Summary
Mastcelldegranulering, frigivning av allergiska mediatorer, är viktig i allergi, astma, och parasit försvar. Här visar vi tekniker 1 för bedömning effekterna av droger och gifter om degranulering, metodik användes nyligen för att uppvisa den kraftfulla hämmande effekten av antibakteriellt medel triclosan 2.
Abstract
Mastceller spelar viktiga roller i allergisk sjukdom och immunförsvaret mot parasiter. När det är aktiverat (t.ex. av ett allergen), de Degranulate, en process som resulterar i exocytos av allergiska mediatorer. Modulering av mastcelldegranulering av droger och gifter kan ha positiva eller negativa effekter på människors hälsa. Mast cellfunktionen har dissekerats i detalj med användning av råtta basofila leukemiceller mast (RBL-2H3), en allmänt accepterad modell av humana mukosala mastceller 3-5. Mast cell granul komponent och den allergiska medlare β-hexosaminidas, som frisätts linjärt parallellt med histamin från mastceller 6, kan lätt och tillförlitligt mätas genom reaktion med ett fluorogent substrat, vilket ger mätbar fluorescensintensitet i en mikroplatta analys som är mottaglig för hög genomströmning studier 1. Ursprungligen publicerad av Naal et al. 1, har vi anpassat denna degranulation analys för screening of droger och gifter och tydligt visar dess användning här.
Triclosan är ett brett spektrum antibiotikum som finns i många konsumentprodukter och har visat sig vara ett terapeutiskt stöd i mänsklig allergisk hudsjukdom 7-11, även om mekanismen för denna effekt är okänd. Här visar vi en analys för effekten av triclosan på mastcelldegranulering. Vi visade nyligen att triclosan påverkar starkt mastcell funktion 2. I ett försök att undvika användningen av ett organiskt lösningsmedel, är triklosan upplöses direkt i vattenhaltig buffert med värme och omröring och resulterande koncentration bekräftas med användning av UV-Vis-spektrofotometri (med användning ε 280 = 4200 L / M / cm) 12. Detta protokoll har potential att kunna användas med en mängd olika kemikalier för att bestämma deras effekter på mastcelldegranulering, och mer allmänt, deras allergiska potential.
Introduction
Mastceller starkt granulerade immuneffektorceller som fungerar som viktiga mediatorer vid astma, allergier, parasit försvar och cancer 13-16. De bor i nästan varje vaskulariserad vävnad 15, där de säkert lagra allergiska och inflammatoriska mediatorer i cytoplasmiska granulat tills aktiverat för att Degranulate. Degranulering är exocytos av membranbundna granulat, vilket resulterar i frisättning av farmakologiskt aktiva mediatorer såsom histamin, tryptas, och leukotriener 15. Denna process resulterar i initiering av typ I överkänslighetsreaktioner som är kritiska för montering försvar mot parasiter samt initiera allergiska, astmatiska och cancerframkallande svar 15.
Mastceller och basofiler uttrycker FceRI receptorer, med hög affinitet receptorer för immunoglobulin E (IgE) 17. Exponering för ett allergen eller antigen orsakar aggregering av flera IgE-bundna FcsRI receptorer 17, och det är denna sektionO-kallas "tvärbindning" av IgE-bundna Fc-receptorer som initierar degranulering processen: en kaskad av tyrosinfosforylering händelser, aktivering av fosfolipas C, utflödet av kalcium från interna affärer, och inflöde av kalcium i cellen 18. Denna kalciuminflöde är nödvändig för degranulering, och vidare signalerar granul fusion med membranet innan orsaka granul exocytos 15. Experimentellt kan en kalciumjonofor användas till pendeltrafik kalcium direkt över cellmembranet 19, som i huvudsak kringgår alla signaltransduktion steg före kalciuminflöde steg 20, vilket möjliggör identifiering av en bana målet med ett gift som uppströms eller nedströms kalcium signalering 20.
Degranulering kan mätas snabbt och effektivt genom att övervaka frisättningen av β-hexosaminidas in cellsupernatant, som frisätts linjärt från granulerna vid sidan histamin 6, men jagär mycket lättare att upptäcka med hjälp av en enkel enzym-substrat reaktion och en mikroplattavläsare för analys av fluorescerande produkt. Denna mikroplatta analys såsom beskrivs i protokollet avsnittet, är baserad på en robust metod som ursprungligen utvecklades av Naal et al. 1, som kvantifierar klyvning av det fluorogena substratet 4-metylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid med β- hexosaminidas. Vi har modifierat analys för att testa effekterna av droger och gifter, med triclosan lyfts fram här. Denna metod tillförlitligt kvantifierar degranulation, är ett billigt alternativ till, exempelvis flödescytometrisk-baserade detektionsmetoder 21, och har potential att ge sig fint till high-throughput screening av ett brett utbud av anti-allergi droger, liksom immunotoxiskt eller allergena kemikalier. Denna sista punkt är särskilt viktigt mot bakgrund av 2007 års National Research Council rapport "kemikalieprövning i 21: a århundradet: en vision och en StrataEGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), som förespråkar för utvecklingen av high-throughput toxikologitester som använder cellodling att minska kostsamma användningen av traditionella försöksdjur som möss. Den degranulering protokoll som utvecklats av Naal et al. Ett och modifieras av oss 2, utnyttjar RBL-2H3-cellinje, som är en väl-accepterad modell homolog med humana mukosala mastceller eller basofiler 3-5. (Metoder för odling av RBL-2H3 celler beskrivs i Hutchinson et al. 22). Denna analys skulle sannolikt anpassas till alla bifogade mast celltyp.
Triclosan (TCS) är ett brett spektrum antimikrobiella som har använts i mer än 30 år på sjukhus, hygienartiklar och konsumentvaror 23,24. Verkningsmekanismen för TCS antimikrobiella egenskaper är hämningen av fettsyror biosyntes, sannolikt genom att hämma enoyl-acylbärarprotein reduktas 25,26. Den finns över hela världen i ett brett spektrum av konsumentprodukter som dusch gel, handlotion, tandkräm, munvatten, och i hand tvål vid koncentrationer upp till 0,3% eller 10 mM 24. Utbredd användning av TCS har resulterat i detekterbara halter i människor 27-29 och i floder och vattendrag 30. En studie utförd av Allmyr et al. 27 visade att TCS och dess metaboliter finns i både plasma och mjölk från ammande mödrar. Viktigt är TCS lätt absorberas in i huden 31 till 37. Queckenberg et al. 37 hittade ~ 10% absorption av en ~ 70 mM TCS grädde i mänsklig hud inom 12 timmar, vilket betydande koncentration i huden, där mastceller bor.
TCS har visats kliniskt för att hantera mänsklig allergisk hudsjukdom 7-11, men den mekanism med vilken TCS lindrar allergiska hudsjukdomar har varit okänt 38. Använda fluorescerande detaile mikroplattan assayd i den här videon, visade vi nyligen att TCS, vid koncentrationer så låga som 2 iM, avsevärt dämpar mast cell funktion och degranulering, vilket ger en möjlig förklaring till dessa kliniska data 2. Förutom att ge en förklaring till dessa kliniska data, våra resultat i Palmer et al. 2 antyder att TCS riktar signalmolekyler nedströms av kalciuminflöde. På grund av vikten av kalcium signalering i många immunologiska och andra biologiska processer, kan TCS ha potentiellt negativa effekter på ett brett utbud av nödvändiga biologiska processer. I själva verket visade Udoji et al. 39 som TCS undertrycker mänskliga naturliga mördarceller lytisk aktivitet, en annan viktig medfödda immunförsvar.
