dilution et 0 pM concentrations TCS.
    8. Sur l'échantillon de 249 ml de R 20; solution TCS-tampon ", transférer 50 ml dans un nouveau tube conique de 50 ml. Sortez 1,8 l de la nouvelle aliquote de 50 et ajouter 1,8 ul de DMSO à 100%. Vortex 3x pendant 8 secondes et inverser 3x, pas ionophore est ajouté.
      1. Étiquette cette "Tube 3, Haute TCS / Non Ionophore / + BT + / DMSO"; utilisé pour le fond.
    9. Sur l'échantillon de 249 ml de solution "tampon de contrôle", transférer 50 ml dans un nouveau tube conique de 50 ml. Sortez 1,8 ul de la nouvelle aliquote de 50 et ajouter 1,8 ul de DMSO à 100%. Vortex 3x pendant 8 secondes et inverser 3x. N ionophore est ajouté.
      1. Étiquette cette "Tube 4, No TCS / Non Ionophore / + BT + / DMSO"; utilisé pour les échantillons de libération spontanée.
    BSA TCS Ionophore Ajouté à 100% de DMSO
    Tube 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> High [] Coche NO
    Tube 2 Coche NO Coche NO
    Tube 3 Coche High [] NO Coche
    Tube 4 Coche NO NO eck marque "fo: content-width =" .1 "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/>
    1. Calculer et enregistrer des volumes de dilutions après la détermination de la concentration du stock "TCS-tampon». Utilisez P2 calibré et P1000 Pipteman. Le volume total pour chaque concentration de dilution devrait être de 1 ml, et doit être préparé dans un tube à centrifuger stérile:
    <td>
    Concentration Haute Triclosan + Tyrodes + BSA +180 nM A23187 (Tube 1 ci-dessus) Chauffé BT +180 nM A23187 (Tube 2 ci-dessus)
    20 uM
    15 pm
    10 uM
    5uM
    1 nM
    0,1 uM
    0,001 uM
    0 uM (haut de la plaque) ---------------------------------- 500 pi plus un autre 500 pi
    0 uM (en bas de la plaque) ---------------------------------- 500 pi plus un autre 500 pi
    1. Prenez les cellules ensemencées hier de l'incubateur, et vider les médias dans l'évier. L'utilisation d'un Combitip, lavez hasard cellules dans la plaque de 96 puits avec BT (200 pl / puits). Répétez le lavage une deuxième fois.
    2. Pour préparer les traitements pour l'application, vortex et inverser dilutions droite avant l'addition à la plaque. En commençant par la partie supérieure de la plaque: ajouter au hasard trois exemplaires de 200 pi chacun de la concentration correcte du TCS à la corresponding bien. Continuez vers le bas de la plaque. Ajouter la solution "de commande de tampon" plus A23187 (de "Tube 2" ci-dessus) pour tous "se moque" de la plaque.
    3. Ajouter 200 pi de solutions appropriées aux puits correspondants:
      1. Ajouter 200 ul de 0,2% de Triton X-100 puits à "TX" désignés.
      2. Ensuite, ajouter 200 pi du tube 3 pour les 3 puits étiquetés «Background (BKGD)-Plus TCS" sur la plaque.
      3. Enfin, ajouter 200 pi du tube 4 à six puits étiquetés «spontanée».
    4. Incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C / 5% de CO 2.
    5. Au cours de l'heure d'incubation 1: Obtenez deux seaux de glace (un pour la plaque "vieux" dans l'incubateur et un pour nouvelle plaque). Dégel 4 méthylumbelliféryl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide (4-MU) à température ambiante pendant jusqu'à 40 minutes, en gardant à l'aluminium car il est sensible à la lumière.
      1. Une fois 4-MU stock est décongelé, maquillage 4-MU travail solutisur 150 Stock ul + 14,85 ml de tampon acétate froid (recette donnée dans le tableau); vortex et retourner. Gardez dans un tube à centrifuger de 50 ml, enveloppé dans du papier, et sur la glace jusqu'à utilisation.
      2. Utiliser Combitip, ajouter hasard 100 ul solution de travail 4-MU froid dans le fond de chaque puits d'une nouvelle Grenier noir de plaque de 96 puits (le seau à glace # 2): commencer d'abord par l'ajout de la solution de travail de manière aléatoire dans le haut de la plaque, de façon aléatoire à l'intérieur de la partie inférieure de la plaque, de façon aléatoire à l'intérieur de Triton X-100 puits, et, enfin, de façon aléatoire à l'intérieur de puits de fond.
      3. Sortez nouvelle boîte de P200 conseils pour la prochaine étape.
    6. A la fin du 1-h d'incubation, mettre la plaque de cellules de l'incubateur de seau à glace # 1, pipette surnageant de haut en bas 4-5x (doucement, ne pas introduire de bulles), en passant autour du puits pour un bon mélange mais sans toucher les cellules tout en mélangeant . Systématiquement, prendre 25 ul d'échantillon dans chaque puits et la placer dans la nouvelle plaque avec le substrat (même ordre de samples, comme initialement planifié). Introduire à la pipette de haut en bas pour mélanger l'échantillon à fond quand à nouveau puits, sans introduire de bulles.
    7. Incuber pendant 30 min à 37 ° C / 5% de CO 2.
    8. Après 30 minutes d'incubation, ajouter 200 pi au hasard tampon glycine-carbonate froid par puits (en utilisant Combitip) pour remplir les puits jusqu'à 325 pi totale (faire cette addition de Triton X-100 échantillons derniers, afin d'éviter Triton X-100 débordement). Vérifiez les bulles avant plaque de lecture (poussez avec la pointe de pipette propre P10 à la pop des bulles).
    9. Exécutez la plaque dans le lecteur de plaque à fluorescence (Suivez toutes les étapes de la section 4).

