Abstract
経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）1を利用して脳内で使用されています。 PRVは、ヒトを含む大型類人猿を、感染していないので、それは、最も一般的に小型哺乳類、特にげっ歯類での研究で使用されています。仮性狂犬病株PRV152は、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子を発現し、逆行だけ離れた感染部位から2,3シナプス結合の階層的なシーケンスを機能的シナプスを横切ります。他のPRV株は、異なる微生物学的特性を有し、両方向（PRV-ベッカーとPRV-カプラン）4,5に搬送することができます。このプロトコルは、PRV152を独占的に扱います。筋肉のような末梢部位にウイルスを送達することによって、それがTへのウイルスの侵入を制限することが可能です神経細胞の特定のセットを通じ、彼は脳。脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンを解決します。仮性狂犬病ウイルスを使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な識別されたネットワーク内の特定の接続を解釈させるように、私たちは使用して識別されたセル間の接続を確認するために、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用する高感度かつ信頼性の高い方法を提示PRV152。彼らは、遠位樹状突起6-11を含む細胞プロセスを明らかにするのに効果的であるため、ペルオキシダーゼおよびDAB（3、3'-ジアミノベンジジン）とBDAとCTbをの免疫化学的検出を選択しました。
Introduction
経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）、PRV-バーサは、最初1961 12に記載とりわけ弱毒株を利用して、げっ歯類の脳に使用されている。ここでは、特定の筋肉の運動皮質の表現を識別するためのプロトコルを提示強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子2を発現する組換え仮性狂犬病ウイルス株（PRV152）を使用して、または筋肉群。記載されている方法は、クロスシナプスが機能回路3,4,13内の他のニューロンに感染することは感染性の子孫を生み出す神経向性ウイルスの挙動を利用しています。 PRV-バーサと同質遺伝子であるPRV152は、唯一の<離れ感染部位3,5からのシナプス結合の階層的なシーケンスを逆行性シナプスを横切ります/ SUP>。正確感染末梢部位を制御することにより、運動ニューロンの特定のサブセットを介して脳へのウイルスの侵入を制限することができます。ウイルス順次接続されているニューロンのチェーンに感染したように、脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンのネットワークを解決します。
ニューラルトレースのウイルスを使用することのさらなる利点は、感染細胞内のレポータータンパク質（この場合はEGFP）の増幅です。この信号増幅も疎突起の検出を可能にする感度のレベルを提供します。例えば、ウィスカーを制御顔面運動ニューロンへの感覚毛の運動野からのスパース投影がウイルス発現緑色蛍光タンパク質14を用いて、ラットで発見されました。以前の研究は、レポーター遺伝子増幅11,15なしで古典的なトレーサーを使用して、この投影法を見つけることができませんでした。残念ながら、多くのウイルスベクターがトレース挙げ研究で使用したものと同様に、それによって多シナプス回路をトレースするためのそれらの使用を制限し、シナプスを横断しません。
モータ回路に参加した細胞のネットワークを識別するための明確な利点を提示しながら、PRV-152を使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な回路内の特定の接続を解釈することができます。したがって、我々は、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用して、二重標識によってPRV-152を使用して識別回路内の特定の接続を検証するための簡単な方法を提示します。 BDAとCTbをの併用は、ニューロン6-8,11の特定のセットの間の接続をトレースするための十分に確立された手法です。一緒に使用する場合、これらの二つのトレーサーは、2色DAB（3、3'-ジアミノベンジジン）手順16を使用して同じ部分に可視化することができます。高分子量BDA（BDA10kDaは）それYので、このプロトコルを選択しました神経プロセス6,7,9の詳細なラベル付けをields。 BDA10kDaのさらなる利点は、以下のものがあります。それは、優先的に順行方向6-8に搬送されます。それは、イオン導入や圧力注入6-8で配信することができます。それは、単純なアビジン-ビオチン化HRP（ABC）の手順17で視覚化することができます。それは、光または電子顕微鏡6,7,18によって画像化することができます。それは、遠位樹状突起10,19を含む細胞プロセスを明らかにするのに有効であるため、ペルオキシダーゼおよびDABとCTbをの免疫化学的検出は、運動ニューロンの逆行性標識のために選ばれました。我々は最近、マウスでのボーカル運動経路を特定するために、以前に20存在しないと仮定した喉頭運動ニューロンへの一次運動野から疎な接続を明らかにするために、このアプローチを使用していました。
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Protocol
注：すべての動物の手順を見直し、デューク大学施設内動物管理と使用委員会により承認されています。