Bortom dess potential som ett terapeutiskt stöd allergisk hudsjukdom (eller, omvänt, som immunotoxicant), kan TCS också vara hormonstörande 40-49. Således, ett tydligt förfarande för hur man förbereder denna kemikalie i lösning is av intresse för toxikologer. Eftersom TCS är en liten hydrofob molekyl, är organiska fordon används ofta för att göra den mer löslig i vatten. I de flesta toxicitetsstudier där TCS har testats, har beredningen involverad upplösning i vatten med hjälp av ett organiskt lösningsmedel, såsom etanol, aceton eller olja 2,50,51. Men ofta gånger dessa lösningsmedel är biologiskt aktiva själva, vilket komplicerar tolkningen av testet kemiska data 51. I själva verket, enligt Rufli et al. 52 och andra 53, rekommenderas att testa lösningar för akvatisk toxicitet experiment framställs med hjälp av fysikaliska metoder under kemiska metoder, på grund av risken för kemiska lösningsmedel för att skapa toxicitet artefakter. Vi har tidigare visat att TCS upplöst i 0,24% etanol / vatten (vol / vol) och sonikerades under 30 min dämpar RBL mastcelldegranulering 2. Etanol vid högre koncentrationer än 0,24% har visat sig dämpa mastcell nedbrytningnulation 54,55-exempel på potentiellt störande effekter av organiska lösningsmedel i toxicitetsstudier.
Inte bara är det viktigt att ta hänsyn till effekten av lösningsmedel på organismen eller celler som används för studien, men också att det är viktigt att övervaka effekterna av ett lösningsmedel på testkemikalien själv. Till exempel, Skaare et al. 51 tyckte att lösa TCS i polyetylenglykol (vanligt förekommande i tandkräm och munvatten) försvagades anti-bakteriella och anti-plack effekter i friska kvinnliga kvinnor medan upplösningen i olja orsakade en total förlust av funktion. Därför kan förmågan hos olika lösningsmedel modulera giftämne och läkemedel, inklusive TCS bör effekter behandlas i analysutformning. Användning av oljor eller tillsatser smak kan störa effekten av TV-kamerasystem i olika produkter 50,51.
I ett försök att eliminera behovet av att använda organiska lösningsmedel, förbättrade vi vid vår metod för att lösa TCS 2 genom att eliminera användningen av en organisk solventilera. I det nuvarande protokollet, upplösa vi TCS granulat direkt i vattenlösning buffert med värme (≤ 50 ° C), och sedan kontrollera koncentrationen av denna TCS lager med UV-Vis-spektrofotometri. Dessa förbättringar är möjliga eftersom TCS är löslig i vatten upp till 40 ^ M ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) och har visats att motstå nedbrytning vid uppvärmning till 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Vi har också den ytterligare fördelen med UV-VIS-spektrofotometri, som TCS även känt att starkt absorberar vid 280 nm 58 med en molär extinktionskoefficient av 4200 L / mol / cm 12.
Detta protokoll ger en enkel men effektivt sätt att lösa TCS granulat i en buffert utan hjälp av ett organiskt lösningsmedel, inklusive låg kostnad och snabb verifieringav koncentration, beskriver och en kraftfull fluorescerande microplate analys för övervakning av kemiska effekter på mastcelldegranulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Observera att alla buffert recept ingår i en tabell i slutet av protokollet text.
DAG 1:
Ett. Beredning av celler
- Planera ut 96-väl systemet plattan setup, centrering prover på layouten för att undvika kanteffekter. Allokera tre replikat för varje TCS koncentration testad (± degranulation stimulerande av antigen eller jonofor), samt tre exemplar för spontan frisättning (ingen degranulation stimulerande), maximal frisättning (0,2% Triton X-100 [TX] rengöringsmedel lys), samt brunnar reserveras för bakgrund prover (som kommer att innehålla några celler). För varje replikat experimentell dag väljer en ny randomiserad layout TCS provkoncentrationer.
- Varm RBL-media (recept ges i tabellen) och trypsin i 37 ° C vattenbad.
- Kontrollera RBL-celler i T-25 kolv (2-4 dagar sedan senaste passage och mindre än 3-4 månader sedan de tinade) för allmänna tecken på god läkath: rätt pH indikeras av färgen på media, och brist på grumlighet. Placera kolven under ett ljusmikroskop för att bekräfta att kolven är fri från föroreningar och att cellerna verkar friska, ordentligt konfluenta, och mestadels bifogas. Observera att cellerna bör kontrolleras för mykoplasmkontaminering ungefär var sjätte vecka 22.
| Behandling | Triplicatesna |
| Stimuleras, 0 iM TCS | A7, B7, C7, F4, G4, H4 |
| Stimuleras, 0,001 iM TCS | F6, G6, H6 |
| Stimulerad, 0,1 pM TCS | A4, B4, C4 |
| Stimulerad, 1 pM TCS | A6, B6, C6 |
| Stimulerad, 5 pM TCS | F5, G5, H5 |
| Stimulerad, 10 pM TCS | A3, B3, C3 |
| Stimulerad, 15 pM TCS | A5, B5, C5 |
| Stimulerad, 20 pM TCS | F7, G7, H7 |
| Stimuleras, plus högsta [TCS] | F3, G3, H3 |
| Spontan, (inkluderar hånar) nr TCS | A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8 |
| TX-100, No TCS | D10, D11, D12, E10, E11, E12 |
| Inga Cells, bakgrund, plus högsta [TCS] | G10, G11, G12, H10, H11, H12 |
Klicka här för att se större bild .
- Ta RBL cellen kolven i den sterila vävnadsodling (TC) huva. Cellerna är fästa till bottenTom i kolven. Arbeta under TC huven och använder standard steril teknik, ta bort alla media från kolv med steril pipett, cellerna sitter kvar på botten av kolven. Nästa, skölj kolven med 2 ml trypsin, sedan kasta denna tvätt.
- Tillsätt exakt 2 ml trypsin för att täcka botten av kolven. Satt i 37 ° C inkubator under 5 min för att tillåta cellerna att lossna från kolvens botten.
- Efter 5 min, träffade sidan av kolven med en öppen handflata för att lossa celler. Omedelbart, tillsätt 18 ml RBL media att tvätta cellerna bort kolven och att släcka trypsin. Omedelbart ta cell-media-trypsin blandningen ur kolven och överföra till en ny, steril 50 ml tub (den totala volymen i röret är nu 20 ml).
- Efter blandning försiktigt men grundligt, ta bort 50 | il cellsuspension från detta rör, och överför till en 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör, som är ett prov som skall räknas. Ta detta exempel, liksom 50 ml0, rör innehållande cell-media-trypsin blandningen ur TC huven på bänken.
- Snurra 50 ml tub i centrifug (med lämplig balans) för 8 minuter vid 500 xg, denna kraft pellets celler effektivt.
- Under spinn tid, räkna cellerna i provet vilken isolerades innan spinningen. För att göra detta måste du först lägga 50 il trypanblått till 50 ^ celler i 1,5 ml rör, och försiktigt men grundligt pipettera upp och ned 5x att blanda. Omedelbart, överför 10 pl av denna blandning till glaset hematocytometer, och räkna cellerna i rutnätet enligt tillverkarens anvisningar. Räkna minst 100 celler för rimliga statistiska resultat.
- Tillbaka i TC huven, ta bort supernatanten från celler som delades ned.
- Cap cellen röret och flick pellet på botten av röret för att lossa celler.
- Lägg till media i trypsiniserade celler för att ge en densitet av 0,5 x 10 6 celler / ml, baserat på antalet celler. Blanda väl men försiktigt för att hålla celler suspenderade under pläteringen förfarandet. Med hjälp av en Pipetman, satte 100 ^ celler / brunn i en 96-brunnar (flat, svart botten), efter plattan mallen arket. Slumpa hur celler tillsätts till brunnarna för att undvika systematiska fel, och blanda efter varje uppsättning av tre brunnar tillsätts. Var noga med att inte sätta celler i brunnarna märkta för bakgrunden proven.
- När alla celler har överförts, placera plattan locket på plattan, och överföra till inkubatorn (37 ° C / 5% CO 2) över natten. Städa upp efter standard steril teknik.
DAG 2:
2. Framställning av Triclosan
- Med hjälp av en graderad cylinder, mått 250 ml Tyrodes buffert (recept ges i tabellen) i en 500 ml märkt Erlenmeyerkolv "TCS-buffert." Lägg omrörarstav. Använd glas, omrörare, termometer avsedd för användning tillsammans med TCS bara.