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Representative Results

Lorsqu'il est chauffé à 50 ° C pendant 90 min, le spectre d'absorption UV-Vis pour TCS produit une forte courbe lisse entre ~ 260 et 300 nm, avec un pic à 280 nm, comme le montre la figure 1. Spectrophotométrie UV-Vis est donc un outil important qui peut être utilisé pour calculer la concentration, puisque le coefficient d'absorption molaire publié à 280 nm est 4,200 L / mol / cm 12. Nous avons constaté que TCS ne tombe pas de solution au cours de la période de toute l'expérience de dégranulation, après le chauffage ° C 50 (données non présentées).

Après l'utilisation de cette méthode de chauffage pour dissoudre TCS directement dans le tampon aqueuse, nous avons examiné l'effet du SDC sur la dégranulation des mastocytes en utilisant un dosage basé sur la fluorescence qui a été optimisé de Naal et al. 1 Ce test enregistre le niveau de β-hexosaminidase libérée de mât cellules après une incubation d'une heure de détection d'un produit de substrat fluorogène. Que ce soit stimulé pour dégranuler par DNP-BSUn antigène (Figure 2) ou le calcium ionophore A23187 (Figure 3), on peut clairement voir que TCS provoque une inhibition dose-réponse significative de la libération de β-hexosaminidase (c. dégranulation).

Figure 2 est représentative des résultats obtenus pour les cellules RBL IgE sensibilisés, qui ont été incubées pendant 1 heure dans "TCS-tampon" ou "buffer de contrôle», et exposés à une dose d'antigène DNP-BSA de 0,0004 ug / ml. Cette concentration de DNP-BSA a suscité une réaction de dégranulation absolue moyenne de 22,5% ± 0,1 (moyenne ± écart-type) en l'absence de TCS. Inhibition statistiquement significative de la dégranulation a commencé à 5 pm, où les niveaux de dégranulation étaient de 0,79 ± 0,05 fois (moyenne ± écart type) des niveaux de contrôle TCS 0 um. Comme la concentration TCS augmente, il ya un effet d'amortissement plus élevé des TCS, montrant une relation dose-réponse forte. TCS, à 20 uM, almost abroge totalement la réaction de dégranulation, à un niveau à peu près égal à la dégranulation spontanée (où aucun antigène est présent). Dans l'ensemble, ce chiffre montre une forte inhibition de la dégranulation des mastocytes antigène multivalent stimulé raison de la concentration validées par TCS, sans l'utilisation de solvants organiques.