1.保存仮性狂犬病ウイルス
- 私たちは、1×10 9 PFU /メートルの力価でプリンストン大学で博士リンEnquistの研究室から生ウイルス（PRV152）を得ました。ウイルスを生成するためのプロトコルは、2を公開されています。
- 適切なバイオセーフティ条件の下で-80℃でBSL-2バイオセーフティキャビネットや店舗内チューブあたり20μlのでウイルスを等分。
- 注入の直前にPRVのアリコートを解凍します。
筋肉内に注射するための2外科の準備
- ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。
- 眼用軟膏で角膜を保護します。
- トンを準備彼の髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互に手術部位を消毒することにより、無菌技術による手術部位。外科的領域をカバーするために、滅菌ドレープを使用してください。手順を通して無菌技術に準拠していることを確認してください。
- 皮膚切開を行い、目的の筋肉を明らかにしました。例えば、輪状甲状喉頭筋にアクセスするためには、まず胸骨筋の上に重なる部分を除去する必要があります。
- VetBond組織接着剤を用いて任意の離断筋肉をシール。
筋肉にPRVの3インジェクション
- 34 Gステンレス鋼針を取り付け、解凍したてのPRV溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。
- ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロチップを出ることを確認します。 bioharzard廃棄物などの流体捨てます。
- 定位micropを使用ositioningデバイスは慎重に興味のある筋肉にマイクロチップを配置し、わずかな腫脹が表示されるまで、ゆっくりと筋肉を埋めます。注入速度は、注入されるべき筋肉とボリュームのサイズに依存して変化します。例えば、4 NL /秒の速度で200 NL（1μlの合計）の5回の注射は、輪状甲状筋を埋めるために同じサイトに1分間隔で行われるべきです。関心の次の筋肉に注射器（この場合は横方向の輪状披裂）を移動し、注入手順を繰り返します。一度だけ各筋肉を穿刺。
- 5分後にマイクロシリンジを撤回。
- VetBondの組織接着剤を使用して、筋膜の断線をシール。
- すべての注射が完了した後、VetBond組織接着剤を使用して創傷を閉じます。お近くのinstitional動物使用のガイドラインに応じて、縫合糸または創傷クリップを使用することができます。
- 胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、yで必要とされるケア当社の機関の動物の使用に関するガイドライン。
- （この場合、2 回目にラベルを付ける皮質ニューロンを注文する90時間）実験的に決定生存期間の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。
- 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。
- 少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。
eGFPの4免疫化学的検出
- スライディングミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。取り付けられた切片を染色する際に薄肉部は、例えば、30μmとするために、使用されてもよいです。
- 光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。
- VECTASTAINエリートキット（キットVE）から正常ヤギ血清、0.3％Tween20を含むPBSで30分間、切片中の非特異的抗原を遮断します。
- インクルードを室温でキットをVEから、その後ヤギ抗ウサギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベート、5分間のセクションをPBSで3回洗浄します。
- インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。
- 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後ザをRTでキットVEからABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。
- 0.05％DAB（3、3'-ジアミノベンジジン）および0.015％のH 2 O 2を含有する 、10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。
- スーパーフロストプラススライド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。
- 2キシレン回洗浄（各5分）を介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。
- 画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 DAB反応製品insidE細胞は茶色に表示されます。デジタル化された画像は色が細かいプロセスを強調するために反転させることができます。
PRVトレースによって検出された脳領域へのトレーサーの注射用5。外科の準備
- ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。
- 眼用軟膏で角膜を保護します。
- 適切な定位フレームに頭部を固定してください。