- Också vid denna tid, åtgärd 250ml Tyrodes till en separat 500 ml E-kolv, märkt "CONTROL buffert." användning glas, omrörare, termometer som inte är avsedda för TCS. Lägg omrörarstav.
- Väg upp 0,0022 g TCS granulat och överföra till "TCS-buffert" kolv (som innehåller 250 ml Tyrodes buffert). För att effektivt överföra granulat till Erlenmeyerkolv, använd 10 ml från de uppmätta 250 ml Tyrodes att tvätta bort väga båt och se alla TCS har överförts.
- Place "TCS-buffert" kolv på en kombination värmeplatta / magnetiska omrörarplatta, och ställ in den att röra vid en hanterbar hög hastighet. När väl blandade, kommer detta TCS lager vara nominellt 30 ^ (faktiska koncentrationen kommer att beräknas efter uppvärmning). (Gör allt blandas i en kemisk dragskåp.)
- Också vid denna tid, placera "kontroll buffer" kolv (innehåller ingen TCS) på en andra kombination värmeplatta / magnetiska omrörarplatta, och ställa den under omrörning vid samma hastighet.
- Slå på UV / Vis lampa att värma upp lampan för senare användning.
- Värm "TCS-buffert"-lösning till 50 ° C under konstant omröring. När upp till temperatur, tid för 90 min. Under 90 min, att fortsätta att övervaka 50 ° C temperatur och lämplig omröringshastighet ofta.
- Samtidigt, värm "kontroll buffert"-lösning (som är bara 250 ml vanligt Tyrodes buffert) till 50 ° C under kontinuerlig omrörning. När den når 50 ° C, tid för 90 minuter, under vilken tid temperaturen (hålla vid 50 ° C) och omrörning båda övervakas.
- Vid slutet av 90 minuter, ta båda Erlenmeyerkolvar upp den varma tallrikar och överföring till bänk.
- Använda funktionen Våglängdsscanning på en UV / Vis spektrofotometer, på 1 ml av den uppvärmda "kontroll buffert" lösning innan scanning 1 ml uppvärmd "TCS-buffert" lösning tom maskinen. Kontrollera formen av spektrumet, end post Absorbans värde vid 280 nm. För att bestämma koncentrationen, använd Beer-Lambert ekvationen (A 280 = ε 280 ℓ c) med en ε 280 av 4200 L / mol / cm 12 och ℓ av 1 cm.
- Efter bestämning av TCS koncentration, tillsätt 0,249 g bovint serumalbumin (BSA) till den återstående 249 ml av den "TCS-buffert"-lösning, och blanda väl.
- Samtidigt, tillsätt 0,249 g BSA till de återstående 249 ml av "kontroll buffert"-lösning, och blanda väl.
DAG 2:
Tre. Antigen-stimulerad degranulering analysen med RBL-2H3 celler
- Innan du börjar, kontrollera pH-värdet av alla buffertar som används, och se till att de är tydliga och inte grumlig: detta inkluderar Tyrodes buffert, natriumacetat buffert, och glycin karbonatbuffert (recept ges i tabellen).
- Varma RBL media och trypsin i 37 ° C vattenbad.
- Gör BT (1 mg / ml0; BSA i Tyrodes buffert): 0,05 g BSA + 50 ml Tyrodes buffert (X2). Satt i 37 ° C vattenbad.
- Gör 0,2% Triton X-100: 3.136 ml BT + 64 | il av 10% Triton X-100 (slutlig koncentration av Triton X-100 är 0,2%). Blanda väl genom att vända, men inte virvel. Satt i 37 ° C vattenbad.
- Börja förberedelserna av TCS och uppvärmda Tyrodes buffert (steg "2" ovan) OBS:. Starta inte nästa steg (IgE exponering) tills "TCS-buffert" och "kontroll buffer" lösningar når 50 ° C och rör om den första 70 min av den 90 min värme / omrörning tid.
- När båda lösningar har omrördes vid 50 ° C under 70 min, utgör 0,1 pg / ml anti-DNP-mus IgE (Sigma) i RBL media för provbrunnar att sensibiliseras (100 ul / brunn). IgE lager bör inte vara äldre än 30 dagar vid förvaring vid 4 ° C, registrera hur gamla beståndet är. Flick att blanda, men inte virvel IgE.
- Under en TC huva,tillsätt 0,6 pl IgE lager (lager är 1 mg / ml) till 6 ml RBL media i en 50 ml tub. I en andra 50 ml rör, tillsätt 6 ml av vanlig RBL medier endast (som är avsedd för nonsensitized proven).
- Dumpa allt material från 96-brunnar (som var beredd på dag 1) i diskhon, och sätta plåten under TC huven.
- Slumpmässigt Tillsätt 100 mikroliter media / IgE blandningen till brunnar som bör uppmuntras (48 brunnar totalt). Denna blandning är inte avsedd för "spontan", "TX," och "bakgrund" prover.
- Slumpmässigt Tillsätt 100 mikroliter vanligt RBL media bara "TX", "spontan" och "bakgrund" brunnar.
- Sätt plattan locket på plattan, och sedan flytta plattan i 5% CO 2/37 ° C inkubator i 1 timme.
- Under 1 timme inkubation, följ steg från 3,13 till 3,24.
- På bänk, förbereda antigen utspädningar. Lägg 0.53 il 1,6 mg / ml lager DNP-BSA + 850 pl & #160; BT att få ett antigen koncentration av 1 pg / ml. Vortex och invertera detta lager för att blanda.
- När har "TCS-buffert" och "kontroll buffer" värmts och sedan under 90 minuter vid 50 ° C, fortsätt med resten av förberedelserna för TCS-protokollet (gå till steg 2.6 - 2.8.1). Efter att BSA löses in båda lösningarna, fortsätt nedan.
- Börja förbereda exponering buffertar, med ± Ag, ± TCS. Först från 249 ml prov av "TCS-buffert"-lösning (som redan har uppvärmts och omrördes under 90 min), överför 50 ml till en ny 50 ml koniska rör. Avlägsna 20 pl av denna 50 ml alikvot och ersätta det med 20 pl av 1 ng / ml antigen utarbetats tidigare för en slutlig antigen koncentration på 0,0004 ng / ml DNP-BSA. Vortex och invertera.
- Etikett detta "Rör 1, Hög TCS / + Ag / + BT." Det används för spädning och högsta TCS koncentration exponering.
- Från 249 ml prov av "kontroll buffert" lösningen, överför 50 ml till en ny 50 ml tub. Avlägsna 20 pl av denna nya 50-ml alikvot och ersätta med 20 pl av 1 pg / ml antigen utarbetats tidigare för en slutlig antigen koncentration av 0,0004 | ig / ml DNP-BSA. Vortex och invertera.
- Etikett detta "Rör 2, nr TCS / + Ag / + BT". Används för TCS utspädningar och 0 iM TCS koncentration exponering.
- Nu tar ut 50 ml av "TCS-buffert"-lösning och sätta in en annan 50-ml tub. Avlägsna 20 pl från denna nya 50-ml alikvot och ersätta det med 20 pl vanligt BT. Vortex och invertera. Ingen antigen tillsätts.
- Märk detta "Tube 3, High TCS / Nej Ag / + BT." Detta används för bakgrunden.
- Överför 50 ml av "kontroll buffert" lösning till en annan 50-ml tub. Ta ut 20 pl från denna NE v 50-ml alikvot och ersätta det med 20 pl vanligt BT. Vortex och invertera. (Ingen Ag tillsätts.)
- Märk detta "Rör 4, nr TCS / Nej Ag / + BT." Detta används för bakgrunden och spontana prover.
BSA TCS Antigen Rör 1 
Hög [] Rör 2 NEJ Rör 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Hög [] NEJ Rör 4 NEJ NEJ - Beräkna och registrera volymerna för utspädningar Efter bestämning av koncentrationen av "TCS-buffert" lager. Total mängd för varje utspädning koncentrationen bör vara 1 ml och bör förberedas i ett sterilt mikrocentrifugrör. Använd kalibrerad P2 och P1000 Pipetman.