Dans la figure 3, le calcium ionophore A23187 a été utilisé comme un moyen d'étudier le mécanisme de TCS-induite amortissement de la dégranulation des mastocytes dans RBL. A23187 est utilisé comme alternative stimulant car il contourne la réticulation FcsRI et d'autres événements de signalisation en amont de l'afflux de calcium, mais encore provoque une dégranulation. Mastocytes RBL ont été incubées pendant 1 heure dans "TCS-buffer" ou "tampon de contrôle", contenant une dose d'ionophore calcique de 180 nM. En l'absence de TCS, cette concentration de A23187 induit une réponse de dégranulation absolue moyenne de 25,1% ± 4,7 (moyenne ± écart-type). L'inhibition de la dégranulation étaittrouvé avec aussi peu que 1 pm TCS (0,63 ± 0,11 [moyenne ± écart-type]). Comme TCS concentration augmente, il en va de la gravité de l'inhibition: à 5 pm, 0,21 fois ± 0,04 des niveaux de contrôle TCS 0 pm; à 10 pm, 0,09 ± 0,05; à 15 um, 0.077 ± 0.006, et à 20 pm , 0,09 ± 0,02 (moyenne ± écart-type). En fait, à partir de 5 uM et des concentrations plus élevées de TCS, les niveaux de la dégranulation induite par A23187 ont été trouvés pour être près du niveau de contrôle spontané (où aucun A23187 est présent à tous). Dans l'ensemble, la figure 3, en combinaison avec la figure 2, indique que les événements moléculaires ciblées par TCS en aval sont susceptibles d'afflux de calcium.

Figure 1
Figure 1:. Représentant TCS spectre d'absorption UV-Vis TCS a un pois robustek à 280 nm, ce qui permet de déterminer facilement A 280, ainsi que offrant la possibilité d'utiliser le coefficient d'extinction molaire de 4200 l / mole / cm 12 pour déterminer la concentration réelle de TCS dissous dans du tampon Tyrode. La ligne jaune indique le pic à 280 nm. Dans cet exemple, la valeur d'absorption à 280 nm est 0,11876, ce qui indique une concentration TCS de 28,28 iM. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2
Figure 2:. Une réponse de dégranulation représentant des mastocytes RBL IgE-sensibilisées exposées à 0,0004 ug / ml antigène DNP-BSA et TCS (0-20 M) Une valeur de libération spontanée (sans antigène présent) est représenté à titre de référence. Les valeurs représentent la moyenne7; écart-type des échantillons en triple. Tel que présenté, les données ont été normalisées au contrôle (0 iM TCS), et des différences significatives ont été déterminées dans le logiciel Prism avec une ANOVA à un facteur suivie post hoc d'un test de Tukey (comparaisons effectuées à 0,001 uM réponse moyen TCS). La signification est représentée par *** p <0,001. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3:. Une réponse de la dégranulation des mastocytes représentant RBL stimulées avec 180 nM A23187 Ionophore de calcium en présence de TCS (0-20 M) Un échantillon de libération spontanée (pas ionophore présent) est représenté à titre de référence. Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type des échantillons en triple. Comme presented, les données sont normalisées au contrôle (0 iM TCS), et des différences significatives ont été déterminées dans le logiciel Prism avec une ANOVA à un facteur suivie post hoc d'un test de Tukey (comparaisons effectuées à 0,001 uM réponse moyen TCS). La signification est représentée par *** p <0,001; ** p <0,01. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

En 2004, Naal et al. 1 développé un biocapteur des mastocytes de test à haut débit de la dégranulation. Il s'agit d'un test robuste que nous avons adapté à nos études TCS et détaillées dans cette vidéo. Avant la Naal et al. 1 essai, la dégranulation des mastocytes a été évaluée régulièrement par β-hexosaminidase 59-61, mais ces premières méthodes utilisées fluoromètres dont un échantillon a été lue à la fois. Surtout, Naal et al. concordance directe établie entre leur méthode plus haut débit en utilisant un lecteur de microplaques et la méthode antérieure dans laquelle les échantillons ont été lus un à-la-fois dans un fluorimètre. En somme, Naal et al. 1 a grandement amélioré la vitesse, la puissance, la simplicité et la fiabilité du test en l'adaptant à une plate-forme de microplaques à haut débit, ainsi que par incorporation de plusieurs modifications au workflow. Ici, nous avons en outre conçu cet essai pour une étude de divers produits chimiques d'essai, en particulier, ici, Le médicament TCS omniprésent. Les détails de la vidéo décrit les étapes de ce test très utile. En outre, nous avons également développé une méthode organique sans solvant de l'application TCS dans un tampon aqueux, et nous montrer une procédure simple et peu coûteuse pour vérifier la concentration TCS. Ces méthodes devraient être utiles au champ apparemment croissant de triclosan toxicologie. Dans cette discussion, nous détaillons plusieurs considérations pour l'utilisation de ce test de dégranulation de tester d'autres produits chimiques ainsi.