- 髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互にサイトを消毒することにより、無菌技術による手術部位を準備します。
- 頭皮の切開を行い、目的の脳領域上の皮膚を撤回。
- 適切な定位座標で小開頭手術を行います。例えば、laryngeally接続運動皮質の座標はでPRVトレースによって識別n個の成体マウスは、1.2ミリメートル、横方向とブレグマに0.2ミリメートル吻側です。
脳へのビオチン化デキストランアミンの6インジェクション
- 滅菌生理食塩水の333μlのBDA 25mgの（10,000 MW）を溶解することにより、7.5％のビオチン化デキストランアミン（BDA）を準備します。
- 計画された注射用の十分なBDA溶液でNanoject IIマイクロピペットシステムをロードします。
- ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロピペットチップを出ていることを確認します。
- 定位微細位置決め装置を使用して、慎重に関心のある脳領域にマイクロピペットの先端を下げ、ゆっくりBDAを注射します。領域の大きさに応じて、噴射率を標識するために調整します。例えば、4.6 NLの12注射は離れて0.2ミリメートル（吻側 - 尾側方向）は成体マウスでlaryngeally接続運動皮質をカバーするために、四つの異なる場所でも行われなければなりません。最終噴射量は、対象の脳領域の大きさに応じて調整されるべきです、ラベルは脳組織を通って、ラベルされたニューロンのプロセスに沿って拡散することにより、射出コアから広がる可能性があることを念頭に置いて。
- 歯科用セメントを使用して開頭術を密封し、VetBond組織接着剤を使用して頭皮の傷を閉じます。
- 胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。
筋肉へのコレラ毒素サブユニットBの7インジェクション
- 滅菌生理食塩水100μlのCTbを1mgを溶解させることによって、1％コレラ毒素サブユニットB（CTB）を準備します。
- 六日の脳へのBDA注射後、筋肉にPRV注射のために上記のように外科手術の準備を行います。
- 34 Gステンレス鋼針を取り付け、CTbを溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。
- 以前デとして関心の筋肉（複数可）にマイクロインジェクションを実行しますPRVのためのスクライブ。
- 胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。
- 三日のCTB注射の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。
- 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。
- 少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。
同じセクション内BDAとCTbを8.検出
- ミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。
- 光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。
- インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。
- 切片を5分間PBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。 10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、0.05％DAB（3、3'-ジアミノベンジジン）、0.015％のH 2 O 2、及び0.05％の塩化ニッケルを含有し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。細胞内でのDAB反応生成物は、黒表示されます。
- VECTASTAINエリートキットから正常ウサギ血清を0.3％Tween 20を含むPBS中で30分間ブロックセクション。
- RTで：インキュベートは、（10,000 1）ヤギ抗CTbをで2時間のセクションをブロックされています。
- セクション5分間PBS中で3回洗浄し、その後、インクルードをRTでキットをVEからウサギ抗ヤギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベートします。
- インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。
- 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で30分間、それらを反応させます。
- 0.05％DAB（3、3を含む、10分間のセクションをリン酸緩衝液で3回洗浄し、リン酸緩衝液中に最大8分、pHが7.4のために開発「-diaminobenzidine）と0.015％H 2 O 2。細胞内でのDAB反応生成物は茶色に表示されます。
- スーパーフロストプラススライド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。
- 2キシレン回洗浄（各5分）を介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。
- 画像顕微鏡に取り付けられたセクション。
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Representative Results
