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Neuroscience

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

Published: September 14, 2015 doi: 10.3791/50672

Abstract

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 접근법은 가장 광범위 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV) (1)을 이용하여 뇌에 사용되어왔다. PRV는 인간을 비롯한 영장류를 감염시키지 않으므로 가장 일반적으로 작은 포유류, 특히 설치류 연구에 사용된다. (僞) 균주 PRV152는 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 리포터 유전자를 발현하고 만 역행 떨어져 감염 부위에서 2,3- 시냅스 연결의 계층 순서를 기능적 시냅스 십자가. 기타 PRV 균주는 별개의 미생물 학적 특성을 가지고 두 방향 (PRV-베커와 PRV-카플란) 4,5에서 전송 될 수있다. 이 프로토콜은 PRV152 독점적으로 다룰 것이다. 근육과 같은 말초 부위에서 바이러스를 제공함으로써, t로 바이러스의 침입을 제한 할 수있다뉴런의 특정한 세트를 통해 그 뇌. eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 연결된 뉴런을 해결. (僞) 바이러스와 transsynaptic 추적의 분산 특성이 어려운 식별 된 네트워크 내에서 특정 연결을 해석한다, 우리는 사용하여 식별 세포 사이의 연결을 확인하기위한 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 서브 유닛 B (CTB)를 사용하는 민감하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다 PRV152. 그들은 말초 돌기 6-11 포함한 세포 과정을 계시하는데 효과적이기 때문에 옥시다아제 및 DAB (3,3'- 디아 미노)와 BDA 및 CTB의 면역 검출을 선택 하였다.

Introduction

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 방법은 가장 광범위 특히 약독 화 균주 PRV-Bartha은 1961에서 설명 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV)을 이용하여 쥐의 뇌에서 사용되어왔다 (12). 여기서는 특정 근육의 운동 피질 표현을 식별하기위한 프로토콜을 제시 또는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 2 리포터 유전자 발현 (僞) 재조합 바이러스 균주 (PRV152)를 사용하여 근육 그룹. 한 방법은 간 시냅스가 기능 회로 3,4,13 내의 다른 신경 세포를 감염시킬 것을 전염성 자손을 생산 neurotropic 바이러스의 동작을 이용한다. PRV-Bartha과 동종이다 PRV152은 단지 거리에 감염 사이트 3,5 <에서 역행 시냅스 연결의 계층 순서를 통해 시냅스를 교차/ SUP>. 정확하게 감염의 외주 위치를 제어함으로써, 그 운동 뉴런의 특정 서브 세트를 통해 뇌에 바이러스의 침입을 제한 할 수있다. 바이러스 순차적으로 연결된 뉴런의 체인을 감염 같이, eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 접속되어 신경 네트워크를 해결할 것이다.

신경 추적하는 바이러스를 사용하는 부가적인 이점은 감염된 세포 내에서 리포터 단백질 (이 경우 eGFP는)의 증폭이다. 이 신호 증폭에도 희소 돌기의 검출 감도의 허용 레벨을 제공한다. 예를 들면, 수염을 제어 안면 운동 뉴런에 vibrissa 모터 피질에서 희소 돌기 급속도로 표현 녹색 형광 단백질 (14)을 사용하여 래트에서 발견되었다; 이전의 연구는 리포터 유전자 증폭 11, 15 않고 고전 추적기를 사용하여이 투사를 찾지 못했습니다. 불행하게도많은 바이러스 추적 벡터는, 인용 된 연구에서 사용 된 것과 같은, 다중함으로써 시냅스 회로 추적을위한 이들의 사용을 제한하는, 시냅스 교차하지 않는다.