TCS a été préparé directement dans un tampon aqueux sans l'aide de solvants organiques, la concentration a été vérifiée par spectrophotométrie UV-Vis (Figure 1), puis l'effet de TCS (<30 M) a été examiné sur la dégranulation des mastocytes (figures 2 et 3) , en utilisant un dosage de microplaques à fluorescence pour détecter la présence de la β-hexosaminidase, un marqueur de substitution de la dégranulation. Nous avons constaté que TCS est capable de freiner significativement la libération de β-hexosaminidase par les mastocytes RBL lorsqu'il est dissous dans une faible concentration de l'éthanol (0,24% vol / vol) 2 ou, comme représenté ici, directement dans un tampon aqueux. En renonçant solvant organique, nous voyons plus prononcée amortissement en antigène dégranulation induite par rapport à nos études dans lesquelles TCS a été dissous dans de l'éthanol de 0,24% (vol / vol). Par exemple, ici, nous avons démontré une réduction> 50% dans la dégranulation induite par l'antigène (0,46 fois ± 0,07), ce qui est beaucoup plus grand que le ~ 25% de réduction, nous avons signalé à 10 uM TCS dissous dans l'éthanol de 0,24% (0,76 fois ± 0,02) 2. Dans la même veine, nous avons déterminé des cellules A23187-stimulés que par 5 pm, TCS inhibe la dégranulation des niveaux de libération spontanée; cet effet n'a pas été démontré jusqu'à 10 uM TCS dans notre plus tôt, l'éthanol-utilisation, l'étude 2. Il ya deux raisons possibles à cette différence: soit un véhicule d'éthanol 0,24% 2 atténue la capacité du TCS pour inhiber cel mât actifl dégranulation ou le TCS nous utilisions était moins concentré que prévu (depuis concentrations n'ont pas été vérifiées par spectrophotométrie UV-Vis dans la précédente étude 2). En ce qui concerne la cible moléculaire de l'inhibition de la dégranulation des mastocytes du TCS, il survient probablement quelque part dans les transduction du signal en cascade en aval de l'afflux de calcium 2. Nous avons utilisé calcium ionophore A23187 comme un stimulant de la dégranulation de contourner les événements de signalisation précoces, et l'effet inhibiteur du TCS persisté, ce qui indique que l'objectif de TCS inhibition de la voie de la dégranulation n'est pas susceptible situé en amont de l'afflux de calcium. Nous avons précédemment montré que hérissement de la membrane de ces cellules est également supprimée en raison de traitement TCS, suggérant la possibilité d'une cible de voie commune 2.

Des études antérieures ont trouvé le spectre d'absorption du TCS ayant un pic maximal à 280 nm et un coefficient d'absorption molaire a été évaluée à 4200 L / mol / cm à cette wavelenGTH (à des valeurs de pH au-dessous du pKa) 12. Il a été démontré que le chauffage du TCS ne conduise pas à la dégradation thermique 57, et une autre étude a montré le succès à dissoudre dans l'eau TCS tout en étant chauffé à 50 ° C sans l'aide d'un solvant organique 56. Quand un nouveau produit chimique d'essai est utilisé, sa solubilité dans le tampon aqueux, bien sûr, doit être examinée attentivement. Nous avons également constaté que, lorsque l'on chauffe le TCS, la forme de l'affichage spectral n'est pas affecté s'il est chauffé pendant 40-90 min (données non présentées): cela suggère une absence de dégradation du TCS lorsqu'il est chauffé pendant une longue période de temps. Notez, cependant, que TCS dissolution est supérieure à 90 min à 40 min. Nous avons également confirmé que TCS ne tombe pas de solution pour la durée de l'expérience de dégranulation (données non présentées).