Koncentration Hög Triclosan + Tyrodes BSA + 0,0004 | ig / ml Ag
(Rör 1 från ovan)Uppvärmd BT 0,0004 | ig / ml Ag
(Rör 2 från ovan)20 pM 10 pM 5 pM 1 pM 0,1 ^ M 0,001 | iM 0 iM (ovanpå plattan) ----------------------- 500 xl plus ytterligare 500 ^ 0 iM (botten av plattan) ----------------------- 500 xl plus ytterligare 500 ^ - Efter 1-hr IgE inkubation, ta plattan från kuvösen och slänga alla medier i diskhon. (Obs: om testkemikalier är kända för att vara mer giftiga än konsumentprodukt TCS, får farligt avfall vara nödvändigt.)
- Med hjälp av en Combitip, slumpmässigt tvätta cellerna i 96-brunnar med BSA-Tyrodes buffert (200il / brunn). Släpp tvättbuffert på sidorna av brunnarna, i stället för direkt på de bifogade cellerna, för att undvika att störa de bifogade cellerna. Upprepa processen en andra gång.
- Att förbereda behandlingar för ansökan, virvel och invertera utspädningar precis före tillsats till plattan.
- Från och med den övre delen av plattan: Slumpmässigt lägga triplikat av 200 | il vardera av antigenlösningar (med korrekta koncentrationer av TCS) till motsvarande brunnar. Fortsätt att botten av plattan. Lägg till "kontroll buffert" lösning plus Ag (från "Tube 2" ovan) till alla "mocks" på plattan.
- Tillsätt 200 l av lämpliga lösningar till motsvarande brunnar:
- Lägg 200 pl av 0,2% Triton X-100 till "TX"-utsedda brunnar.
- Nästa, tillsätt 200 pl av Tube 3 till de tre brunnar märkta "Bakgrund (bkgd)-Högsta TCS" på plattan.
- Slutligen, tillsätt 200 lav Tube 4 till 6 brunnar märkta "Spontan."
- Inkubera plattan under 1 timme i 37 ° C / 5% CO2.
- Under 1 timme inkubation: Få två hinkar med is (en för "gamla" plattan i kuvös och en för ny plåt). Tina 4-metylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glukosaminid (4-MU) vid rumstemperatur under upp till 40 min, varvid i folie för att det är ljuskänsligt.
- När 4-MU stock tinas, utgör 4-MU fungerande lösning: 150 pl lager + 14,85 ml kall acetatbuffert (recept ges i tabellen), virvel och invertera. Håll 50 ml centrifugrör, inslagna i aluminiumfolie, och på is fram till användning.
- Använda Combitip, slumpmässigt tillsätt 100 l kallt 4-MU fungerande lösning i botten av varje brunn i en ny Grenier svart 96-brunnar (om ishink # 2). Börja först genom tillsats av den verksamma lösningen slumpmässigt i toppen av plattan, slumpmässigt i botten av plattan, slumpmässigt i Triton X-100 brunnar,och slutligen slumpmässigt i bakgrunden brunnar.
- Få ut ny låda med P200 tips för nästa steg.
- I slutet av 1-timmars inkubation, lägger cellplattan från inkubatorn på ishink # 1, pipett supernatanten upp och ned 4-5x (försiktigt, inte införa bubblor), går runt brunnen för god blandning men inte röra cellerna under blandning . Systematiskt, ta ut 25 pl prov från varje brunn och plats i den nya plattan med substrat (samma beställning av prover, såsom ursprungligen planerat). Pipettera upp och ner för att blanda provet noggrant när nya väl, utan att införa bubblor.
- Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C / 5% CO2.
- Efter 30 minuters inkubation, slumpmässigt tillsätt 200 l av kall glycin-karbonatbuffert per brunn (med Combitip) för att fylla brunnar upp till 325 l totalt. (Gör detta tillägg till Triton X-100 prover sist, för att undvika att Triton X-100 spillover). Kontrollera om bubblor innan avläsningsplatta (peta med rent P10 pipettte tips till pop några bubblor).
- Kör plattan i fluorescens plattavläsaren (gå till avsnitt 4).
DAG 2:
4. Bildrörsplattan Reader Instruktioner och dataanalys
- Öppna Gen5 programmet och öppna experiment avsnittet.
- Slå på plattan läsare och insatsskiva (övre vänstra hörnet är A1).
- Protokoll
Procedur Läs ställa egna avläsningar. Lägg inte till något om prover, replikat, etc., i syfte att samla rå fluorescensdata från varje brunn. - Under "Läs" välja "fluorescens," "Endpoint", "Normal", "Gain 40," "Excitering 360/40," "Emission 460/40," Optik ställning: Topp 50%. Top optisk offset: 7mm. Ingen skaka, ingen fördröjning, inga kinetik, ingen monitor väl, temperatur: inkubator off.
- Välj matt svart botten, 96-brunnar (Grenier 96-väl, Flat Bottom).
- Deal med plattan layout: Protokoll plåt layout. Ställ in prover utan att ange repetitioner, utspädningar etc.
- Tallrik läsa.
- Spara fil: Klicka på "Excel"-knappen, vilket kommer att exportera data fil till Excel. Gör detta för plåt layout och matrix. Spara filen på datorn och på en USB-enhet.
- I Excel, subtrahera den genomsnittliga bakgrunden läsning från varje prov, inklusive Triton X-100 brunnar.
- Beräkna relativ% degranulation genom att dividera varje värde (som redan har haft bakgrund subtraheras) med genomsnittligt Triton X-100 värde, och sedan multiplicera med 100 för att göra det till en procentsats.
- Vanlig allt triplicatesna, och beräkna standardavvikelse. Graph data i Excel som medelvärden ± standardavvikelser. För statistisk testning, flyttar nu till Prism programvara genom GraphPad.
DAG 2:
Fem. Jonoforen stimulerad degranulering analysen med RBL-2H3 celler
- Följ protokoll för "Beredning av celler" (avsnitt 1, Dag 1) och "Framställning av triclosan" (avsnitt 2, Dag 2), enligt anvisningarna ovan. Plattan layout exempel jonofora stimulering visas nedan.
Behandling Triplicatesna Stimuleras, 0 iM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4 Stimuleras, 0,001 iM TCS F6, G6, H6 Stimulerad, 0,01 pM TCS F3, G3, H3 Stimulerad, 0,1 pM TCS A4, B4, C4 Stimulerad, 1 pM TCS A6, B6, C6 Stimuleras, 5 iM [TCS F5, G5, H5 Stimulerad, 10 pM TCS A3, B3, C3 Stimulerad, 15 pM TCS A5, B5, C5 Stimulerad, 20 pM TCS F7, G7, H7 Spontan, med DMSO, ingen TCS (inkluderar mocks) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8 TX-100, med DMSO, ingen TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12 Inga celler bakgrund, med DMSO, plus högsta [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12 
Klicka här för att se större bild . - Innan du börjar, kontrollera pH-värdet av alla buffertar som används, och se till att de är tydliga och inte grumlig. Tyrodes, natriumacetat-buffert och glycin karbonatbuffert (recept ges i tabellen).
- Förbered en 50 ml koniska rör för BT genom att tillsätta 0,05 g BSA till 50 ml Tyrodes buffert och genom vortexning att blanda väl. Inkubera i 37 ° C vattenbad.
- Gör 0,2% Triton X-100 med 0,0032% DMSO (den slutliga kalciumjonofor fordon koncentration) genom tillsats av 96 | il av 10% Triton X-100 till 4,704 ml BT. Blanda väl. Nästa, ta ut 0.155 il av denna lösning och kasta. Nu lägger tillbaka i 0,155 il 100% DMSO.
- Bered en 5 mM stamlösning (2,5 mg / ml) av A23187 jonofor från pulver genom tillsats av 400 | il färskt 100% DMSO in jonoforen flaskan och vortex-blandning. Väl i lösning,överföra till en 1,5-ml konisk tub, innehåll rekord och dagens datum och utgångsdatum (3 månader från beredning vid förvaring ordentligt vid -20 ° C).
- Alternativt, om du använder ett fruset lager idag, tina på is, och kontrollera att 5 mM A23187 jonofor är väl blandad och klar. Vortex, knäpp, och invertera detta lager innan du använder. Avstämningsdag för förberedelse och Lot # av detta A23187.