모터 회로에 참여하는 세포의 네트워크를 식별하기위한 고유 한 장점을 제시하고 있지만, transsynaptic의 분산 특성은 PRV-152 곤란 회로 내의 특정 연결을 해석하게하여 추적. 따라서, 우리는 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 사용하여 이중 라벨에 의해 PRV-152을 사용하여 식별 회로 내의 특정 연결을 검증하기위한 간단한 방법을 제시한다. BDA와 CTB의 병용은 신경 6-8,11의 특정 세트 사이의 연결을 추적하는 잘 확립 된 방법입니다. 함께 사용되는 경우, 이들 두 추적자 2 색 DAB (3,3'- 디아 미노) 프로 시저 (16)를 사용하여 동일한 구역으로 시각화 될 수있다. 고 분자량 BDA (BDA10kDa)은이 프로토콜을 선택한 것이 Y 때문에신경 과정 6, 7의 상세한 라벨을 ields. BDA10kDa의 추가 장점은 다음과 같습니다 :이 우선적으로 선행 성 방향 6-8로 운송된다; 이는 이온 삼투압 또는 압입 6-8에 의해 전달 될 ​​수있다; 그것은 단순한 아비딘 - 바이오틴 HRP (ABC) 프로 시저 (17)에 의해 시각화 될 수있다; 그것은 빛 또는 전자 현미경 6,7,18에 의해 촬영 할 수 있습니다. 이 원위 수상 돌기 10,19 포함 세포 과정을 공개 효과적이기 때문에 퍼 옥시 다제 및 DAB와 CTB의 면역 화학적 검출의 motoneurons의 역행 라벨 선택되었다. 우리는 최근 생쥐의 보컬 모터 경로를 확인하고 이전에 20 부재로 가정 된 후두 운동 신경, 1 차 운동 피질에서 스파 스 연결을 나타 내기 위해이 방법을 사용했다.

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Protocol

참고 : 모든 동물 절차를 검토하고 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 보관 (僞) 바이러스

  1. 우리는 1 × 109 PFU / m의 역가에 프린스턴 대학에서 박사 린 Enquist의 실험실에서 라이브 바이러스 (PRV152)을 얻었다. 바이러스를 생성하는 2 프로토콜을 발표되었다.
  2. 적절한 바이오 안전성 조건에서 -80 ° C에서 BSL-2 바이오 안전성 캐비닛과 가게 내부 튜브 당 20 μL에서 바이러스를 나누어지는.
  3. 바로 주입하기 전에 PRV의 나누어지는을 녹여.

근육에 주사 2. 수술 준비

  1. (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다.
  2. 안과 연고와 각막을 보호합니다.
  3. T 준비머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 수술 부위를 소독하여 무균 기술에 따라 그 수술 부위. 수술 영역을 커버하는 멸균 커튼을 사용하십시오. 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 준수해야합니다.
  4. 피부 절개를 확인하고 관심있는 근육을 알 수있다. 예를 들어, 첫 sternohyoid 근육의 상부 부분을 제거 할 필요가있다 cricothyroid 후두 근육에 액세스한다.
  5. VetBond 조직 접착제와 어떤 횡단 근육을 밀봉합니다.

근육에 PRV 3. 주입

  1. 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, 갓 해동 PRV 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트.
  2. 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 실린 팁을 종료 확인합니다. bioharzard 폐기물 등의 유체 폐기하십시오.
  3. 정위 microp 사용ositioning 장치는주의 깊게 관심의 근육에 마이크로 실린 팁을 배치하고 약간의 붓기가 보일 때까지 천천히 근육을 입력합니다. 근육과 볼륨의 크기에 따라 달라질 분사량이 분사된다. 예를 들어, 4 NL / 초의 속도로 200 NL (1 μL 전체)의 다섯 주사 cricothyroid 근육을 채우기 위해 동일한 부위에 약 1 분 이격되어야한다. 관심 옆 근육 주사기 (여기서는 횡 cricoarytenoid)를 이동 및 주입 절차를 반복한다. 한 번만 각 근육에 구멍.
  4. 5 분 후에 마이크로 실린 후퇴.
  5. VetBond 조직 접착제를 사용하여 밴드의 틈을 밀봉합니다.
  6. 모든 주사가​​ 완료된 후, VetBond 조직 접착제를 사용하여 상처를 닫는다. 지역 institional 동물 사용 지침, 봉합이나 상처 클립에 따라이 사용될 수있다.
  7. 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터하고 진통, 음식, 물을 제공하고, Y가 요구 신경우리의 기관 동물 사용 지침.
  8. 실험적으로 결정된 생존 시간 후 (이 경우 90 시간이 2 라벨 ND 피질 뉴런을 주문하기 위해), 펜토 바르 비탈 과다에 의해, 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류.
  9. 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정.
  10. 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect.