L'antigène DNP-BSA et les concentrations de ionophore de calcium utilisé dans cette étude ont été choisis sur la base des analyses et des antigènes de réponse ionophore dose, uneD ont été sélectionnés pour obtenir des niveaux modérés de dégranulation des figures représentatives 2 et 3. Un exemple d'une analyse dose-réponse de l'antigène peut être vu dans la figure 1A de notre précédent 2 de travail. Lors de la détermination de la concentration en antigène ou ionophore pour être utilisé dans votre expérience, il est important d'être conscient que les expériences de dose-réponse stimulants doivent être faites périodiquement, généralement au moins tous les deux mois, puisque les cellules RBL-2H3 fonctionnent parfois de manière variable. La concentration qui donne le pourcentage de dégranulation souhaité peut varier en fonction de l'âge des cellules et sur la préparation d'antigène / ionophore. En outre, comme nous l'avons vu avec l'arsénite inorganique 22, les pourcentages de dégranulation absolus (taux d'antigène utilisés) peuvent influer sur les niveaux de substances toxiques effets sur la dégranulation RBL, donc toxique dose-réponse devrait être fait à plusieurs différentes concentrations d'antigène / ionophore. Il est également important de considérer la conce finalentration de véhicule DMSO lors de la stimulation dégranulation avec ionophore, depuis la dégranulation est affectée par DMSO 62. Nous avons trouvé les concentrations de DMSO utilisées dans ce protocole n'affectent pas la dégranulation, des lectures de base, soit 0,2% de Triton X-100 valeurs 2.

En plus de l'antigène multivalent DNP-BSA et l'ionophore de calcium A23187, il existe plusieurs autres méthodes de stimulation RBL-2H3. Une de ces méthodes est la stimulation par l'exposition au composé 48/80 avec la quercétine 63. Une autre est la réticulation de récepteurs IgE liés avec une IgG anti-IgE, comme nous l'avons précédemment testé avec exposition TCS 2. Beaucoup d'autres méthodes de stimulation existent, et chacune de ces méthodes traite un aspect mécaniste différent de la dégranulation des mastocytes. Ce test de lecteur de plaque peut être adapté pour une utilisation avec la plupart de ces alternatives stimulateurs, élargissant ainsi son utilité.

Ce protocole de dégranulation a le potentiel pour être utilisé avec une grande variété de chemicals. Dans une étude de tout produit chimique de test en utilisant ce test, les contrôles doivent être exécutés dans les cas suivants: (1) l'effet de la substance d'essai sur le fond (pas de cellules) des lectures, (2) l'effet de la substance chimique sur la dégranulation spontané (cellules sans IgE , aucun antigène, aucun ionophore), (3) l'effet de la substance chimique sur-Triton-X 100 valeurs de cellules lysées (sans antigène, aucun ionophore). Ces tests peuvent être facilement travaillés dans la disposition de la plaque. Auparavant, nous avons trouvé le TCS touche aucun de ces trois paramètres 2. En outre, les tests doivent être effectués pour déterminer que le produit chimique d'essai n'interfère pas avec l'enzyme / substrat réaction β-hexosaminidase lui-même dans une préparation acellulaire, comme décrit dans la figure S1 de l'annexe A de la section de données supplémentaires de Palmer et al. 2 Nous avons constaté que TCS n'interfère pas avec la capacité de β-hexosaminidase à cliver le substrat fluorogénique 4-MU 2. Effets de toutes les solvants utilisés doivent également être considérésdans toutes ces expériences de contrôle. Par exemple, nous avons confirmé que le DMSO, solvant pour le ionophore, n'a aucun effet sur-X-100 Triton niveaux de fluorescence de l'échantillon (données non présentées). Nous notons également que nous avons sélectionné tous les plastiques utilisés dans cette étude pour ne contenant pas le perturbateur endocrinien du bisphénol A; Malheureusement, tous les plastiques actuellement sur ​​le marché ne contiennent probablement quelques perturber le système endocrinien, ce qui pourrait confondre les données 64.