- När har "TCS-buffert" och "kontroll buffer" värmts och rördes i 90 minuter, fortsätter resten av förberedelserna för TCS-protokoll (gå till steg 2.6-2.8.1). Efter BSA är väl blandas in båda lösningarna, fortsätter med de återstående protokollsteg.
- Från 249 ml prov av "TCS-buffert" lösningen, överför 50 ml till en ny 50 ml koniska rör. Ta 1,8 pl av 50 ml alikvot och tillsätt 1,8 pl 5 mM jonofor lager. Vortex 3x för 8 sekunder och vänd 3x. Slutlig jonofor koncentration är en80 Nm. Observera att denna koncentration av A23187 varierar beroende på lager potens, och en A23187 jonofor dos respons rekommenderas för att identifiera en koncentration av A23187 som framkallar en degranulation nivå på ungefär 20% maximal frisättning, som har identifierats som en icke cytotoxisk för RBL-2H3 celler genom cytotoxicitetsanalys (se 2).
- Etikett detta "Rör 1, Hög TCS / + jonofor / + BT." Används för utspädningar och högsta TCS koncentration exponering.
- Från 249 ml prov av "kontroll buffert" lösningen, överför 50 ml till en ny 50 ml koniska rör. Ta ut 1,8 ìl av 50 ml alikvot och lägg tillbaka i 1,8 pl 5 mM jonofor lager. Vortex 3x för 8 sekunder och vänd 3x. Slutlig jonofora koncentrationen är 180 Nm.
- Etikett detta "Rör 2, nr TCS / + jonofor / + BT." Detta används för spädning och 0 iM TCS koncentrationer.
- Från 249 ml prov av R 20, TCS-buffert "lösningen, överför 50 ml till en ny 50 ml koniska rör. Ta ut 1,8 ìl av nya 50 ml alikvot och tillsätt 1,8 pl 100% DMSO. Vortex 3x för 8 sekunder och vänd 3x, ingen jonofor tillsätts.
- Etikett detta "Tube 3, High TCS / No jonofor / + BT / + DMSO", används för bakgrunden.
- Från 249 ml prov av "kontroll buffert" lösningen, överför 50 ml till en ny 50 ml koniska rör. Ta ut 1,8 l från den nya 50 ml alikvot och tillsätt 1,8 pl 100% DMSO. Vortex 3x för 8 sekunder och vänd 3x. Ingen jonofor tillsättes.
- Etikett detta "Rör 4, nr TCS / Nej jonofor / + BT / + DMSO", används för spontan frisättning prover.
BSA TCS Jonofor Added 100% DMSO Rör 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Hög [] NEJ Rör 2 NEJ NEJ Rör 3 Hög [] NEJ Rör 4 NEJ NEJ eck märke "fo: innehåll-width =" .1 "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> - Beräkna och registrera volymerna för utspädningar Efter bestämning av koncentrationen av "TCS-buffert" lager. Använd kalibrerad P2 och P1000 Pipetman. Total volym för varje utspädning koncentration bör vara 1 ml, och bör förberedas i ett sterilt mikrocentrifugrör:
Koncentration Hög Triclosan + Tyrodes + BSA +180 nM A23187 (Rör 1 från ovan) Värms BT +180 nM A23187 (Rör 2 från ovan) 20 pM 15 pM 10 pM 5 pM 1 pM <td>0,1 ^ M 0,001 | iM 0 iM (ovanpå plattan) ---------------------------------- 500 xl plus ytterligare 500 ^ 0 iM (botten av plattan) ---------------------------------- 500 xl plus ytterligare 500 ^ - Ta cellerna ströks igår ur kuvösen och tomma media i vasken. Med hjälp av en Combitip, slumpmässigt tvätta celler i 96-brunnar med BT (200 pl / brunn). Upprepa tvätta en andra gång.
- Att förbereda behandlingar för ansökan, virvel och invertera utspädningar precis före tillsats till plattan. Från och med den övre delen av plattan: Slumpmässigt lägga triplikat av 200 | il vardera av den korrekta koncentrationen av TV-kamerasystem till correspoENDE väl. Fortsätt att botten av plattan. Lägg till "kontroll buffert"-lösning plus A23187 (från "Tube 2" ovan) till alla "hånar" på plattan.
- Tillsätt 200 l av lämpliga lösningar till motsvarande brunnar:
- Lägg 200 pl av 0,2% Triton X-100 till "TX"-utsedda brunnar.
- Nästa, tillsätt 200 pl av Tube 3 till de tre brunnar märkta "Bakgrund (bkgd)-Högsta TCS" på plattan.
- Slutligen, tillsätt 200 l av röret 4 till sex brunnar märkta "Spontan."
- Inkubera plattan under 1 timme i 37 ° C / 5% CO2.
- Under 1 timme inkubation: Få två hinkar med is (en för "gamla" plattan i kuvös och en för ny plåt). Tina 4-metylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glukosaminid (4-MU) vid rumstemperatur under upp till 40 min, varvid i folie för att det är ljuskänsligt.
- När 4-MU stock tinas, utgör 4-MU arbetar solutipå: 150 l lager + 14,85 ml kall acetatbuffert (recept ges i tabellen), virvel och invertera. Håll 50 ml centrifugrör, inslagna i aluminiumfolie, och på is fram till användning.
- Använda Combitip, slumpmässigt tillsätt 100 l kallt 4-MU fungerande lösning i botten av varje brunn i en ny Grenier svart 96-brunnar (om ishink # 2): starta först genom att lägga till den arbetande lösningen slumpmässigt inom den övre delen av platta, slumpmässigt i botten av plattan, slumpmässigt i Triton X-100 brunnar, och slutligen slumpmässigt i bakgrunden brunnar.
- Få ut ny låda med P200 tips för nästa steg.
- I slutet av 1-timmars inkubation, lägger cellplattan från inkubatorn på ishink # 1, pipett supernatanten upp och ned 4-5x (försiktigt, inte införa bubblor), går runt brunnen för god blandning men inte röra cellerna under blandning . Systematiskt, ta ut 25 pl prov från varje brunn och plats i den nya plattan med substrat (samma beställning av samples, såsom ursprungligen planerat). Pipettera upp och ner för att blanda provet noggrant när nya väl, utan att införa bubblor.
- Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C / 5% CO2.
- Efter 30 minuters inkubation, slumpmässigt tillsätt 200 l kallt glycin-karbonatbuffert per brunn (med Combitip) för att fylla brunnar upp till 325 l totalt (gör detta förutom Triton X-100 prover sist, för att undvika att Triton X-100 spillover). Kontrollera om bubblor innan avläsningsplatta (peta med rent P10 pipettspets till pop några bubblor).
- Kör plattan i fluorescens plattläsaren (Följ alla stegen i avsnitt 4).
Procedur 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid uppvärmning till 50 ° C under 90 min, producerar UV-Vis absorbans spektrum för TCS en stark, mjuk kurva mellan ~ 260 och 300 nm, med en topp vid 280 nm, såsom visas i figur 1. UV-Vis-spektrofotometri är därför ett viktigt verktyg som kan användas för att beräkna koncentrationen, eftersom publicerade molära absorptionskoefficienten vid 280 nm är 4,200 L / mol / cm 12. Vi har funnit att TCS inte faller ut ur lösningen under tidsramen för hela degranulering experimentet, efter 50 ° C uppvärmning (data ej visade).
Efter att ha använt denna uppvärmningsmetod att upplösa TCS direkt i vattenhaltig buffert, undersökte vi effekten av TCS på mastcelldegranulering med användning av en fluorescens-baserad analys som var optimerad från Naal et al. Ett Denna analys registrerar nivån av β-hexosaminidas frigörs från mast celler efter en timmes inkubation genom att upptäcka ett fluorogent substrat produkt. Vare stimuleras att Degranulate av DNP-BSA-antigen (figur 2) eller kalcium-jonofor A23187 (fig 3), kan man tydligt se att TCS orsakar en signifikant dos-responsiv hämning av frisättningen av β-hexosaminidas (dvs. degranulering).