eGFPのための染色は、一次運動ニューロンの筋肉にPRV152を注入した後、約72時間の弱い信号を示す開始する必要があります。ウイルスの複製および経シナプス輸送はtiter-と時間依存4されています。約90時間の注入後、eGFPの染色は、2 番目の順に感染した細胞において強いシグナルを明らかにします。より長い生存期間は、3 回目を明らかにし、より高次の細胞が、生存時間は約5日間接種後PRVの致死性によって制限されています。
図1aは、7つの喉頭筋の二つに94時間PRV152を注入した後、PRV152は喉頭運動ニューロンを収容疑核、におけるEGFPを発現する感染したニューロンを示しています。ウイルスが感染した筋肉は、そのような舌下神経核などの他の発声運動ニューロンプールを、神経支配ニューロンを介して脳に入ったので、eGFPを発現しない（ 図1B）。
図3は 、末梢注射部位へのeGFPの反対を表現する運動皮質における感染前運動ニューロンを示しています。 PRV152は疑核に喉頭運動ニューロンに当たる多シナプス回路を介して拡散するので、bのできますeは喉頭筋肉の運動皮質の表現を構成する細胞の集団のみが感染していたと仮定しました。 （と前脳の大部分は示されていない）示された断面の残りのEGFPシグナルの欠如は、標識の特異性を示します。
図4は疑核のレベルで脳幹内BDA標識軸索を示しています。軸索は逆行喉頭筋に注射により標識のCTB正運動ニューロンと接触します。軸索は、喉頭運動ニューロンの樹状突起と細胞体の近くに静脈瘤と推定される端子終末を形成する表示されます。電子顕微鏡や電気を使用してさらなる実験は、これらの静脈瘤は、シナプス終末を表しているかどうかを決定する必要があります。
図5aは PRV152でトレース逆行性経シナプスによって識別されるようにlaryngeally接続運動皮質に置かBDAの二国間の注入を示しています。ベック ause BDAは、求心性と遠心性接続の両方を標識することができる、方向固有のものではありません。例えば、投影視野（順行）及び細胞体（逆行）ラベルの両方が視床（ 図5b）に見られます。
図1：PRV152（a）はAmbiguus AMB（）におけるEGFP（緑）、コリンアセチルトランスフェラーゼ免疫運動ニューロン（赤）を発現する感染ニューロンとマウス脳幹94時間の（b）の舌下（XII）核PRV152を注入した後に輪状甲状と横輪状披裂喉頭筋。 RF =網様体。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：輪状甲状と横輪状披裂喉頭筋肉にPRV152を注入した後、マウス86時間の脳幹におけるPsuedorabiesウイルス（PRV152）感染（a）のニューロンが白（強化緑色蛍光タンパク質を発現する、染色した切片の元の明視野画像から反転色。 ）を注入筋肉に疑核AMB（）同側で、周囲の網様体（RF）および孤束核（ソル）ではなく、舌下核（XII）。 （B）のAmb、高倍率で網状介在（赤い矢印、RFにおける細胞体）。スケールバーのための：1ミリメートル。 Bの100ミクロン。 （アリアガら 。2012年から変更された）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3：皮質錐体ニューロンは、eGFPの（白、染色した切片の元の明視野画像から反転色）を発現する輪状甲状と横輪状披裂喉頭筋にPsuedorabiesウイルス（PRV152）の注射後のM1の皮質層Vにスケールバー：のための1ミリメートルメインパネル;インセット200ミクロン。 （アリアガら 2012から変更）。
図4：脳幹におけるM1軸索 M1にBDAの注射から喉頭の筋肉とM1の軸索内注射からのAmb（ブラウン）（黒）でCTbを標識運動ニューロンを含む冠状脳幹部分の（a）の低消費電力。 BDAラベル軸索は、皮質錐体（Pyrで）トラックで見ることができます。略語：のAmb、疑核。 Pyrで、ピラミッド。 MRF、Reticular形成は、直接のAmbに正中。 DRF、のAmbに網様体の背側。 （b）は BDAの高倍率はのAMB運動ニューロン（CTB茶色）に接触（矢印）を行い、M1からの軸索（黒、矢頭）をラベルされました。 （c）は 、M1の軸索（黒）（矢印）に沿って走ると近く（矢頭）のAmbから放射状に広がる大型のAmb運動ニューロン樹状突起。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：注射部位とPRVのシナプス経由のトレースでは見られないBDAの注射によって明らかにされた追加の双方向接続。 （a）は、一次運動野（M1）で二国間のビオチン化デキストランアミン（BDA）注射（黒）は、基礎となる線条体に高密度のターミナル投影視野（黒）を明らかにしました。 （B）コルチM1からCAL軸索は視床（VL）の腹外側核で終了します。視床細胞のクラスター（ダークブラウンと白の矢印ヘッドでマーク）バックM1の歌領域とそのプロジェクトはまた、VLで観察されます。内部カプセル（IC）は皮質からの軸索を標識しました。スケールバーのための：1ミリメートル。 bについては200μm。 （アリアガら 。2012年から変更された）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
PRV152 4,21を用いた実験を計画する際に考慮に入れなければならない多くの問題があります。最も重要なのは、仮性狂犬病ウイルスは致命的です。前述したように、ヒトを含む大型類人猿は、感染に対して感受性ではなく、適切なケアは、他の動物を保護するために行使されなければなりません。成体マウスは通常、5〜7日間の弱毒PRV152株を接種した後に生き残ります。したがって、PRV152は1週間以上の生存時間を必要とする実験のために適切ではありません。また、感染した動物は、一般的に、それによって正常な行動の観察を必要とする実験のためPRV152の有用性を制限し、生存期間中に病気の兆候が表示されます。