Dans le cas où dépannage est nécessaire, plusieurs aspects potentiels de ce protocole devraient être revues. Par exemple, il se peut que (1) les niveaux de libération spontanée est trop élevé (supérieur à environ 7% des valeurs de lyse), (2) une relation dose-réponse avec soit stimulant et / ou un test chimique n'est pas respectée, ou (3) la concentration TCS en solution est trop faible (inférieure à 20 um). Dans le premier cas, un niveau élevé spontanée pourrait être une indication des cellules étant en culture trop longtemps ou être contaminé par des mycoplasmes, par conséquent, Essayez ces expériences sur des cellules RBL-2H3 qui ont été en culture entre 2-20 semaines, et de tester régulièrement pour les mycoplasmes. Si une réponse à la dose de stimulant n'est pas respecté, la concentration en stimulant dissous peut être trop faible, et les stocks devrait être refaite. À titre d'exemple, ionophore de calcium est généralement fourni sous forme de film mince, être reconstitué avec DMSO, ce qui nécessite une attention particulière et beaucoup vortex. En outre, un nouveau stock de ionophore avec un numéro de lot différent pourrait avoir une puissance différente simplement due à la variation de lot à lot; par conséquent, une réponse à la dose de dégranulation est recommandé à chaque stock de ionophore nouvellement acheté. Il est également intéressant de noter que l'absence apparente d'effet avec un produit chimique d'essai donnée pourrait être une indication que ce produit chimique peut nécessiter une période d'incubation plus longue afin de provoquer un effet. Si vous n'êtes pas atteindre un rendement élevé TCS en solution, vérifier que la température est restée constante (50 ° C ± 5) tandis que les granules se dissolvent dans la mémoire tampon. Til thermomètre ne doit jamais toucher le fond du flacon, une position qui aboutirait à une surestimation de la température de la solution. Aussi, assurez-vous qu'il ya une agitation vigoureuse constants et que le compte à rebours de 90 minutes n'est pas démarré jusqu'à ce que la température a atteint la première fois à 50 ° C.

Tableau pour le dépannage.

Problème

Raison potentiel

Solution

TCS stock est déterminé à être <20 uM

Chauffage non uniforme de la solution

S'assurer que le thermomètre est placé de sorte qu'il est mis en suspension dans la solution et ne touche pas le fond du flacon.

Remuer n'est pas suffisamment vigoureuse

Augmenter agitation magnétique sur Stir-plaque pour atteindre un niveau d'agitation qui est vigoureuse sans provoquer la solution à sauter hors du flacon. Assurez-vous qu'un barreau magnétique de taille appropriée est utilisé.

Problèmes avec spectrophotomètre

Permettre un bon échauffement de la lampe UV (généralement 10 minutes), ou remplacer l'ampoule si nécessaire.

Niveaux de dégranulation spontanées sont trop élevés (> ~ 7%)

Les cellules ont acquis des mutations génétiques anormaux dus à trop de temps dans la culture

Réaliser des expériences avec un nouveau dégel des cellules.

Les cellules meurent à cause de cisaillement mécanique

Lors de l'ajout tampon ou traitements cellules adhérentes, veiller à ne pas perturber les cellules, en ajoutant soigneusement ces volumes sur les côtés de la cupule. S'exercer à utiliser le Combitip.

IgE / DNP-BSA ne provoque pas de libération de bêta-hexosaminidase par rapport aux niveaux de libération spontanée

IgE est plus de 30 jours ou a été soumis à geler dégel

Utilisez une nouvelle aliquote correctement stocké des IgE.

DNP-BSA n'a pas été correctement mélangés

Soyez sûr d'ajouter soigneusement le petit volume de DNP-BSA au tube conique et to vortex fond.

Ionophore A23187 ne provoque pas de libération de bêta-hexosaminidase par rapport aux niveaux de libération spontanée

A23187 stock n'a pas été correctement reconstitué

Produit arrive comme une «couche mince», et doit être reconstitué avec soin et beaucoup de vortex. Transfert reconstitué actions pour un nouveau tube de 1,5 ml pour le stockage.