Figur 2 är representativ för resultat som erhölls för IgE-sensibiliserade RBL-celler, som inkuberades under 1 h i "TCS-buffert" eller "kontroll buffert," och exponerades för en DNP-BSA-antigen dos av 0,0004 ug / ml. Denna koncentration av DNP-BSA framkallade en genomsnittlig absolut degranulation svar på 22,5% ± 0,1 (medelvärde ± standardavvikelse) i frånvaro av TCS. Statistiskt signifikant hämning av degranulation började vid 5 ^ M, där degranulering nivåerna var 0,79-faldigt ± 0,05 (medelvärde ± SD) av de 0 iM TCS kontroll nivåer. Eftersom TCS koncentrationen ökar, det finns en större dämpande effekt av TCS, som visar en stark relation dosrespons. TCS, vid 20 ^ M, almost upphävs helt degranuleringen svar, till nivåer ungefär lika spontan degranulering (där ingen antigen är närvarande). Sammantaget visar denna figur stark inhibering av multivalent antigenbindande stimulerad mastcelldegranulering grund av koncentration-verified TCS, utan användning av organiska lösningsmedel.
I figur 3, var kalciumjonoforen A23187 används som ett sätt för att undersöka mekanismen av TCS-inducerad dämpning av degranulering i RBL mastceller. A23187 används som en alternativ stimulerande eftersom det kringgår FcsRI tvärbindning och andra signaleringshändelser uppströms av kalciuminflöde, men fortfarande orsakar degranulering. RBL mastceller inkuberades under 1 h i "TCS-buffert" eller "kontroll buffert," som innehåller en dos kalciumjonofor av 180 nM. I frånvaro av TCS, framkallade denna koncentration av A23187 en genomsnittlig absolut degranulering svaret av 25,1% ± 4,7 (medelvärde ± standardavvikelse). Hämning av degranulation varhittades med så lite som 1 | iM TCS (0,63 ± 0,11 [medelvärde ± SD]). Eftersom TCS koncentrationen ökar, så ökar svårighetsgraden av hämningen: vid 5 ^ M, 0,21-faldig ± 0,04 av 0 iM TCS kontroll nivåer, vid 10 ^ M, 0,09 ± 0,05, vid 15 pm, 0,077 ± 0,006, och vid 20 pm , 0,09 ± 0,02 (medelvärde ± SD). I själva verket, från 5 ^ M och högre koncentrationer av TCS, har nivåerna av A23187-inducerad degranulering befunnits vara nära nivån för spontana kontroll (där ingen A23187 finns alls). Totalt sett, figur 3, i kombination med fig. 2, visar att de molekylära händelserna måltavla för TCS är sannolika nedströms kalciuminflöde.
Figur 1:. Representant TCS UV-VIS absorbansspektrum TCS har en robust ärtak vid 280 nm, möjliggör enkel bestämning av A 280, samt ge möjlighet att använda den molära extinktionskoefficienten för 4200 L / mol / cm 12 för att bestämma den faktiska koncentrationen av TCS löst i Tyrodes buffert. Den gula linjen anger toppen vid 280 nm. I det här exemplet, är absorbansen värdet vid 280 nm 0,11876, vilket tyder på en TCS koncentration av 28,28 iM. Klicka här för att se större bild .
Figur 2:. En representant degranulation respons av IgE-sensibiliserade RBL mastceller utsätts för 0,0004 ng / ml DNP-BSA-antigen och TCS (0-20 iM) En spontan frisättning värde (ingen antigen närvarande) visas för referens. Värden representerar menar7; standardavvikelsen för trippelprover. Som framgår var uppgifterna normaliseras till kontrollen (0 iM TCS), och betydande skillnader bestämdes i Prism mjukvara med en envägs ANOVA följt av en Tukeys post hoc test (jämförelser görs till 0,001 iM TCS genomsnittliga svar). Betydelse representeras av *** p <0,001. Klicka här för att se större bild .
Figur 3:. En representativ degranulering svaret av RBL mastceller stimulerade med 180 nM A23187 kalciumjonofor i närvaro av TCS (0-20 ^ M) En spontan frisättning prov (ingen jonofor närvarande) visas som referens. Värden representerar medelvärdet ± standardavvikelsen av trefaldiga prover. Som presented, är uppgifterna normaliseras till kontrollen (0 iM TCS), och betydande skillnader bestämdes i Prism mjukvara med en envägs ANOVA följt av en Tukeys post hoc test (jämförelser görs till 0,001 iM TCS genomsnittliga svar). Betydelse representeras av *** p <0,001; ** p <0,01. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under 2004 utvecklade Naal et al. 1 en mast cell biosensor för hög genomströmning testning av degranulering. Det är en robust analys som vi har anpassat för våra TCS studier och som beskrivs i den här videon. Före Naal et al., 1-analysen hade mastcelldegranulering har rutinmässigt bedömts via β-hexosaminidas 59-61, men dessa tidiga metoder utnyttjade fluorometrar i vilka ett prov lästes i taget. Viktigt Naal et al. upprättas direkt överensstämmelse mellan deras mer hög genomströmning metod som utnyttjar en mikroplattavläsare och den tidigare metoden där proverna läste en-på-en-gång i en fluorometer. I summan, Naal et al. 1 förbättrats avsevärt hastigheten, makt, enkelhet och tillförlitlighet av analysen genom att anpassa den till en high-throughput microplate plattform, liksom genom att integrera flera ändringar i arbetsflödet. Här har vi anpassat vidare denna analys för en studie av olika testkemikalier, i synnerhet, här, Den allestädes närvarande drogen TCS. Videon detaljerna stegen detta mycket användbar analys. Dessutom har vi också utvecklat ett organiskt lösningsmedel-fri metod att applicera TCS i vattenlösning buffert, och vi visar en enkel, billig förfarande för kontroll TCS koncentration. Dessa metoder bör vara till hjälp för den till synes växande området för triclosan toxikologi. I denna diskussion, detalj vi flera faktorer för att använda denna degranulering analys för att testa andra kemikalier också.
TCS framställdes direkt i vattenhaltig buffert utan hjälp av organiska lösningsmedel, var koncentration verifierades genom UV-VIS-spektrofotometri (figur 1) och sedan effekten av TCS (<30 ^ M) undersöktes på mastcelldegranulering (figurerna 2 och 3) , med användning av en fluorescens mikroplatta analys för att detektera närvaron av β-hexosaminidas, en surrogatmarkör för degranulering. Vi har funnit att TCS kan avsevärt dämpa frisättningen av β-hexosaminidase från RBL mastceller vid upplösning i en låg koncentration av etanol (0,24% vol / vol) 2 eller, såsom visas här, direkt i vattenhaltig buffert. Genom foregoing organiskt lösningsmedel, ser vi faktiskt mer uttalad dämpning i antigen-inducerad degranulering jämfört våra studier där TCS löstes i 0,24% etanol (volym / volym). Till exempel, här vi har visat en> 50% reduktion av antigen-inducerad degranulering (0,46-faldig ± 0,07), vilket är mycket större än ~ 25% minskning vi rapporterade för 10 pM TCS lösta i 0,24% etanol (0,76-faldig ± 0,02) 2. I samma anda har vi bestämt för A23187-stimulerade celler som, med 5 ^ M hämmar TCS degranulation till spontan frisättning nivåer, denna effekt inte påvisas förrän 10 iM TCS i vår tidigare, etanol-användning, studie 2. Det finns två möjliga orsaker till denna diskrepans: antingen en 0,24% etanol fordon 2 dämpar TCS: s förmåga att hämma aktivt mast celL degranulation, eller TCS vi använde var mindre koncentrerad än väntat (eftersom halterna inte granskades av UV-Vis-spektrofotometri i tidigare studie 2). När det molekylära målet för TCS: s hämning av mastcelldegranulering, det förekommer sannolikt någonstans i kaskaden signaltransduktionsstegen nedströms kalciuminflöde 2. Vi använde kalciumjonoforen A23187 som en degranulering stimulerande att kringgå tidiga signaleringshändelser, och TCS: s hämmande effekt kvarstod, vilket indikerar att målet för TCS hämning i degranulering reaktionsvägen inte troligt är placerad uppströms kalciuminflöde. Vi har tidigare visat att membran ruffling av dessa celler också är undertryckt på grund av TCS behandling, vilket tyder på möjligheten av en gemensam väg mål 2.