eGFP는 4. 면역 화학적 검출

  1. 슬라이딩 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다. 장착 섹션을 더럽히는 경우가 더 얇은 섹션, 30 μm의 예를 위해 사용될 수있다.
  2. 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다.
  3. PBS는 VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 염소 혈청 0.3 % 트윈 20을 포함하는 30 분 동안 섹션이 아닌 특정 항원을 차단 (키트를 VE).
  4. 실온에서 키트를 VE에서 다음 염소 항 - 토끼 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오.
  5. 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다.
  6. 실온에서 키트를 VE에서 다음 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오.
  7. 0.05 % DAB (3, 3'-미노)와 0.015 %의 H 2 O 2를 포함, 10 분 동안 인산 버퍼에 절을 세 번 씻어 인산염 버퍼에 8 분, pH가 7.4에 대한 개발.
  8. 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %).
  9. 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에.
  10. 이미지 현미경에 장착 된 부분. DAB 반응 생성물 insid전자 세포는 갈색 나타납니다. 디지털화 된 이미지는 미세 공정을 강조 반전 색이 될 수 있습니다.

PRV 추적에 의해 발견 된 뇌 영역으로 트레이서 사출 5. 수술 준비

  1. (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다.
  2. 안과 연고와 각막을 보호합니다.
  3. 적절한 정위 프레임에 머리를 고정합니다.
  4. 머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 사이트를 소독하여 무균 기술에 따라 수술 부위를 준비합니다.
  5. 두피 절개를 확인하고 관심있는 뇌 영역을 통해 피부를 철회.
  6. 해당 정위 좌표에 작은 개두술을 수행합니다. 예를 들어, PRV는 추적을 식별 laryngeally 연결 운동 피질의 좌표N 성인 마우스는 1.2 mm의 측면과 브레 그마 0.2 mm의 주동이 있습니다.

뇌에 바이오틴 덱스 트란 아민 6. 주입

  1. 멸균 생리 식염수 333 μL에서 BDA의 25 밀리그램 (10,000 MW)을 용해하여 7.5 % 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)를 준비합니다.
  2. 계획 주사에 대한 충분한 BDA 솔루션 Nanoject II의 마이크로 피펫 시스템을로드합니다.
  3. 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 피펫 팁을 종료되어 있는지 확인합니다.
  4. 마이크로 위치 정위 장치를 사용하는 것은주의 깊게 관심 뇌 영역에 마이크로 피펫 팁을 낮추고 BDA 천천히 주입. 영역의 크기에 따라 주사 속도가 표시되도록 조정한다. 예를 들어, 4.6 NL의 12 주사 떨어져 0.2 MM (rostro-꼬리 방향) 성인 쥐의 laryngeally 연결 운동 피질을 충당하기 위해 네 개의 다른 위치에있을 제작한다. 최종 주입 부피는 관심 뇌 영역의 크기에 따라 조정되어야레이블이 뇌 조직을 통해 레이블 뉴런의 과정을 따라 확산에 의해 주입 코어에서 확산 할 수 있음을 염두에두고.
  5. 치과 용 시멘트를 이용하여 개두술을 밀봉하고 VetBond 조직 접착제를 이용하여 두피에 상처를 닫는다.
  6. 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경.

근육 콜레라 독소 B 서브 유닛의 사출 7.

  1. 멸균 생리 식염수 100 ㎕에 CTB 1mg을 용해시켜 1 % 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 준비한다.
  2. 엿새 동안 뇌에 BDA 주입 한 후, 근육에 PRV 주사에 대해 상술 한 바와 같이, 수술 준비를 수행합니다.
  3. 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, CTB 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트.
  4. 이전에 해제로 관심의 근육 (들)에 microinjections를 수행PRV에 대한 스 크라이 빙.
  5. 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경.
  6. 사흘 CTB 주입 후, 펜토 바르 비탈 과다하여 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류.
  7. 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정.
  8. 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect.