A23187 stock n'a pas été correctement enregistré

Les stocks sont sensibles à la lumière. Une fois reconstitué, Parafilm le haut, et un magasin en papillote à -20 ° C. S'il ya une question sur le stockage d'un stock, le jeter et commencer les essais avec un nouveau matériel.

180 nM de l'ionophore A23187 ne provoque pasle même niveau de réponse de la dégranulation relative, en tant que résultat dans un dosage plus tôt

Variation de lot à lot de ionophore A23187

Effectuer un essai de dose-réponse pour chaque nouveau lot de ionophore. Il est également recommandé que les stocks provenant du même lot de tester, en raison de la variabilité potentielle dans le processus de reconstitution.

Comme dans toute expérience de toxicologie / pharmacologie, la substance d'essai ne doit pas être manifestement toxiques aux concentrations testées. Nous vous recommandons d'utiliser des méthodes qui test pour les deux apoptose et nécrose, soit individuellement ou combinées (comme avec les dosages clonogènes), ainsi que des tests pour dommages généraux à la membrane plasmique (comme la fuite de lactate déshydrogénase). TCS, à des concentrations présentées dans cette étude, n'est pas cytotoxique pour les cellules RBL-2H3 2. Une note de préoccupation particulier avec les études ionophore est que ionophore, plus ionophore véhicule(Probablement DMSO), plus chimique d'essai, plus les solvants organiques utilisés, pourraient être un breuvage potentiellement cytotoxique, qui doit être soigneusement contrôlée, comme cela se fait dans Palmer et al. 2

Notre protocole de préparation de solutions TCS sans l'utilisation d'un solvant organique sera utile pour la poursuite des essais toxicologiques de ce produit chimique omniprésent, sans l'interférence des artefacts solvant, une considération particulièrement importante en toxicologie aquatique. Ces méthodes permettent également la vérification de la concentration du TCS en solution et la quantification des effets que les produits chimiques, comme TCS, ont sur la dégranulation des mastocytes. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les effets d'une grande variété de produits chimiques sur la dégranulation des mastocytes, comme suspect perturbateurs endocriniens 55, et peut potentiellement être étendu pour le criblage à haut débit. En outre, d'autres types de mastocytes peuvent être utilisés dans ce test dans les travaux futurs.

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Disclosures

Nous n'avons rien à révéler.

Acknowledgments

LMW et RHK sont pris en charge par la Graduate School UMaine des sciences et de génie (GSBSE) biomédical; RHK a également été soutenue par le Maine Agricultural Experiment Station & Forêt. Un financement supplémentaire a été fourni par l'Institut national des sciences médicales générales (NIH P20-GM103423), le Maine et agricole Experiment Station Forest (Nombre Grant ME08004-10, JAG), l'Université du Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) , et un démarreur de subventions de recherche en pharmacologie / toxicologie de la fondation PhRMA (JAG). Nous remercions les Drs. David Holowka et Barbara Baird pour l'antigène et les cellules. Nous sommes reconnaissants envers Hina Hashmi, Alejandro Velez, et Andrew Abovian de l'aide avec l'équipement et les commandes. C'est Maine agricole et forestier Experiment Station numéro de publication 3311.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RBL-2H3 Cells

 ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

 Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

 Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

 Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

 Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

 Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

 Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

 Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

 J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

 VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

 Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

 J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

 Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

 Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

 EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

 Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

 Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

 Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

 Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

 VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

 Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

 Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

 VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

 VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

 VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

 VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

 VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

 Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

 BioTek

Module S

Hematocytometer

 Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

 VWR

97042-634

Centrifuge

 Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

 VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

 The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

 ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

 VWR

Range: P2-P1000

Balance

 Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

 Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

 Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

 Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Acetate Buffer, pH 4.4

 Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

 Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

 26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

 135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

 Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
Plastic material used:

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

 VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

 VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

 VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

 VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

 N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

 Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

 Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

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References

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Immunologie Numéro 81 mastocytes des basophiles dégranulation RBL-2H3 le triclosan irgasan antibactérien β-hexosaminidase les allergies l'asthme des substances toxiques ionophore un antigène fluorescence microplaques UV-Vis
Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique
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Weatherly, L. M., Kennedy, R. H.,… More

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

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