Tidigare studier har funnit absorbansspektrum av TCS har en maximal topp vid 280 nm och en molar absorptionskoefficient utvärderades vara 4200 L / mol / cm vid denna Våglängdgth (vid pH-värden under pKa) 12. Det har visat sig att upphettning av TCS inte leder till termisk nedbrytning 57, och en annan studie har visat framgång i upplösning av TCS i vatten medan den värms till 50 ° C utan hjälp av ett organiskt lösningsmedel 56. När någon ny testkemikalie används, dess löslighet i vattenhaltig buffert naturligtvis, måste noggrant övervägas. Vi har också funnit att, när uppvärmning av TCS, är formen på den spektrala avläsning opåverkad om det upphettas under 40 till 90 min (data visas ej): detta tyder på en brist på nedbrytning av TCS vid upphettning under en längre period av tid. Observera dock är att TCS upplösning större vid 90 min än 40 min. Vi har också bekräftat att TCS inte faller ut ur lösningen för varaktigheten av degranulering experimentet (data ej visade).
DNP-BSA-antigen och kalciumkoncentrationer jonofor användes i denna studie valdes på basis av antigen-och jonofor-dos-respons-analyser, end valdes för att framkalla måttliga degranulering nivåer för de representativa figurerna 2 och 3. Ett exempel på ett antigen dos respons-analys kan ses i Figur 1A i vårt tidigare arbete 2. Vid bestämning av antigen eller jonofora koncentration som skall användas i experimentet, är det viktigt att vara medveten om att centralstimulerande dos-respons-experiment måste göras regelbundet, vanligtvis minst varannan månad, eftersom RBL-2H3 celler ibland fungerar steglöst. Den koncentration som ger den önskade degranulation procentsats kan variera beroende på ålder av cellerna och på antigen / jonofor beredning. Också, som vi har sett med oorganiskt arsenit 22, kan absolut degranulering procentsatser (nivåer av antigen som används) påverkar halterna av toxiska effekter på RBL degranulation, så toxikant dos-respons bör göras på flera olika antigen / jonofor koncentrationer. Det är också viktigt att beakta den slutliga concentration DMSO fordon vid stimulering degranulation med jonofor, eftersom degranulering påverkas av DMSO 62. Vi har funnit DMSO koncentrationer som används i detta protokoll inte påverkar degranulation, läsningar bakgrund, eller 0,2% Triton X-100 värden 2.
Förutom den multivalenta antigenbindande DNP-BSA och kalciumjonoforen A23187, finns det flera andra metoder för RBL-2H3 stimulering. En av dessa metoder är stimulering via exponering till förening 48/80 tillsammans med quercetin 63. En annan är tvärbindning av IgE-bundna receptorer med en anti-IgE-IgG, som vi tidigare testats tillsammans med TCS exponering 2. Många andra stimulering metoder finns, och var och en av dessa metoder avser en särskild mekanistisk aspekt av mastcelldegranulering. Denna plattläsaren analys kan anpassas för användning med många av dessa alternativa stimulatorer, ytterligare expandera sin användbarhet.
Denna degranulation protokoll har potential att kunna användas med en mängd olika chemicals. I en studie av något test kemisk användning av denna analys, måste kontroller köras för följande: (1) effekt av testämnet på bakgrunden (inga celler) avläsningar, (2) effekten av kemikalien på spontan degranulering (celler utan IgE , inget antigen, ingen jonofor), (3) effekten av kemikalien på Triton-X-100 värden av lyserade celler (inget antigen, ingen jonofor). Dessa tester kan lätt arbetas in i plattan layout. Tidigare hittade vi TCS påverkar ingen av dessa tre parametrar 2. Dessutom bör tester köras för att fastställa att testämnet inte stör β-hexosaminidas enzym / substrat reaktion sig i en cell-fri beredning, såsom beskrivs i figur S1 i Bilaga A kompletterande uppgifter avsnittet Palmer et al. 2 Vi fann att TCS inte interfererar med förmågan hos β-hexosaminidas att klyva det fluorogena substratet 4-MU 2. Effekter av eventuella lösningsmedel som används måste också beaktasi alla dessa kontrollexperiment. Exempelvis bekräftade vi att DMSO, lösningsmedel för jonoforen, har ingen effekt på Triton-X-100 provfluorescens nivåer (data ej visade). Vi noterar också att vi valde all plast som används i denna studie för att inte innehåller endocrinedisruptor bisfenol A, tyvärr, men all plast som finns på marknaden förmodligen göra innehåller några hormonstörande aktivitet, vilket potentiellt kan förbrylla uppgifter 64.
I händelse av att krävs felsökning, måste flera potentiella aspekter av detta protokoll ses över. Till exempel kan det vara så att (1) spontan frisättning nivåerna är för hög (större än ~ 7% av lys-värden), (2) en dos-respons med antingen stimulerande och / eller testkemikalie inte respekteras, eller (3) TCS-koncentrationen i lösning är för låg (lägre än 20 | iM). I det första fallet, skulle en hög spontan nivå vara en indikation på att cellerna i kulturen för länge eller är förorenat med mykoplasma, därför, Prova dessa experiment med RBL-2H3 celler som har varit i kultur mellan 2-20 veckor, och regelbundet testa för mykoplasma. Om en stimulerande dos respons inte följs, kan det upplösta stimulerande koncentrationen vara för låg, och bestånd bör omarbetas. Som ett exempel, typiskt kalciumjonofor tillhandahålls som en tunn film, som skall rekonstitueras med DMSO, kräver noggrann uppmärksamhet och mycket vortexa. Dessutom skulle en ny jonofor lager med en annan partinummer har en annan styrka helt enkelt på grund av massa-till-mycket variation, och därför är en degranulation dos respons rekommenderas med varje nyinköpt jonofora lager. Det är också värt att notera att en uppenbar brist på effekt med en given testkemikalie kan vara en indikation på att denna kemikalie kan kräva en längre inkubationstid för att orsaka en effekt. Om du inte uppnår en hög TCS avkastning i lösning, kontrollera att temperaturen har varit konstant (50 ° C ± 5) medan kornen löses i buffert. THan termometern aldrig skulle röra vid botten av flaskan, en ståndpunkt som skulle leda till en överskattning av temperaturen i lösningen. Se också till att det finns konstant kraftig omrörning och att 90 min nedräkning inte startas förrän temperaturen först har nått 50 ° C.
Tabell för felsökning.