같은 섹션에서 BDA와 CTB 8. 검출

  1. 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다.
  2. 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다.
  4. 다음 실온에서 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오. 10 분 동안 인산염 완충액 섹션 세 번 씻고, 0.05 % DAB (3,3'- 디아 미노 벤지딘), 0.015 %의 H 2 O 2, 및 0.05 %의 염화 니켈을 함유하는 인산염 완충액에서 8 분, pH가 7.4에 대해 개발한다. 세포 내부의 DAB 반응 생성물은 검은 나타납니다.
  5. VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 토끼 혈청 트윈 20 0.3 %를 포함하는 PBS에서 30 분 동안 차단 섹션.
  6. 실온에서 : 품어 염소에 2 시간 동안 안티 CTB (10,000 1) 섹션을 차단.
  7. 실온에서 키트를 VE에서 다음 토끼 항 염소 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오.
  8. 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다.
  9. 다음 실온에서 ABC 용액에 30 분 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오.
  10. 0.05 % DAB (3, 3을 포함, 10 분 동안 섹션을 인산염 완충액에 세 번 씻어 인산염 버퍼에 최대 8 분, pH가 7.4에 대한 개발'-diaminobenzidine)와 0.015 %의 H 2 O 2. 세포 내부의 DAB 반응 생성물 갈색 나타납니다.
  11. 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %).
  12. 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에.
  13. 이미지 현미경에 장착 된 부분.

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Representative Results

eGFP는 위해 염색하는 것은 근육에 PRV152를 주입 한 후 일차 운동 뉴런에 약 72 시간을 약한 신호를 보여주는 시작해야한다. 복제 및 바이러스의 transsynaptic 교통 titer-과 시간에 따라 4입니다. 약 90 시간 주입 후, eGFP는 염색은 2 차 순서에 감염된 세포에 강력한 신호를 공개합니다. 긴 생존 시간은 3 차 및 고차 세포를 공개하지만 생존 시간은 약 오일 접종 후 PRV의 치사에 의해 제한됩니다.

그림 1a는 PRV152는 후두 운동 신경, 일곱 후두 근육의 두 가지로 PRV152의 주사 후 94 시간 주택 핵 ambiguus에 eGFP는 표현에 감염된 신경을 보여줍니다. 바이러스가 감염된 근육, 같은 설하 핵 다른 phonatory 운동 신경 풀을, 신경을 분포시키다 신경을 통해 뇌에 입력하기 때문에, eGFP는을 표명하지 아니합니다 (그림 1b).

그림 2는 핵 ambiguus에서 차 감염 이후 2 주문 뇌간 신경 세포에 바이러스의 역행 전송을 보여줍니다. 주입은 일방적이고, 뇌간에서 라벨의 결과 패턴은 동측 핵 ambiguus과 고독한 핵 (그림 2a)의 감염을 보여줍니다. 망상의 interneurons 또한 감염 eGFP는 (그림 2b)에 대해 강하게 염색 하였다. 이들의 interneurons는 phonatory 모터 신경 풀과 반대측 핵 ambiguus 등 다양한 구조를 연결; 바이러스는 단지 역행 방향으로 확산하기 때문에, 그들의 원심성 대상 표지 된 남아있다.

도 3은 주사 부위 주변에 eGFP는 반대측의 발현 운동 피질에 감염된 전 운동 뉴런을 나타낸다. PRV152이 핵 ambiguus에서 후두 운동 신경에 충돌 다중 시냅스 회로를 통해 확산 때문에, 수 bE는 후두 근육의 운동 피질 표현을 구성하는 세포의 집단이 감염된 것으로한다. (그리고 전뇌의 대부분은 도시되지 않음) 도시 섹션의 나머지 eGFP는 신호의 결여는 표지의 특이성을 보여준다.

그림 4는 핵 ambiguus의 수준에서 뇌간에 축삭을 BDA가 표지이다. 축삭은 역행 후두 근육에 주사하여 표시된 CTB 양성 운동 신경과의 접촉을합니다. 축삭은 후두 운동 신경의 정맥류와 수상 돌기 근처 추정 터미널 튼스와 소마를 형성 표시됩니다. 전자 현미경 또는 전기 생리학을 사용하여 추가 실험은 이러한 정맥류가 시냅스 튼스를 나타내는 여부를 결정해야합니다.