さらに、PRV152は、細胞傷害性免疫応答22をトリガーします 。複製やウイルスの送信は時間依存4 titer-とされているので、ニューロンのパターンは、ビラの免疫化学的検出によって明らかに細胞は、感染の段階を経て進行としてのLタンパク質またはEGFPレポーター遺伝子は、生存期間の過程で変更されます。五日間筋肉内接種後、 第 3または第 4次ニューロンは、検出可能であり得るが、最も初期の感染ニューロンは、アポトーシスになることがあります。したがって、最適な生存時間はそれぞれの研究のために実験的に決定されるべきです。これは、回路を介して感染の進行および細胞または動物死の危険を冒すことなく、興味のある特定の神経細胞を標識するための最良の時点を決定するために、時系列分析を実行することをお勧めします。
PRVでの標識の成功に影響を与える最も重要な要因の一つは、ウイルス力価です。 1.4×10 5〜7×10 4 PFU / mlの23からPRV-バーサの力価を減少させる際に感染した細胞の数の著しい減少が報告されています。したがって、我々は、1×10 7 PFU / mlの力価の上を使用し、等分VIにしておくことをお勧め-80℃でRUSそれは、その感染力を維持するために使用されるまで。高力価を使用する場合でも、1は、すべての細胞型が感染を許容することができるということを覚えておいてください。したがって、PRV追跡により同定された細胞は、感染した標的への入力の完全代表ではないかもしれません。
記載の方法は、多シナプス回路を介し、特に筋肉、末梢の標的を調節する中央遠心性を分析するためのPRVの有用性に焦点を当てています。それらはまた、末梢接種によって感染させることができるので、そのような視覚的および自律神経24などの他の神経回路は、この技術によく適しています。しかし、PRV前件3で広く説明するようにいくつかの問題を慎重に考慮すると、中枢神経系への直接注射のために有効に利用することができます。これらの著者は、PRV-バーサおよび関連株が広くidentifyiためPRV152はよく適し作り、感染した神経細胞の樹状アーバーを埋めることに言及遠位樹状突起への求心性神経をngの。ウイルスのこの特性は、典型的には、従来のトレーサーを用いて研究されているセルのボディ領域の外に位置する遠位樹状突起への入力の予備リストを推定するための記載された技術は、特に有用です。
周辺ターゲットからトレースすると、交感神経支配が可能な交絡を考慮すべきです。したがって、我々は最初に交感神経入力のPRVの標識は、結果の解釈に影響を与えるかどうかを判断するために、通常とsympathectomized動物で標識パターンを比較することをお勧めします。
PRV152で表さeGFPを感染細胞からの信号は、免疫組織化学を必要とせずに蛍光顕微鏡を使用して、直接画像化することができます。しかしながら、この信号は、光退色に供され、経時的に劣化します。管トレースのDAB染色と組み合わせた免疫組織化学の主な利点は、反応生成物の永久的な性質です。それ私がしばらく感染した細胞を検出するために、ウイルスタンパク質に対する抗体を使用することもできるのは、別のウイルスの要素は必ずしも互いに25またはEGFPシグナルと共局在化しないであろう。そこで、蛍光で観測された標識パターンを維持するためのeGFPに対する抗体を使用することをお勧めします。
感染細胞へのすべての求心路は、遠位樹状突起に接触するものを含め、ウイルスの経シナプス通過のための導管になりそうなので、私たちは確実に識別された回路でリレーのその後の確認のため、このような樹状突起を染色する従来のトレーサーを選択することが重要であると考え。我々は、この目的のためにCTbを選択し、それが樹状突起の良好な染色および周囲の神経網および運動皮質から下降軸索の両方で強いコントラストを提供することを見出しました。それは染色された軸索と細胞体の着色（BDA =茶色、CTbを=黒）を逆にすることも可能であるが、我々は、黒は最高の共同を提供することを見つけますntrast細かい口径の軸索を可視化します。
BDAの標識パターンを解釈するときに心に留めておくべき重要な点は、BDA10kDaは主に順行性トレーサーとして使用されることであるが、また6（ 図6）逆行性細胞を標識することができます。また、BDAは、別の端末サイトに軸索担保に沿って分布して細胞内に逆行性に輸送することができます。それらの軸索側枝が注入領域の投影対象と同じ領域内に存在する場合、それは順行性標識と区別することは困難です。
最終的なテクニカルノートが34のG NanoFil金属シリンジは、細かい口径よりも良好に機能する筋肉にトレーサーを注入するためのガラスピペットを引っ張ったが、小さな動物での脳内注射に使用した場合あまり機械的な損傷を引き起こすことがあります。したがって、我々は、中央の注射用周辺注射用金属シリンジとガラスピペットを使用することをお勧めします。
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Acknowledgments
我々は、喉頭手術技術を教えるため、神戸大学、日本の博士俊夫寺島に感謝し、PRV-バーサを供給するためのプリンストン大学のDr.リンEnquist。研究は、エーリッヒ・D・ジャービスとグスタボ・アリアガにNSF大学院研究フェローシップ賞にNIHのパイオニア賞DP1 OD000448によってサポートされていました。適切に入金前作からフィギュアは、ジャーナルの編集方針に従ってPLoSのONEオープンアクセスクリエイティブ・コモンズ・ライセンス（CC-BY）の下で使用されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
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