Problem | Möjlig orsak | Lösning | |||
TCS lager bestäms vara <20 iM | Olikformig uppvärmning av lösningen | Se till att termometern är placerad så att den är upphängd i lösningen och är ej i kontakt med kolvens botten. | |||
Omrörning inte är tillräckligt kraftig | Öka magnetomröring på stir-platta för att nå en nivå av omrörning som är kraftig utan att orsaka att lösningen att hoppa ut ur kolven. Se till att en lämpligt dimensionerad magnetisk omrörarstav användes. | ||||
Problem med spektrofotometer | Medge en riktig uppvärmning av UV-lampa (vanligtvis 10 minuter), eller byt ut glödlampan om så behövs. | ||||
Spontana degranulering nivåerna är för höga (> ~ 7%) | Celler har fått onormala genetiska mutationer på grund av alltför mycket tid i odling | Utföra experiment med en ny cell töväder. | Celler dör på grund av mekanisk skjuvning | När du lägger buffert eller behandlingar vidhäftande celler, vara noga med att inte störa cellerna, genom att dessa volymer försiktigt på sidorna av mikrobrunnarna. Öva med Combitip. | |
IgE / DNP-BSA orsakar inte utsläpp av beta-hexosaminidas över spontan frisättning nivåer | IgE är äldre än 30 dagar eller har utsatts för frysning tina | Använd en ny, rätt förvaring alikvot av IgE. | |||
DNP-BSA har inte blivit ordentligt blandat | Var noga med att lägga den lilla volymen av DNP-BSA till den koniska röret och to virvel grundligt. | ||||
A23187 jonofor orsakar inte utsläpp av beta-hexosaminidas över spontan frisättning nivåer | A23187 lager har inte riktigt färdigställts | Produkten kommer som en "tunn film", och måste beredas med omsorg och mycket vortex. Transfer rekonstituerad lager till en ny 1,5-ml tub för förvaring. | |||
A23187 lager har inte förvaras på rätt sätt | Lagren är ljuskänsliga. Efter beredning Parafilm toppen, och lagra insvept i folie vid -20 ° C. Om det finns en fråga om lagring av ett lager, kasta och börja testerna med en ny stock. | ||||
180 nM A23187 jonofor inte framkallar intesamma nivå av relativ degranulering svar, som den som finns i en tidigare analys | Lot-till-lot variation av A23187 jonofor | Utför ett experiment dos-respons för varje ny lot jonofor. Det rekommenderas också att lagren från samma parti testas, beroende på potentiella variabilitet i beredning processen. |
Som i alla toxikologi / farmakologi experiment, måste provningen kemikalien inte vara öppet toxiska vid de testade koncentrationerna. Vi rekommenderar användning av metoder som test för både apoptos och nekros, antingen individuellt eller kombinerat (t.ex. med klonogena analyser), samt test för allmän skada på plasmamembranet (t.ex. laktatdehydrogenas läckage). TCS, vid koncentrationer som visas i denna studie, är inte cytotoxisk för RBL-2H3-celler 2. En särskild del av oro med jonoforen studier är att jonofor plus jonofora fordon(Sannolikt DMSO), plus testkemikalie, plus några organiska lösningsmedel som används, skulle kunna vara ett potentiellt cytotoxiska brygd, som måste kontrolleras noggrant, som görs i Palmer et al. 2
Vårt protokoll för beredning TCS lösningar utan användning av ett organiskt lösningsmedel kommer att vara användbart för ytterligare toxikologiska tester av denna allestädes närvarande kemikalie, utan inblandning av lösningsmedel artefakter, en särskilt viktig faktor i akvatisk toxikologi. Dessa metoder också möjliggöra kontroll av koncentrationen av TCS i lösning och kvantifiering av de effekter som kemikalier, såsom TCS, har på mastcelldegranulering. Detta protokoll kan användas för att bedöma effekterna av en mängd olika kemikalier på mastcellsdegranulering, såsom misstänkt hormonstörande kemikalier 55, och kan potentiellt skalas upp för high throughput screening. Dessutom kan andra mast celltyper användas i denna analys i det fortsatta arbetet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
LMV och RHK stöds av UMaine Graduate School of Biomedical Science and Engineering (GSBSE), RHK stöddes också av den Maine Agricultural & Forest Experiment Station. Ytterligare finansiering lämnades av National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), Maine Agricultural & Forest Experiment Station (licensnummer ME08004-10, JAG), University of Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1.008.498) , och en forskning Starter Grant i farmakologi / toxikologi från PhRMA stiftelsen (JAG). Vi tackar Dr. David Holowka och Barbara Baird för antigenet och cellerna. Vi är tacksamma för att Hina Hashmi, Alejandro Velez, och Andrew Abovian för hjälp med utrustning och beställningar. Detta är Maine Agricultural & Forest Experiment Station publikation nummer 3311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RBL-2H3 Cells |
ATCC | CRL-2256 |
The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC |
| Triclosan/Irgasan |
Sigma | 72779 CAS# 3380-34-5 |
Should be stored in a low humidity environment |
| Trypsin |
Gibco | 25300-054 CAS# 3380-34-5 |
|
| EMEM |
Lonza | 12-611F |
|
| Fetal Bovine Serum |
Atlanta Biologicals | S11150 |
|
| Gentamycin Sulfate |
Lonza Biological Sciences | 17-518 |
|
| Albumin, Bovine Serum |
Calbiochem | 12659 CAS# 9048-46-8 |
|
| Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution) |
Pierce | 28314 CAS# 9002-93-1 |
|
| HEPES |
J.T Baker | 4153-01 CAS# 75277-39-3 |
|
| Magnesium Chloride |
VWR | BDH0244-500G CAS# 7791-18-6 |
|
| D-(+)-Glucose |
Biomedicals | 152527 CAS# 50-99-7 |
|
| Potassium Chloride Crystal |
J.T Baker | 3046-01 CAS# 7447-40-7 |
|
| Calcium chloride dihyrdate |
Acros Organics | 207780010 CAS# 10035-04-8 |
|
| Glycine |
Sigma | G8898 CAS# 56-40-6 |
|
| 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU) |
EMD Biosciences | 474502-250MG CAS # 37067-30-4 |
Wrap in foil – is light-sensitive |
| Anti-DNP Mouse IgE |
Sigma | D8406 |
Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month. |
| DNP-BSA |
Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University | Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018 |
|
| Calcium Ionophore A23187 |
Sigma | C75-22-1mg |
Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully |
| DMSO |
Sigma | D2650 CAS# 67-68-5 |
|
| Acetic Acid |
VWR | BDH3094-2 CAS# 64-19-7 |
|
| Anhydrous Sodium Carbonate |
Sigma | 222321 CAS# 497-19-8 |
|
| Sodium Chloride |
Sigma | 71376 CAS# 7647-14-5 |
|
| Hydrochloric Acid |
VWR | BDH3026 CAS# 7647-01-0 |
|
| Reference Buffer, pH 7 |
VWR | BDH5046 |
|
| Reference Buffer, pH 10 |
VWR | BDH5072 |
|
| Reference Buffer, pH 4 |
VWR | BDH5018 |
|
| pH electrode storage solution |
VWR | 14002-828 |
|
| Equipment: | |||
| DU 7500 Spectrophotometer |
Beckmann | No longer sold |
|
| Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software |
BioTek | Module S |
|
| Hematocytometer |
Hausser Scientific | 3110 |
|
| 7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate |
VWR | 97042-634 |
|
| Centrifuge |
Eppendorf | 5430 |
|
| Tissue culture water bath |
VWR | Model# 89032-206 |
|
| Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood) |
The Baker Company | Model# SG403A-HE |
|
| Tissue culture incubator |
ThermoScientific | Model# 3598 |
|
| Pipetman |
VWR | Range: P2-P1000 |
|
| Balance |
Mettler Toledo | Model# AG204 |
|
| pH meter |
Symphony/VWR | Model# SB70P |
|
| Pipet-Aid |
Drummond Scientific | 4-000-100 |
|
| Combitip dispenser |
Eppendorf | 4981 000.019 |
|
| Recipes: | |||
| Acetate Buffer, pH 4.4 |
Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml | Sterile Filter into autoclaved glass bottle |
|
| Substrate (4-MU) |
Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again | For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer |
|
| Glycine Carbonate Buffer, pH 10 |
26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| Tyrodes (2 L), pH 7.4 |
135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| RBL Cell Media |
Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only. | Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle |
|
| Plastic material used: | |||
| 200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack |
VWR | 53509-009 |
polypropylene |
| 1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery |
VWR | 89003-420 |
polyethylene |
| 10 µl micro tip low binding sterile |
VWR | 14217-704 |
polypropylene |
| Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force |
VWR | 20170-038 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-178 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-103 |
polypropylene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 690175 |
polystyrene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 658175 |
polystyrene |
| CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 607180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 710180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 606180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 760180 |
polystyrene |
| 1 cm cuvettes |
N/A | N/A |
polystyrene |
| CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate |
Greiner Bio One | 655086 |
polystyrene |
| Combitips |
Eppendorf | 022266501 |
Polypropylene/ polyethylene |
References
- Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
- Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
- Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
- Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
- Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
- Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
- Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
- Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
- Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861 (1997).
- Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
- Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
- Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
- Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
- Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
- Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
- Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
- Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
- Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
- Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
- Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
- Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
- Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
- Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
- McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
- Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
- Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
- Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
- Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
- Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
- Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937 (2002).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
- Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
- Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
- Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
- Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
- Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
- Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
- Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
- Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
- Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
- Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
- Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
- Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
- Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
- Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
- Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
- Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
- Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
- Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
- Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
- Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
- Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
- Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
- Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
- Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
- Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
- Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
- Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
- Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
- Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).