도 5a는 PRV152으로 추적 역행 transynaptic에 의해 식별 laryngeally 연결 운동 피질에 배치 BDA의 양자 주입을 보여줍니다. 벡 ause BDA는 모두 구 심성 및 원심성 연결이 표시 될 수 있으며, 방향성 특정하지 않습니다. 예를 들어, 투영 영역 (선행 성) 및 세포 기관 모두 (역행) 라벨 시상에 보인다 (도 5b).

그림 1
그림 1 : PRV152은 () Ambiguus AMB ()에 eGFP는 (녹색)과 콜린 아세틸 면역 양성의 motoneurons (적색) 표현에 감염된 뉴런 및 (b)에 PRV152의 주입 후 마우스 뇌간 94 시간의 설하 (XII) 핵 Cricothyroid 및 측면 Cricoarytenoid 후두 근육. RF = 망상 형성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 :. Cricothyroid 및 측면 Cricoarytenoid 후두 근육에 PRV152을 주입 한 후 마우스 86 시간의 뇌간에 Psuedorabies 바이러스 (PRV152) 감염 () 뉴런이 강화 된 발현하는 녹색 형광 단백질 (흰색, 스테인드 섹션의 원래 시야 이미지에서 반전 된 색상 ) 주입 된 근육에 핵 ambiguus AMB () 동측에, 주변의 망상 형성 (RF)와 고독한 핵 (솔),하지만 설하 핵 (XII). (B) 암브 높은 배율에서 망상의 interneurons (빨간색 화살표, RF의 세포 기관). 스케일 바 : 대한 1mm; B 100 μm의. (Arriaga 등. 2012 년 수정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 :. 두피 피라미드 뉴런은 eGFP는 (흰색, 스테인드 섹션의 원래 시야 이미지에서 반전 색) 표현 Cricothyroid과 측면 Cricoarytenoid 후두 근육에 Psuedorabies 바이러스 (PRV152)의 사출 다음 (M1)의 피질 레이어 V의 크기를 조절 바 : 1mm에 대한 메인 패널; 삽입 된 200 μm의. (Arriaga 등 알에서 수정. 2012).

그림 4
그림 4 :. 뇌간에서 M1 축삭 () (M1)에 BDA의 주입에서 후두 근육과 M1의 축삭 (검은 색)의 주입에서 암브 (갈색)에 CTB 표지 운동 뉴런을 포함하는 관상 뇌간 부분의 낮은 전력. BDA 표시 축삭은 cortico-피라미드 (피리) 트랙에서 볼 수 있습니다. 요약 : 암브, 핵 ambiguus; 피라, 피라미드; MRF, Reticular 형성은 직접 암브에 내측; DRF, 암브에 망상 형성 지느러미. (b)는 BDA의 높은 배율 암브 모터 뉴런 (CTB 갈색)에 접촉 (화살표)를 만드는 (M1)에서 축삭 (검정, 화살표 머리)를 표시. (C) (M1)의 축삭 (검정) (화살표)를 따라 실행하고 근처 (화살표 머리) 암브로부터 방출 큰 암브 모터 신경 세포 수상 돌기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 주사 부위와 PRV의 transynaptic 추적으로 보지 BDA 주사에 의해 밝혀 추가 양방향 연결. () 일차 운동 피질 (M1)의 양자 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA) 주사 (블랙) 기본 선조체의 밀도 터미널 투사 필드 (검정색) 밝혔다. (b) 코르티(M1)에서 CAL 축삭은 시상 (VL)의 복부 측면 핵에 종료; 시상 세포의 클러스터 (어두운 갈색과 흰색 화살표 머리로 표시) 다시 M1 노래 영역에 해당 프로젝트는 VL에서 관찰된다. 내부 캡슐 (IC)는 피질에서 나오는 축삭을 표시했다. 스케일 바 : 대한 1mm; B 200 μm의. (Arriaga 등. 2012 년 수정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

PRV152 4,21 이용한 실험을 계획 할 때 고려되어야 문제들이있다. 가장 중요한 것은, (僞) 바이러스는 치명적이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 인간을 비롯한 영장류가 감염에 민감하지 않지만 적절한주의가 다른 동물을 보호하기를 기울여야한다. 성인 마우스는 일반적으로 5-7일 감쇠 PRV152 균주 접종 후 생존. 따라서, PRV152 1 주일 이상 생존 시간을 필요로 실험에 적합하지 않습니다. 또한, 감염된 동물은 일반적으로하여 정상적인 동작의 관찰을 필요로하는 실험 PRV152의 유용성을 제한, 생존 기간 동안 질병의 징후를 표시합니다.

또한, PRV152는 세포 독성 면역 반응 (22)을 트리거합니다. 바이러스의 복제 및 전송 시간에 따른 4 titer-하고 있기 때문에, 신경의 패턴 비라의 면역 검출에 의해 밝혀세포는 감염의 단계를 통해 진행으로 L 단백질 또는 eGFP는 리포터 유전자는 생존 기간의 과정을 통해 변경됩니다. 다섯 일 근육에 접종 한 후, 3 번째, 4 번째 순서의 뉴런은 검출 될 수 있지만, 초기 감염 뉴런 사멸 될 수도있다. 따라서 최적의 생존 기간은 각각의 연구를 위해 실험적으로 결정되어야한다. 이는 회로를 통해 감염의 진행 및 세포 또는 동물을 죽음의 위험없이 관심있는 특정 뉴런 레이블을 가장 시점을 결정하기 위해 시계열 분석을 수행 할 것을 권장한다.

PRV와 라벨의 성공에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중의 하나는 바이러스 역가이다. 1.4 X 10월 5일에서 7일까지 × 104 PFU / ㎖ 23 PRV-Bartha의 역가를 감소시키는 경우에 감염된 세포의 수가 현저히 감소가보고되었다. 따라서, 우리는 1 × 10 7 PFU / ㎖ 및 유지 분주 VI 이상 사용 역가 추천RUS가에서 -80 ° C ~ 그것의 감염성을 유지하기 위해 사용될 때까지. 높은 역가를 사용하는 경우에도, 하나는 모든 종류의 세포 감염에 대한 허용 될 수 있음을 유의하십시오. 따라서, PRV 추적에 의해 확인 된 세포는 감염된 대상에 대한 입력의 완전하게 대표하지 않을 수 있습니다.

한 방법은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 목표, 구체적으로 근육을 조절하는 중앙 efferents을 분석 PRV의 유용성에 초점을 맞추고있다. 그들은 또한 주변 접종에 의해 감염 될 수 있기 때문에 시각적 및 24와 같은 다른 자율 신경 회로는이 기술에 매우 적합하다. 그러나, PRV는 사전 검토 3에서 광범위 바와 같이 몇 가지 문제가주의 깊게 고려하면 중추 신경계로의 직접 분사를 위해 효과적으로 사용될 수있다. 그 저자는 PRV-Bartha 및 관련 균주가 광범위하게 identifyi에 대한 PRV152가 적합하다, 감염된 신경 세포의 수지상 아버을 채우기 언급NG는 말단 수상 돌기에 구 심성. 바이러스의이 속성은 일반적으로 기존의 추적자 공부하는 셀 바디 영역의 외부에있는 말단 수상 돌기에 입력 예비 목록을 추론에 대한 설명 기술은 특히 유용합니다.

주변 대상에서 추적 할 때, 교감 신경 분포가 가능한 혼동 고려되어야한다. 따라서, 우리는 처음에 공감 입력 PRV 라벨이 결과의 해석에 영향을 미칠 것입니다 여부를 결정하기 위해 정상 및 sympathectomized 동물의 라벨 패턴을 비교하는 것이 좋습니다.

면역 조직 화학에 대한 필요없이 형광 현미경을 이용하여 직접 묘화 될 수 PRV152 표현 eGFP는 감염된 세포에서의 신호; 그러나,이 신호는 사진 표백의 대상이며, 시간이 지남에 따라 저하됩니다. DAB는 요로 트레이싱 결합 면역 조직 염색의 주요 장점은 반응 생성물의 영구적 인 특성이다. 그것은 내가 동안또한 감염된 세포를 검출하는 바이러스 단백질에 대한 항체를 사용하는 것이 가능하다, 다른 바이러스 성 요소는 반드시 서로 25 또는 eGFP는 신호와 공동 지역화 않는다. 따라서, 우리는 형광에 의해 관찰 라벨 패턴을 유지하기 위해 eGFP는 대한 항체를 사용하는 것이 좋습니다.

감염된 세포에 대한 모든 구 심성은 원위 수상 돌기에 문의하는 것이 포함하여 바이러스의 transsynaptic 통과를위한 도관 될 가능성이 있기 때문에, 우리는 중요한 확실하게 식별 회로 릴레이의 다음 확인을 위해 같은 수상 돌기 얼룩 기존의 추적을 선택하는 것으로 간주. 우리는이 목적을 위해, CTB를 선택하고,이 돌기의 양호한 염색 및 주변 neuropil와 운동 피질에서 내림차순 축삭 모두 강한 콘트라스트를 제공한다는 것을 발견했다. 이 염색 축색과 세포체의 착색 (BDA = 갈색; CTB = 검정색)을 반전 할 수 있지만, 우리는 블랙 최선 공동을 제공한다는 발견ntrast 좋은 구경 축삭을 시각화.

BDA 라벨 패턴을 해석 할 때 명심해야 할 중요한 점은 BDA10kDa 주로 선행 성 추적자로 사용뿐만 아니라 역행 (그림 6) 6 셀 라벨을 할 수 있다는 것입니다. 또한, BDA는 다른 단말기 사이트에 축삭 담보를 따라 분포 셀에 역행 수송 할 수있다. 그 축삭 담보가 분사 영역의 투사 대상물과 동일한 영역에 존재한다면, 그것은 선행 성 라벨 구별하기 어렵다.

최종 기술 노트는 34 G NanoFil 금속 주사기, 좋은 구경보다 더 나은 수행 근육에 추적자를 주입 유리 피펫을 뽑아하지만, 작은 동물의 뇌내 주사에 사용하는 경우 너무 많은 기계적인 손상이 발생한다는 것입니다. 따라서 우리는 주변 주사에 대한 금속 주사기와 중앙 주사의 유리 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.

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Acknowledgments

우리는 후두 수술 기술을 가르치는, 고베 대학, 일본의 박사 토시오 테라지마 감사와 PRV-Bartha를 공급하는 프린스턴 대학의 박사 린 Enquist. 연구는 에리히 D. 자비스에 NIH 개척자 상 DP1 OD000448와 구스타보 Arriaga에 NSF 대학원 연구 활동 상에 의해 지원되었다. 적절하게 적립 이전의 연구에서 수치 저널의 편집 정책에 따라 PLoS의 하나 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 라이선스 (CC-BY)에서 사용된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NanoFil Microinjection System World Precision Instruments IO-Kit 34 G option
Stereotaxic frame David Kopf Instruments Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-204
Sliding microtome Leica SM2010 R
Name Company Catalog Number Comments
VetBond 3M 1469SB
Isofluorane (Forane) Baxter  1001936060
Betadine Swab Stick Cardinal Health 2130-01 200 count
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500
SuperFrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
Biotinylated dextran amines Invitrogen D-1956 10,000 MW
Pseudorabies virus Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) PRV152 Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) List Biological Laboratories 703
Cholera Toxin B Subunit List Biological Laboratories 103B
Anti-eGFP Open Biosystems ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine Sigma-Aldrich D5905 10 mg tablets
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H3410 30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl Sigma-Aldrich K4138 80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride Sigma-Aldrich 339350
Phosphate buffer Sigma-Aldrich P3619 1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital Sigma-Aldrich P3761 50 mg/ml dose
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylenes Sigma-Aldrich 534056 Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment Vet Depot 1017992

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References

  1. Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
  2. Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
  3. Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  6. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
  7. Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
  8. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  9. Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
  10. Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
  11. Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
  12. Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
  13. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  14. Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
  15. Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  18. Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
  19. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
  20. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
  21. Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
  22. Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
  23. Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
  24. Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
  25. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).

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신경 과학 문제 (103) (僞) 바이러스 콜레라 독소 바이오틴 덱스 트란 아민 회로 추적 신경 해부학.
Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적
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Arriaga, G., Macopson, J. J.,More

Arriaga, G., Macopson, J. J., Jarvis, E. D. Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling. J. Vis. Exp. (103), e50672, doi:10.3791/50672 (2015).

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